MX2013003715A - Factor ii y fibrinogeno para tratamiento de trastornos hemostaticos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la normalización de la hemostasis alterada que comprende administrar un tratamiento de factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (1) FIl; (2) PCC; y (3) una combinación de tres factores de FII, FX y FVIIa. El tratamiento de factor de coagulación puede administrarse en combinación con fibrinógeno. El o los factores de coagulación pueden ser factor o factores de coagulación recombinantes humanos.

Description

FACTOR II Y FIBRINOGENO PARA TRATAMIENTO DE TRASTORNOS HEMOSTATICOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para tratar trastornos hemostáticos .

Antecedentes de la Invención La hemostasis se refiere al proceso para detener la pérdida de sangre de un vaso sanguíneo dañado. La coagulación o la formación de coágulos de sangre es una parte importante de la hemostasis. Para detener el sangrado de una herida, se cubre la pared de un vaso sanguíneo dañado se recubre con un coágulo que contiene plaquetas y fibrina. Los trastornos de coagulación pueden conducir a un mayor riesgo de sangrado (hemorragia) o coagulación (trombosis) .

El sangrado o transfusión masiva en los pacientes se asocia comúnmente con la insuficiencia de coagulación. Esta insuficiencia de coagulación puede provocarse por la coagulopatía dilucional, definida como una tendencia superior al sangrado debido a la dilución de la sangre. La compensación de líquidos es un tratamiento convencional para la pérdida extensa de sangre para normalizar la presión sanguínea y evitar el choque circulatorio. No obstante, la compensación de líquidos diluye los factores de coagulación en la sangre restante y afecta su función, lo que puede Ref. 240101 resultar en un sangrado superior que puede poner en riesgo la vida .

Las vías bioquímicas in vivo que conducen a la coagulación son complejas y requieren una gran cantidad de factores y cofactores. Existen diez factores designados con los números romanos I a XIII, donde los denominadores III, IV y VI no se utilizan. Numerosos factores y cofactores relacionados modulan la actividad de la vía bioquímica. Por ejemplo, en la vía de factor tisular, después del daño del vaso sanguíneo, el factor VII (abreviado FVII según la convención de los factores denominados con números romanos) entra en contacto con el factor tisular (TF, por sus siglas en inglés) expresado sobre las células que presentan factor tisular (fibroblastos y leucocitos estromales) . Esto forma un complejo activado (TF-FVlla) . El TF-FVlla activa el FIX y el FX. El FVII se activa a sí mismo por la trombina, el FXIa, la plasmina, el FXII y el FXa. La conversión de FX en FXa activado por TF-FVIIa se inhibe casi inmediatamente mediante el inhibidor de la vía de factor tisular (TFPI, por sus siglas en inglés) . El FXa y su cofactor FVa forman el complejo protrombinasa que activa la protrombina en trombina. La trombina a continuación activa otros componentes de la cascada de coagulación, que incluyen el FV y el FVII (que activa el FXI, que a su vez activa el FIX) y activa y libera al FVIII de su unión con el factor de Willebrand (vWf) . El FVIIIa es el cofactor del FlXa y juntos forman un complejo "tenaza" que activa el FX para regenerarse positivamente en el ciclo. La activación de la vía produce un brote de trombina activada. La trombina activada en este ciclo puede convertir el fibronógeno en fibrina que es la proteína que forma el coágulo junto con las plaquetas.

La protrombina (FII) se produce en el hígado y se modifica postraslacionalmente en una reacción que depende de la vitamina K que convierte diez ácidos glutámicos de la protrombina en ácido glutámico carboxi gama. La deficiencia de la vitamina K o la administración de la warfarina anticoagulante inhibe la conversión de los residuos de ácido glutámico del factor II en Gla, lo que ralentiza la activación de la cascada de coagulación. La trombina (Fila) se produce mediante escisión enzimática de dos sitios en FII por el Factor X activado (FXa) . La actividad de FXa se mejora ampliamente mediante la unión al Factor V activado (FVa) . En los seres humanos adultos el nivel sanguíneo normal de actividad de protrombina medido fue de aproximadamente 1.1 unidades/ml. Los niveles en plasma de protrombina del recién nacido aumentan de forma constante después del nacimiento hasta alcanzar niveles de adulto normales, de un nivel de aproximadamente 0.5 unidades/ml un día después del nacimiento, a un nivel de aproximadamente 0.9 unidades/ml después de 6 meses de vida.

La trombina, que se forma a partir de la protrombina, tiene muchos efectos en la cascada de coagulación. Es una serina proteasa que convierte el fibrinógeno soluble en cepas insolubles de fibrina, así como también cataliza muchas otras reacciones relacionadas con la coagulación. Al Dieri et al. investigaron la relación entre las concentraciones del factor de coagulación, los parámetros de generación de trombina y la cantidad de pérdida de sangre en pacientes con varias deficiencias congénitas del factor de coagulación. Los autores demostraron que la tendencia al sangrado se asoció directamente con la cantidad de generación de trombina, que varió linealmente con respecto a las concentraciones de FII. Al Dieri et al. Thromb Haemost 2002, 88:576-82. Fenger- Erikson et al. también mostraron, en el caso de coagulopatía dilucional, que además del fibrinógeno, los factores de coagulación incluidos el FII, FX y FXIII también disminuyeron por debajo del nivel esperado después de una dilución al 32% con solución de almidón de hidroxietilo . Fenger-Eriksen et al. J Thromb Haemost 2009, 7:1099-105.

El fibrinógeno (Factor I o FI) es una glicoproteína de plasma soluble que se sintetiza en el hígado y se convierte por la trombina en fibrina durante la coagulación de la sangre. Los procesos en la cascada de coagulación convierten la protrombina en la serina proteasa trombina activada que convierte el fibrinógeno en fibrina. A continuación la fibrina se retícula por el factor XIII para formar un coágulo. La concentración normal de fibrinógeno en el plasma sanguíneo es de 1.5 a 4.0 g/L o aproximadamente 7 µ?. En el caso de pérdida de sangre marcada, el fibrinógeno, más que cualesquiera otros factores o plaquetas procoagulantes alcanza concentraciones en plasma gravemente bajas. Hiippala et al. Anesth Analg- 1995 , 81:360-5; Singbartl et al. Anesth Analg 2003, 96:929-35; McLoughlin et al. Anesth Analg 1996, 83:459-65. Pequeñas cantidades de coloides (menores a 1000 mi) pueden afectar la polimerización de fibrina y por consiguiente la firmeza del coágulo. Innerhofer P et al.. Anesth Analg 2002, 95:858-65; Mittermayr et al. Anesth Analg 2007;105:905-17; Fries et al. Anesth Analg 2002, 94:1280-7. Algunas recomendaciones citan un umbral de concentración de fibrinógeno de 1 g/L con base en los resultados de un estudio en el que se observó que cuatro de cuatro pacientes con una concentración de fibrinógeno menor a 0.5 g/L presentaron sangrado microvascular difuso. Spahn et al.. Crit Care 2007, 11: 17; Stainsby et al. Br J Haematol 2006;135:634-41; Ciavarella et al. Br J Haematol 1987; 67: 365-8. Por el contrario, datos clínicos recientes de hemorragia periportal, neurocirugía y cirugía cardiaca muestran que a una concentración de fibrinógeno menor que 1.5 - 2 g/L, ya existe una tendencia superior al sangrado peri y postoperatorio. Charbit et al. J Thromb Haemost 2007, 5:266-73; Gerlach et al. Stroke 2002, 33:1618-23; Blome et al. J Thromb Haemost 2005, 93:1101-7; Ucar efc al. Heart Surg Forum 2007, 10:E392-6.

Los problemas de coagulación asociados con los trastornos de sangrado como la coagulopatía dilucional pueden abordarse con terapia hemostática. El propósito de la terapia hemostática es minimizar la pérdida de sangre, los requisitos de transfusión y la mortalidad. En pacientes con traumatismos con Valores de Gravedad de Lesión (ISS, por sus siglas en inglés) idénticos, la mortalidad prácticamente se duplica simplemente como resultado de la coagulopatía. Brohi et al. J Trauma 2003, 54:1127-30. El sangrado o transfusión masiva en los pacientes con traumatismos múltiples se asocia con la insuficiencia de coagulación. Por tanto, para alcanzar una hemostasis adecuada, se requiere una cantidad suficiente de trombina y una cantidad suficiente de sustrato coagulable. Los elementos clave en la coagulación son la formación de trombina en la superficie de la plaqueta y la escisión del fibrinógeno por la trombina para formar fibrina. Brohi et al. J Trauma 2003, 54:1127-30. Si se forma suficiente trombina, esta convierte al fibrinógeno en fibrina estable, que determina la firmeza del coágulo en desarrollo en la presencia del factor XIII (FXIII) . Korte, et al., Hamostaseologie 2006, 26:S30-5.

El reemplazo agresivo de líquidos es crucial en el caso de la pérdida de sangre masiva en pacientes que presentan traumatismos y traumatismos múltiples para mantener la normovolemia. Sperry JL, et al. J Trauma 2008; 64:9-14. No obstante, la estabilización hemodinámica mediante la administración de grandes cantidades de soluciones cristaloides o coloidales provoca la coagulopatía dilucional. Los efectos clínicos de la insuficiencia de coagulación de plasma provocada por la hemodilución normovolémica se investigaron anteriormente en varias publicaciones. Innerhofer P, et al. Anesth Analg 2002;95:858-65, Singbartl et al. Anesth Analg 2003;96:929-35. Mittermayr et al. Anesth Analg 2007;105:905-17.

