WO2002031481A2 - Vorrichtung und verfahren zur elektrisch beschleunigten immobilisierung und zur detektion von molekülen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur elektrisch beschleunigten immobilisierung und zur detektion von molekülen Download PDF

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WO2002031481A2
WO2002031481A2 PCT/EP2001/011411 EP0111411W WO0231481A2 WO 2002031481 A2 WO2002031481 A2 WO 2002031481A2 EP 0111411 W EP0111411 W EP 0111411W WO 0231481 A2 WO0231481 A2 WO 0231481A2
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Claus Escher
Günter BROMMER
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Definitions

  • the object of the invention is a device and a method for the electrically accelerated immobilization of molecules and for their detection by means of electrical methods.
  • the detection of one or more different molecular structures from the solution is an essential part of many biochemical investigations.
  • a widely used method is to detect those
  • the molecular structures to be recognized are formed from ligands which are recognized and bound by specific receptors (catcher molecules).
  • ligands which are recognized and bound by specific receptors (catcher molecules).
  • catcher molecules include e.g. Antigen-antibody or
  • Ligand-receptor reactions or hybridizations of nucleic acids can be used as capture molecules which form stable and specific bonds with the molecules to be recognized.
  • capture molecules are mono- or polyclonal antibodies, antigens, enzymes, coenzymes, enzyme inhibitors and activators, proteins, hormones,
  • Hormone receptors agonists and antagonists for cell membrane receptors, oligosaccharides, lectins, toxins, pathogens, bacteria, oligonucleotides, nucleic acids, nucleic acid-binding proteins such as transcription factors, peptides or synthetic pairing systems such as PNA, p-RNA, p-DNA or CNA etc.
  • non-specific capture molecules such as lectins can also be used.
  • the inhibition of recognition by small molecules or the binding of small molecules to biomolecules themselves should also be mentioned in this context. The detection of the presence of such molecular structures and in many cases also their quantification is particularly important in drug development pharmaceutical industry, therapy tracking in medical treatment, medical diagnostics but also in agricultural sciences and forensics.
  • a chip As a rule, one wants to analyze a sample for several different target molecules at the same time.
  • the format of a chip is suitable for this, in which different sensor positions are defined on a flat substrate.
  • the selective loading of the different sensor positions with specific recognition molecules (capture molecules) can e.g. done with the help of a dispenser.
  • electrical or other methods can also be used.
  • Solid particles (beads), membrane structures or gels or also represent flat surfaces, such as microtiter plates or chips.
  • the substrate for immobilization because of the good electrical contacting possibilities, is the form of chips, analogous to those that have long been state of the art in semiconductor technology. This has the further advantage that experience and techniques of semiconductor technology can be used here. Examples of electrical methods and devices of this type are e.g. B. disclosed in WO-A-88/09499, EP-A-0543550, US-A-5653939, WO-A-97/21094 and WO-A-97/34140.
  • DE-A-197 41 716 describes an addressable modular recognition system containing at least one immobilized binding component with at least one binding site and at least one recognition species that can bind to the binding component.
  • the molecules to be detected are immobilized either directly on or between the measuring chip equipped with electrodes or on a layer provided on the chip.
  • US-A-5653939, WO-A-97/21094 and WO-A-97/34140 describe very fine structures in the sub- ⁇ m range
  • Electrodes described which have great advantages through higher sensitivity in impedance spectroscopy and redox recycling.
  • the method of redox recycling is also described in Sensors and Actuators B 26-27 (1995) 394-397.
  • the molecules are immobilized by means of electrophoresis near the electrode, thus increasing the immobilization rate. This significantly shortens the incubation time of the electrode or of the entire chip required to immobilize the target molecules. In particular, the need for a layer above the electrode which is impermeable to these molecules is pointed out. On the other hand, this layer must be permeable to water and small ions.
  • a selective loading with biological detection systems can also be carried out.
  • the electrical field application can also be used in the opposite direction to drive charged biomolecules away from the immediate vicinity of the electrode. In this way, for example, non-specifically bound target molecules or target molecules that are not completely complementary to the capture molecule (so-called mismatches) can be mobilized again, so that only the desired, precisely matching target molecules are mobilized
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • Permeation layer opened which has certain functional properties.
  • the impermeability for the biomolecules to be detected and the permeability for water and small ions are essential. Furthermore, this layer serves to protect the biomolecules from the adverse conditions caused by the
  • Electrolysis products such as H + , OH " , H 2 , 0 2 and free radicals are produced by typically keeping the biomolecules a few ⁇ m away from the electrode.
  • An integral and indispensable component of those disclosed in WO 96/01836 The device is also a so-called attachment layer for attaching the biomolecules, which is either integrated into the permeation layer or applied to it as a separate layer.
  • a disadvantage of the methods and devices described above is that with the proposed devices, coupling of electrically accelerated immobilization and hybridization on the one hand and electrical detection on the other hand is not possible or is possible only in an insufficient manner. This is because the accelerated immobilization and hybridization requires keeping the molecules to be detected away from the electrodes
  • Electrodes 2000,., 21, 157-164 a high sensitivity when reading out by means of impedance spectroscopy or redox recycling, however, requires the smallest possible electrode structures in the ⁇ m or sub- ⁇ m range, the molecules to be detected being immobilized as close as possible to the electrode must (Sensors and Actuators B 49, (1998) 73-80) in order to obtain high sensitivity.
  • this contradiction is solved in that a division of labor is carried out between an electrode or a set of electrodes which electrophoretically enriches the molecules to be detected, with the result of accelerated immobilization, and a second set of electrodes which is used for highly sensitive detection.
  • the object of the invention is therefore a device for electronic immobilization and detection of macromolecules, which has a carrier with a plurality of sensor positions arranged thereon, each sensor position consisting of at least one mobilization electrode and one sensor electrode, which can be independently assigned electrical potentials, and wherein at least one mobilization electrode is covered with a permeation layer which is impermeable to the macromolecules to be detected, but is permeable to water and small ions.
  • a device is preferred in which the sensor electrode can bind macromolecules.
  • Fig. 1 shows such an arrangement. So-called mobilization electrodes are located on a solid support (1) and an insulation layer (2) lying above it
  • FIG.1 also shows an enlarged section of a set of the mobilization and sensor electrodes.
  • Fig. 2 illustrates how, when the middle set of mobilization electrodes is loaded with a suitable electrical potential, the overlying area of the electrolyte (6) is enriched (7) with the molecules to be detected.
  • the carrier preferably consists of silicon, silicon dioxide, glass, ceramic or plastic or a composite of these substances.
  • the carrier can active semiconductor devices such as CMOS blocks included.
  • the mobilization and detection electrodes can have the same or different geometries and consist of the same or different electrically conductive materials. They preferably consist independently of one another of gold, platinum, palladium, silver, copper, aluminum or of carbon.
  • the two types of electrodes can lie in one plane or be offset in height.
  • the main difference between the two types of electrodes is that the mobilization electrodes are covered with a permeation layer that keeps the molecules to be detected away from these electrodes.
  • the sensor electrodes are either uncoated or covered with a thin layer that has functional groups for binding the molecules to be immobilized.
  • the molecules can be immobilized either on or directly above the sensor electrodes and / or on the permeation layer, but the immobilization preferably takes place on or immediately above the sensor electrodes.
  • the permeation layer can e.g. can be selected from the group agarose, polyacrylamide or polyurethane.
  • optical or radiometric methods can also be used to detect the molecules that are preferably immobilized on the sensor electrodes. If necessary, the molecules to be detected can also be labeled with electrically active labein or electrically active reporter groups such as ferrocene, PQQ or porphyrins in order to increase the sensitivity of the electrochemical or electrical analysis.
