SE459783B - Stabilt plasminogenpreparat - Google Patents

Description

20 25 30 40 ' fysiologiskt godtagbara, oorganiska saltet, 459 783 2 Såsom typiska exempel på förfaranden för rening av rå ' plasminogen finns förfaranden med användning av en fixerad plasminogenstabilisator [japanska utlagda patentansökningen 153 592 (1980)] och med användning av lysinsefaros [Science, H 170, 1095 (l970)].

Det stabiliserande plasminogenpreparatet enligt före- liggande uppfinning karakteriseras därav, att det innehåller minst en stabilisator, som utväljes från 0,0Û2~0,4 M av det som utgöres av Hgclz, (NH4)2SÛ4, Nâ2SO4, Nâ2B407, KHZPO4, KZHPÛ4, NaH2PO4 och/eller Na2HPO4, KCl, 0,01-100 mM fenylmetansulfonylfluo- rid och 1-1 000 BAEEU/ml sojaböntrypsininhibitor, vattenhaltig lösning, i form av en eller vilket preparat innehåller minst som utväljes fran 0,091-10 vikt/vikt X av det fysiologiskt godtagbara, oorganiska saltet, KCl, en stabilisator, som utgöres av MQCIZ, (NH4)2SÛ4, Nâ2SÜ4, Na2B4O7, KHZPÜQ, K2HPÛ4, NaH2PO4 och/eller Na2HP04, 0,01-10 vikt/vikt 1 fenylmetansul- fonylfluorid och 0,1-1 000 BAEEU/ml sojaböntrypsininhibitor, i form av torrt pulver. s om beror pà mängden av plasmin i plasminogenprepara- Den verksamma mängden av plasminogenstabilisatorn, tillsättes, tet och slaget av stabilisator. Emellertid skall mängden reg- leras i enlighet med användningsändamàlet för plasminogenpre- paratet. Exempelvis är, för ändamalet av studier av fibrino- lys, stabilisatorns koncentration önskvärt mindre än det läg- sta värdet som åstadkommer fíbrinolys. Vidare tillsättes, vid fall av farmaceutiska tillämpningsändamàl, där plasminogenpre- paraten undergár en sträng behandling, t ex värmebehandling vid 80°C i 10 timmar för att inaktivera virus, en stor mängd av stabilisatorn och efter en sträng behandling av preparatet borttages den genom dialys eller nägra andra lämpliga metoder.

I fallen av PMSF (fenylmetansulfonylfluorid, densamma användes härefter) och sojaböntrypsininhibitor är det viktigt att till- sätta en tillräcklig mängd stabilisator för att fullständigt hämma förorening av plasmin.

Specifika konoentrationer av stabilisatorerna, som an- vändes i föreliggande uppfinning, är följande: För vattenhaltiga lösningar_av plasminogen användes ett fysiologiskt godtagbart, oorganiskt salt för att ge en slutlig 10 15 20 30 3 459 785 koncentration av 0,002 till 0,4 M, lämpligen 0,01 till 0,3 M, och lämpligast 0,05 till 0,2 M, PMS? 0,01 till 100 mM och so- jaböntrypsininhibitor 1 till 1 000 BAEEU/ml. För torrt pulver av plasminogen användes ett fysiologiskt godtagbart, oorga- niskt salt för att ge en slutlig koncentration av 0,01 till 10 vikt/vikt 1, PMSF 0,01 till 10 vikt/vikt Z, och sojabön- trypsininhibitor 0,1 till 1 000 BAEEU/mg.

Plasminogen riskerar att inaktiveras vanligen under pro- duktionsförfarandet, speciellt under värmebehandling eller lyofilisering, sàsom angavs ovan. Följaktligen tillämpas lämp- ligen stabiliseringsförfarandet enligt föreliggande uppfinning inte endast vid värmebehandling av en plasminogen-innehållande vattenhaltig lösning eller vid lyofilisering därav, utan även vid alla stegen i produktionsförfarandet. Vid fallet av värme- behandling för att inaktivera virus, t ex värmebehandling vid 60°C i 10 timmar, är det önskvärt att utföra värmebehandlingen efter tillsats av stabilisatorn och göra uppslutningen vid 4° till 37°C vid pH 2 till 4 i 20 till 60 minuter.