La coagulopatía dilucional generalmente se trata con plasma recién congelado (FFP, por sus siglas en inglés) y si estuviera disponible, con crioprecipitado . Stainsby et al. Br J Anaesth 2000, 85:487-91; Spahn et al. Crit Care 2007, 11:R17. No obstante, las concentraciones de factor de coagulación reducidas gravemente apenas pueden corregirse mediante la administración de FFP debido a sus concentraciones bajas de factores de coagulación y a sus efectos de expansión de volumen que compensan el aumento pretendido en la concentración de cualquier proteína de interés. Mittermayer 2007, supra; Scalea et al. Ann Surg, 2008, 248:578-84; Chowdhury et al.. Br J Haematol 2004, 125:69-73; Stanworth et al. Br J Haematol 2004, 126:139-52; Abdel-Wahab et al . Transfusión 2006, 46:1279-85. Además, la administración de FFP se asocia con varias complicaciones como el comienzo de lesión pulmonar, insuficiencia de órganos múltiples e infección. Watson GA, et al. J Trauma 2009, 67:221-7; Sarani et al. Crit Care Med 2008, 36:1114-8; Dará et al. Crit Care Med. 2005, 33:2667-71. Además, el proceso de descongelación necesario retrasa el tratamiento inmediato, que es de especial importancia en el caso del sangrado agudo y serio.

El efecto de la administración de concentrado de fibrinógeno sobre la coagulopatía dilucional se examinó previamente in vitro, en varios modelos animales así como en la práctica clínica. Fries et al. Br J Anaesth 2005, 95:172-7; Fries et al. Anesth Analg 2006, 102:347-51; Velik-Salchner et al. J Thromb Haemost 2007, 5:1019-25; Stinger et al. J Trauma 2008, 64:S79-85. La administración de concentrado de fibrinógeno solo normaliza la firmeza del coágulo, pero no el inicio de la coagulación, debido a que esta es una reacción que depende de la trombina. Fries et al. Br J Anaesth 2005, 95:172-7; Fries et al. Anesth Analg 2006, 102:347-51; Fenger-Eriksen et al. J Thromb Haemost 2009, 7:795-802. Por consiguiente, las combinaciones de fibrinógeno y complejos de factor de coagulación como el concentrado de complejo de protrombina (PCC, por sus siglas en inglés) se estudiaron anteriormente .

En particular, Fríes et al. estudiaron el efecto de la sustitución de fibrinógeno sobre la inversión de la coagulopatía dilucional en un modelo in vi tro. British Journal of Anaesthesia, 2006, 97 (4 ): 460-467. Se diluyó la sangre de 5 voluntarios masculinos saludables en un 60% mediante el uso de solución de lactato de Ringer, solución de gelatina modificada al 4% o almidón de hidroxietilo al 6% (HES) 130/0.4, así como la combinación de solución de lactato de Ringer con cualquiera de 2 soluciones coloidales. Fríes et al., Anest Analg; 2006, 102:347-51. A partir de entonces, se incubaron alícuotas de muestras de sangre diluida con 3 concentraciones diferentes de fibrinógeno (0.75, 1.5 y 3.0 g/L) . Las mediciones se realizaron mediante tromboelastografía modificada (ROTEM*; Pentapharm, Munich, Alemania) . Después de la dilución al 60%, los tiempos de coagulación aumentaron, mientras que la firmeza del coágulo y la polimerización de fibrina disminuyeron significativamente. Después de la administración de fibrinógeno, los tiempos de coagulación disminuyeron. La firmeza del coágulo, así como la polimerización de fibrina, aumentó en todas las muestras de sangre diluida cuando se agregó el fibrinógeno. El efecto de la sustitución de fibrinógeno in vitro sobre las variables de ROTEM® dependió de la dosis de fibrinógeno y del tipo de solución utilizada para diluir las muestras de sangre.

En otro estudio, Fries et al. investigaron el efecto del fibrinógeno y el concentrado de complejo de protrombina (PCC) en condiciones de hemodilución y hemorragia descontrolada en un modelo porcino. Fries et al., British Journal of Anaesthesia, 2006, 97 (4 ): 60 -467. Después de una gran pérdida de sangre del 65% del volumen sanguíneo total estimado, el reemplazo de volumen de líquido con HES (2500 mi) resultó en coagulopatía dilucional como se midió mediante pruebas de coagulación convencionales y análisis ROTEM*. En los animales que recibieron un concentrado de glóbulos rojos recuperados únicamente y en el grupo de placebo hubo una pequeña mejora estadísticamente significativa en los parámetros de ROTEM®. No obstante, en el grupo de tratamiento, la sustitución adicional de fibrinógeno y PCC resultó en la normalización de los parámetros de coagulación. La pérdida de sangre y la mortalidad después de la lesión hepática estándar disminuyó de forma significativa en los animales tratados con fibrinógeno y PCC en comparación con placebo .

El PCC habitualmente se administra en la práctica clínica en el caso de tiempo de coagulación prolongado en pacientes gravemente enfermos así como en situaciones de sangrado masivo. Schochl et al. Anaesthesia 2009. El PCC corresponde a los factores II, VII, IX y X así como a la proteína C y a pequeñas cantidades de heparina y ha sido utilizado durante años para tratar deficiencias de coagulación hereditarias y para la inversión de la anticoagulación después de la administración de antagonistas de vitamina K. Únicamente datos animales limitados acerca del uso de preparaciones de PCC modernas en cerdos que presentan deficiencias de factor de coagulación adquiridas provocadas por la pérdida de sangre masiva y la administración de HES se encuentran disponibles. Dickneite et al. Anest Analg 2008, 106:1070-7; Dickneite et al. Br J Anaesth 2009, 102:345-54; Dickneite et al J Trauma 2009.

Staudinger et al. investigaron el efecto de PCC sobre la coagulación del plasma en pacientes gravemente enfermos y señalaron que una dosis de 2000 unidades de Factor IX de PCC (30 IU/kg de peso corporal medio) normalizó el tiempo de protrombina (PT, por sus siglas en inglés) mediante el aumento del nivel en plasma de los factores de coagulación II, VII, IX y X en pacientes con actividad de coagulación moderadamente reducida. Staudinger et al. Intensive Care Med 1999, 25:1105-10. No obstante, con respecto a la generación de trombina, el PCC parece ser mucho más activo que el rhFVIIa. Dickneite et al J Trauma 2009. El PCC puede asociarse con un mayor riesgo de complicaciones tromboembólicas , especialmente en pacientes con defectos de coagulación adquiridos. Bagot et al. Thromb Haemost 2007, 98:1141-2; Warren et al. Ann Emerg Med 2009, 53:758-61; Kohler et al. Thro b Haemost 1998, 80:399-402.

También se han propuesto varios métodos adicionales para el tratamiento del sangrado y la pérdida de sangre, incluido el complemento de factores de coagulación. Véase, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos 2003/0129183, 2004/0198647, 2004/0237970, 2005/0282771, 2006/0025336, 2006/0211621, 2007/0232788, 2008/0014251, 2008/0188400, 2008/0267940, 2010/0093607, 2009/0098103, 2009/0148502, 2009/0175931, 2009/0232877 y 2010/0086529.

Pese a la propuesta y al estudio de varias composiciones y métodos para restablecer la hemostasis, aún existe una necesidad en la técnica de contar con métodos para tratar los trastornos hemostáticos como la coagulopatía dilucional .

Para alcanzar la hemostasis en los pacientes con trastornos de sangrado o pérdida de sangre, se requiere una cantidad suficiente de trombina y una cantidad suficiente de sustrato coagulable (fibrinógeno) . Los elementos clave en la coagulación son la formación de trombina en la superficie de la plaqueta y la escisión del fibrinógeno por la trombina para formar fibrina. Si se forma suficiente trombina, esta convierte al fibrinógeno en fibrina estable, siempre que haya suficiente fibrinógeno presente, lo que determina la firmeza del coágulo en desarrollo en la presencia del factor XIII (FXIII) .

La presente invención prevé el tratamiento o minimización del sangrado descontrolado mediante el uso de agente (s) hemostático (s) recombinante (s) , incluido el factor II recombinante humano (rhFII) solo o una combinación de tres factores de coagulación humanos recombinantes , rhll, rhFX y rhVIIa (3F) , donde los agentes hemostáticos se utilizan con o sin fibrinógeno. En particular, la presente invención demuestra la eficacia de tales agentes hemostáticos recombinantes en el tratamiento de la coagulopatía dilucional. Sorprendentemente, la administración de rhFII solo o en combinación con fibrinógeno es suficiente para restablecer la hemostasis norm l. La administración de rhFII solo o en combinación con fibrinógeno, puede evitar complicaciones potencialmente serias de eventos tromboembólicos que pueden acompañar otras formas estándar de tratamiento proporcionadas actualmente para controlar los trastornos de sangrado o pérdida de sangre.

Cabe señalar que la referencia a cualesquiera publicaciones en la presente no debe interpretarse como un reconocimiento de que la publicación es una técnica anterior a las invenciones descritas a continuación.

Breve Descripción de la Invención El tratamiento de un trastorno hemostático o la normalización de la hemostasis puede comprender administrar un tratamiento de factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (1) FII solo; (2) PCC; y (3) una combinación de tres factores de FII, FX y Vlla. El tratamiento de factor de coagulación (agente (s) hemostático (s) ) puede administrarse de forma opcional en combinación con fibrinógeno. El o los agentes hemostáticos pueden ser factores recombinantes humanos, por ejemplo, rhFII, rhFX y rhVIIa (esta combinación de tres factores de factores humanos recombinantes puede abreviarse como 3F) o rhFII solo. En algunas modalidades, un tratamiento eficaz de un trastorno hemostático o para la normalización de la hemostasis puede comprender la coadministración de fibrinógeno y rhFII. El tratamiento puede llevarse a cabo sin complementación sustancial · de ningún otro factor de coagulación. Por consiguiente, en algunas modalidades, un tratamiento eficaz de un trastorno hemostático puede comprender administrar un tratamiento de factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (1) FII solo, por ejemplo, rhFII; (2) 3F; (3) fibrinógeno y una combinación de FII, FVIIa y FX; (4) o fibrinógeno y FII.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 : Pérdida de sangre por kg de peso corporal en mL después de la incisión hepática y la administración de control salino, concentrado de fibrinógeno (fib) , concentración de fibrinógeno en combinación con PCC (PCC + fib) , concentrado de fibrinógeno en combinación con una combinación de tres factores (TresF + fib) o concentrado de fibrinógeno en combinación con FII recombinante humano (FII + fib), mostrada como promedio +/- SO.