  • electrically active labein or electrically active reporter groups such as ferrocene, PQQ or porphyrins
  • the detection is preferably carried out electrically or electrochemically, e.g. by means of
  • auxiliary electrodes e.g. can be used as reference electrodes or current-dissipating counter electrodes. These auxiliary electrodes can e.g. mobilization electrodes present on the chip or other electrodes integrated on the chip or external electrodes in electrical contact with the electrolyte.
  • Impedance spectroscopy is preferred for impedance analysis.
  • An alternating voltage of different frequency is applied to the sensor electrodes.
  • the frequency of the AC voltage and the strength of the AC voltage applied are freely selectable.
  • a typical frequency range goes from 0.1 Hz to 20 MHz, a range from 1 Hz to 5 MHz is preferred.
  • a typical voltage range extends from 0.1 mV to 10 V, preferred is 1 to 100 mV.
  • the geometric arrangement and size of the electrodes can also be freely selected, by means of which the choice of the most advantageous frequency and voltage can also be controlled.
  • the sensor electrodes are so-called interdigital electrodes, which are distinguished by particularly high sensitivity (Sensors & Actuators B49 (1998) 73-80).
  • Fig. 3 shows such an embodiment for the example shown in Fig.1 in side view (3a) and in top view (3b).
  • the sensor electrodes (4) protrude into one another in the manner of fingers, it being possible for adjacent fingers to be electrically connected to one another. They are separated by insulating areas and one or more mobilization electrodes.
  • the mobilization electrodes are with a
  • Permeation layer (5) occupied, which was partially exposed to make the mobilization electrode (3) visible.
  • Fig. 4 (a) to (c) illustrate various embodiments of the height offset of mobilization and interdigitating sensor electrodes.
  • Insulation layer e.g. (Photostructurable) polyimide (8) applied to the continuous mobilization electrode (3), photostructured and the raised areas metallized (4).
  • the lateral structuring can also be done in other ways customary in photolithography.
  • the insulation layer which was initially still unstructured on the mobilization electrode, is also metallized and then the metal layer and insulation layer are structured by photolithographic processes.
  • Fig.4 (b) shows an embodiment in which the mobilization electrode (3) is structured and areas (2) not covered with the mobilization electrode are provided with a conductive web (9) insulated from the mobilization electrode, on which a conductive coating consisting of a suitable material is provided (4) is applied.
  • Fig.4 (c) shows the possibility of achieving a height offset through depressions (10) in the Si0 2 layer (2), which isolates the top of the chip from the Si substrate. Such depressions can, for example, be etched into the Si0 2 layer.
  • the mobilization electrodes (3) are recesses while the sensor electrodes (4) are on the raised areas.
  • Fig.4 (d) shows an embodiment in which several interdigitating fingers (1) on a raised area (2) without an intervening mobilization electrode
  • the number of immediately adjacent fingers can be chosen as desired, a number from 1 to 10 fingers is particularly preferred.
  • the height offset of the interdigitating sensor electrodes can be in the range from approximately -10 ⁇ m to +10 ⁇ m, they are preferably elevated or at the same height as the mobilization electrode, particularly preferably they have a height offset of 0 to 5 ⁇ m.
  • the permeation layer generally consists of agarose, polyacrylamide or polyurethane. Their layer thickness is typically in the ⁇ m range.
  • the necessary lateral structuring of the permeation layer can be carried out, for example, by photolithography or by electrodeposition of the permeation layer or an intermediate layer on the mobilization electrodes that promotes the permeation layer. If mobilization and sensor electrodes consist of different metallic materials, their selective binding behavior can be used for the selective application of a permeation layer.
  • Photolithographic structuring can be carried out, for example, by means of a lift-off process or by direct structuring of a photosensitive permeation layer. Photo-induced polymerization of suitable mono- and oligomers can also be used for the structured coating of the chip with a permeation layer.
  • the entire chip is coated, for example by means of spin coating, with a solution which, in addition to a polymerizable component, contains a photosensitive initiator component for the polymerization. Exposure using appropriate masks then leads to a laterally structured polymerization. The unpolymerized areas are then covered with a suitable solvent from the unpolymerized monomer or oligomer building blocks.
  • the permeation layer consists of two partial layers, the layer close to the electrode having the property of being structurable on the carrier and allowing the specific connection of a second layer. Special, particularly advantageous
  • Sensor positions consist of three independent electrodes, one mobilization and two sensor electrodes.
  • the two sensor electrodes can form narrow, long, finger-like structures and have a finger width of less than 2 ⁇ m.
  • Sensor electrodes that represent interdigital electrodes in which at least some interstices are filled by a mobilization electrode have proven successful.
  • the respective mobilization electrodes can also consist of several partial electrodes which are conductively interconnected in a layer deeper in the carrier.
  • the sensor positions are arranged in a two-dimensional array.
  • a grid size of 10 to 1,000 ⁇ m is preferably selected.
  • the electrodes of the sensor positions are coupled to an electrical control and read-out unit in order to enable detection.
  • the sensor positions can be wetted with a liquid electrolyte that contains the molecules to be detected.
  • a device in which the sensor positions in a flow chamber can be wetted with a liquid electrolyte has proven particularly useful.
  • the sensor electrodes of the various sensor positions are selectively equipped with known macromolecules as specific detection systems.
  • Catcher molecules can be connected directly to the sensor electrodes via functional groups that are covalently bound to the catcher molecules, such as thiollinkers in gold electrodes or via a functional sation of the metal surface, for example in the form of aminopropyltriethoxysilane, to which capture molecules functionalized with active ester are bound.
  • any remaining absorption capacity of the electrode surface after the capture molecules have been bound can be completely saturated with molecules which in the following steps do not bind to molecules to which the electrode is exposed, so that no further unspecific bonds to the electrode are possible.
  • These molecules are preferably very reactive as far as the connection to the electrode is concerned, so that as far as possible all remaining free reaction sites are occupied and they are preferably smaller than the actual capture molecules so as not to interfere with the subsequent recognition process.
  • the method of detecting the molecules which are preferably immobilized on the sensor electrodes can be by optical, radiometric or electrical
  • auxiliary electrodes e.g. can be used as reference electrodes or as current-dissipating counter electrodes. These auxiliary electrodes can mobilization electrodes present on the chip or others on the
  • Chip integrated electrodes or external electrodes in electrical contact with the electrolyte Chip integrated electrodes or external electrodes in electrical contact with the electrolyte.
  • the method according to the invention for accelerated immobilization and electrical detection of macromolecules comprises the following steps:
  • the mobilization electrodes are coated with a permeation layer that is permeable to water and small ions, but impermeable to molecules that bind to the electrode or it could isolate, and is also impermeable to the macromolecules to be detected and
  • the sensor electrodes either represent uncoated metal electrodes or are designed such that they can bind the macromolecules to be detected specifically or non-specifically;
  • the selected potentials will lead to the electrolysis of the water.
  • macromolecules to be immobilized or detected according to the invention are proteins, including the peptides, nucleic acids and their analogs, oligosaccharides.
  • the sensor electrodes are preferably designed such that they can bind the macromolecules to be detected specifically or non-specifically; in the case of specific binding, the sensor electrodes are provided with capture molecules, which can be specific proteins or peptides or also nucleic acids or oligonucleotides.
  • Impedance spectroscopy Redox recycling or impedance analysis is preferred for electrical detection, and impedance spectroscopy is very particularly preferred here used.
  • impedance spectroscopy an alternating voltage of different frequency is applied to the sensor electrodes.
  • the frequency of the AC voltage and the strength of the AC voltage applied are freely selectable.
  • a typical frequency range goes from 0.1 Hz to 20 MHz, a range from 1 Hz to 5 MHz is preferred.
  • a typical voltage range extends from 0.1 mV up to 10 V, but the range between 1 and 100 mV is preferred.
