MX2010013282A - Composicion, metodo y kit para la preparacion de plasmina. - Google Patents
Composicion, metodo y kit para la preparacion de plasmina.Info
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Abstract
Se provee una estreptoquinasa inmovilizada en una superficie, en particular una estreptoquinasa resistente a plasmina inmovilizada, y composiciones, métodos y kits de utilización de la misma para preparar plasmina.
Description
MPOSICIÓN. MÉTODO Y KIT PARA LA PREPARACION DE PLA
REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONAD
Esta solicitud es una fase nacional de la Solicitud Inter PCT/US09/046152, presentada el 3 de junio de 2009, que idad para la Solicitud Provisional de E.U.A. No. 61/058,677, prese junio de 2008, cada una de las cuales se incorpora aquí para re u totalidad.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe composiciones y métod arar plasmina, en particular composiciones y métodos para ina usando estreptoquinasa inmovilizada.
inógeno intrínseco, también conocido como uroquinasa, es una ucida por el riñon y se puede aislar de la orina. También se rar a partir de un número de fuentes de cultivo de tejido. Activ inógeno extrínseco, también conocido como activador de plasmi ular y como activador de plasminógeno de tejido (t-PA), se pued uchos homogenados de tejido (notablemente útero humano), l ar vascular y de algunos cultivos celulares. Además, de es eles de activador de plasminógeno, existe también un p riano, estreptoquinasa (estreptoquinasa), preparada a pa tococci.
Con el uso intensificado de catéteres arteriales y venoso as, la plasmina activa suministrada localmente ofrece una opo éutica atractiva en terapia trombolítica o al abrir catéteres tapado úmero de razones para esto: 1 ) ser una serina proteasa a ina es un agente de disolución de coágulo directo en contra
edores inmediatos del sitio de trombo será rápidamente neut ante la circulación de ot2-antiplasmina.
Existen varios desafíos técnicos asociados con purifica ina, especialmente con su uso y suministro terapéutico. La plas erina proteasa activa que es propensa a autodigestión e inactiva siológico. De manera desafortunada, la degradación de plasmina nte en el intervalo de pH requerido para la manifestación de su e coágulo.
Procedimientos actuales para activación comerc inógeno derivado de plasma a plasmina emplean estrepto le en una reacción llevada a cabo en la fase líquida. El prod ina de esta reacción de activación no es completamente esta a auto-proteólisis hasta que la etapa de activación ha procedido ado de conversión de plasminógeno a plasmina. Durante esta act treptoquinasa se divide mediante plasmina, necesitando la remo
uede usar para administración (por ejemplo, parenteralmente) c acéutico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la presente invención provee una com comprende una estreptoquinasa inmovilizada en una ma ptoquinasa es un muíante de estreptoquinasa caracterizado com activar plasminógeno a plasmina, aún resistente a degrada mina en relación a su estreptoquinasa tipo silvestre correspondien
En otro aspecto, la presente invención provee un artí cación que comprende una matriz que tiene una estrept vilizada en esta, en donde la estreptoquinasa es un mut ptoquinasa caracterizado como capaz de activar plasminó mina, aún resistente a degradación de plasmina en relació
arar plasmina. El kit comprende:
a) una estreptoquinasa inmovilizada en una matriz, en d ptoquinasa es un mutante de estreptoquinasa caracterizado com ctivar plasminógeno a plasmina, aún resistente a degrada ina en relación con su estreptoquinasa tipo silvestre correspondi b) una matriz de unión a plasmina que tiene una uesta en esta que tiene afinidad para la plasmina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra una secuencia de nucleótido (es de O: 3) que comprende un cuadro de lectura abierta (como se re as letras del caso superior) que codifica un polipéptido de estrepto nte doble. El cuadro de lectura abierta se muestra flanqueado itios de enzima de restricción (como se representa por las letras
yado doble.
La figura 3 muestra la secuencia de aminoácido (SEQ ID roducto de polipéptido de un vector de expresión pET32 (pET gen, Madison, Wl) que comprende el cuadro de lectura abierta (c senta por las letras del caso superior) mostrado en SEQ ID NO ciones de lisina (K) a arginina (N) en el polipéptido de estrepto n subrayado sencillo. El residuo de aminoácido de isoleu spondiente al N-término de la secuencia de estreptoquinas yado doble.