Las Figuras 2A-2B: Análisis ROTEM* en el punto de referencia (BL) , después de la extracción de sangre (BW) , después de la hemodilución (HD) , después de la administración del fármaco de estudio (TH) y en el punto de equivalencia de observación (END) . Los fármacos de estudio corresponden al concentrado de fibrinógeno (fibrinógeno) , concentración de fibrinógeno en combinación con PCC (PCC) , concentrado de fibrinógeno en combinación con el factor FII recombinante humano (FII) , concentrado de fibrinógeno en combinación con una combinación de tres factores (3F) o control salino. Se muestra el tiempo de coagulación (CT en segundos) (figura 2A) y la firmeza de coágulo máxima (MCF, en mm) (figura 2B) . Se muestran las diferencias estadísticamente significativas (P<.001) en comparación con el grupo salino y el grupo de fibrinógeno .

Figura 3 : Pérdida de sangre por kg de peso corporal en mi después de la administración de (1) control salino; (2) FII recombinante humano (rhFII) a 8 mg/kg; (3) combinación de tres factores que corresponde a rhFII + rh FX + rhFVIIa a 4.0, 0.32 y 0.006 mg/kg, respectivamente (dosis baja); (4) combinación de tres factores que corresponde a rhFII + rh FX + rhFVIIa a 8.0, 0.64 y 0.012 mg/kg, respectivamente (dosis alta) ; (5) FEIBA VH* (concentrado complejo activado (APCC) ; Baxter) a 40U/kg; (6) NovoSeven® (factor de coagulación Vlla; Novo Nordisk) a una primera dosis de 200 µ?/kg seguida por una segunda dosis de 100 yg/kg una hora después; o Haemocomplettan* HS (concentrado de fibrinógeno; CSL-Behring) , como valores individuales y media (barra horizontal) .

La Figura 4 : Los resultados de ROTEM después de la administración de factores de coagulación o sus combinaciones como se describe para la figura 3 anterior que muestra a) el tiempo de coagulación (CT) b) la firmeza de coágulo máxima ( CF, por sus siglas en inglés) de ex-TEM (factor tisular) activaron la totalidad de las muestras de sangre extraídas en el punto de referencia, después de la dilución, después de la administración del fármaco y en la finalización del experimento, respectivamente, mostrados como media ± SEM.

Las Figuras 5A-5B: Resultados de generación de trombina (trombograma calibrado automatizado) después de la administración de ' los factores de coagulación o sus combinaciones, como se describe para la figura 3 anterior que muestra A) tiempo de retraso, (B) tiempo para el pico, (C) pico y (D) trombina endógena potencial para las muestras de plasma obtenidas en el punto de referencia, después de la dilución, después de la administración del fármaco y al final del experimento, mostrados como ± SEM medios.

Las Figuras 6A-6D: Concentración del complejo trombina-antitrombina en las muestras de plasma después de la administración de los factores de coagulación o sus combinaciones, como se describe para la figura 3 extraídas en el punto de referencia, después de la dilución, después de la administración del fármaco y al final del experimento mostrada como media.

La figura 7: los niveles de TAT fueron similares en todos los grupos de tratamiento después de la etapa de dilución.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un tratamiento para el sangrado descontrolado o para la normalización de la hemostasis mediante la administración de un tratamiento de factor de coagulación o una combinación de uno o más factores de coagulación. En particular, la invención proporciona un tratamiento para el sangrado descontrolado o para la normalización de la hemostasis mediante la administración de FII o una combinación de tres factores (FII, FX y Vlla ) . En ciertas modalidades, los agentes hemostáticos o factores de coagulación son factores de coagulación recombinantes humanos. En modalidades adicionales, los factores de coagulación se administran con o sin fibrinógeno. En ciertas modalidades, el tratamiento de factor de coagulación es PCC (FII, FVII, FIX y FX, opcionalmente con pequeñas cantidades de heparina) .

El comienzo de la coagulopatía dilucional y el efecto del tratamiento puede medirse mediante pruebas de coagulación convencionales como la tromboelastometría rotacional (ROTEM^) y la generación de trombina medida con el trombograma calibrado automatizado (CAT, por sus siglas en inglés) llevada a cabo mediante el uso de un activador de TF de 1 pM.

ROTEM* investiga la interacción de los factores de coagulación, sus inhibidores, fármacos anticoagulantes, células sanguíneas, específicamente plaquetas, durante la coagulación y la fibrinólisis posterior. Las condiciones reológicas imitan el flujo lento de la sangre en las venas. En resumen, la sangre se coloca en una cubeta desechable que utiliza una pipeta electrónica. Una clavija desechable se une a una barra que se conecta con un resorte fino y oscila lentamente hacia atrás y hacia delante. La señal de la clavija suspendida en la muestra de sangre se transmite mediante un sistema de detección óptico. El instrumento mide y muestra gráficamente los cambios en la elasticidad en todas las etapas del coágulo en desarrollo y resolución. La temperatura de prueba típica es de 37°C, pero pueden seleccionarse diferentes temperaturas. El resultado principal es una curva de reacción que muestra la elasticidad con el paso del tiempo cuando el coágulo se forma o disuelve.

Cuatro parámetros describen la curva de coagulación en el uso de rutina. El tiempo de coagulación (CT) es el tiempo de latencia desde la adición del reactivo de partida a la sangre hasta que el coágulo comienza a formarse. La prolongación del CT puede ser un resultado de las deficiencias de coagulación, principalmente de los factores de coagulación o heparina (en función de la prueba utilizada) . Una disminución del CT incluye hipercoagulabilidad. El ángulo alfa es el' ángulo de una tangente a la curva, mientras que el tiempo de formación de coágulo (CFT, por sus siglas en inglés) es el tiempo desde el CT hasta alcanzar un punto de firmeza de coágulo de 20 mm. Estos parámetros indican la velocidad en la cual se forma un coágulo sólido y se influencian principalmente por la función de plaquetas, pero los factores de fibrinógeno y coagulación también contribuyen. El CFT prolongado (o ángulo alfa inferior) generalmente es causado por una función plaquetaria pobre, un conteo de plaquetas bajo, trastornos de polimerización de fibrina o deficiencia de fibrinógeno. La reducción del CFT (o un ángulo alfa elevado) indica hipercoagulabilidad. La firmeza de coágulo máxima (MCF) es la mayor amplitud vertical del rastro. Refleja la fuerza absoluta de la fibrina y del coágulo de plaquetas. Una MCF baja indica una disminución del número o función de plaquetas, una disminución del nivel de fibrinógeno o de trastornos de polimerización de fibrina o una actividad baja del factor XIII. Un coágulo mecánicamente débil representa un riesgo de sangrado serio.

Pueden utilizarse variaciones de ROTEMs para enfatizar los diferentes parámetros y efectos. Por ejemplo, EXTEM es una prueba de selección para el sistema de hemostasis (extrínseco) . El reactivo EXTEM activa débilmente la hemostasis mediante el uso del factor tisular. A continuación el resultado se influencia por factores de coagulación extrínsecos, plaquetas y fibrinógeno.

El trombograma calibrado automatizado (CAT) se describe por Hemker et al. (Pathophysiol Haemost Thromb, 2002, 32:249-253). Mediante el uso de un sustrato de trombina fluorogéníco "lento" y una comparación continua con un calibrador accionado simultáneamente, la generación de trombina puede monitorearse automáticamente. El "trombograma" resultante mide la hipocoagulabilidad y las hipercoagulabilidades en el plasma con pocas plaquetas.

El tratamiento de un trastorno hemostático o la normalización de la hemostasis puede comprender la administración de un tratamiento de factor de coagulación, por ejemplo, FII y opcionalmente FX y FVIIa o una combinación de fibrinógeno y FII, opcionalmente además en combinación con FX y FVIIa. El o los agentes hemostático (s) pueden ser factores recombinantes humanos, por ejemplo, rhFII, rhFX y rhVIIa o rhFII solo. En algunas modalidades, un tratamiento eficaz de un trastorno hemostático puede consistir en la administración de FII o la coadministración de FII, FX y FVIIa, o la coadministración de fibrinógeno con FII y opcionalmente además la coadministración de FX y FVIIa, donde FII, FX' y/o FVIIa pueden ser factores humanos producidos de forma recombinante .

El tratamiento o normalización o hemostasis puede llevarse a cabo sin complementación sustancial de ningún otro factor de coagulación. En algunas modalidades, el tratamiento de un trastorno hemostático puede consistir en FII o en la coadministración de fibrinógeno y FII, donde el FII puede ser FII recombinante humano (rhFII) .

El término "complementación sustancial" se refiere a la adición de otros componentes, como los factores de coagulación además de los descritos en la presente invención, en una cantidad por la cual el efecto de uno o más agentes hemostáticos, cuando se complementan con tales factores de coagulación adicionales, es considerablemente diferente al efecto de la administración de uno o más agentes hemostáticos sin complementación.