  • the geometric arrangement and size of the electrodes can also be freely selected, by means of which the choice of the most advantageous frequency and voltage can also be controlled. If necessary, the molecules to be detected can also be labeled with electrically active labels in order to increase the sensitivity of the
  • the immobilized macromolecules are used to influence the redox reactions at the sensor electrode.
  • the electrodes were then left in the refrigerator at 4 ° C. for 45 min in a steam-saturated atmosphere with evaporation protection with one drop each (10 ⁇ l) of a 100 ⁇ M solution of 3'-GGT AAA AGT CTT AAC CCA CA-5'-C 6 Hi 2 -SH in 1 M phosphate buffer (pH 6.6).
  • the Au electrodes were placed in 400 ⁇ l of a 1 mM mercaptohexanol solution in Eppendorf reaction vessels for 90 min at room temperature
  • Electrodes were dipped into a measuring-electrolyte consisting of a 20 mM [Fe (CN) 6] 3 "4" solution in 1 M phosphate buffer (half each Fe 2+ and Fe 3+) and made an impedance measurement.
  • the measurement itself was carried out with the IM6e impedance spectrometer from Zahner in a 3-electrode configuration.
  • the reference and counter electrodes were each formed by a platinum wire.
  • a first impedance spectrum of this monolayer of oligonucleotide capture molecules and mecaptohexanol from 0.1 Hz to 1 MHz was then recorded.
  • Figures 5a and 5b each show the mean values of the values measured by two of the four electrodes.
  • Fig. 5a clearly shows that the impedance at low frequencies increases significantly due to hybridization, while Fig. 5b shows that non-specific bindings do not play an important role.
  • Fig. 7 shows the scaling of the different elements of the equivalent circuit with the size of the electrode.
  • a capacitance connected in parallel is added to the equivalent circuit, which simulates the parasitic capacitance of our test setup of approx. 50 pF and thus limits our measuring range.
  • the limitation is shown in Fig. 7 by the diagonally running upper limitation of the family of curves, which makes the overlying part of a useful measurement inaccessible.
  • Electrode area The family of curves shows that the horizontal branch sensitive to the hybridization events can also be used in the low-frequency range for electrode sizes of 30 ⁇ m 2 and smaller at frequencies of 1 Hz and smaller to discriminate detection events.
  • the invention also relates to a method for electrically accelerated immobilization and for the electrical detection of electrically charged macromolecules, as described above, and for their electrical specificity selection comprising the steps: d) provision of sensor electrodes with the mobilization and sensor electrodes described above, wherein the sensor electrodes are permanently provided with a first type of recognition molecule and have reversibly bound a second type of macromolecule, and e) the mobilization electrodes have a sufficiently high electrical potential of suitable polarity and a sufficiently long duration, possibly also pulsating, to release all bonds from Macromolecules on the sensor electrodes except for the bonds with the highest bond strength.
  • the procedure described under e) can also be carried out by means of the sensor electrodes instead of by means of the mobilizing electrodes. If necessary, chemical washing processes or changes in temperature can support the electrical specificity selection.
  • the fixation of the molecules to be detected on the sensor electrode can be promoted by molecular layers with chemical adhesion groups, which can bind other molecules through a chemical reaction or complex formation. It is possible to track such binding events with high sensitivity.
  • a low molecular complexing agent such as biotin
  • Thiol function is bound to the electrode, this can then with a higher molecular complexation partner, z. B. streptavidin, to which any other molecules can be bound, are complexed.
  • the procedure is immunodetection.
  • Molecular layers are built up, which can consist of antigen, antibody or nucleic acid sequences.
  • haptens low molecular weight antigens
  • other antigens often proteins
  • the specific complex formation between the firmly anchored antigens and the antibodies in the test sample enables specific antibody detection in this way.
  • the antibodies can also be bound to the sensor electrodes and haptens or the like can be detected from the measurement sample.
  • a further embodiment of the method according to the invention is provided by using the device according to the invention for the electrical readout of hybridization processes in nucleic acid chemistry.
  • the device according to the invention for the electrical readout of hybridization processes in nucleic acid chemistry.
  • the invention after applying a sufficiently high electrical potential of suitable polarity and a sufficiently long duration, only those macromolecules remain on the sensor electrode which are particularly firmly bound. They can then be identified using an impedance analysis, in particular using impedance spectroscopy.
  • a redox recycling method can also be used to recognize the remaining, immobilized macromolecules.

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Abstract

Beschrieben wird eine Vorrichtung zur elektronischen Immobilisierung und Detektion von Makromolekülen. Diese weist einen Träger (1) mit mehreren darauf angeordneten Sensorpositionen auf, auf denen Makromoleküle immobilisiert werden können, wobei jede Sensorposition aus mindestens einer Mobilisierungselektrode (3) und einer Sensorelektorde (4) besteht, die unabhängig voneinander mit elektrischen Potentialen belegt werden können, und wobei die Mobilisierungselektroden wenigstens einer Sensorposition mit einer Permeationsschicht (5) überzogen sind, die undurchlässig für die zu detektierenden Makromoleküle, aber durchlässig für Wasser und kleine Ionen ist, und wobei die Sensorelektroden entweder unbeschichtete Metallelektroden darstellen oder so ausgebildet sind, dass sie die zu detektierenden Makromoleküle spezifisch oder unspezifisch binden können. Mit der beschriebenen Vorrichtung lässt sich eine beschleunigte elektrische Immobilisierung und Hybridisierung sowie eine hochempfindliche elektrische Detektion von Molekülen durchführen.

Description

Beschreibung
Vorrichtung und Verfahren zur elektrisch beschleunigten Immobilisierung und zur Detektion von Molekülen
Der Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zur elektrisch beschleunigten Immobilisierung von Molekülen und zu ihrer Detektion mittels elektrischer Methoden.
Die Detektion einer oder mehrerer unterschiedlicher Molekülstrukturen aus der Lösung heraus ist ein essentielles Bestandteil vieler biochemischer Unter- suchungen. Eine weit verbreitete Methode besteht darin, die zu detektierenden
Moleküle selektiv zu immobilisieren und anschließend zu detektieren.
Typischerweise werden die zu erkennenden Molekülstrukturen (Zielmoleküle) aus Liganden gebildet, die durch spezifische Rezeptoren (Fängermoleküle) erkannt und gebunden werden. Zu solchen Systemen gehören z.B. Antigen-Antikörper- oder
Ligand-Rezeptor-Reaktionen oder Hybridisierungen von Nukleinsäuren. Als Fängermoleküle können Verbindungen eingesetzt werden, die stabile und spezifische Bindungen mit den zu erkennenden Molekülen eingehen. Beispiele von Fängermolekülen sind mono- oder polyklonale Antikörper, Antigene, Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Proteine, Hormone,
Hormonrezeptoren, Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Oligosaccharide, Lectine, Toxine, Pathogene, Bakterien, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäure bindende Proteine wie z.B. Transkriptionsfaktoren, Peptide oder auch synthetische Paarungssysteme, wie PNA, p-RNA, p-DNA oder CNA etc.. Aber auch unspezifisch wirkende Fängermoleküle, wie z.B. Lectine sind verwendbar. Auch die Inhibierung der Erkennung durch kleine Moleküle oder die Bindung kleiner Moleküle an Biomoleküle selbst ist in diesem Zusammenhang zu nennen. Die Erkennung der Präsens solcher Molekülstrukturen und in vielen Fällen auch ihre Quantifizierung ist insbesondere in der Wirkstoffentwicklung der pharmazeutischen Industrie, der Therapieverfolgung bei medizinischer Behandlung, der medizinischen Diagnostik aber auch in den Agrarwissenschaften und der Forensik von Bedeutung.
