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Die
Erfindung liegt auf dem Gebiet von Biosensoren, die genutzt werden,
um Eigenschaften einer Teskomponente zu messen.
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Als
Biosensor wird allgemein eine Anordnung bezeichnet, in der ein biologisch
aktives Element/eine biologisch aktive Komponente, beispielsweise
ein Protein, ein DNS-Abschnitt, ein Biomimetikum oder eine ganze
Zelle, mit einem physikalischen Wandler (Transduktor) gekoppelt
oder in diesen integriert ist. Mit Hilfe des physikalischen Wandlers
wird infolge einer Wechselwirkung des biologisch aktiven Elements
mit einer Testkomponente, insbesondere Molekülen, einer Testsubstanz ein
Meßsignal
erzeugt, welches dann als Meßgröße meßtechnisch
erfaßt
werden kann. Die Meßgröße kann
abhängig
von dem ausgehenden Meßsignal
bei bekannten Biosensoren optischer, elektrochemischer, kalorimetrischer, piezoelektrischer
oder magnetischer Natur sein. Biosensoren eröffnen die Möglichkeit, Wechselwirkungen
zwischen biologisch aktiven Komponenten zu untersuchen, um beispielsweise
Informationen über Verbindungen
mit bekannter Bioaktivität
oder über die
Bioaktivität
von Proben mit bekannter oder unbekannter chemischer Zusammensetzung
zu gewinnen (vgl. Keusgen: „Biosensors:
new approaches in drug discovery",
Naturwissenschaften, 89 (2002) 433–444).
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Die
Selektivität
eines Biosensors hängt
von der oder den vom jeweiligen Biosensor umfaßten biologisch aktiven Komponenten
ab, die mit den zu untersuchenden Testkomponenten wechselwirken.
Nur bestimmte Testkomponenten, die mit der vom Biosensor umfaßten biologisch
aktiven Komponente wechselwirken, verursachen ein meßbares Signal. Die überwiegenden
Anzahl der bekannten Biosensoren weisen elektrochemische Wandler
(Transduktoren) auf. Die verwendeten Wandler können in amperometrische, potentiometrische,
konduktometrische und kapazitive Wandler eingeteilt werden. Amperometrische
Biosensoren detektieren bei einem konstant gehaltenen Potential Änderungen
eines Stromflusses über
den Biosensor, wenn Ladungstransfer in Form von Elektronen zwischen
einer biologisch aktiven Komponente und einer Elektrode erfolgt.
In einer typischen Meßanordnung
für einen
amperometrischen Biosensor wird beispielsweise ein Enzym auf einer
Oberfläche
einer Elektrode immobilisiert und ein gelöstes biochemisches Substrat
zugegeben. Wenn das Enzym mit dem Substrat interagiert, fließt ein Strom,
der abhängig
von der Konzentration des Analyten ist. Potentiometrische Biosensoren
detektieren bei konstant gehaltenem Strom, der üblicherweise gleich null gehalten
wird, eine Veränderung
der Spannung. Im Vergleich zu amperometrischen Biosensoren kann
hier die biologisch aktive Komponente, beispielsweise ein Enzym,
auf der Oberfläche
einer pH-sensitiven Vorrichtung aufgebracht sein. Bei konduktometrischen
Biosensoren wird die Änderung
der Leitfähigkeit
zwischen zwei Elektroden detektiert. Bewirkt eine Wechselwirkung zwischen
der zu untersuchenden Testkomponente und der vom Biosensor umfaßten biologisch
aktiven Komponente eine Änderung
der Dielektrizitätskonstante,
können auch
Kapazitätsmessungen
für die physikalische
Wandlung des Meßsignals
verwendet werden.