Como se utiliza en la presente, las proteínas "recombinantes" incluyen aquellas proteínas preparadas mediante técnicas recombinantes . Tales proteínas incluyen las que se parecen a- la proteína natural así como las modificadas para mejorar la actividad, la vida media de las proteínas, la estabilidad de las proteínas, la ubicación de las proteínas y la eficacia. Véase la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. US 2005/0164367, que se incorpora en la presente a modo de referencia.

Como se utiliza en la presente, "tratamiento" es un método para obtener los resultados clínicos beneficiosos o deseados. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, a modo no taxativo, la mitigación de los síntomas, la disminución del sangrado, la estabilización del individuo y la prevención del sangrado.

La expresión "que consiste esencialmente en" no pretende implicar que se deben evitar otros tratamientos de pacientes convencionales concurrentes, sino que el tratamiento que consiste esencialmente en, por ejemplo, la administración de FII o la coadministración de una cantidad eficaz de fibrinógeno y el FII no se encuentra inmediatamente precedido por, no se acompaña por o no se encuentra seguido inmediatamente por una complementación significativa de otros factores de coagulación, particularmente factores de coagulación proteicos como los denominados con los números romanos V a XIII. En algunas modalidades, puede llevarse a cabo un tratamiento que consiste esencialmente en la administración de FII solo o en la coadministración de una cantidad eficaz de fibrinógeno y FII concurrentemente con procedimientos separados como la transfusión, la administración de plaquetas congeladas, células sanguíneas recuperadas, líquidos que contienen cristaloides y/o coloides y otros tratamientos convencionales que no comprenden complementación activa de factores de coagulación más allá de lo que puede ser endógeno en la sangre transfundida, en una preparación de plaquetas congeladas o similares. En otras modalidades, puede que no sea necesaria o deseada la modalidad simultánea de cualquier procedimiento que comprenda una administración separada de una composición que incluye cantidades significativas de factores de coagulación (por ejemplo, factores V a XIII) cuando se lleva a cabo un tratamiento que consiste escencialmente en la administración de una cantidad eficaz de FII, 3F, fibrinógeno y FII o fibrinógeno y 3F.

En algunas modalidades, el método para tratar un trastorno de sangrado traumático en un mamífero que necesita del tratamiento puede comprender administrar un factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (a) PCC (FII, FX, FIX, FVII y proteína C) ; (b) rhFII, rhFVIIa y r FX; y (c) rhFII solo, donde (a) , (b) o (c) se proporciona opcionalmente en combinación con fibrinógeno. Del mismo modo, el método para normalizar la hemostasis alterada asociada con un trastorno de sangrado traumático en un mamífero puede comprender administrar un tratamiento de factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (a) PCC (FII, FX, FIX, FVII y proteína C) ; (b) rhFII, rhFVIIa y rhFX; y (c) rhFII solo, donde (a) , (b) o (c) se proporciona opcionalmente en combinación con fibrinógeno. Además, el método para reducir la mortalidad que resulta de un trastorno de sangrado traumático puede comprender administrar un tratamiento de factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (a) PCC (FII, FX, FIX, FVII y proteína C) ; (b) rhFII, rhFVIIa y rhFX; y (c) rhFII solo, donde (a) , (b) o (c) se proporciona opcionalmente en combinación con fibrinógeno .

El método para tratar un trastorno hemostático o normalizar la hemostasis puede comprender aumentar la firmeza de coágulo máxima (MCF) , reducir el tiempo de coagulación (CT) y/o mejorar la generación de trombina después de la hemorragia o pérdida de sangre masiva asociada con un desorden de sangrado traumático en un mamífero mediante la administración de una terapia de combinación que comprende o consiste escencialmente en uno o más agentes hemostáticos que incluyen FII y opcionalmente fibrinógeno.

En cualquiera de estos métodos el tratamiento de factor de coagulación puede seleccionarse del grupo que consiste en (a) PCC (FII, FX, FIX, FVII y proteína C) ; (b) rhFII, rhFVIIa y rhFX; y (c) rhFII. En una modalidad, el tratamiento de factor de coagulación es una combinación de FII, FVHa y FX. En otra modalidad, el tratamiento de factor de coagulación es FII o rhFII solo. En otras modalidades, el tratamiento de factor de coagulación puede ser una combinación de rhFII, rhFVIIa y rhFX o rhFII solo, sustancialraente sin complementación de ningún factor hemostático, particularmente otros factores de coagulación denominados con números romanos. Es decir, en algunas modalidades, los métodos pueden comprender administrar rhFIl y opcionalmente fibrinógeno sustancialmente sin complementación de ningún otro factor hemostático, particularmente los factores V a XIII.

En modalidades alternativas, el método para tratar un trastorno de sangrado traumático en un mamífero que necesita del método puede consistir en la administración de un tratamiento de factor de coagulación como se describe anteriormente. Del mismo modo, el método para normalizar la hemostasis alterada asociada a un trastorno de sangrado traumático en un mamífero puede consistir en la administración de un tratamiento de factor de coagulación como se describe anteriormente. Además, el método para reducir la mortalidad que resulta de un trastorno de sangrado traumático puede consistir en la administración de un tratamiento de factor de coagulación como se describe anteriormente.

El método para tratar un trastorno hemostático o normalizar la hemostasis puede comprender aumentar la firmeza de coágulo máxima (MCF) , reducir el tiempo de coagulación (CT) y/o mejorar la generación de trombina después de la hemorragia o pérdida de sangre masiva asociada con un trastorno de sangrado traumático en un mamífero mediante un método que puede consistir en la administración de un tratamiento de factor de coagulación. En ciertas modalidades, la firmeza de coágulo máxima se aumenta de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 40 mm, de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 30 mm, de aproximadamente 10 mm, a aproximadamente 15 mm, de aproximadamente 20 mm, a aproximadamente 25 mm o aproximadamente 30 mm. En otras modalidades, el tiempo de coagulación se reduce de aproximadamente 35 a aproximadamente 75 segundos o aproximadamente 35 segundos, aproximadamente 40 segundos, aproximadamente 45 segundos, aproximadamente 50 segundos, aproximadamente 55 segundos, aproximadamente 60 segundos, aproximadamente 65 segundos, aproximadamente 70 segundos o aproximadamente 75 segundos. Como se establece anteriormente, el tratamiento de factor de coagulación puede seleccionarse del grupo que consiste en (a) PCC (FII, FX, FIX, FVII y proteína C) ; (b) rhFII, rhFVIIa y rhFX; y (c) rhFII solo, donde (a) , (b) o (c) se proporciona opcionalmente en combinación con fibrinógeno. En algunas modalidades preferidas, el tratamiento de factor de coagulación es una combinación de (1) FII, FVIIa y FX; o (2) FII solo. El tratamiento de factor de coagulación puede comprender factores recombinantes humanos, es decir, una combinación de (1) rhFII, rhFVIIa y rhFX; o (2) rhFII solo. En algunas modalidades, los métodos pueden consistir en la coadministración de rhFII, y opcionalmente la coadministración de fibrinógeno.

"Coadministración" o "cotratamiento" significa administrar una mezcla de componentes o administrar componentes de un cotratamiento de forma separada en momentos en que se encuentran cerca, por ejemplo, administrar componentes coadministrados durante períodos de superposición temporal o comenzar la administración de un componente dentro de aproximadamente una hora o media hora o un cuarto de hora del comienzo o finalización de la administración de un componente coadministrado.

Los componentes administrados en los métodos descritos en la presente se formulan y administran mediante el uso de técnicas bien establecidas en la técnica. Por ejemplo, el fibrinógeno y el FII, rhFII, o 3F pueden administrarse mediante inyección intravenosa o infusión mediante el uso de un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y excipientes adecuados para la formulación de los agentes activos incluyen cualquier agente farmacéutico que no induzca una respuesta inmune nociva para el individuo que recibe la composición y que puede administrarse sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, a modo no taxativo, líquidos como el agua, solución salina, glicerol, azúcares y etanol. Las sales farmacéuticamente aceptables también pueden incluirse. Tales sales incluyen sales de ácidos minerales como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos, sulfatos y similares; y sales de ácidos orgánicos como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Además, las sustancias auxiliares como los agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponación de pH y similares, pueden encontrarse en tales vehículos. Una discusión profunda de los excipientes farmacéuticamente aceptables se encuentra disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. , 18va edición, Easton, Pa., 1990).

El trastorno hemostático puede asociarse con cualquiera de coagulopatía (por ejemplo, coagulopatía dilucional) , sangrado traumático, sangrado periquirúrgico, sangrado posquirúrgico, hemorragia postparto y similares. El trastorno hemostático puede asociarse con un nivel de concentración de fibrinógeno en sangre menor de aproximadamente 2 a aproximadamente 1.5 g/L, menor de aproximadamente 1 g/L, o menor de aproximadamente 0.5 g/L. El trastorno hemostático puede asociarse con una pérdida de sangre de aproximadamente un 30% a aproximadamente un 85%, por ejemplo, mayor de aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 45%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 55%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80% o aproximadamente un 85% del volumen de sangre total estimado de un mamífero. En algunas modalidades, la coagulopatía dilucional resulta del restablecimiento de la normovolemia o el restablecimiento de la estabilización hemodinámica . Por consiguiente, el mamífero que necesita de los tratamientos descritos en la presente puede ser un mamífero que cumpla con uno. o más de estos criterios.

Los trastornos hemostáticos también pueden incluir hemofilia A y B, pacientes que padecen hemofilia A y B con anticuerpos inhibidores, deficiencias en los factores de coagulación, por ejemplo, fibrinógeno, FII, FV, FVII, , FIX, FVIII, FX, FXI, FXII y FXIII, factor de von illebrand, deficiencia de FV/FVII combinada, deficiencia de vitamina K epóxido reductasa Cl, deficiencia de gama-carboxilasa; sangrado asociado con traumatismos, lesiones, trombosis, trombocitopenia, accidentes cardiovasculares, coagulopatía, coagulación intravascular diseminada (DIC, por sus siglas en inglés) ; sobreanticoagulación asociada con heparina, heparina de bajo peso molecular, pentasacáridos , warfarina, antitrombóticos de moléculas pequeñas (es decir, inhibidores de FXa) ; y trastornos de plaquetas como, síndrome de Bernard Soulier, tromboblastemia de Glanzman y deficiencia de depósito de almacenamiento.