In der Regel will man eine Probe auf mehrere verschiedenartige Zielmoleküle hin gleichzeitig analysieren. Dazu bietet sich das Format eines Chips an, bei dem auf einem ebenen Substrat verschiedene Sensorpositionen definiert sind. Die selektive Beladung der verschiedenen Sensorpositionen mit spezifischen Erkennungsmolekülen (Fängermoleküle) kann z.B. mit Hilfe eines Dispensers geschehen. Es können jedoch auch elektrische oder andere Verfahren genutzt werden.
Zum Zwecke der Detektion sind eine ganze Reihe von Verfahren entwickelt worden, wie Autoradiographie, Massenspektrometrie oder optische Auslesung z. B. mittels Fluoreszenzspektroskopie.
Die Nachteile dieser Verfahren sind vielfältig. Die meisten bedürfen einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung der Moleküle oder sind, wie die Massenspektrometrie und die optische Auslesung, apparativ aufwendig und schwierig zu miniaturisieren. Die Immobilisierung selbst findet dabei auf der Oberfläche von festen Substraten statt. Diese Substrate können z.B. dispergierte
Festkörperteilchen (beads), Membranstrukturen oder Gele sein oder auch ebene Oberflächen darstellen, wie Mikrotiterplatten oder Chips.
Wegen der oben beschriebenen Nachteile optischer oder radiographischer Detektionsmethoden wird in zunehmendem Maße daran gearbeitet, elektrische oder elektrochemische Verfahren für die Detektion zu nutzen. Dabei bietet sich als Substrat zur Immobilisierung wegen der guten elektrischen Kontaktierungsmöglich- keiten die Form von Chips an, analog denen, die in der Halbleitertechnik schon lange Stand der Technik sind. Dies hat den weiteren Vorteil, daß man hierbei Erfahrungen und Techniken der Halbleitertechnologie nutzen kann. Beispiele für elektrische Verfahren und Vorrichtungen dieser Art sind z. B. offenbart in WO-A-88/09499, EP-A-0543550, US-A-5653939, WO-A-97/21094 und WO-A- 97/34140.
Aus der WO-A-96/07917 ist eine elektronische Vorrichtung zum Einsatz für diagnostische Zwecke bekannt, auf einer ersten Oberfläche des Trägers angebracht sind Die DE-A-197 41 716 beschreibt ein adressierbares modulares Erkennungssystem enthaltend mindestens eine immobilisierte Bindungskomponente mit mindestens einer Bindungsstelle und mindestens eine Erkennungsspezies, die an die Bindungskomponente binden kann.
Bei allen diesen Verfahren werden die zu detektierenden Moleküle entweder direkt auf oder zwischen den mit Elektroden bestückten Messchip oder auf einer dafür vorgesehenen Schicht auf dem Chip immobilisiert. In US-A-5653939, WO-A- 97/21094 und WO-A-97/34140 werden sehr feine, im sub-μm-Bereich strukturierte
Elektroden beschrieben, die große Vorteile durch höhere Sensitivität bei der Impedanzspektroskopie und dem Redox-Recycling besitzen. Die Methode des Redox-Recycling wird auch beschrieben in Sensors and Actuators B 26-27 (1995) 394-397.
In US-A-4787963 und WO-A-96/01836 wird ein Verfahren vorgestellt, wie die Immobilisierung der zu detektierenden Moleküle in wässriger Lösung elektrisch gesteuert und beschleunigt werden kann. Dabei nutzt man die Tatsache aus, daß die meisten der interessierenden Moleküle in der Lösung in ionischer Form, also elektrisch geladen, vorliegen. Zur Steuerung und Beschleunigung der
Immobilisierung werden die Moleküle mittels Elektrophorese nahe der Elektrode angereichert und so die Immobilisierungsrate erhöht. Dies verkürzt die zur Immobilisierung der Zielmoleküle notwendige Inkubationszeit der Elektrode bzw. des gesamten Chips deutlich. Dabei wird insbesondere auf die Notwendigkeit einer für diese Moleküle undurchlässigen Schicht über der Elektrode hingewiesen. Auf der anderen Seite muß diese Schicht durchlässig für Wasser und kleine Ionen sein.
In WO-A-96/01836 wird weiterhin offenbart, daß mit diesem Verfahren neben der selektiven und beschleunigten Immobilisierung der zu detektierenden Moleküle (Zielmoleküle) auch eine selektive Beladung mit biologischen Erkennungssystemen (Fängermoleküle) vorgenommen werden kann. Darüberhinaus kann die elektrische Feldapplikation auch in umgekehrter Richtung zum Wegtreiben geladener Biomoleküle aus der unmittelbaren Umgebung der Elektrode genutzt werden. Auf diese Weise können z.B. unspezifisch gebundene Zielmoleküle oder zum Fängermolekül nicht ganz komplementäre Zielmoleküle (sog. Mismatches) wieder mobilisiert werden, so daß nur die gewünschten genau passenden Zielmoleküle
« immobilisiert übrigbleiben.
Bekanntestes Beispiel hierfür ist bei der Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen die Diskriminierung zwischen genau passenden komplementären Nukleotidsträngen und solchen, bei denen eine Base nicht das entsprechende, passende Pendant vorfindet, also die Detektion von sog. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Diese Diskriminierungsmöglichkeit wird gemeinhin als Stringenzkontrolle bezeichnet und ist z.B. beschrieben in WO-A-96/01836 und in Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 94, 1119-1123, Feb. 1997.
In US-A-5653939 wird zwar auch auf die Möglichkeit einer Beschleunigung der Immobilisierung von Oligonukleotiden und deren Hybridisierung hingewiesen, jedoch wird nicht offenbart, wie dies effizient geschehen kann. In WO-A-96/01836 und z.B. in Electrophoresis 2000, 21, 157-164 wird dargelegt, daß dazu die Aufrechterhaltung eines Stromes notwendig ist, was seinerseits durch das Aufrechterhalten einer laufenden Elektrolyse erreicht wird. Diese Möglichkeit wird, wie in WO-A-96/01836 offenbart wird, durch eine besondere, sogenannte Permeation Layer oder
Permeationsschicht eröffnet, die bestimmte funktionelle Eigenschaften besitzt.
Dabei sind unabdingbar die Undurchlässigkeit für die zu detektierenden Biomoleküle und die Durchlässigkeit für Wasser und kleine Ionen. Des weiteren dient diese Schicht zum Schutz der Biomoleküle vor den adversen Bedingungen, die durch die
Elektrolyseprodukte wie H+, OH", H2, 02 und freie Radikale hervorgerufen werden, indem sie die Biomoleküle typisch,erweise einige μm von der Elektrode entfernt hält. Integraler und unverzichtbarer Bestandteil der in WO 96/01836 offenbarten Vorrichtung ist weiterhin ein sogenannter Attachment Layer zum Anbinden der Biomoleküle, die entweder in die Permeationsschicht integriert oder als separate Schicht auf sie aufgebracht wird.
Nachteil der oben geschilderten Verfahren und Vorrichtungen ist, daß mit den vorgeschlagenen Vorrichtungen eine Kopplung von elektrisch beschleunigter Immobilisierung und Hybridisierung auf der einen Seite und elektrischer Detektion auf der anderen Seite nicht oder nur in ungenügender Weise möglich ist. Dies liegt darin begründet, daß die beschleunigte Immobilisierung und Hybridisierung ein Fernhalten der zu detektierenden Moleküle von den Elektroden erfordert
(Electrophoresis 2000,.,21 , 157-164), eine hohe Sensitivität beim Auslesen mittels Impedanzspektroskopie oder Redox-Recycling jedoch möglichst kleiner Elektrodenstrukturen im μm oder sub-μm-Bereich bedarf, wobei die zu detektierenden Moleküle möglichst nahe an der Elektrode immobilisiert werden müssen (Sensors and Actuators B 49, (1998) 73-80), um hohe Sensitivität zu erhalten.