La figura 4 muestra la secuencia de aminoácido (SEQ ID roducto de polipéptido de un vector de expresión pET41 (pET gen, Madison, Wl) que comprende el cuadro de lectura abierta ( senta por las letras de caso superior) mostrado en SEQ ID NO ciones de lisina (K) a arginina (N) en el polipéptido de estrepto n subrayado sencillo. El residuo de aminoácido de isoleu
o se cataliza por estreptoquinasa recombinante. Tiempo = O hora ( ras (carril 2); 4 horas (carril 3); 6 horas (carril 4); y 18 horas ( iles 6, 7 y 8 corresponden a control de estreptoquinasa recom rol plasminógeno recombinante, y marcador de P (SeeBlue® ect¡vamente.
La figura 7 es un Western blot del experimento de c ? mostrado en la figura 6 usando anticuerpos anti-estrepto lonal. Tiempo = O hora (carril 1); 2 horas (carril 2); 4 horas (ca s (carril 4); y 18 horas (carril 5). Carriles 6, 7 y 8 corresponden streptoquinasa recombinante, control de plasminógeno recombi ador de PM (SeeBlue® Plus 2), respectivamente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION
De acuerdo con la presente invención, el método de pur
inógeno a plasmina usando estreptoquinasa inmovilizada, en d ptoquinasa es un mutante de estreptoquinasa caracterizado com ctivar plasminógeno a plasmina, aún resistente a degrada ina en relación con su estreptoquinasa tipo silvestre correspond b; capturar la plasmina activa en una matriz que captura plas , por ejemplo, benzamidina-SEPHAROSE. Opcionalmente, el iás comprende la elución de la plasmina unida con regulador d pH; y, además opcionalmente, formulación de plasmina final en a a de pH 3.7.
1- Estreptoquinasa
Estreptoquinasa de origen natural así como recombin mplan por la presente invención. Sin ser unido a una teoría partí que el mecanismo de activación de estreptoquinasa invol ación de un complejo estequiométrico con plasminógeno.
ucida por técnicas de ADN recombinante, es decir, producida a las transformadas por un constructo de ADN exógeno que co eptoquinasa deseada, que puede ser estreptoquinasa de tipo si uíante resistente a plasmina.
Estreptoquinasas "sintéticas" son aquellas prepara sis química.
Estreptoquinasa de origen natural se produce po ptococci y ciertas bacterias que contienen material genético a ado de Streptococci de grupos Lancefield A, C o G. Por eptoquinasa se puede preparar a partir de cultivos de la cepa S. e A.
Métodos numerosos de purificación de estreptoquinas rito que incluyen, por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 2, 2,781 , 2,677,642, 2,677,643, 2,691 ,620, 2,784,145, 3,226,304, 3, 9,472, 3,444,045, 3,980,772, 4,381 , 346, RE32271 , y 5,334,384
entación. Por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,334,384, des edimiento para la separación de estreptoquinasa a partir de prot aminación en una mezcla que contiene estreptoquinasa, que co r la mezcla con un agente de reducción para reducir puentes de s proteínas de contaminación a grupos tiol libres, poner en co c\a con un reactivo capaz de reaccionar con un grupo tiol libre y iz que contiene tiol, y a partir de entonces separar las prot aminación modificadas químicamente resultantes a partir de la proveer estreptoquinasa en una forma sustancialmente libre de p ontaminación.
El gen que codifica para estreptoquinasa se ha aislado su fuente natural (especies Streptococcus) y se clona e organismos heterólogos tal como levadura (Hagenson et al., ob. Technol. 11 :650 (1989)), bacterias viz., E. coli (Malke et al., Pr . Sci. 81 :3557 (1984)), especies alternas de Streptococcus (Mal
El cuadro 1 muestra la secuencia de aminoác ptoquinasa codificada por el gen de estreptoquinasa a partir de tococcus equisimilis H46A como se describe por alke et al 7-362 (1985) (Véase también GenBank No. de acceso 110618 corpora aquí para referencia.