El trastorno hemostático también puede incluir el sangrado relacionado a los trastornos trombóticos como la trombosis venosa profunda, la trombosis asociada con estados o malignidades de enfermedad cardiovascular, la trombosis que resulta de los catéteres residentes o de otros procedimientos quirúrgicos invasivos y la trombosis asociada con enfermedades autoinmunes como el lupus.

Los métodos descritos en la presente pueden comprender o consistir básicamente en la coadministración de fibrinógeno en una cantidad suficiente para aumentar la concentración de fibrinógeno en sangre por encima de aproximadamente 0.5, aproximadamente 1, aproximadamente 1.5 o aproximadamente 2 g/L. En algunas modalidades el fibrinógeno se administra a una dosis de 12.5 a 200 mg/kg, por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 12.5, 25, 50, 100 o 200 mg/kg. En algunas modalidades, el rhFII se administra en una dosis de 1, 2, 4, 8 o 10 mg/kg. En algunas modalidades, la coadministración de fibrinógeno y uno o más agentes hemostáticos resulta en el mantenimiento de una coagulación aproximadamente normalizada durante al menos dos horas después de la administración.

En algunas modalidades, los agentes activos para un tratamiento pueden ensamblarse en un kit. El kit puede contener fibrinógeno y FII, rhFII y/o 3F así como cualesquiera excipientes adecuados, como, a modo no taxativo, solución salina y de sacarosa y cualquier cofactor adicional para la estabilización o eficacia de los componentes de la composición, como, a modo no taxativo, azúcares, antioxidantes y albúmina. Además, el kit puede comprender otros elementos implicados en la administración de los agentes activos, que incluyen un dispositivo para la inyección de los agentes activos (por ejemplo, una jeringa) , un torniquete y un hisopo de algodón con alcohol para limpiar el sitio de inyección. También pueden incluirse otros elementos en un kit que incluye elementos que participan en el cierre de heridas como materiales de sutura, agujas y fórceps.

Aunque los métodos descritos en la presente se describieron en detalle con referencia a sus modalidades, resultará evidente para el entendido en la técnica que pueden realizarse varios cambios y pueden emplearse equivalentes sin apartarse del alcance de la invención. Del mismo modo, los siguientes ejemplos se presentan como ilustrativos de los métodos descritos, pero no deben interpretarse como limitativos de los métodos descritos.

El fibrinógeno o concentrado de fibrinógeno puede administrarse además de uno o más agentes hemostáticos para mejorar la firmeza final del coágulo. En ciertas modalidades, la combinación de fibrinógeno con PCC, rhFII o 3F acorta el tiempo de coagulación y mejora la generación de trombina. La administración de PCC o rhFII combinado con fibrinógeno puede utilizarse para reducir la mortalidad en el tratamiento de hemorragia descontrolada. La administración de la combinación de PCC y fibrinógeno puede utilizarse para reforzar la coagulación, hasta 0.5 horas, una hora o dos horas después de la administración. Por consiguiente, el uso de rhFII, particularmente en combinación con fibrinógeno, puede ser una alternativa para el PCC con una eficacia comparable pero con un menor riesgo de complicaciones tromboembólicas .

El tratamiento que comprende la coadministración de fibrinógeno y rhFII sin complementación de ningún otro agente hemostático puede ser eficaz en la normalización de la hemostasis alterada después de una pérdida de sangre grave al menos tan alta como una hemodilución de aproximadamente un 60% con menor riesgo de complicaciones. La coadministración de fibrinógeno y del 3F que contiene rhFII también es eficaz. Además, el tratamiento eficaz puede consistir básicamente en la administración de rhFII o 3F con o sin complementación de fibrinógeno.

EJEMPLOS Ejemplo 1 MÉTODOS Preparación y mediciones quirúrgicas: El estudio se llevó a cabo mediante el uso de cincuenta cerdos saludables. La medicación previa de los animales se realizó con azaperona (4mg kg"1 IM, agente- neuroléptico, Stresnil®, Janssen, Vienna, Austria) y atropina (O.lmg kg"1 IM) una hora antes del comienzo del estudio. La anestesia se indujo y mantuvo con propofol (1 a 2mg kg"1 IV) . Para la inducción de analgesia, se inyectó piritramida (30mg, opioide con una vida media de aproximadamente 4 a 8 horas, Dipidolor®, Janssen, Vienna, Austria) . Para la relajación de los músculos se inyectó 0.2mg kg"1 h"1 de pancuronio después de la anestesia endotraqueal. Después de la incubación, se insertó un catéter 7.5 French en la arteria femoral para la extracción de muestras de sangre y la medición de la presión sanguínea continua. Se insertaron dos catéteres 7.5 French en ambas venas femorales para la extracción de sangre, la administración de coloides y cristaloides y la administración del fármaco de estudio. Se colocó un catéter Swan-Ganz a través de la V. jugularis derecha.

Protocolo experimental: La necesidad basal del reemplazo de líquidos (4 mi kg"1) se satisfizo durante la totalidad del curso del ensayo mediante el uso de cristaloides (solución de lactato de Ringer) . Para inducir una coagulopatía dilucional estandarizada, se llevó a cabo la hemodilución normovolémica con HES 130/0.4 al 6% (Voluven®, Fresenius Co., Bad Homburg, Alemania): la sangre se extrajo de los animales a través de los catéteres grandes y se reemplazó con coloide en una proporción 1:1. Después de la finalización de la hemodilución la sangre extraída se procesó en un sistema de autotransfusión Cell Saver (Cats®, Fresenius, Vienna, Austria) , se concentró y se volvió a transfundir para evitar la anemia hemodinámicamente relevante. La hemodilución normovolémica se completó cuando la coagulopatía resultante alcanzó un nivel crítico como se determinó mediante ROTEM® y el uso del reactivo EXTEM: tiempo de coagulación (CT) >100 segundos y una firmeza de coágulo máxima (MCF) <40 mm. Los animales se asignaron aleatoriamente a 200 mg kg"1 de concentrado de fibrinógeno (Haemocomplettan HS®, CSL-Behring) (Fibrinogen Group) , a 200 mg kg"1 de concentrado de fibrinógeno y 35 IU kg"1 de PCC (Beriplex®, CSL Behring, Marburg, Alemania) (grupo de PCC) , a 200 mg kg"1 de concentrado de fibrinógeno y a 4 mg kg"1 de concentrado de rhFII (AstraZeneca R&D Mólndal, Suecia) (grupo de FII) , a 200 mg kg"1 de concentrado de fibrinógeno y al concentrado de una combinación de tres factores que incluyó 4 mg kg"1 de rhFII, 0.32 mg kg"1 de rhFX y 0.006 mg kg"1 de rhFVIIa (AstraZeneca R&D Mólndal, Suecia) (grupo de 3F) o una cantidad igual de solución salina normal (grupo de solución salina) . La dosis de concentrado de fibrinógeno y PCC se basó en los datos publicados anteriormente de experimentos animales. Sperry et al. J Trauma 2008, 64:9-14; Innerhofer P et al.. Anesth Analg 2002, 95:858-65.

Se indujo una lesión hepática estandarizada (12 cm de largo y 3 cm de profundidad) mediante el uso de una plantilla inmediatamente después de la administración de los factores de coagulación o la combinación de factores de coagulación descrita anteriormente. El corte se realizó sobre el lóbulo derecho del hígado. El estudio fue ciego para el personal que realizó los exámenes de tejidos, los ensayos de coagulación, la documentación de hemodinámica, la incisión de hígado o para aquellos que participaron en la recolección y medición de la pérdida de sangre ocurrida.

Después de la incisión hepática, se evaluó la pérdida de sangre posterior ya que fue la duración de tiempo hasta que los animales murieron debido al choque hemorrágico. Además de las mediciones tromboelastométricas , se llevaron a cabo ensayos de coagulación estándar (PT, aPTT, fibrinógeno, conteo de plaquetas) , se midieron los parámetros para la coagulación activada (dímeros D y TAT) y se llevó a cabo un ensayo de generación de trombina para la estimación del potencial para formar la trombina (trombograma calibrado automatizado, CAT) .

Dos horas después del traumatismo hepático los animales sobrevivientes se sacrificaron con infusión de potasio. Se extrajo el corazón, los pulmones, las partes de los intestinos y los ríñones y se evaluó la ocurrencia de trombosis microvascular .

Muestreo de sangre y métodos analíticos : El muestreo de sangre arterial se realizó en el punto de referencia (BL) después de la extracción de sangre (BW) , de la hemodilución (HD) , de la terapia con los fármacos de estudio (TH) y 120 minutos después de la incisión hepática o inmediatamente antes de la muerte anticipada (END) . Todas las muestras de sangre se extrajeron de la arteria femoral y se descartaron los primeros 5 mi de sangre. Las muestras de sangre para ROTEM® y los análisis de coagulación se recolectaron en tubos de 3mL que contenían 0.3mL (0.106mol/ L) de citrato de sodio (pH 5.5) tamponado (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania). Las muestras de sangre para el conteo de células sanguíneas se recolectaron en tubos de 2.7mL que contenían 1.6mg de EDTA /mL (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) . Se determinó el tiempo de protrombina (PT) , el tiempo de tromboplastina parcial (PTT-LA1) , la concentración de fibrinógeno, el complejo antitrombina (AT) y trombina-antitrombina (TAT) mediante métodos de laboratorio estándar con el uso de pruebas adecuadas de Dade Behring, Marburg, Alemania y el coagulómetro Amelung, Baxter, Reino Unido. Para las mediciones de dímeros D se utilizó el análisis D-dimer 0020008500® (Instrumentation Laboratory Company, Lexington, E.U.A.). El conteo de células sanguíneas se realizó mediante el uso del contador Sysmex Poch-100i® (Sysmex, Lake Zurich, IL, E.U.A.). Se utilizó tromboelastometría (ROTEM®, Pentapharm, Munich, Alemania) para la evaluación funcional del sistema de coagulación. Para la aceleración y una mejor estandarización, se utilizó el reactivo EXTEM. Luddington, Clin Lab Haematol 2005, 27:81-90.