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Aus
dem Dokument
US 6,485,986 ist
ein Verfahren zum elektrochemischen Aufbringen organischer Schichten
auf einem Siliziumsubstrat bekannt, wodurch eine in der Biosensorik
einsetzbare Schichtanordnung hergestellt wird.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, einen verbesserten Biosensor sowie ein verbessertes
Verfahren zum Messen von Eigenschaften einer Testkomponente, die
mit einer oder mehreren biologisch aktiven Komponenten des Biosensors
wechselwirken, mit Hilfe des Biosensors anzugeben, die eine mit
Hilfe einfacher apparativer Mittel ausführbare Ermittlung von Informationen über Eigenschaften
der Testkomponente einer Testsubstanz ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch einen
Biosensor nach dem unabhängigen
Anspruch 1 und ein Verfahren zum Messen von Eigenschaften einer
Testkomponente in einer Testsubstanz nach dem unabhängigen Anspruch
12 gelöst.
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Die
Erfindung umfaßt
den Gedanken, einen Biosensor mit einer Anordnung von mehreren Schichten,
die eine Halbleitersubstratschicht und eine benachbart zu der Halbleitersubstratschicht
angeordnete Schicht mit Elementen einer biologisch aktiven Komponente,
die immobilisiert sind, aufweist, für eine elektrische Leitfähigkeitsmessung
zu nutzen. Zu diesem Zweck verfügt
der Biosensor über
einen mit der Schicht mit der biologisch aktiven Komponente in Wirkverbindung
stehenden Wechselwirkungsabschnitt, in welchem eine Testsubstanz
zum Wechselwirken einer Testkomponente der Testsubstanz mit der
biologisch aktiven Komponente eingebracht werden kann, und mindestens
eine Anschlußelektrode,
die mit dem Wechselwirkungsabschnitt elektrisch leitend verbunden
ist, sowie einer weiteren Anschlußelektrode, die mit der Halbleitersubstratschicht
elektrisch verbunden ist. Mit Hilfe der mindestens einen Anschlußelektrode
und der weiteren Anschlußelektrode
sind Anschlußmittel
zum Ankoppeln der Anordnung mit den mehreren Schichten an einen
elektrischen Stromkreis gebildet, so daß eine elektrische Leitfähigkeit
zwischen der mindestens einen Anschlußelektrode und der weiteren
Anschlußelektrode über die
Anordnung der mehreren Schichten und dem Wechselwirkungsabschnitt
meßbar
ist, wobei sich die elektrische Leitfähigkeit gegebenenfalls infolge
des Wechselwirkens der Testkomponente mit der biologisch aktiven
Komponente ändern
kann.
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Die
Halbleitersubstratschicht ist hierbei insbesondere im Bereich der
abgeschiedenen organischen Schicht bzw. in dem Bereich, in welchem
die Leitfähigkeit
gemessen wird, im wesentlichen oxidfrei gebildet, ggf. mit einer
nicht geschlossenen Oxidschicht versehen, bei der es sich im Fall
der Verwendung einer Siliziumsubstratschicht um eine nicht geschlossene
Siliziumoxidschicht handeln kann. Als Substrat wird dann ein Silizium-Einkristall,
polykristallines Silizium, poröses
Silizium oder amorphes Siliziummaterial verwendet, bevorzugt mit
einer 1-1-1-Oberflächenorientierung
bzw. Vorzugsorienierung, was die Abscheidung von geschlossenen,
kompakten organischen Schichten ermöglicht. Der Begriff Siliziumsubstrat
umfaßt
auch Siliziumverbindungen, Siliziumlegierungen und Siliziummaterial
mit eingelagerten Fremdatomen/-ionen (Dotierung). Dies gilt für andere
Halbleitersubstrate entsprechend. Testkomponenten können insbesondere
Moleküle,
Ionen und/oder Elemente sowie hieraus zusammengesetzte Komponenten
sein.