CUADRO 1
Secuencia de aminoácido para estreptoquinasa de acuerdo c
GENBANK No. de acceso 1106184A
Secuencia de aminoácido7
(SEQ IP NO.1)
MKNYLSFG F ALLFALTFGT VNSVQAI GP EWLLDRPSVN NSQLWSVAG TVEGTNQ
LKFFEIDLTS RPAHGGKTEQ GLSPJSKPFA TDSGAMSHKL EKADLLKAIQ EQLIANV
DDYFEVIDFA SDATITDRNG KVYFADKDGS VTLPTQPVQE FLLSGHVRVR PYKEKPI
AKSVDVEYTV QFTPLNPDDD FRPGL DTKL LKTLAIGDTI TSQELLAQAQ SILNKNH
TIYERDSSIV THDNDIFRTI LP DQEFTYR VKNREQAYRI NKKSGLNEEI NNTDLIS
YVLKKGEKPY DPFDRSHLKL FTIKYVDVDT NELLKSEQLL TASERNLDFR DLYDPRD
LLYNNLDAFG IMDYTLTGKV EDNHDDTNRI ITVYMGKRPE GENASYHLAY DKDRYTE
EVYSYLRYTG TPIPDNPNDK
†Los 26 aminoácidos correspondientes a la secuencia
ificados genéticamente que contienen dominios de unión a fib gle" derivados de plasminógeno, y métodos para obtener los iante técnicas de ADN recombinante, se han descrito (EU 0397 36
En algunas modalidades, la estreptoquinasa a ser inm streptoquinasa recombinante (por ejemplo, tipo silvestre recomb nte resistente a plasmina) preparada mediante la expresión mbinante ya sea in vivo o in vitro. Tecnología recombinante es ru conocida en la técnica. Marcadores de afinidad de aminoácido se ducir por reacción de cadena de polimerasa. Expresión se puede vo usando bacterias (por ejemplo, E. coli), eucariotas inferio ipio, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Pichia cariotas superiores (por ejemplo, células de insecto infectadas con las de mamífero de células de insecto), o in vitro (lisados de ctos de germen de trigo, lisados de reticulocito). La estreptoqui e purificar mediante cromatografía de afinidad usando
ptoquinasa de interés, opcionalmente, una secuencia que cod ador de afinidad de polipéptido, y una secuencia de señal de term onalmente, el vector también puede comprender una secuen ica para una molécula adaptadora de polipéptido, preferib onada entre la proteína y regiones que codifican el marc ad.
Para expresión in vivo de las proteínas, ADNc se puede ectores de expresión comercial (por ejemplo, como se provee por gen, Clontech) y se introducen en el organismo apropia esión. Para expresión in vitro las secuencias de ADN amplific se pueden usar directamente en sistemas de transcripción/tradu acoplados (por ejemplo, lisados S30 de E. coli de polimerasa de expresan, preferiblemente cepas deficientes de proteasa, lis en de trigo, lisados de reticulocito con y sin microsomas (por o se provee por Promega, Pharmacia, Panvera)).
// competente apropiada mediante transformación dependiente d as incluyen: azul XL-1 , BL21 , SG13009 (Ion-)). Cultivos se pued er a fase log-media, inducida para expresión, y las células se iante centrifugación. Las células se pueden re-suspender cont ima y las membranas de rompen mediante cicl elación/descongelación rápida, o mediante sonicación. D lares se pueden remover mediante centrifugación y la matriz de piada se puede añadir a sobrenadantes. La estreptoquinasa de in y las proteínas de unión no específicamente se remueven por et do repetidas. De manera alternativa, perlas de afinidad mag ositivos de filtración se pueden usar (QIAGEN, Inc., Valencia, CA).
Saccharomyces cerevisiae se permite para glicosila o y modificaciones de lípido de proteínas. El método riormente para E. coli se puede usar con ligeras modificaciones formacion y lisis celular. Transformación para Saccharomyces c
doras e infección de suspensiones de célula de insecto liqui as son SF9, SF21). Expresión basada en célula de mamífero r fección y clonación de líneas celulares. Proteínas solubles se edio mientras proteínas de unión de membrana o intracelular re celular (ya sea solubilización de detergente, congelación-descong ínas después pueden ser análogos purificados para el proce rito para E. coli.
Para traducción in vitro el sistema de elección es lisado obtenidos a partir de cepas de sobreexpresión de polimerasa de ficientes de proteasa. Lisados de E. coli proveen expresión de nte (30-50 µg/ml de lisado). El procedimiento entero se lleva a los de 96 pozos. Genes de interés se amplifican mediante PCR nucleótidos que contienen las secuencias específicas de g enen un promotor de polimerasa de ARN T7 y sitio de unió encia que codifica e! marcador de afinidad. De manera alternati
os de reticulocito en combinación con microsomas.