El ensayo de trombograma calibrado automatizado (CAT) se realizó en placas de fondo redondo de 96 pocilios (Greiner raicrolon, en forma de U, unión alta, E.U.A.) . Las muestras de plasma citrado (80 µ?) y solución activadora (20 µ?) (reactivo PPP Cat# TS31.00, Thrombinoscope, Maastricht, Países Bajos) que contenían 1 pM de TF se mezclaron en los pocilios de muestra. Paralelamente a esto, se analizó un calibrador (Cat # TS20.00, Thrombinoscope) mediante la mezcla de 20 µ? de calibrador y 80 µ? de plasma de cerdo citrado normal acumulado en pocilios acoplados a los pocilios de muestra. A continuación la placa se movió a un fluorómetro (Ascent reader, Thermolabsystems OY, Helsinki, Finlandia) y se administraron 20 µ? de una solución de FluCa (Cat # TS50.00, Thrombinoscope) que contenía sustrato fluorogénico y CaCl2 con el instrumento. La señal fluorogénica se midió a Aex 390 nm, Aem 460 nm durante 60 minutos. La placa de 96 pocilios se mantuvo en un bloque de calentamiento a 37°c durante la adición de los reactivos. Se calculó el comienzo de la actividad de trombina (tiempo de retraso) , el tiempo para la actividad de trombina pico (ttPeak) , la actividad de trombina pico (Peak) y la actividad de trombina total, es decir, el potencial de trombina endógena (ETP, por sus siglas en inglés) mediante el uso del software Thrombinoscope (versión 3.0.0.29) de Thrombinoscope BV (Maastricht, los Países Bajos) .

Análisis estadísticos : Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante el uso del paquete estadístico SPSS 15.0 (SPSS, Chicago, IL) . Se utilizó la prueba de Shapiro- ilk para probar la normalidad. Aquellas variables que no se distribuyeron normalmente se transformaron logarítmicamente para permitir el análisis paramétrico. Con la aplicación de un procedimiento jerárquico, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para detectar los efectos del grupo global y del tiempo (P<.05 se consideró significativo) . En el caso de diferencias significativas, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para detectar las diferencias entre los grupos. Se utilizó el procedimiento Bonferroni-Holm para la corrección de comparaciones múltiples. P<.005 se consideró significativo. En el caso de diferencias significativas se realizaron pruebas T pareadas dentro de pruebas T independientes entre los grupos. P<.001 se consideró significativo. Se analizó la supervivencia entre grupos mediante el uso de los métodos de Kaplan-Meier con comparación de orden logarítmico (Mantel Cox) de supervivencia cumulativa por grupo de tratamiento.

RESULTADOS Se examinaron 50 cerdos con un peso medio de 36.98 kg (± 4.23) y una edad entre cuatro y cinco meses. No se detectaron diferencias estadísticamente significativas en el punto de referencia entre los grupos con respecto a los parámetros hemodinámicas o los parámetros de coagulación, conteo de plaquetas o glóbulos rojos. Todos los resultados de las pruebas de coagulación se encontraron dentro del intervalo normal. Velik-Salchner et al. Thronib Res 2006, 117 : 597-602.

Tiempo de supervivencia: Los animales tratados con fibrinógeno combinado con rhFll (P=.029) o con PCC (P=.017) vivieron durante un tiempo significativamente mayor después de la lesión hepática con hemorragia descontrolada que los del grupo de control . Todos los grupos de animales tratados con al menos un factor sanguíneo presentaron tiempos de supervivencia en comparación con el grupo de control, mientras que el fibrinógeno solo y la combinación de fibrinógeno con 3F mostró un efecto similar sobre la supervivencia después de la lesión hepática en comparación con el grupo de control . Un animal murió debido a una complicación tromboembólica inmediatamente después de la administración de PCC.

Pérdida de sangre: Como se muestra en la figura 1, después de la lesión hepática con hemorragia descontrolada, la pérdida de sangre disminuyó de forma significativa en todos los grupos en comparación con el grupo de solución salin .

ROTEM" : El tiempo de coagulación (CT) disminuyó de forma significativa después de la administración de fibrinógeno combinado con PCC o con 3F en comparación con el tratamiento con solución salina o fibrinógeno solo. Como se muestra en la figura 2A, al final del período de observación (END) , el CT se acortó aún de forma significativa en los animales tratados con la combinación de fibrinógeno y 3F en comparación con la solución salina o el fibrinógeno solo. La combinación de fibrinógeno y PCC acortó de forma significativa el CT en comparación con la solución salina.

Como se muestra en la figura 2B, la firmeza de coágulo máxima (MCF) aumentó de forma significativa tras la administración del fibrinógeno combinado con 3F o rhFII en comparación con el tratamiento con solución salina sola. Después de la dilución, la MCF disminuyó de forma significativa en la misma cantidad en todos los grupos. Después de la administración de fibrinógeno, la MCF aumentó de forma significativa en comparación con los animales de control tratados con solución salina. Al final del período de observación, la MCF aumentó aún de forma significativa en los cerdos que recibieron la combinación de fibrinógeno y concentrado de 3F (grupo de 3F) o fibrinógeno y rhFII en comparación con el grupo de solución salina.

Generación de trombina (CAT): El tiempo de retraso y el tiempo para el pico no difirió dentro de los grupos. La administración de fibrinógeno combinado con PCC, rhFII o con 3F resultó en un valor de pico significativamente mayor que en los animales tratados con fibrinógeno solo. En comparación con el grupo de control, el valor del pico también aumentó de forma significativa después de la administración de fibrinógeno y rhFII así como fibrinógeno y 3F. Dos horas después de la lesión hepática, el valor del pico aumentó de forma significativa en los animales tratados con la combinación de fibrinógeno y PCC en comparación con los demás grupos . Los animales tratados con la combinación de fibrinógeno y rhFII así como fibrinógeno y 3F presentaron un ETP significativamente mayor que el de los animales tratados únicamente con fibrinógeno (#) , mientras que la combinación de fibrinógeno y rhFII también resultó en un ETP significativamente mayor en comparación con el grupo de control. Al final del período de observación, la combinación de fibrinógeno y PCC presentó un ETP significativamente mayor que el de los demás grupos .

CONCLUSIÓN Como se demostró anteriormente, la administración de PCC o rhFII en combinación con fibrinógeno, en comparación con la solución salina o el fibrinógeno solo, resultó en una disminución significativa en la pérdida de sangre después de la hemodilución normovolémica y la lesión hepática. La administración de PCC o rhFII en combinación con fibrinógeno también resultó en animales que vivieron durante un tiempo significativamente mayor después de la lesión hepática. El tiempo de coagulación se acortó de forma significativa con la administración de rFH en combinación con fibrinógeno en comparación con los controles y la firmeza de coágulo máxima también aumentó de forma significativa con el tratamiento de rhFII en combinación con fibrinógeno. Estos resultados demuestran que la administración de rhFII (en este caso, en combinación con fibrinógeno) es un tratamiento eficaz suficiente para restablecer la hemostasis normalizada, prevenir la pérdida de sangre y disminuir la mortalidad. Por consiguiente, el uso de rhFII en el tratamiento de trastornos de sangrado y pérdida de sangre es eficaz y puede evitar las complicaciones potencialmente serias de los eventos tromboembólicos que pueden acompañar la administración de una combinación de múltiples factores de coagulación.

Ejemplo 2 MÉTODOS Anestesia y mantenimiento de la homeostasis: Los cerdos se medicaron previamente con Dormicum (2 mg/kg) y Ketaminol (10 mg/kg) intramuscular. Después de aproximadamente 20 minutos se insertó un catéter de polietileno (Venflon 1.0 x 32 mm, Becton Dickinson, Helsingborg, Suecia) en una vena de la oreja para utilizarse para la administración de los anestésicos y la solución de Ringer. Los cerdos se anestesiaron inicialmente con pentobarbital sodio (Apoteksbolaget , Umeá, Suecia), administrado de forma intravenosa como una dosis en bolo (15 mg/kg) para que la entubación fuera posible. Durante el experimento la anestesia se mantuvo con una infusión posterior de pentobarbital (10 a 15 mg/kg/h) complementada con isoflurano al 1.8% (Isoba® vet, Schering-Plough, Dinamarca) durante la preparación. Los cerdos se ventilaron (Servo Ventilator 900C, Siemens Elema, Solna, Suecia) con aire ambiente proporcionado con un 10% de 02. La frecuencia respiratoria se mantuvo constante a 15 ciclos/minuto y el C02 al final de la espiración se mantuvo a aproximadamente 5.5 kPa mediante la regulación del volumen de espiración. La solución de Ringer (Fresenius Kabi AS, Halden, Noruega) 1.5 mL/kg/h se administró de forma continua para reemplazar la pérdida de líquidos. La temperatura corporal se mantuvo a 36 a 39°C a lo largo del experimento con el abrigo de los animales y mediante calentamiento externo. Al final del experimento se administró a los animales una dosis letal de pentobarbital (>150 mg/kg) .