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Die
Nutzung der Anordnung auf Basis der Halbleitersubstratschicht, insbesondere
einer Siliziumsubstratschicht, hat den Vorteil, daß Halbleiter, insbesondere
Silizium, nicht toxisch, im Vergleich zu im Stand der Technik verwendeten
Metallen, beispielsweise Gold, kostengünstig verfügbar und leicht mit Hilfe von
Standardtechnologien strukturierbar sind. Die Oberfläche von
Silizium ist im Vergleich zu Gold selbstpassivierend. Kratzer oder
Oberflächendefekte
führen
bei Silizium nicht zu einem Kurzschluß von Strom über die
Lösung.
Die Siliziumoberfläche wird
im Bereich der Defekte sofort durch Oxidation mit einer gegen null
gehenden Leitfähigkeit
passiviert, so daß der
Strom weiterhin vorrangig über
die organische Schicht fließt
bzw. der Potentialabfall über
die organische Schicht erhalten bleibt. Aus der Halbleitertechnologie
sind geeignete Technologien zur Bereitstellung einer gewünschten
Oberfläche
des Siliziumsubstrats bekannt. Beispielsweise ist es vorteilhaft,
eine H-terminierte Oberfläche zu
verwenden. Für
die Herstellung der für
den Biosensor genutzten Mehrschichtanordnung stehen verschiedene
Herstellungsverfahren zur Verfügung.
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Die
Erfindung hat darüber
hinaus den Vorteil, daß eine
elektrische Leitfähigkeitsmessung,
beispielsweise im Vergleich zu optischen Messungen, mit Hilfe sehr
einfacher apparativer Mittel und mit großer Sensitivität ausgeführt werden
kann.
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Eine
zweckmäßige Weiterbildung
der Erfindung sieht vor, daß der
Wechselwirkungsabschnitt als ein Durchströmungsabschnitt gebildet ist,
der von der Testsubstanz in flüssiger
oder gasförmiger
Form durchströmt
werden kann. Hierdurch ist ein fortdauernder Austausch der Testsubstanz
beim Nutzen des Biosensors zum Messen ermöglicht.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung sieht an die mindestens eine Anschlußelektrode
und die weitere Anschlußelektrode
angeschlossene Anzeigemittel zum Anzeigen einer aus der elektrischen
Leitfähigkeit über die
Anordnung der mehreren Schichten und den Wechellwirkungsabschnitt
abgeleiteten Meßgröße vor.
Auf diese Weise kann ein von stationären Meßeinrichtungen unabhängiger Biosensor
zur Detektion ausgebildet werden.
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In ähnlicher
Weise kann bei einer Weiterbildung der Erfindung eine an die mindestens
eine Anschlußelektrode
und die weitere Anschlußelektrode angeschlossene,
elektrische Energiequelle vorgesehen sein. Hierbei kann es sich
beispielsweise um eine Batterie oder ein Bauteil zur induktiven
Einspeisung einer elektrischen Energie handeln. Eine Energiegewinnung
kann auch aus biochemischen Prozessen realisiert werden, beispielsweise
mittels einer Immobilisierung einer Nervenzelle, welche elektrische
Impulse abgibt.
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Um
eine detaillierte und umfangreiche Auswertung der Analyse der Testsubstanz
mit Hilfe des Biosensors zu ermöglichen,
sieht eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung Speichermittel,
beispielsweise elektrische, magnetische oder optische Speichermittel,
zum Speichern von Informationen betreffend die Leitfähigkeit über die
Anordnung der mehreren Schichten und dem Wechselwirkungsabschnitt
vor. Die Speichermittel können
mit Hilfe einer geeigne ten Computereinrichtung ausgelesen werden,
um die Informationen über
die Leitfähigkeit
mit Hilfe der Computereinrichtung zu analysieren. Dieses ermöglicht den
Einsatz des Biosensors getrennt von der Computereinrichtung zum
Auswerten. Mit Hilfe der Speichermittel kann beispielsweise auch
ein Farbumschlag registriert werden.