Erfindungsgemäß wird dieser Widerspruch dadurch gelöst, daß eine Arbeitsteilung vorgenommen wird zwischen einer Elektrode oder einem Satz von Elektroden, der die zu detektierenden Moleküle elektrophoretisch anreichert mit der Folge einer beschleunigten Immobilisierung und einem zweiten Satz von Elektroden, der für eine hochsensitive Detektion genutzt wird.
Der Gegenstand der Erfindung ist deshalb eine Vorrichtung zur elektronischen Immobilisierung und Detektion von Makromolekülen, die einen Träger mit mehreren darauf angeordneten Sensorpositionen aufweist, wobei jede Sensorposition aus mindestens einer Mobilisierungselektrode und einer Sensorelektrode besteht, die unabhängig voneinander mit elektrischen Potentialen belegt werden können, und wobei wenigstens eine Mobilisierungselektrode mit einer Permeationsschicht überzogen ist, die undurchlässig für die zu detektierenden Makromoleküle, aber durchlässig für Wasser und kleine Ionen ist. Bevorzugt ist eine Vorrichtung bei der die Sensorelektrode Makromoleküle binden kann.
Abb. 1 zeigt eine solche Anordnung. Auf einem festen Träger (1) und einer darüber- liegenden Isolationsschicht (2) befinden sich sogenannte Mobilisierungselektroden
(3) und Detektions- oder Sensorelektroden (4). Über den Mobilisierungselektroden befindet sich eine Permeationsschicht (5). Abb.1 zeigt auch einen vergrößerten Ausschnitt eines Satzes der Mobilisierungs- und Sensorelektroden.
Abb.2 illustriert, wie bei Beaufschlagung des mittleren Satzes von Mobilisierungselektroden mit einem geeigneten elektrischen Potential der darüberiiegende Bereich des Elektrolyten (6) mit den zu detektierenden Molekülen angereichert (7) wird.
Der Träger besteht vorzugsweise aus Silizium, Siliziumdioxid, Glas, Keramik oder Kunststoff oder aus einem Verbund dieser Stoffe.
Erfindungsgemäß kann der Träger aktive Halbleiterbausteine wie z.B. CMOS- Bausteinen enthalten.
Die Mobilisierungs- und Detektionselektroden können dabei gleiche oder verschiedene Geometrien aufweisen und aus gleichen oder verschiedenen elektrisch leitfähigen Materialien bestehen. Vorzugsweise bestehen sie unabhängig voneinander aus Gold, Platin, Palladium, Silber, Kupfer, Aluminium oder aus Kohlenstoff.
Die beiden Elektrodenarten können in einer Ebene liegen oder höhenversetzt aufgebracht sein.
Der wesentliche Unterschied zwischen den beiden Elektrodenarten besteht darin, dass die Mobilisierungselektroden mit einer Permeationsschicht belegt sind, die die zu detektierenden Moleküle von diesen Elektroden fernhält. Die Sensorelektroden sind entweder unbeschichtet oder mit einer dünnen Schicht belegt, die funktionelle Gruppen zur Anbindung der zu immobilisierenden Moleküle besitzt. Die Immobilisierung der Moleküle kann sowohl auf oder unmittelbar über den Sensorelektoden und/oder auf der Permeationsschicht erfolgen, bevorzugt findet die Immobilisierung jedoch auf bzw. unmittelbar über den Sensorelektroden statt.
Die Permeationsschicht kann dabei z.B. aus der Gruppe Agarose, Polyacrylamid oder Polyurethan ausgewählt werden.
Zur Detektion der vorzugsweise auf den Sensorelektroden immobilisierten Molekülen können neben elektrochemischen bzw. elektrischen auch optische oder radiometrische Verfahren eingesetzt werden. Gegebenenfalls können die zu detektierenden Moleküle auch mit elektrisch aktiven Labein oder elektrisch aktiven Reportergruppen, wie Ferrocen, PQQ oder Porphyrinen markiert werden, um die Sensitivität der elektrochemischen oder elektrischen Analyse zu erhöhen.
Bevorzugt erfolgt die Detektion elektrisch bzw. elektrochemisch, z.B. mittels
Cyclovoltammetrie, ganz besonders bevorzugt sind dabei die Impedanzanalyse und das Redox-Recycling. Dabei können neben den Sensorelektroden weitere Hilfselektroden z.B. als Referenzelektroden oder stromabführende Gegenelektroden zum Einsatz kommen. Diese Hilfselektroden können z.B. auf dem Chip vorhandene Mobilisierungselektroden oder andere auf dem Chip integrierte Elektroden oder externe mit dem Elektrolyt in elektrischem Kontakt befindliche Elektroden sein.
Bei der Impedanzanalyse wird bevorzugt die Impedanzspektroskopie verwendet. Dabei wird an die Sensorelektroden eine Wechselspannung unterschiedlicher Frequenz angelegt. Die Frequenz der Wechselspannung sowie die Stärke der angelegten Wechselspannung sind frei wählbar. Ein typischer Frequenzbereich geht dabei von 0,1 Hz bis 20 MHz, bevorzugt ist ein Bereich von 1 Hz bis 5 MHz. Ein typischer Spannungsbereich reicht von 0,1 mV bis zu 10 V, bevorzugt ist hier 1 bis 100mV.
Ebenso frei wählbar ist die geometrische Anordnung und Größe der Elektroden, durch die auch die Wahl der vorteilhaftesten Frequenz und Spannung gesteuert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform stellen die Sensorelektroden sog. Interdigital- elektroden da, die sich durch besonders hohe Sensitivität auszeichnen (Sensors & Actuators B49 (1998) 73-80).
Äbb.3 zeigt eine solche Ausführungsform für das in Abb.1 gezeigte Beispiel in Seitenansicht (3a) und in Aufsicht (3b). Die Sensorelektroden (4) ragen fingerförmig ineinander, wobei benachbarte Finger elektrisch gegeneinander geschaltet werden können. Sie sind getrennt durch isolierende Bereiche und eine oder mehrere Mobilisierungselektroden. Die Mobilisierungselektroden sind mit einer
Permeationsschicht (5) belegt, die zur Sichtbarmachung der Mobilisierungselektrode (3) teilweise freigelegt wurde.
In Abb.4(a) bis (c) sind verschiedene Ausführungsformen des Höhenversatzes von Mobilisierungs- und interdigitierenden Sensorelektroden illustriert. In (a) wird eine
Isolationsschicht, z.B. (photostrukturierbares) Polyimid (8) auf die durchgehende Mobilisierungselektrode (3) aufgebracht, photostrukturiert und die erhabenen Bereiche metallisiert (4). Die laterale Strukturierung kann auch auf andere in der Photolitographie übliche Weisen geschehen. So kann z.B. auch die zunächst noch unstrukturiert auf der Mobilisierungselektrode aufgebrachte Isolationsschicht metallisiert werden und anschließend Metallschicht und Isolationsschicht durch photolithographische Verfahren strukturiert werden.
Abb.4(b) zeigt eine Ausführungsform bei der die Mobilisierungselektrode (3) strukturiert ist und nicht mit Mobilisierungselektrode belegte Bereiche (2) mit einem von der Mobilisierungselektrode isolierten leitfähigen Steg (9) versehen sind, auf dem eine aus geeignetem Material bestehende leitfähige Beschichtung (4) aufgebracht ist.
Abb.4(c) zeigt die Möglichkeit der Erzielung eines Höhenversatzes durch Vertiefungen (10) in der Si02-Schicht (2), die die Oberseite des Chips vom Si-Substrat isoliert. Solche Vertiefungen können z.B. in die Si02-Schicht geätzt werden. In den Vertiefungen liegen die Mobilisierungselektroden (3) während sich die Sensorelektroden (4) auf den erhabenen Stellen befinden.