a) Estreptoquinasa resistente a plasmina
Estreptoquinasa es una proteína lábil susceptibl radación en reacción con plasmina. Fragmentos de estrept radada a plasmina se ha mostrado que exhiben actividades i 0 un activador de plasminógeno en comparación con la estrept a (Shi et al., Biochem. J. 304: 235-241 (1994)). Las uniones de p olécula de estreptoquinasa que se hidrolizan mediante plas minan previamente (Shi et al., supra). Plasmina cataliza específi idrólisis de uniones de péptido que tienen en el lado amino Lys y cíficamente, la unión de péptido Lys59-Ser60 de estreptoquin e algunas uniones de péptido que se dividen en la reacción temp imina mientras el péptido NH2-terminal, Ile1-Lys59, es esenci ibilización de la estructura de estreptoquinasa (Shi et al., supra
En una modalidad, la estreptoquinasa es un muta ptoquinasa caracterizado como capaz de activar plasminó ina, aún resistente a degradación de plasmina en relación ptoquinasa tipo silvestre correspondiente. En otra modali ptoquinasa comprende una secuencia de aminoácido que ti oácido diferente de lisina en una posición correspondiente a la 12 o ambos en SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el ami nte de lisina en la posición correspondiente a la posición 85 S en SEQ ID NO: 1 es asparagina o glutamina. En una modal ptido de estreptoquinasa comprende la secuencia de aminoácid uestra en SEQ ID NO: 2 (cuadro 2). En otra modalidad, el polipé ptoquinasa comprende residuos de aminoácido 27-440 como se Q ID NO: 2 (cuadro 2).
CUADRO 2
ubrayan (la proteína madura comienza con isoleucina (I) en la Mutaciones K85N y K412N tienen subrayado doble (K: li ragina).
En otras modalidades, la secuencia de estrepto nalmente, además comprende residuos polares o cargados e posiciones correspondientes a las posiciones 406-410 en SEQ ID
2.- Estreptoquinasa inmovilizada
Estreptoquinasa inmovilizada se puede usar para minógeno a plasmina. Este método se provee para poca o aminación de la preparación final con la estreptoquinasa por si eras múltiples existen para inmovilizar estreptoquinasa.
Estreptoquinasa se puede adsorber en una matriz adecú ???, se ha informado que estreptoquinasa tiene aún la capac ar plasminógeno a plasmina cuando la estreptoquinasa
tachi et al., Thrombos. Haemostas (Stuttg.) 39:426 (1978) info vitización del activador de plasminógeno, uroquinasa, en ni nte de E.U.A. No. 4,305,926, incorporada aquí para referencia, vilización de estreptoquinasa en un polímero biocompatible tal , Dacron, colágeno, polivinilpirrolidina, o p-aminofenilalani érica y leucina.
En una modalidad, la estreptoquinasa se inmoviliza rficie usando un marcador de afinidad como se describe en la Pa A. No. 6,406,921 , que se incorpora en el presente docume encia en su totalidad. La superficie puede ser orgánica o ino >gica o no biológica, o cualquier combinación de estos materiales, alidad, la superficie es transparente o translúcida. Numerosos m adecuados para usarse como una superficie. Por ejemplo, la s e comprender un material seleccionado de un grupo que consta d , cuarzo, vidrio, vidrio de poro controlado, carbón, alúmina, di
lquenosulfona (PAS); polihidroxietilmetacrilato; polidimetil crilamida, polümida: co-polímeros de bloque, y Foto-res rgit™, películas polimerizadas de Langmuir-blodgett, y estructur ién pueden servir como superficies en la presente invención.
El término "marcador de afinidad" se usa aquí para referi al funcional capaz de inmovilizar una proteína sobre la funci esta de una superficie. En algunos casos, el marcador de afinida un grupo funcional químico simple. Otras posibilidades i oácidos, polipéptidos, proteínas, bicapas lipídicas, o un hidr ador de afinidad se puede unir de forma covalente o no covale ína (vía conjugación química o como una proteína de fusi plo). Asimismo, el marcador de afinidad se puede unir a rficial ya sea de forma covalente o no covalente.
Una "molécula adaptadora", para propósitos de esta in ualquier entidad que enlaza un marcador de afinidad a una prot
El término "proteína de fusión" se refiere a una uesta de dos o más polipéptidos que, aunque típicamente no un tado nativo, se unen por sus respectivos términos amino y car s de un enlace de péptido para formar un polipéptido continuo ntiende que dos o más componentes polipeptídicos pueden amente o unirse indirectamente a través de un enlazador/separ do.