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Eine
bevorzugte Fortbildung der Erfindung kann vorsehen, daß die Anordnung
der mehreren Schichten zwischen der Halbleitersubstratschicht und
der Schicht mit der biologisch aktiven Komponente eine Anbindungsschicht
mit Linkermolekülen aufweist,
wobei die Linkermoleküle
zum Anbinden der biologisch aktiven Komponente an die Halbleitersubstratschicht über jeweilige
chemische Bindungen mit Elementen der Halbleitersubstratschicht
und der biologisch aktiven Komponente verbunden sind und die biologisch
aktive Komponente an mindestens einer Ankopplungsgruppe der Linkermoleküle anlagert. Die
Anbindungsschicht kann kovalent, über eine Salzbindung, über elektrostatische
Wechselwirkung, hydrophobe Wechselwirkung, Van-der-Waals Wechselwirkung
oder in ähnlicher
Weise gebunden sein. Auf diese Weise kann der Biosensor mit Hilfe
selektiv ausgewählter
Linkermoleküle
für verschieden
Analyseaufgaben individuell angepaßt werden.
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Eine
vorteilhafte Ausführungsform
der Erfindung sieht vor, daß die
Linkermoleküle
Photoradikale sind. Hierdurch ist es möglich, die Anbindungsschicht mit
den Linkermolekülen
mit Hilfe einer durch Licht induzierten Photoreaktion zu erzeugen.
Der Begriff Photoradikale in der hier verwendeten Bedeutung bezieht
sich auf photochemisch erzeugte/gebildete reaktionsfähige Verbindungen
bzw. Molekülreste, Atome
oder Ionen, insbesondere Radikale und Elektronenmangelverbindungen.
Gegenüber
bekannten Verfahren, bei denen in einer Schutzgasumgebung gearbeitet
werden muß,
ermöglicht
die Nutzung eines nicht anodischen, elektrochemischen Potentials und
von Photoradikalen als Linkermoleküle eine vereinfachte Herstellung
der Anbindungsschicht. Ein Verfahren zum Herstellen eines Biosensors
mit Hilfe von Photoradikalen ist in der mit der vorliegenden Anmeldung
zeitgleich eingereichten deutschen Anmeldung mit dem Titel „Verfahren
zum Herstellen einer Anordnung mit mehreren Schichten auf Basis
eines Halbleitersubstrats und Mehrschichtanordnung" zu entnehmen, deren
Inhalt hier mittels Referenz integriert wird. Diese Anmeldung beschreibt
darüber
hinaus ein hinsichtlich des Herstellens einer Mehrschichtanordnung
für einen
Biosensor bevorzugtes Verfahren, bei dem die elektrischen Leitfähigkeitseigenschaften über die
Grenzschicht zwischen dem Halbleiter, insbesondere Silizium, und
der organischen Schicht der sich ergebenden Schichtanordnung durch
die Vermeidung von Oxid auf der Halbleitersubstratschicht, insbesondere
in den für
die Leitfähigkeitsmessung
relevanten Bereichen der Halbleitersubstratschicht, vorteilhaft
ausgeprägt
werden.
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Eine
optimierte Leitfähigkeit
wird bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung dadurch erreicht,
daß die
chemischen Bindungen zwischen den Photoradikalen und den Elementen
der Halbleitersubstratschicht Si-N-Bindungen umfassen.
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Zweckmäßig kann
bei einer Ausführungsform
der Erfindung vorgesehen sein, daß die Photoradikale auf Basis
einer Arylazid-Verbindung, eines Benzophenon-Derivats und/oder eines
Diazirin-Derivats gebildet sind. Besonders bevorzugt werden als Photolinker
Halogen-Arylazid-Verbindungen
verwendet, beispielsweise Fluor-Arylazid-Derivate. Diese Verbindungsklasse
kann in verschiedenen Formen mit Ankopplungsgruppen versehen werden,
die einerseits während
der photoinduzierten Abscheidungsprozesse stabil sind, d. h. es
treten auch keine intramolekularen Reaktionen auf, und andererseits die
Fähigkeit
aufweisen, abhängig
von der Ankopplungsgruppe, unterschiedliche Moleküle, Ionen und/oder
Elemente zu binden.