Använda stabilisatorer i föreliggande uppfinning kan även tillåtas att kvarvara som de är i preparaten efter ovan angivna behandling, varvid kvarvarande stabilisatorer även ökar stabiliteten hos plasminogen vid stående.

Tillsatsen av stabilisator enligt föreliggande uppfin- ning förbättrar stabiliteten av plasminogen i dess produk- tionssteg inklusive värmebehandling, lyofilisering och andra förfaranden, för att därvid göra förlusten av plasminogen i produktionsförfarandet till ett minimum, och plasminogenprepa- raten, som innehåller stabilisatorn, har hög stabilitet vid staende; sålunda tillhandahåller föreliggande uppfinning ett mycket gynnsamt förfarande, såsom ett industriellt förfarande för alstring av plasminogenpreparat. Det är självfallet, att förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan utnyttjas inte endast vid alstringen av plasminogenpreparat, utan även all- mänt i andra fall, där stabilisering av plasminogen erfordras.

Föreliggande uppfinning kommer att belysas mera i detalj genom följande exempel, men föreliggande uppfinning är inte begränsad därtill. I exemplen visas en verkan av plasminogen genom kaseinenheten (CU-enhet) [Vox Sang., 5, 357-376 (1969)] och en aktivitet av sojaböntrypsininhibitor visas av BAEEU UI 10 15 20 25 30 459 783 4 ELaskowski, M. (1955) Method in Enzymology 2, Colowick S.P. och Kaplan, N.O., Inc.]. 37, utgiven av New York, Academic Press, Exemgel 1 (Stabiliseringsverkan på plasminogenlösning> Olika slag av inhibitorer sattes vardera till en vatten- haltig losning av 100 CU/ml plasminogen i tris (pH 7,8).

-HCl-buffert Lösningarna tilläts att stå i en termostat av 3?°C för att testa stabiliteterna. Resultaten visas i tabell 1.

TABELL 1 Slutlig Kvarvarande aktivitet Inhibitor koncentration vid 37°C i 24 h (Z) PMSF 0,1 mM 98 - - 1 mM 98 Sojaböntrypsin- lnhibitor 10 BAEEU/ml 88 - - 100 BÅEEU/ml 92 Inte nåoon tillsats - 43 Exemgel 2 (Stabiliseringsverkan pá lyofiliserad plasminogen) Lösningarna i exempel 1 till vilka olika slag av inhibi- torer hade satts, lyofiliserades och erhållna lyofilisat till- läts stå i 1 månad i en termostat av 50°C eller i 3 månader vid rumstempeartur för att testa stabiliteterna. visas i tabell 2.

Resultaten TABELL 2 Kvarvarande aktivitet Kvarvarande aktivitet vid stående vid 50°C efter 3 månaders förva- Inhibitor i 1 månad 1 rino vid rumgtgmpi Z PMS? 94 93 Sojaböntrypsin- * inhibitor 93 91 Inte nåoon tillsats 32 25 10 15 20 25 30 35 40 5 459 783 Exempel 3 Fraktíon III, som erhölls enligt Cohn's fraktioneringsme- tod med kall etanol, suspenderades i en vattenhaltíg lösning,. som innehöll 1 vikt/volym % natriumklorid och efter det att sus- pensionen omrörts under ett ögonblick borttogs överskiktad vätska genom Centrifugering. Enligt förfarandet enligt oc. neueeen e: ei. _fseienee,' 1095 0970)] handesaen överskiktade vätskan i en lysin-"Sepharose"-kolonn för att - absorbera plasmínogen, sedan tvättades orena proteiner bort med fysiologiskt saltvatten och adsorberad plasminogen elue- rades genom användning av en vattenhaltig lösning (pH 7,0), som innehöll både 0,002 bI&aminokapronsyra och 1 % natriumklorid.