Preparaciones quirúrgicas: Se insertó un catéter de polietileno (Intramedic PE-200 Clay Adams, Parsippany, Nueva Jersey, E.U.A.) en la arteria femoral derecha para una medición de presión arterial continua y para la recolección de muestras de sangre. Los catéteres de polietileno (Intramedic PE-200 Clay Adams, Parsippany, Nueva Jersey, E.U.A.) se insertaron en ambas venas femorales para la extracción de sangre y la administración de glóbulos rojos procesados (PRC, por sus siglas en inglés) , almidón de hidroxietilo (HES) y el fármaco/vehículo de estudio. Se colocó un cuatro catéter de polietileno en la vena yugular derecha (Intraraedic PE-200 Clay Adaras, Parsippany, Nueva Jersey, E.U.A.) para monitorear la presión venosa central (CVP, por sus siglas en inglés) . La temperatura corporal se midió mediante sonda rectal. Finalmente, se realizó una laparotomía media, de aproximadamente 35 era para descubrir el hígado. Hasta la modalidad de la incisión hepática, la herida se cerró con fórceps hemostáticos y se protegió del secado con hisopos de algodón mojados con solución salina.

Protocolo experimental : Después de las muestras de sangre del punto de referencia (BSO) los animales experimentaron un intercambio isovolémico y normotérmico de aproximadamente un 60% de su volumen de sangre total (70 mL/kg) con HES 60 mg/mL (Voluven", Fresenius Kabi AB, Uppsala, Suecia) . Se extrajo cuanta sangre fue posible con jeringas de 50 mL preparadas con 5 mL de citrato de sodio 0.109 M hasta que la presión sanguínea arterial media (MAP) alcanzó un nivel crítico de 30 ramHg a 35 mmHg. A continuación los animales se dejaron descansar hasta que la MAP aumentó a un nivel estable (aproximadamente 10 minutos) .

La extracción de sangre después continuó hasta que la MAP disminuyó a un mínimo de 30 mmHg y el HES se administró inmediatamente de forma intravenosa (lmL HES:1 mL sangre) por medio de un esfingomanómetro . Normalmente es difícil tomar el volumen calculado de la sangre necesaria para establecer la coagulopatía durante la primera ronda de intercambio de sangre-HES. Si el nivel de coagulopatía chequeado con el análisis de ROTEM es demasiado bajo se extrae más sangre y se reemplaza con HES (1:1 a pesar de que la sangre se diluya después de la primera ronda de intercambio) . Durante la segunda ronda y las rondas siguientes, la presión arterial media no disminuirá por debajo de los 60 mmHg y no existe la necesidad de ningún intervalo de recuperación. Para maximizar el volumen de sangre extraída en la primera ronda de intercambio, a pesar de que la MAP se encuentre en disminución, puede administrarse clorhidrato de fenilefrina (Apoteket AB, Mólndal, Suecia) de forma intravenosa para extraer la sangre de los vasos periféricos. El clorhidrato de fenilefrina (aproximadamente 2 mL de 0.1 mg/mL) se proporciona después de un intervalo de recuperación de 10 minutos cuando la MAP disminuyó a aproximadamente 40 mmHg. Durante el aumento breve e inmediato en la MAP algunas jeringas adicionales pueden llenarse con sangre.

La sangre derramada se procesó mediante el uso de un programa de lavado de calidad en un dispositivo de autotransfusión Cell Saver (CATS , ß Fresenius Kabi AB, Uppsala, Suecia) y después de la recuperación del volumen con HES los animales recibieron un volumen adecuado de glóbulos rojos procesados para mantener el valor de hemoglobina por encima de 50 g/L y de ese modo evitar la muerte prematura por anemia seria. El análisis de ROTEM se realizó después de la hemodilucion para determinar el grado de coagulopatía . Los criterios para la coagulopatía fueron los siguientes: CTEx-TEM =100 s y MCF =40 mm. Después de la coagulopatía establecida se recolectó una muestra de sangre (BS2) . A continuación se administró el fármaco de estudio. Los fármacos de estudio correspondieron a los siguientes: (1) Control salino; (2) FII recombinante humano (rhFII) a 8 mg/kg; (3) combinación de tres factores que corresponde a rhFII + rh FX + rhFVIIa a 4.0, 0.32 y 0.006 mg/kg, respectivamente (dosis baja); (4) combinación de tres factores que corresponde a rhFII + rh FX + rhFVIIa a 8.0, 0.64 y 0.012 mg/kg, respectivamente (dosis alta); (5) FEIBA VH* (complejo coagulante antiinhibidor (APCC) ; Baxter) a 40U/kg,- (6) NovoSeven8 (factor de coagulación Vlla; Novo Nordisk) a 200 + 100 µ?/kg; o Haemocomplettan" HS (concentrado de fibrinógeno; CSL-Behring) . Diez (10) minutos después de que se completó la infusión se recolectó otra muestra de sangre (BS3). Se realizó una incisión estandarizada mediante la colocación de una plantilla casera sobre el lóbulo derecho del hígado y se tiró de un bisturí quirúrgico (no. 11) a través de una hendidura en la plantilla (longitud 8 cm, profundidad 3cm) para inducir el sangrado descontrolado. El tiempo de observación máximo después de la incisión del hígado fue de 120 minutos. Justo antes de la muerte se recolectó una última muestra de sangre (BS4) . La sangre se succionó hacia fuera del abdomen y se determinó la pérdida de sangre total así como el tiempo de supervivencia. La muerte se definió como la actividad eléctrica sin pulso, MAP por debajo de 15 mmHg o dióxido de carbono al final de la espiración por debajo de 1.5 JcPa.

Muestreo de sangre: La sangre arterial se recolectó en tubos de citrato (S-Monovette* 9 NC/ 2.9 mL, Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) para las mediciones de ROTEM y el plasma se guardó para la generación de trombina y los análisis de complejo trombina-antitrombina . La sangre para determinar las concentraciones en plasma de factor II recombinante humano (rhFII) , Factor X recombinante humano (rhFX) , FVIla, fibrinógeno humano y conteo celular, se recolectó en tubos de EDTA de potasio (S-Monovette* 2.6 mL K3E , Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) .

Análisis de sangre entera ROTEM: A lo largo del experimento se obtuvieron muestras de sangre en serie para evaluar la competencia del sistema hemostático con respecto al desarrollo de la elasticidad del coágulo mediante el uso de pruebas de coagulación estándar (EXTEM, * INTEM, F Pentapharm GmbH, Munich, Alemania) en tromboelastometía rotacional (ROTEM*, Pentapharm GmbH, Munich, Alemania) . Se utilizaron reactivos disponibles comercialmente excepto por la solución de cloruro de calcio que se preparó dentro de la empresa con una concentración similar a la de la solución disponible comercialmente. Se siguieron las instrucciones de procedimiento del fabricante. En este estudio se evaluó el tiempo de coagulación (CT) , el tiempo de formación de coágulo ( CFT) y la firmeza de coágulo máxima (MCF) .

Gases de la sangre y electrolitos : Durante el experimento se analizaron los gases de la sangre arterial, los parámetros ácidos-básicos y los electrolitos (ABL 700, Radiometer Medical ApS, Brónshój , Dinamarca) . Los análisis se realizaron de conformidad con las instrucciones del fabricante. Todos los animales presentaron un estado de gas sanguíneo bueno a lo largo de los experimentos.

Conteo de células: Para monitorear las posibles variaciones en las concentraciones de las células sanguíneas, las muestras de sangre arterial se analizaron en un instrumento contador de células automatizado (KX-21N, Sysmex, Kobe, Japón) en todas las ocasiones de muestreo de sangre. Los análisis se realizaron de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Análisis de plasma Complejo trombina-antitrombina (TAT) : Los niveles en plasma de TAT se midieron mediante el uso de un inmunoensayo enzimático de fase doble (Enzygnost* TAT micro, Dade Behring GmbH, Marburg, Alemania) . Se siguieron las instrucciones del fabricante. Si se obtenían concentraciones >90 ]iq/mL, las muestras se diluían 10 veces en tampón diluyente y se volvían a analizar. Si se observaban coágulos en las muestras de plasma, no se analizaban para detectar el TAT.

CAT: El ensayo CAT se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1.

RESULTADOS Análisis de datos: Se recolectaron los datos de presión arterial media, presión venosa central y frecuencia cardiaca mediante del uso del software de la empresa (PharmLab V6.0, AstraZeneca R&D Mólndal) . Los resultados se presentan como estadísticas descriptivas con valores medios + error estándar de la media (SEM, por sus siglas en inglés) excepto por el tiempo de coagulación de la sangre y los resultados de concentración de TAT. Estos resultados se presentan como valores medios debido a que los valores atípicos en estos datos afectaron el valor medio de una forma engañosa. La última muestra de sangre en cada experimento, llamada "fin del experimento" se tomó antes de la muerte que ocurre en intervalos de tiempo experimentales diferentes para la mayoría de los animales .

Pérdida de sangre: La figura 3 muestra la pérdida por kg de peso corporal en mi después de la administración del vehículo, las sustancias de prueba y de control y la incisión hepática. Los datos se muestran como valores individuales con la media representada por una barra horizontal.

Tiempo de supervivencia: La figura 4 muestra las curvas de supervivencia para los diferentes grupos de tratamiento. En el grupo vehículo un 25% de los animales sobrevivió a lo largo de la totalidad del experimento. La supervivencia para el tiempo de observación de 2 horas en los grupos de tratamiento para la dosis más baja de la combinación de tres factores fue de un 67%, para la dosis más alta de la combinación de tres factores NovoSeven® y Haemocomplettan® fue de un 80%, para rhFII y FEIBA® fue de un 100%, respectivamente.