Una capa de moléculas orgánicas se puede recubri rficie. Una cara de la capa se puede componer de funcion icas en los terminales de las moléculas orgánicas que se a icamente o físicamente sobre el material superficial (grupos sup ra cara de la capa se puede exponer y puede llevar cualquier nú onalidades químicas (grupos terminales). En algunas modalida culas de la capa se ordenan altamente y se envasan estrech o en gran parte a interacciones hidrófobas y de van der Waals e
vilización que es específica a un sitio designado o locació ptoquinasa. Para que esto ocurra, la unión del marcador de afini ína de estreptoquinasa debe ser específica del sitio. Esta inmo cífica del sitio puede ayudar a asegurar que el sitio reactivo de la e accesible a ligandos en solución. Otra ventaja de inmovili s de marcadores de afinidad es que permite una estrat vilización común para usarse con proteínas múltiples y diferentes.
En algunas modalidades, el marcador de afinidad comp os un aminoácido. El marcador de afinidad puede ser un polipép prende al menos un aminoácido reactivo. Alternativamente, el finidad puede ser un aminoácido reactivo a la capa de molécula a, tal como, por ejemplo, cisteína, lisina, histidina, arginina, ti mina. Un marcador de afinidad de polipéptido o aminoácido se riblemente como una proteína de fusión con la proteína. Los ma minoácido proveen un aminoácido sencillo o una serie de ami
noácidos. Por ejemplo, el marcador de afinidad puede compre cisteína, poli-lisina, poli-arginina, o poli-histidina. Los marcad noácido se componen preferiblemente de dos a veinte residuo noácido sencillo, tal como por ejemplo, histidinas, lisinas, a ínas, glutaminas, tirosinas o cualquier combinación de estos.
En una modalidad, un marcador de aminoácido de uno noácidos comprende al menos uno a diez cisteinas para el enlac a a diez lisinas para el enlace amida; o una a diez argininas plamiento a grupos dicarbonilo vecinales. Una persona con experi cnica puede aparear fácilmente marcadores de afinidad adecu funcionalidad-Y dada.
La posición del marcador de aminoácido puede est no- o carboxi-terminal de la proteína estreptoquinasa o en cualqu e estas. Cuando son compatibles con la función de prot cadores de afinidad introducidos para la purificación de pro
lt son químicamente aminoacilados para contener aminoácidos a icamente ("no naturales") para usarse con químicas de acop cífico (es decir, modificaciones de cetona, grupos foto-reactivos).
En algunas modalidades, el marcador de afinidad co proteína completa, tal como, pero sin limitación a, glutat ferasa, un anticuerpo, avidina o estreptavidina.
Otra conjugación de proteína y técnicas de inmo cidas en la técnica se pueden adaptar para propósitos de inmo streptoquinasa en la superficie. Por ejemplo, el marcador de e ser un bioconjugado orgánico que se acopla química ptoquinasa. La biotina o antígenos se pueden entrelazar química ptoquinasa. Alternativamente, un entrelazador químico se pue unir un radical funcional simple tal como un tiol o una ami rficie de estreptoquinasa.
En otras modalidades, el marcador de afinidad
lípida como se describe en la Publicación PCT WO 96/38726.
Todavía en otras modalidades adicionales, una tadora puede enlazar el marcador de afinidad a la estrepto vilizada. El espaciamiento adicional de la proteína de la superfici uce por el uso de una molécula adaptadora puede ser convenien ínas, puede estar propenso a la inactivación superficial. Una pers riencia en la técnica es capaz de seleccionar una molécula ad es apropiada para un marcador de afinidad dado. Por ejemp ador de afinidad es estreptavidina, entonces el adaptador puede cula de biotina que se conjuga químicamente a la estreptoquinas que inmovilizar. Alternativamente, si el marcador de afinidad es o mono-capa de fosfolípido entonces un ancla de membrana s ccionar como una molécula adaptadora adecuada.
En una modalidad, la molécula adaptadora es un polipé o una proteína G o proteína A. En otra modalidad, el marc
tificación de la unión superficial.
En otra modalidad, la estreptoquinasa recombinante s vilizar usando cromatografía de adsorción de ion metálico inm C). Este método de cromatografía que es una técnica de se ible especialmente y también aplicable a la mayoría de los eínas, es una técnica comúnmente usada en los esquemas de pu con otra etapa cromatográfica, tal como cromatografía de int o (IEX) y/o cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).
IMAC utiliza matrices que comprenden un grupo capaz d uelado con un ion de metal de transición, quelado que a su ve 0 el ligando en cromatografía para adsorber un compuesto de u uerza de unión en IMAC se afecta predominantemente por las esp metálico, el pH de los reguladores de pH, y la naturaleza del o. Debido a que los iones metálicos se unen fuertemente a la eína adsorbida puede, opcionalmente, eluirse por medio de dis
ados metálicos.