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Die
Leitfähigkeitsmessung
kann zweckmäßig mit
Hilfe einer Strommessung oder einer Potentialmessung ausgeführt werden.
Hierbei ist es vorteilhaft, eine der beiden Größen konstant zu halten. Die Strommessung
ist bei konstantem elektrochemischen Potential vorteilhaft, da sie
im Vergleich zur Potentialmessung empfindlicher ist.
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Die
Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme
auf eine Zeichnung näher
erläutert.
Hierbei zeigen:
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1 eine schematische Darstellung
einer Meßanordnung
mit einem Biosensor;
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2 eine schematische Darstellung
einer Anordnung mehrerer Schichten;
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3 eine grafische Darstellung
einer Strom-Zeit-Kurve in einer Puffer-Lösung bei konstanter Spannung;
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4 eine grafische Darstellung
einer Strom-Zeit-Kurve in einer gepufferten Lösung mit biotinyliertem Peptid
und Streptavidin bei konstanter Spannung;
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5 eine grafische Darstellung
einer Strom-Zeit-Kurve mit einer Puffer-Lösung aus biotinyliertem Peptid
und Streptavidin bei konstanter Spannung ; und
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6 eine schematische Darstellung
eines Biosensors mit Anschlußelektroden.
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1 zeigt eine schematische
Darstellung einer Meßanordnung
zum Ausführen
einer elektrischen Leitfähigkeitsmessung
an einem Biosensor. Der verwendete Biosensor umfaßt in dem
Ausführungsbeispiel
gemäß 2 eine Schichtanordnung mit
einem einkristallinen Silizium-Wafer 1 mit atomar glatter
Oberfläche
und 1-1-1-Oberflächenorientierung,
bedeckt mit einem organischen Schichtsystem 2, welches
unmittelbar auf dem Wafer 1 eine Schicht 2a mit
Linkermolekülen
(Crosslinker) und hierauf abgeschieden eine Schicht 2b mit
biologisch aktiven Komponenten, beispielsweise Peptide (ein nicht
homooligomerisierender Leucin-Zipper) umfaßt, wobei die biologisch aktiven
Komponenten mit Hilfe der Linkermoleküle an den Wafer 1 über kovalente
chemische Bindungen gekoppelt sind.
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Gemäß 1 ist auf der Rückseite
des Silizium-Wafers 1 eine Indium-Gallium Paste aufgetragen, über welche
ein guter elektrischer Kontakt zu einem unterliegenden Metallteller 3 besteht.
Der Metallteller 3 ist mit einem Potentiostaten 4 verbunden, welcher
bevorzugt einen Rechner in Form eines üblichen Personalcomputers umfaßt oder
mit diesem verbunden ist. Auf der mit organischen Substanzen beschichteten
Vorderseite des Silizium-Wafers 1 ist ein nach oben und
unten hin offenes Teflongefäß 5 angeordnet.
Ein Viton-Dichtring 6 zwischen Teflongefäß 5 und
Silizium-Wafer 1 sorgt dafür, daß beim Befüllen des Gefäßes 5 mit
einer Lösung,
welche im Fall der Durchführung
einer Messung eine biologische Testsubstanz ist, keine Lösung ausläuft. Somit
stellt der beschichtete Silizium-Wafer 1 den Boden des Gefäßes 5 dar.
Das Teflongefäß 5 wird über im Metallteller 3 befestigte
Schrauben fixiert. In dem Gefäß 5 ist
oberhalb des organischen Schichtsystems 2 ein Wechselwirkungsabschnitt 7 gebildet, in
welchem die biologische Testsubstanz zu Meßzwecken eingebracht wird,
so daß Moleküle in der
Testsubstanz mit den biologisch aktiven Komponenten in dem Schichtsystem 2 Wechselwirken
können.