Abb.4(d) stellt eine Ausführungsform dar, bei der mehrere interdigitierende Finger (1) auf einer erhabenen Stelle (2) ohne zwischenliegende Mobilisierungselektrode
(4) eng benachbart nebeneinander angeordnet sind. Diese Variante ist besonders bevorzugt bei Anwendungen, bei denen es auf hohe Sensitivität ankommt und auch besonders bevorzugt beim Redox-Recycling. Die Anzahl der unmittelbar benachbarten Finger kann dabei beliebig gewählt werden, besonders bevorzugt ist eine Anzahl von 1 bis 10 Finger.
Der Höhenversatz der interdigitierenden Sensorelektroden kann im Bereich von etwa -10 μm bis +10 μm liegen, bevorzugt sind sie gegenüber der Mobilisierungselektrode erhöht oder auf gleicher Höhe, besonders bevorzugt weisen sie einen Höhenversatz von 0 bis 5 μm auf.
Die Permeationsschicht besteht im allgemeinen aus Agarose, Polyacrylamid oder Polyurethan. Typischerweise liegt ihre Schichtdicke im μm-Bereich. Die notwendige laterale Strukturierung der Permeationsschicht kann z.B. photolithographisch vorgenommen werden oder durch Elektro-Abscheidung der Permeationsschicht oder einer für die Permeationsschicht haftvermittelnden Zwischenschicht auf den Mobilisierungselektroden. Bestehen Mobilisierungs- und Sensorelektroden aus verschiedenen metallischen Materialien, kann deren selektives Bindungsverhalten zu einer selektiven Aufbringung einer Permeationsschicht genutzt werden. Eine photolithographische Strukturierung kann z.B. durch ein lift-off-Verfahren oder durch eine direkte Strukturierung einer photoempfindlichen Permeationsschicht vorgenommen werden. Es kann auch eine photoinduzierte Polymerisation von geeigneten Mono- und Oligomeren zur strukturierten Belegung des Chips mit einer Permeationsschicht verwendet werden. Dabei wird der ganze Chip z.B. mittels Spin Coating mit einer Lösung beschichtet, die neben einem polymerisierbaren Baustein eine photosensitive Initiatorkomponente zur Polymerisation enthält. Eine Belichtung mittels entsprechender Masken führt dann zu einer lateral strukturierten Polymerisation. Die nicht polymerisierten Bereiche werden dann mit einem geeigneten Lösungsmittel von den nicht polymerisierten Monomer- oder Oligomerbausteinen befreit. In einer anderen Ausführungsform besteht die Permeationsschicht aus zwei Teilschichten, wobei die elektrodennahe Schicht die Eigenschaft der Strukturierbarkeit auf dem Träger besitzt und die spezifische Anbindung einer zweiten Schicht ermöglicht. Spezielle, besonders vorteilhafte
Sensorpositionen bestehen aus drei unabhängigen Elektroden, einer Mobilisierungsund zwei Sensorelektroden. Dabei können die beiden Sensorelektroden schmale, lange, fingerähnliche Strukturen bilden und eine Fingerbreite von unter 2 μm aufweisen. Bewährt haben sich Sensorelektroden, die Interdigitalelektroden darstellen, bei denen zumindest einige Zwischenräume durch eine Mobilisierungselektrode ausgefüllt sind. Die jeweiligen Mobilisierungselektroden können auch aus mehreren Teileiektroden bestehen, die in einer tiefer im Träger liegenden Schicht leitfähig zusammengeschaltet sind.
Im allgemeinen sind die Sensorpositionen in einem zweidimensionalen Array angeordnet. Dabei wird vorzugsweise ein Rastermaß von 10 bis 1.000 μm gewählt.
Die Elektroden der Sensorpositionen sind an eine elektrische Steuerungs- und Ausleseeinheit angekoppelt, um eine Detektion zu ermöglichen.
Zur Detektion ist es erforderlich, dass die Sensorpositionen mit einem flüssigen Elektrolyten benetzt werden können, der die zu detektierenden Moleküle enthält.
Besonders bewährt hat sich dabei eine Vorrichtung, bei der die Sensorpositionen in einer Durchflusskammer mit einem flüssigen Elektrolyten benetzt werden können.
Zur Detektion ist es weiterhin erforderlich, dass die Sensorelektroden der verschiedenen Sensorpositionen selektiv mit bekannten Makromolekülen als spezifischen Erkennungssystemen bestückt sind.
Die Anbindung von Fängermolekülen kann direkt auf den Sensorelektroden erfolgen über funktioneile Gruppen, die kovalent an die Fängermoleküle gebunden sind, wie Thiollinkern bei Elektroden aus Gold oder über eine vorausgeschaltete Funktionali- sierung der Metalloberfläche z.B. in Form von Aminopropyltriethoxysilan an das mit Aktivester funktionalisierte Fängermoleküle gebunden werden.
Eine gegebenenfalls verbleibende Aufnahmekapazität der Elektrodenoberfläche nach Anbindung der Fängermoleküle kann vollständig mit Molekülen abgesättigt werden, die in den folgenden Schritten keine Bindung mit Molekülen eingehen, denen die Elektrode ausgesetzt wird, so daß keine weiteren unspezifischen Bindungen an die Elektrode möglich sind. Diese Moleküle sind vorzugsweise sehr reaktiv, was die Anbindung an die Elektrode betrifft, damit möglichst alle verbleibenden freien Reaktionsstellen besetzt werden und sie sind vorzugsweise kleiner als die eigentlichen Fängermoleküle, um den nachfolgenden Erkennungsprozeß nicht zu stören.
Das Verfahren der Detektion der vorzugsweise auf den Sensorelektroden immobilisierten Molekülen kann durch optische, radiometrische oder elektrische
Verfahren erfolgen. Bevorzugt sind jedoch elektrische Detektionsmethoden, ganz besonders die Impedanzanalyse und das Redox-Recycling. Dabei können neben den Sensorelektroden weitere Hilfselektroden z.B. als Referenzelektroden oder als stromabführende Gegenelektroden zum Einsatz kommen. Diese Hilfselektroden können auf dem Chip vorhandene Mobilisierungselektroden oder andere auf dem
Chip integrierte Elektroden oder externe mit dem Elektrolyt in elektrischem Kontakt befindliche Elektroden sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur beschleunigten Immobilisierung und elektrischen Detektion von Makromolekülen umfasst die folgenden Schritte:
a) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition mit Mobilisierungs- und Sensorelektroden, wobei
aa) die Mobilisierungselektroden mit einer Permeationsschicht überzogen sind, die durchlässig ist für Wasser und kleine Ionen, jedoch undurchlässig für Moleküle, die an der Elektrode anbinden oder sie isolieren könnten, und auch undurchlässig ist für die zu detektierenden Makromoleküle und
bb) die Sensorelektroden entweder unbeschichtete Metallelektroden darstellen oder so ausgebildet sind, dass sie die zu detektierenden Makromoleküle spezifisch oder unspezifisch binden können;
b) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, der die zu immobilisierenden Makromomoleküle in gelöster Form enthält,
c) Beaufschlagung der Mobilisierungselektroden mit einem genügend hohen Potential geeigneter Polarität zur Verdichtung der geladenen Makromoleküle in der unmittelbaren Umgebung der Sensorposition, und
d) elektrische Detektion der zu detektierenden Makromoleküle mit einem geeigneten Detektionsverfahren.
In der Regel werden die dabei gewählten Potentiale zur Elektrolyse des Wassers führen.
Beispiele für erfindungsgemäß zu immobilisierende bzw. zu detektierende Makromoleküle sind Proteine, einschließlich der Peptide, Nukleinsäuren und deren Analoge, Oligosaccharide.