Queladores simples se han sugerido como ligandos par omo ácido iminodiacético (IDA). IDA, acoplado a soportes de ag ués se carga con varios metales, tales como Cu2\ Zn2+, y Ni2 o para capturar proteínas y péptidos y también está disponibl as comerciales. Más específicamente, la Patente de E.U. 1 ,271 (Hochuli, asignada a Hoffmann-La Roche Inc.), que se i para referencia, describe una resina quelada de metal que co dos IDA. La resina puede de acuerdo a la especificación prepa manera conocida por medio de tratamiento de agaro orohidrina o epibromohidrina, reacción del epóxido resultante ica de ácido iminoacético y convirtiendo el producto en sal de por medio de lavado con una solución de cobre (II) o zinc.
EP 87109892.7 (F. Hoffmann-La Roche AG) y su equiv nte de E.U.A. No. 4,877,830 (Dóbeli et al., asignada a Hoff
s.
Lizano et al., J. Microbio!. Methods, 23:261-280 se íncorp referencia de la enseñanza de uso de matriz para inmovili ína recombinante.
Las composiciones de la presente invención también se inistrar en forma de kit. En consecuencia, en otros aspectos, la nción provee un kit para la preparación de plasmina. El kit compre ptoquinasa inmovilizada en una matriz, en donde la estreptoqui estreptoquinasa mutante caracterizada por ser capaz de minógeno a plasmina, aún resistente a degradación de plasmina r orrespondiente estreptoquinasa de tipo silvestre. La estreptoqui o se describió antes.
En una modalidad, el kit comprende además una matriz smina que tiene una molécula dispuesta sobre esta que tiene la plasmina.
plos, pero se debe observar que la invención no se limita a los eje
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Preparación de estreptoquinasa marcada recombinante
La molécula de ADN mostrada en la figura 1 (es decir, ), que comprende una secuencia de ácido nucleico que codif ína de estreptoquinasa doble-mutante se sintetiza (Blue Heron ell, WA) y se clona (para facilitar la clonación, un sitio 5'BamHI y ?? se incluye) en los vectores pET21b, pET32b, y rcialmente disponibles (EMD Chemicals, Inc. (Novagen®), Gib para producir varios polipéptidos recombinantes (figura ctivamente) que comprenden una secuencia de amin
Todos los tres constructos de ADN de estrepto mbinante se transforman en E. coli células competentes Gold BL2 tagene, La Jolla, CA) y crecen usando medio Luria-Berta amente, aproximadamente 0.5 mi de un cultivo de semilla du e se desarrolla a 37°C y se usa para inocular aproximadamente edio LB fresco. Para los constructos pET21b y pET32b, el medi plementa con 50 µ?/??? de ampicilina, mientras que el constructo esarrolla en presencia de 30 µ9/??? de canamicina. Cada cu rrolla a un OD595nm de aproximadamente 0.7, y después se indu ón de ß-D-l-tiogalactopiranosida de isopropilo (IPTG) a 1.0 mM. uatro horas de crecimiento a 37°C, las células de los cultivos se entrifugación y se congelan a -20°C hasta que se requiera su uso.
Las etapas de purificación de estreptoquinasa reco l para todos los tres constructos son similares, y están involucr celular y clarificación. Las pellas celulares descongeladas
ntes marcadas con poli-histidina). Usado celular clarificado se ap na de quelación HiTrap cargada con cobalto a 5 ml/minuto des ibrio con 20 mM de fosfato de sodio, 500 nM de NaCI, y 10 zol, pH 7.4. Después de la carga, la columna se lava extensivam gulador de pH anterior. La elución de la proteína se inicia por me ación de 20 mM de fosfato de sodio, 500 mM de NaCI, y 500 zol, pH 7.4 de regulador de pH de lución. Las mediciones de abs das en 280 nm se usan para monitorear el progreso de la co icación usando un instrumento de cromatografía AKTA Expl thcare. Fracciones que contienen la proteína de estrepto mbinante objetivo durante la elución como se determina por electr -PAGE se agrupan, y regulador de pH intercambiado para puri onal usando cromatografía de intercambio de anión.