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In
das Gefäß 5 ragen
von ober her bis in den Wechselwirkungsabschnitt 7 zwei
als Anschlußelektroden
gebildete Golddrähte 8, 9,
welche mit dem Potentiostaten 4 elektrisch verbunden sind.
Hierbei dient ein Golddraht 8 als Referenzelektrode, ein Golddraht 9 als
Gegenelektrode, und der beschichtete Silizium-Wafer 1 stellt
eine Arbeitselektrode dar (drei Elektroden-Aufbau). Bei leitfähiger Lösung (biologische
Testsubstanz) im Gefäß 5 wird
ein konstantes Potential von etwa –1V am Potentiostaten 4 eingestellt. 3 zeigt eine Messung des
von der Leitfähigkeit
abhängigen
Stromes in Abhängigkeit
von der Zeit nach dem Einbringen der Puffer-Lösung in dem Wechselwirkungsabschnitt.
Bei einem konstant angelegtem Potential von –1V ist der Strom konstant und
kleiner 1 μA.
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Nach
Zugabe von Streptavidin zu der Pufferlösung (vgl. 4) sinkt der Strom in kurzer Zeit wieder
auf einen Wert kleiner 1 μA.
Streptavidin bindet nicht an das Peptid, mit welchem der Silizium-Wafer 1 beschichtet
ist (Negativkontrolle). Nach mehrmaligem Spülen des Gefäßes 5 (Lösung einfüllen und vollständig abpumpen)
mit Pufferlösung
führt Einfüllen von
Lösung
mit biotinyliertem Peptid Nr. 3 und Streptavidin in Puffer zu einem
starken Anstieg des Stromes auf einen Wert von größer 3 μA (vgl. 5). Das biotinylierte Peptid
Nr. 3, das über
die Biotinmarkierung an Streptavidin binden kann, bindet an das Peptid
mit welchem der Silizium-Wafer 1 beschichtet ist. Der Biosensor
zeigt diese Wechselwirkung als Leitfähigkeitsänderung zeitabhängig in
Echtzeit in Form eines erheblich größeren Stromflusses an.
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6 zeigt eine schematische
Darstellung eines Biosensors 60 mit einer Mehrschichtanordnung 62,
die eine Siliziumsubstratschicht 61, eine hierauf abgeschiedene
Schicht 63 mit Linkermolekülen, die über kovalente chemische Bindungen
mit dem Silizium der Silziumsubstratschicht 61 verbunden
sind, und eine auf der Schicht 63 angeordnete weitere Schicht 64 mit
biologisch aktiven Komponenten umfaßt. Oberhalb der weiteren Schicht 64 ist
ein Wechselwirkungsabschnitt 65 gebildet, in welchem eine Testsubstanz
mit einer Testkomponente, beispielsweise als Lösung oder Suspension, eingebracht
werden kann, so daß die
Testkomponente in Wechselwirkung mit der biologisch aktiven Komponente
der weiteren Schicht 64 treten kann. Der Wechselwirkungsabschnitt 65 weist
zwei Öffnungen 66, 67 auf,
so daß der
Wechselwirkungsabschnitt 65 von der Testsubstanz durchströmt werden
kann. Eine Anschlußelektrode 68 ist
an dem Wechselwirkungsabschnitt 64 angebracht. Eine weitere
Anschlußelektrode 69 steht mit
der Siliziumsubstratschicht 61 in elektrischem Kontakt
und ist beispielsweise mit Hilfe einer elektrisch leitenden Paste
ohne Siliziumoxid angebracht oder ist mittels Bedampfens einer Siliziumoxid
freien Oberfläche
mit Gold realisiert. Mit Hilfe der Anschlußelektrode 68 und
der weiteren Anschlußelektrode 69,
die zweckmäßig aus
einem geeigneten Metall, beispielsweise Gold, gebildet sind, sind
Anschlußmittel
zum Anschließen
des Biosensors 60 an einen elektrischen Stromkreis 70 gebildet,
welcher seinerseits nach 6 eine
Meßeinrichtung 71,
welche wahlweise eine Anzeigeeinrichtung umfaßt, und eine elektrische Potentialquelle 72 aufweist.