Efter att ha díalyserat mot destillerat vatten delades den renade plasminogenlösningen i ett stort antal prov, vilka klassi- ficerades i fyra grupper, och dessa grupper behandlades under respektive följande olika förhållanden: Förhållande D: olika slag av stabílisatorer sattes till respek: tive prov i denna grupp och erhållna lösningar upphettades till 60°C i 10 timmar.

Förhållande B: olika slag av stabilisatorer sattes till respekti- ve prov i denna grupp; erhållna lösningar uppslöts vid ett pH av 3,0 vid rumstemperatur i 30 minuter och därefter värmebehand- lades de vid 60°C i 10 timmar.

Förhållande C: proven i denna grupp uppslöts vid ett pH 3,0 i 30 minuter och därefter sattes olika slag av stabilisatorer till respektive erhållna prov, erhållna lösningar värmebehandlades vid 60°C i 10 timmar.

Förhållande A: proven i denna grupp underkastades inte någon be- handling förutom tillsats av olika slag av stabilisatorer.

Därefter bestämdes återstående aktiviteter hos följande prov: De överskiktade vätskorna hos proven, som erhållits under förhållandena D, B, C och A efter det att pH-värdena hos dessa prov korrigerats till 7,0 f 0,2. _ _ Proven, som erhållits genom lyofiliseríng_av_lösningarna, som erhållits under förhållande B (förhållande E). proven i förhanenae E efter at: ha stam vid 4°c i s ma- nader (förhållande F).

Aktívítetsbestämningarna utfördes genom kaseinsönderdel- níngsmetoden enligt förfarandet enligt Sgouris et al. [Vox Sang., 459 783 6 å, 357 (1960l]. Tabell 3 visar kvarvarande aktiviteter hos de olika proven, som erhållits genom behandlingarna under de sex förhållandena, uttryckta i procent, grunqat på aktiviteten hos ett aldrig upphettat plasmínogenpreparat, som inte innehåller någon tillsats, antaget såsom 100 %. 459 785 .wuHOW å å 3 _ 2 å ä 32.8 _. 2 å S .WN å .å šmoáv _ _. .å 2 i 3 2 ä 242.8 vomß: 2 ä S S _ ä ä 22:25 ßofïmz ä E o... 3 å E: :Éïcv _. 2 å 3 2 2 E: šmoå: _. 2. i 2 i N I ä 22.8 åwfiå 2 å S ä. ä E: 29:: _. ä ä S 2. ä ä E22: _. 3 E m» 2 3 E šäx: Jwmtfz, 2 ä 2 S ä E cáñm: Sv. 2 å 2 å ä E: šmíâ ._ ä å mm S ä 2: 9.2.8 ._ - - 2 2 2 E: 52.3 Så - - 3 S. S 2: 3235» 5.3.: 35 m m. . Q u m < _ uwcwïfikw... .åâfiåfifipßm Bšïfëšm Bšqïæšë» »wšïmfwm åšëâgäë Üšå "ÉWSC cowcnflflqzpmw axwfio hona: hmmcflfiscmzon »ouwo ^wv»u~ofi>~uxc uw:c~æ>»=>z m ;;mm

Claims (1)

10 15 11 459 785 Patentkrav

1. Stabilt plasminogenpreparat, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innehåller minst en stabilisator, som utväljes från 0,002-0,4 M av det fysiologiskt godtagbara, oorganiska saltet, som utgöres av KCI, MgCl2, (NH4)2SO4, Na2SO4, Na2B4O7, KHZPO4, KZHPO4, NaH2PO4 och/eller Na2HP04, 0,01~100 mM fenyl- metansulfonylfluoríd och 1-1 000 BAEEU/ml sojaböntrypsininhi- bitor, i form av en vattenhaltig lösning, eller vilket prepa- rat innehåller minst en stabilisator, som utväljes fràn 0,01- 10 vikt/vikt % av det fysiologiskt godtagbara, oorganiska sal- tet, som utgöres av KCI, MgCl2, (NH4)2SO4, Na2SO4, Na2B4O7, KHZPO4, KZHPO4, HaH2P04 och/eller Na2HPO4, 0,01-10 vikt/vikt Z fenylmetansulfonylfluorid och 0,1-1 000 BAEEU/ml sojaböntryp- sininhibitor, i form av torrt pulver.