Una columna Q-sepharose HiTrap de 5 mi (GE Healthc ees Corp, Piscataway, NJ) equilibrada con 25 mM Tris-HCI,
% desarrollado durante 20 minutos se usa para eluir la proteína ob
La proteína de fusión-GST pET41 se purifica de lisad ficado usando una columna FF GSTrap de 5 mi (GE HealthC nees Corp, Piscataway, NJ). El lisado celular clarificado se ap mna equilibrada con solución salina amortiguada con fosfato ( a se sigue por medio de lavado extenso con PBS, y la elución de gra con 50 mM de Tris-HCI, y 10 mM de glutationa, pH 8.0. SD tern-blotting de anti-estreptoquinasa, y ensayos de activación con tidad de todas las tres proteínas purificadas.
La figura 5 muestra un ejemplo de un gel SDS-PAGE te Coomasie de una estreptoquinasa recombinante purificada a minógeno recombinante purificado.
EJEMPLO 2
rifugación a 2000 x g durante 3 minutos y se lava posteriorment S con 20 mM Tris HCI, pH 7.4. La matriz se remueve de la unidad oloca en un tubo de microcentrifuga, y se re-suspende en 20 lador de pH Tris-HCI 50 mM, pH 7.4.
EJEMPLO 3
Preparación de plasminógeno
Plasminógeno derivado de plasma se puede preparar ribe en, por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 6,964,764 y 6,969, corpora aquí para referencia en su totalidad. Por ejemplo, plasm urifica de pasta Cohn Fraction ll+lll por medio de cromatog dad en Lys-Sepharose como se describe por Deutsch et al., 1095 (1970). De esta manera, 200 g de la pasta se re-suspen de 0.15 M de regulador de pH de citrato de sodio, pH 7.8. La su
olución de plasminógeno. El precipitado de plasminógeno crudo 5%) se puede almacenar a 4°C.
EJEMPLO 4
Activación de plasminógeno a plasmina usando estreptoauin tan te resistente a plasmina marcada con polihistidina inmovi
Una cantidad equimolar de plasminógeno se añad ptoquinasa inmovilizada en 50 mM de regulador de pH Tris-HCI, muestras se incuban a 22°C y se colocan en una plataforma de mantener la matriz en suspensión. En la terminación de la activ ión de plasmina se filtra de estreptoquinasa-SEPHAROSE en un e inmediatamente se aplican en benzamidina-SEPHAROSE.
Para monitorear el progreso de activación de plasminó valos diferentes, una muestra se selecciona y la reacción se ter
crilamida SDS-10%.
EJEMPLO 5
Activación de plasminóqeno recombinante por medio de estreptoquinasa resistente a plasmina marcada en solució
La estreptoquinasa recombinante purificada producida tructo de expresión pET21b se dialíza contra 25 mM Tris-HCI, pH BACA, 1 mM EDTA, y 25% de glicerol (v:v). Plasminógeno reco icado por afinidad en el mismo regulador de pH se mez ptoquinasa recombinante en relaciones molares de 100:1 , 10:1 , idad de estreptoquinasa en cada una de estas tres reacci tiene constante, mientras la cantidad de plasminógeno recombi para producir las varias relaciones molares de plas mbinante a estreptoquinasa. Los dos componentes se mezcl
minógeno recombinante.estreptoquinasa recombinante, activa minógeno recombinante a plasmina recombinante por m ptoquinasa recombinante es evidente en SDS-PAGE. El curso d activación revela que el plasminógeno recombinante se con lasmin al inicio en la reacción, evidente por la formación de dos condiciones de reducción PAGE. La banda observada migra c ador 28 kD es el dominio de proteasa serina de recPlas tras la banda más pequeña migra justo arriba del marcador 14 inio kringle. Concomitante con la apariencia de estas dos band parición del material de inicio plasminógeno recombinante a 3 horas en la reacción, casi todo el plasminógeno recombinant ertido a plasmina recombinante.
Para la reacción de relación molar 10:1 , SDS-PAGE s escasamente para rastrear el experimento, mientras que la can ína total presente en el experimento de relación molar 1 :1 es m
ransfieren a membranas PVDF de acuerdo al protocolo de m cha Cell II X Novex (Invitrogen, Carlsbad, CA). El bloque ibrana PVDF se conduce con una solución BSA 1% en solució rtiguada de fosfato (Sigma-P3688, St. Louis, MO), mientras ción salina amortiguada Tris (Sigma-T9039, St. Louis, MO) se s las soluciones de lavado y dilución de anticuerpo. Despué ferencia electroforética y bloqueo de la membrana PVDF, la ma iza con anticuerpos anti-estreptoquinasa conejo policlonal (AbD 0-0173), Raleigh, NC) usando una dilución 1 :4000 del anticuer rva. Anticuerpos IgG anti-conejo cabra (Sigma-A3937, St. Lo cados con fosfatasa alcalina se usan a una dilución 1 :5000 vec sustrato Sigma Fast BCIP/NBT (Sigma-B5655, St. Louis, M alizar los fragmentos de estreptoquinasa.