Die umfaßte Anzeigeeinrichtung
kann beispielsweise eine optische Anzeige sein, die durch farbliche Änderung
das Erfassen einer bestimmten elektrischen Leitfähigkeit und/oder einer Leitfähigkeitsänderung
ermöglicht, was
jeweils einer bestimmten Wechselwirkung zwischen der Testkomponete
in der Testsubstanz und der biologisch aktiven Komponente in der
weiteren Schicht 64 entsprechen kann. Mit Hilfe des elektrischen
Stromkreises können
Meßsignale
für die
elektrische Leitfähigkeit
und deren Änderung
zwischen der Anschlußelektrode 68 und
der weiteren Anschlußelektrode 69 über die
Mehrschichtanordnung 62 und den Wechselwirkungsabschnitt 65 gemessen werden.
Wahlweise können
die erfaßten
Meßwerte
in einem elektronischen, magnetischen oder optischen Speicher 73,
welcher in die Meßeinrichtung
integriert oder hiervon getrennt ausgeführt ist, in geeigneter Form
gespeichert werden, so daß die
Meßwerte
für ein
späteres
Auslesen und Auswerten mit einer geeigneten Einrichtung, beispielsweise
einem Computer, zur Verfügung
stehen.
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Die
erfaßten
Meßwerte
liefern Informationen über
eine vorhandene oder nicht ausgebildete (Negativtest) Wechselwirkung
zwischen der Testkomponente der Testsubstanz in dem Wechselwirkungsabschnitt 65 und
der biologisch aktiven Komponente in der weiteren Schicht 64.
Der elektrische Stromkreis 70 kann meßtechnisch vom Fachmann für den jeweiligen
Anwen dungsfall individuell angepaßt werden, insbesondere hinsichtlich
des benötigten
elektrischen Potentials und der benötigten Meßgeräte. Der Biosensor 60 und
der elektrische Stromkreis 70, auch einschließlich des
elektronischen Speichers 73, können insbesondere für mobile
Anwendungen als ein biosensorisches Meßsystem integriert sein, beispielsweise
in Form eines Einzelchips.
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Die
in 4 beobachtbare Bindung
zwischen der immobilisierten biologisch aktiven Komponente und der
gelösten
Testkomponente ist auf mehrgestaltige Wechselwirkungen in der Lösung zurückzuführen. Zum
einen finden Konformationsänderungen
der immobilisierten Komponente unter Ausbildung einer helikalen
Sekundärstruktur
statt und es erfolgt eine Bindung über hydrophobe Wechselwirkungen
und über
elektrostatische Wechselwirkungen (Salzbrücken) mit dem im Puffer gelösten Peptid
Nr. 3. Diese Wechselwirkungen sind von mehreren Faktoren abhängig, etwa
von dem Lösungsmittel,
der Ionenstärke,
dem pH-Wert und der Temperatur. Weiterhin ist Peptid Nr. 3, das
seinerseits bei der Bindung auch Konformationsänderungen eingeht, mit einem niedermolekularen
Molekül,
Biotin, markiert, über das
es in Wechselwirkung in Form von Bindung mit dem sich in der Lösung befindlichen
Protein Streptavidin steht.