Bevorzugt sind die Sensorelektroden so ausgebildet, daß sie die zu detektierenden Makromoleküle spezifisch oder unspezifisch binden können; im Falle der spezifischen Bindung sind die Sensorelektroden mit Fängermolekülen versehen, die spezifische Proteine oder Peptide sein können oder auch Nukleinsäuren oder Oligonukleotide.
Zur elektrischen Detektion wird vorzugsweise das Redox-Recycling oder die Impedanzanalyse, hier ganz besonders bevorzugt die Impedanzspektroskopie verwendet. Im Falle der Impedanzspektroskopie wird an die Sensorelektroden eine Wechselspannung unterschiedlicher Frequenz angelegt. Die Frequenz der Wechselspannung sowie die Stärke der angelegten Wechselspannung sind frei wählbar. Ein typischer Frequenzbereich geht dabei von 0,1 Hz bis 20 MHz, bevorzugt ist ein Bereich von 1 Hz bis 5 MHz. Ein typischer Spannungsbereich reicht von 0,1 mV bis zu 10 V, bevorzugt ist jedoch der Bereich zwischen 1 bis 100mV. Ebenso frei wählbar sind die geometrische Anordnung und Größe der Elektroden, durch die auch die Wahl der vorteilhaftesten Frequenz und Spannung gesteuert werden kann. Gegebenenfalls können die zu detektierenden Moleküle auch mit elektrisch aktiven Labein markiert werden, um die Sensitivität der
Impedanzanalyse zu erhöhen. Es ist auch möglich, zur Detektion elektrochemische Reaktionen wie Oxidationen oder Reduktionen von elektrisch aktiven Molekülen zu nutzen, die dem Elektrolyten zugefügt werden.
Dabei wird die Beeinflussung der Redox-Reaktionen an der Sensorelektrode durch die immobilisierten Makromoleküle genutzt.
Bei der Impedanzanalyse zur Erkennung von Hybridisierungsvorgängen auf den Sensorelektroden erzielt man umso höhere Empfindlichkeiten, je kleiner die Fläche der Sensorelektroden ist. Dies und die prinzipiell zu erzielende Empfindlichkeit soll folgendes Beispiel illustrieren.
Anwendungsbeispiel zur Erkennung von Hybridisierungsereignissen durch Impedanzanalyse:
Vier runde Goldelektroden der Firma CH Instruments, Ine (part no. CH1 101 ) mit einem Durchmesser von 2 mm wurden zunächst durch einen mechanischen Schleifprozeß und dann mittels cyclovoltammetrischer Behandlung in 0,5 M Hcl04 gereinigt und aktiviert.
Danach wurden die Elektroden für 45 min im Kühlschrank bei 4°C in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit Verdampfungsschutz mit je einem Tropfen (10 μl) einer 100 μM Lösung von 3'-GGT AAA AGT CTT AAC CCA CA-5'-C6Hi2-SH in 1 M Phosphatpuffer (pH 6,6) inkubiert.
Unmittelbar darauf wurden die Au-Elektroden für 90 min bei Raumtemperatur in Eppendorf-Reaktionsgefäßen in 400 μl einer 1 mM Mercaptohexanollösung in
Reinstwasser getaucht.
Unmittelbar danach wurden die Elektroden in einen Meß-Elektrolyten, bestehend aus einer 20 mM [Fe(CN)6]3" 4" Lösung in 1 M Phosphatpuffer (je zur Hälfte Fe2+ und Fe3+) getaucht und eine Impedanzmessung vorgenommen. Die Messung selbst erfolgte mit dem Impedanzspektrometer IM6e der Fa. Zahner in einer 3-Elektroden Konfiguration. Referenz und Gegenelektrode wurden jeweils durch einen Platindraht gebildet. Dann wurde ein erstes Impedanzspektrum dieser Monoschicht aus Oligonukleotid-Fängermolekülen und Mecaptohexanol von 0,1 Hz bis 1 MHz aufgenommen. Die Abb. 5a und 5b zeigen jeweils die Mittelwerte der von zwei der vier Elektroden gemessenen Werte.
Danach erfolgte die Inkubation der beiden der Abb. 5a zugrundeliegenden Elektroden mit dem zum Fänger komplementären Oligonukleotid 5'-CCA TTT TCA GAA TTG GGT GT-51 und der beiden der Abb. 5b zugrundeliegenden Elektroden mit dem nichtkomplementären Oligonukleotid 3'-GGT AAA AGT CTT AAC CCA CA-5'.
Diese Inkubation erfolgte auf dieselbe Weise wie die der Fänger mit dem einzigen Unterschied, daß die Dauer 60 statt 45 min betrug. Ebenso erfolgte die Messung des Impedanzspektrums auf dieselbe Weise. Abb. 5a und 5b zeigen die jeweiligen
Veränderungen des vermessenen Spektrums.
Abb. 5a zeigt klar, daß die Impedanz bei niedrigen Frequenzen durch die Hybridisierung deutlich ansteigt während Abb. 5b beweist, daß unspezifische Bindungen keine wesentliche Rolle spielen.
Um den Einfluß der Elektrodengröße zu ermitteln, wurden die gemessenen Kurven durch die in Abb. 6 dargestellte Ersatzschaltung simuliert. Die physikalischen Bedeutungen der verschiedenen Elemente des Ersatzschaltbildes können einschlägigen Lehrbüchern, wie z.B. Carl H. Hamann, Wolf Vielstich: Elektrochemie ISBN 3-527-27894-X, entnommen werden. Die durchgezogenen Simulationskurven in Abb. 6 zeigen eine exzellente Übereinstimmung mit den eingezeichneten Meßpunkten.
Die Skalierungen der verschiedenen Elemente der Ersatzschaltung mit der Größe der Elektrode zeigt Abb. 7. Dabei ist der Ersatzschaltung noch eine parallel geschaltete Kapazität hinzugefügt, die die parasitäre Kapazität unseres Meßaufbaus von ca. 50 pF simuliert und unseren Meßbereich insofern begrenzt. Die Begrenzung kommt in Abb. 7 durch die diagonal verlaufende obere Begrenzung der Kurvenschar zum Ausdruck, die den darüberliegenden Teil einer nutzvollen Messung unzugänglich macht.
Ein Zuwachs von n um 1 bedeutet jeweils eine um eine Größenordnung kleinere
Elektrodenfläche. Die Kurvenschar zeigt, daß der für die Hybridisierungsereignisse sensitive waagerechte Ast im niederfrequenten Bereich auch noch bei Elektrodengrößen von 30 μm2 und kleiner bei Frequenzen von 1 Hz und kleiner zur Diskriminierung von Erkennungsereignissen verwendet werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur elektrisch beschleunigten Immobilisierung und zur elektrischen Detektion von elektrisch geladenen Makromolekülen, wie oben beschrieben, sowie zu deren elektrischen Spezifitäts- selektion umfassend die Schritte: d) Bereitstellung von Sensorelektroden mit den vorstehend beschriebenen Mobilisierungs- und Sensorelektroden, wobei die Sensorelektroden fest mit einer ersten Sorte von Erkennungsmolekülen versehen sind und eine zweite Sorte von Makromolekülen reversibel gebunden haben, und e) Beaufschlagung der Mobilisierungselektroden mit einem genügend hohen elektrischen Potential geeigneter Polarität und genügend langer Dauer, gegebenenfalls auch pulsierend, zur Lösung aller Bindungen von Makromolekülen auf den Sensorelektroden bis auf die Bindungen mit der höchsten Bindungsstärke.
Die unter e) geschilderte Vorgehensweise kann statt mittels der Mobilisierungs- elektroden auch mittels der Sensorelektroden vorgenommen werden. Bei Bedarf können chemische Waschprozesse oder Temperaturänderungen die elektrische Spezifitätsselektion unterstützen.