ROTEM: Los resultados de la activación de EXTEM, es decir, la activación mediante TF de las muestras de sangre entera extraídas en el punto de referencia, después de la dilución, después de la administración del fármaco y al final del experimento se muestran las figuras 5A y 4B. En el punto de referencia, CT y MCF son similares para todos los grupos de tratamiento. Después de la dilución, el CT aumenta dos veces el nivel del punto de referencia mientras que la MCF disminuye aproximadamente la mitad del nivel en el punto de referencia. Después de la dilución, ambas variables muestran una variabilidad mayor entre los grupos en comparación con el punto de referencia. Después de la administración de tratamientos, el CT para todos los tratamientos incluidos se desvió de forma similar hacia los valores del punto de referencia sin normalización completa. El efecto sobre la MCF en los diferentes tratamientos fue pequeño excepto por Haemocomplettan0 (fibrinógeno) que mostró una MCF casi normalizada después de la administración del fármaco.

CAT: Los resultados del análisis de trombograma calibrado automatizado de las muestras de plasma extraídas en el punto de referencia, después de la dilución, después de la administración del fármaco y al final del experimento se muestran en las figuras 6A-6D.

Después de la dilución, el tiempo de retraso (LT, por sus siglas en inglés) y el tiempo para el pico (ttPeak) disminuyó mientras que el pico y el potencial de trombina endógena (ETP) aumentaron en comparación con los valores del punto de referencia. Después que las sustancias se administraron el LT aumentó aproximadamente un 50% para rhFII y se notó un leve aumento para Haemocomplettan5 mientras que las otras sustancias resultaron en leves disminuciones del LT. Más adelante, el ttPeak mostró el mismo patrón que el LT. Los valores del pico aumentaron para el rhFII en un 100%, para la combinación de tres factores (dosis baja) en un 30%, para la combinación de tres factores (dosis alta) en un 150% y para FEIBA* en un 150% en comparación con el valor después de la dilución. Los vehículos NovoSeven5 y Haemocomplettan<B no cambiaron el pico en comparación con el valor inmediatamente después de la dilución. Finalmente, los valores de ETP aumentaron en casi un 200% para el rhFII, la combinación de tres factores (dosis alta) y FEIBA® en comparación con los valores después de la etapa de dilución. El ETP para la combinación de tres factores de dosis baja aumentó en aproximadamente un 30% en comparación con el ETP después de la dilución.

Al final del experimento, el LT correspondió al mismo período de tiempo como fue el caso después de la administración de la dosis, con la excepción de que el rhFII había disminuido al mismo nivel que después de la etapa de dilución. Los valores del ttPeak fueron como para el LT. La situación para el pico mostró que todos los grupos de sustancias excepto FEIBA® habían vuelto al nivel encontrado después de la finalización de la dilución. FEIBA* mostró incluso un pico comparable al nivel encontrado inmediatamente después de la administración de la sustancia. Todos los valores de ETP al final del experimento fueron similares al patrón de pico.

TAT: Como se muestra en la figura 7, los niveles de TAT fueron similares en todos los grupos de tratamiento después de la etapa de dilución. Cuando los fármacos habían sido administrados, se observó un aumento en los niveles de TAT de 2 a 3 veces para todos los tratamientos que contenían protrombina, es decir, las combinaciones de tres factores, rhFII y FEIBA . Al final del experimento, el patrón obtenido después de la administración del fármaco aún fue coherente, con un aumento aún mayor en los niveles de TAT para los tratamientos que contenían protrombina excepto para el rhFII solo que mostró una disminución en el nivel de TAT en comparación con el nivel después de la administración. Haemocomplettan® y NovoSeven5 también presentaron un aumento en los niveles de TAT al final del experimento en comparación con el nivel después de la dilución y después de la administración en un factor de 2 a 3.

CONCLUSIÓN Como se demuestra anteriormente, la administración de rhFII solo, en comparación con la solución salina u otros tratamientos, resultó en una disminución significativa de la pérdida de sangre después de la hemodilución normovolémica y lesión hepática. Los análisis de trombograma revelaron un aumento del tiempo de espera de aproximadamente un 50% para el rhFII solo y un aumento del valor del pico para rhFII solo de un 100% y un aumento en el valor de ETP para el rhFII solo de casi un 200%. Estos resultados también demuestran que la administración de rhFII solo es un tratamiento eficaz suficiente para restablecer la hemostasis normalizada, evitar la pérdida de sangre y aumentar el tiempo de supervivencia.

El uso de rhFII solo o el uso de la combinación de tres factores no se probó anteriormente en un modelo animal complejo de sangrado descontrolado debido a la coagulopatia dilucional. Por tanto, la presente invención proporciona for primera vez, la eficacia del rhFII solo o la eficacia de 3F para el tratamiento de trastornos de sangrado y pérdida de sangre. Como se describe en el ejemplo 2 anterior, los niveles de TAT y los datos de la generación de trombina al final del experimento disminuyeron a los niveles de preadministración para todas las muestras. Para la administración de los factores de coagulación, como el rhFII solo, esto puede ser ventajoso ya que permite una mejor modulación de un régimen de tratamiento durante el curso de un episodio de sangrado crítico o período de pérdida de sangre. Puede que un tiempo de duración más prolongado no permita los ajustes necesarios en los regímenes de tratamiento. Además, la administración de rhFII solo, como se discute anteriormente, puede evitar, durante el tratamiento, las complicaciones potencialmente serias de eventos tromboembólicos que a veces acompañan la administración de una combinación de factores de coagulación múltiples.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para normalizar la hemostasis alterada en un mamífero que lo necesita, caracterizado porque comprende administrar un tratamiento de factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (1) FII, (2) una combinación de FII, FVIIa y FX, (3) fibrinógeno y una combinación de FII, FVIIa y FX y (4) fibrinógeno y FII.

2. Un método para aumentar la firmeza de coágulo máxima (MCF) en un mamífero que presenta una hemostasis alterada, caracterizado porque comprende administrar un tratamiento de factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (1) FII, (2) una combinación de FII, FVIIa y FX, (3) fibrinógeno y una combinación de FII, FVIIa y F y (4) fibrinógeno y FII.

3. Un método para reducir el tiempo de coagulación (CT) en un mamífero que presenta una hemostasis alterada, caracterizado porque comprende administrar un tratamiento de factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (1) FII, (2) una combinación de FII, FVIIa y FX, (3) fibrinógeno y una combinación de FII, FVIIa y FX y (4) fibrinógeno y FII.

4. Un método para mejorar la generación de trombina en un mamífero que presenta una hemostasis alterada, caracterizado porque comprende administrar un tratamiento de factor de coagulación que se selecciona del grupo que consiste en (1) FII, (2) una combinación de FII, FVIIa y FX, (3) fibrinógeno y una combinación de FII, FVIIa y FX y (4) fibrinógeno y FII.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la hemostasis alterada se asocia con un trastorno de sangrado, hemorragia, pérdida de sangre masiva o evento de sangrado traumático.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la pérdida de sangre masiva se asocia con la coagulopatía .

7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el trastorno de sangrado es hemofilia.

8. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la hemorragia o evento de sangrado traumático se asocia con sangrado periquirúrgico, sangrado posquirúrgico o hemorragia posparto.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el FII es FII recombinante humano (rhFIl) .

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el FVIIa es FVIIa recombinante humano (rhVIIa) .

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el FX es FX recombinante humano (rhFX) .

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el mamífero que necesita el tratamiento presenta un nivel de concentración de fibrinógeno en sangre menor de aproximadamente 2 g/L, menor de aproximadamente 1 g/L o menor de aproximadamente 0.5 g/L.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el mamífero que necesita el tratamiento presenta un nivel de concentración de fibrinógeno en sangre menor de aproximadamente 200 mg/L, menor de aproximadamente 150 mg/L, menor de aproximadamente 100 mg/L o menor de aproximadamente 50 mg/dL g/L.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la hemostasis alterada se asocia con una pérdida de sangre mayor de aproximadamente un 30%, mayor de aproximadamente un 40%, mayor de aproximadamente un 50%, mayor de aproximadamente un 60%, mayor de aproximadamente un 70%, mayor de aproximadamente un 80% o mayor de aproximadamente un 85% del volumen de sangre total estimado de un mamífero.

15. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la coagulopatía es coagulopatía dilucional que resulta del restablecimiento de normovolemia o de la estabilización hemodinámica .

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el fibrinógeno se administra en una cantidad suficiente para aumentar la concentración de fibrinógeno en sangre por encima de aproximadamente 0.5 g/L, por encima de aproximadamente 1 g/L, por encima de aproximadamente 1.5 g/L, o por encima de aproximadamente 2 mg/L.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el fibrinógeno se administra en una dosis de 12.5 a 200 mg/kg.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el FII es rhFII y se administra en una dosis de 1 a 10 mg/kg.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el tratamiento de factor de coagulación se administra en una dosis que reduce el tiempo de coagulación en aproximadamente 40 segundos a aproximadamente 60 segundos.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el tratamiento de factor de coagulación se administra en una dosis que aumenta la firmeza de coágulo máxima de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 30 mm.

21. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque la administración del tratamiento de factor de coagulación resulta en el mantenimiento de la coagulación normalizada durante al menos dos horas después de la administración.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el tratamiento de factor de coagulación es (1) FII o (2) fibrinógeno y FII; y donde el tratamiento de factor de coagulación se coadministra con FVIIa.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el tratamiento de factor de coagulación es (1) la combinación de FII, FVIIa y FX, o (2) la combinación de FII, FVIIa y FX con fibrinógeno; y donde FII y FVIIa se administran en una proporción de al menos 1:90.

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el tratamiento de factor de coagulación es (1) FII o (2) fibrinógeno y FII; y donde la administración del tratamiento de factor de coagulación se realiza sin coadministración de ningún otro factor de coagulación entre los factores de coagulación FV a FXIII.