Como se muestra en la figura 7, bajo condiciones de e plasminógeno recombinante se incuba con estrept
espada en el mismo sitio en la mancha se debe a la reactividad anticuerpo 1o a plasminógeno recombinante de longitud com rol de plasminógeno recombinante (carril 7) y la muestra de reac il 1), demuestran esta reactividad cruzada. En tiempos de reacc s como plasminógeno recombinante se consume, la banda enc inuida, y una nueva banda aguda que representa el fragm ptoquinasa central aparece. La reactividad cruzada también es el dominio de serina proteasa (SP) de plasmina recombinante ( trados).
Para el experimento de relación molar 1 :1 , la tasa de a isminuye significativamente (datos no mostrados). En t=4 hor ión, los primeros signos de proteólisis de estreptoquinasa es a estas condiciones de reacción, un fragmento de estreptoquin ble se genera, aún en t=18 horas en la reacción. Esto es probab sultado de todas las estreptoquinasas que están enlazadas
EJEMPLO 6
Captura de plasmina en benzamidina-SEPHAROSE
La cromatografía de afinidad es una técnica útil en la pu roteína. Debido a que la proteína de interés es una serina protea decir, plasmina) con especificidad tipo tripsina, benzamidina-SEP elecciona como un absorbente de afinidad que puede permitir la a plasmina activa solamente y puede dejar atrás los varios contar roductos de degradación de plasminógeno. La captura de p ión, y formulación se describe en, por ejemplo, Patente de E. 5,243, que se incorpora aquí para referencia en su totalidad.
La solución de plasminógeno activada completamente e > se aplica a la columna de benzamidina-SEPHAROSE d ilibrada con 0.05 M Tris, pH 8.0, 0.5 M NaCI con un caudal de 3 m olumna se corre a 3 mi/ minuto a 4°C.
porciones frontales pequeñas del pico, B1 y B2, y el volumen del o, B3.
EJEMPLO 8
Formulación de material eluido en agua acidificada
Plasmina eluida se dializa con agua que se ha acidific plo a pH de aproximadamente 3.3 a aproximadamente 3.7 co ico glacial. Inicialmente, esta condición de solvente se elige simp mantener plasmina activa mientras se prepara para los procedi rmulación futuros tales como liofilización, congelamiento, cambi iciones de solvente y así sucesivamente. Todos estos dimientos son más fáciles de realizar con solución de conce a baja, no amortiguada. Pero encontramos que plasm madamente estable en agua acidificada y se puede usar efecti
Claims (2)
1 . - Una composición que comprende una estrepto vilizada en una matriz, en donde la estreptoquinasa es un mut ptoquinasa caracterizado por ser capaz de activar plasminó mina, resistente aún a degradación de plasmina relativa spondiente estreptoquinasa tipo silvestre. 2. - Un artículo de manufactura que comprende una ma una estreptoquinasa inmovilizada sobre esta, en do ptoquinasa es un mutante de estreptoquinasa caracterizado z de activar plasminógeno a plasmina, resistente aún a degrad mina relativa a su correspondiente estreptoquinasa tipo silvestre. 3. - Un método para la preparación de plasmina, el ina. 5. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque la estreptoquinasa es un muta ptoquinasa caracterizado por ser capaz de activar plasminó ina, resistente aún a degradación de plasmina relativa spondiente estreptoquinasa tipo silvestre. 6. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque la estreptoquinasa comprende una s minoácidos que tiene un residuo de aminoácido diferente de lisin ión correspondiente a la posición 85, 412 o ambas como se mu ID NO: 1. 7. - El método de conformidad con la reivindica cterizado además porque la estreptoquinasa comprende la secu oácidos mostrada como residuos de aminoácido 27 al 440 de
2. mutante de estreptoquinasa caracterizado como capaz de inógeno a plasmina, aún resistente a degradación de plas ión con su estreptoquinasa tipo silvestre correspondiente; y b) un nión a plasmina que tiene una molécula dispuesta en esta que ti ad para la plasmina.
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