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Mit
Hilfe des beschriebenen Biosensors ist es möglich, alle denkbaren biologischen
und biochemischen Wechselwirkungen zu detektieren, bei denen es
infolge der Wechselwirkungen zwischen der immobilisierten biologisch
aktiven Komponente und der Testkomponente in der Lösung oder
der Suspension zu einer Leitfähigkeitsänderung
kommt. Hierzu können
etwa Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Testkomponenten gehören, zum
Beispiel: Protein und Protein, Protein und Nukleinsäure, Protein
und Lipid, Protein (z.B. ein Lektin) und Kohlenhydrat (z.B. ein
Saccharid), Protein und niedermolekularer Stoff (z.B. Protein und
Metallion bei Zinkfinger-Proteinen), Protein und Ligand (z.B. Protein
und Peptid; Protein und Farbstoff, Antikörper und Antigen; Rezeptor
und Hormon; Protein und Biomimetikum; Protein und Pharmkon; Enzym
und Substrat oder Substrat-Inhibitor; Apo-Enzym und prosthetische
Gruppe; Transportsytern und Spezies), wobei nicht-kovalente Wechselwirkungen
(durch Wasserstoffbrücken,
hydrophobe Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Wechselwirkungen, Metall-Komplexierung,
Metallbindung oder elektrostatische Wechselwirkungen (z.B. elektrostatische
Bindungen wie Ionenbindungen bzw. Salzbindung)) und kovalente Bindungen
stattfinden können.
Ziel eines solchen Vorgehens bei nicht-kovalenten Bindungen kann
es sein, die Wechselwirkungen quantitativ (etwa durch Bestimmung
der Bindungskonstanten oder Größen der
Bindungskinetik) und/oder qualitativ (z.B. Art der Wechselwirkung und/oder
Abhängigkeit
von Temperatur, pH-Wert oder Ionenstärke) zu beschreiben. Weitere
beobachtete detektierbare Wechselwirkungen sind z.B. Nukleinsäure und
Testkomponente, Peptid und Testkomponente, Lipid und Testkomponente,
Kohlenhydrat und Testkomponente, Pharmakon und Testkomponente, Metall-Chelat
und Testkomponente, Metall und Testkomponente, Ionophor und Ion,
Organelle und Testkomponente, Virus und Testkomponente, Zelle und
Testkomponente, Gewebe und Testkomponente.
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Ist
die Belegung der Oberfläche
(z.B. auf einer atomar glatten Oberfläche) bekannt, können so auch
unbekannte Analytkonzentrationen in der Lösung bestimmt werden (bspw.
durch Aufbringen eines Nickel-Chelats, der an den Histidin-Tag eines
gelösten
Proteins bindet).
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Es
können
im Verlauf der Wechselwirkungen auch chemische Bindungen verändert werden,
z.B. können
kovalente Bindungen gebildet (etwa die kovalente Bindung beim Ausbilden
einer Disulfidbrücke)
oder gebrochen werden. Zu den Wechselwirkungen, die beobachtet werden
können,
zählen
insbesondere alle möglichen
biokatalytischen Prozesse und zwar insbesondere solche von Enzymen,
katalytischen Nukleinsäuren,
Organellen, Zellen oder Geweben, die mit Substraten, Cofaktoren,
Inhibitoren oder Aktivatoren wechselwirken.
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Ziel
dieses Vorgehens kann es sein, Größen der Enzymkinetik zu bestimmen.
Durch die enzymatische Substratumsetzung kann bei bekannter Belegung
der Oberfläche
mit Enzym oder Substrat (atomar glatte Oberfläche) auf unbekannte Analytkonzentration
(Substrat oder Enzym) geschlossen werden. Ein enzymatischer Prozeß kann beispielsweise die
Phosphorylierung (bzw. Dephosphorylierung) oder Glykosilierung eines
Proteins sein. Weiterhin können
Konformationsänderungen
von räumlichen Strukturen,
insbesondere der Protein-Tertiär-
oder Quartärstruktur)
beobachtet werden, z.B. Proteinfaltung oder Strukturänderungen
von Protein-Ligand Komplexen
durch Temperaturerhöhung
(daraus lassen sich thermodynamische Größen von Molekül-Molekül Wechselwirkungen
ableiten).
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Die
in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten
Merkmale der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung
der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von Bedeutung
sein.