Die Fixierung der zu detektierenden Moleküle auf der Sensorelektrode kann dabei durch Molekülschichten mit chemischen Haftgruppen gefördert werden, die durch eine chemische Reaktion oder eine Komplexbildung weitere Moleküle binden können. Es gelingt dabei, mit hoher Empfindlichkeit derartige Bindungsereignisse zu verfolgen.
Wenn beispielsweise ein niedermolekularer Komplexbildner, wie Biotin, über eine
Thiolfunktion an die Elektrode gebunden wird, kann dieser anschließend mit einem höhermolekularen Komplexbildungspartner, z. B. Streptavidin, an welches beliebige weitere Moleküle gebunden sein können, komplexiert werden.
Eine besonders wichtige und sehr breit einsetzbare Anwendung des vorliegenden
Verfahrens ist die Immunodetektion. Dabei wird der Aufbau von Molekülschichten vorgenommen, die aus Antigen-, Antikörper- oder Nukleinsäuresequenzen bestehen können. Zum Nachweis von Antikörpern in der Meßprobe kann man dafür beispielsweise Haptene (niedermolekulare Antigene) oder andere Antigene (häufig Proteine) an die Sensorelektroden binden. Durch die spezifische Komplexbildung zwischen den fest verankerten Antigenen und den in der Messprobe befindlichen Antikörpern gelingt auf diese Weise ein spezifischer Antikörpernachweis. In Umkehrung dieses Prinzips kann man auch die Antikörper auf den Sensorelektroden binden und Haptene oder dergleichen aus der Messprobe detektieren.
Eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gegeben, dass man die erfindungsgemäße Vorrichtung zur elektrischen Auslesung von Hybridisierungsvorgängen in der Nukleinsäurechemie einsetzt. Dabei werden erfindungsgemäß nach Anlegung eines genügend hohen elektrischen Potentials geeigneter Polarität und genügend langer Dauer nur diejenigen Makromoleküle auf der Sensorelektrode verbleiben, die besonders fest gebunden sind. Sie können dann mittels einer Impedanzanalyse, insbesondere mittels der Impedanzspektroskopie, erkannt werden. In ähnlicher Weise läßt sich auch ein Redox- Recycling- Verfahren zur Erkennung der verbleibenden, immobilisierten Makromoleküle einsetzen.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur elektronischen Immobilisierung und Detektion von
Makromolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Träger mit mehreren darauf angeordneten Sensorpositionen aufweist, auf denen diese Makromoleküle immobilisiert werden können, wobei jede Sensorposition aus mindestens einer Mobilisierungselektrode und einer Sensorelektrode besteht, die unabhängig voneinander mit elektischen Potentialen belegt werden können, und wobei wenigstens eine Mobilisierungselektrode wenigstens einer Sensorposition mit einer Permeationsschicht überzogen ist, die undurchlässig für die zu detektierenden Moleküle, aber durchlässig für Wasser und kleine Ionen ist, und wobei die Sensorelektroden der einzelnen Sensorpositionen entweder unbeschichtete Metallelektroden darstellen oder so ausgebildet sind, dass sie die zu detektierenden Makromoleküle spezifisch oder unspezifisch binden können.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorelektroden Makromoleküle binden können.
3. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus Silizium, Siliziumoxid, Glas, Keramik oder Kunststoff oder einen Verbund dieser Stoffe besteht.
4. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger einen aktiven Halbleiterchip mit elektrischen Schaltkreisen enthält.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektroden unabhängig voneinander aus den Materialien Gold,
Platin, Palladium, Silber, Kupfer, Aluminium oder aus Kohlenstoff bestehen.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorelektroden aus Gold oder Palladium bestehen.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorelektroden mit einer Beschichtung versehen sind, die funktioneile Gruppen zur Bindung von Makromolekülen enthält.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweiligen Sensorelektroden einen Flächeninhalt von weniger als 10.000 μm2, bevorzugt weniger als 1.000 μm2, besonders bevorzugt weniger als 100 μm2 besitzen.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Permeationsschicht aus zwei Teilschichten besteht, deren elektrodennahe die Eigenschaft der Strukturierbarkeit auf dem Substrat besitzt und die spezifische Anbindung der zweiten Teilschicht ermöglicht.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mobilisierungselektroden einerseits und die Sensorelektroden andererseits aus unterschiedlichen, leitfähigen Materialien bestehen und die
Permeationsschicht so ausgewählt ist, dass sie nur mit der Mobilisierungselektrode eine feste Verbindung eingeht.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Mobilisierungs- und Sensorelektroden zueinander höhenversetzt sind.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorpositionen mit drei unabhängigen Elektroden, einer Mobilisierungs- und zwei Sensorelektroden belegt sind.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die
Sensorelektroden Interdigitalelektroden sind, bei denen zumindest einige Zwischenräume durch eine Mobilisierungselektrode ausgefüllt werden.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorpositionen in einem zweidimensionalen Array angeordnet sind.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorpositionen mit einem flüssigen Elektrolyten benetzt werden können, der die zu immobilisierenden Moleküle enthält.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass diese mit einer Durchflusskammer ausgestattet ist, die die Benetzung der Sensorpositionen mit einem flüssigen Elektrolyten gestattet, der die zu immobilisierenden
Moleküle enthält.
17. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorelektroden der verschiedenen Sensorpositionen selektiv mit Makromolekülen als spezifischen Erkennungssystemen bestückt sind.
18. Verfahren zur beschleunigten Immobilisierung von elektrisch geladenen Makromolekülen und ihrer elektrischen Detektion umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition mit Mobilisierungs- und Sensorelektroden gemäß Anspruch 1 ,
b) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, der die zu immobilisierenden Makromomoleküle in gelöster Form enthält, c) Beaufschlagung der Mobilisierungselektroden mit einem genügend hohen Potential geeigneter Polarität zur Verdichtung der geladenen Makromoleküle in der unmittelbaren Umgebung der Sensorelektroden, und
d) elektrische Detektion der zu detektierenden Makromoleküle mit einem geeigneten Detektionsverfahren.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch geladenen Makromolekülen Nukleinsäuren und/oder Proteine sind.
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch geladenen Makromoleküle auf den Sensorelektroden immobilisiert werden.
21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorelektroden zuvor mit einer oder mehreren spezifischen Erkennungsstrukturen als Fängermoleküle belegt wurden.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass als Fänger- moleküle Proteine oder Polypeptide eingesetzt werden.
23. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass als Fängermoleküle Nukleinsäuren bzw. Oligonukleotide eingesetzt werden.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den
Fängermolekülen um Oligonukleotide mit 10 bis 25 Basen handelt.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der elektrischen Detektion der zu detektierenden Makromoleküle um eine Impedanzanalyse, insbesondere um die
Impedanzspektroskopie handelt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass [der] ein Elektrolyt eingesetzt wird, der eine gelöste Verbindung enthält, die an der Sensorelektrode einen Redoxprozeß durchlaufen kann.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25 , dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorelektroden aus Gold bestehen, die Fängermoleküle mittels Thiolkopplung als Monoschicht aufgebracht und die verbleibenden Lücken durch Alkylthiole oder Thiole von Alklylderivaten aufgefüllt werden.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Monoschicht zwischen Thiolgruppe und Oligonukleotid die gleiche Länge wie die zum Auffüllen der Schicht verwendeten Alkylthiolderivate besitzt.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Alkylthiolderivat um Mercaptohexanol handelt.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die zu detektierenden Makromoleküle enzymatisch markiert sind und es sich bei dem elektrischen Detektionsverfahren um ein Redox-Recycling handelt.
31. Verfahren zur elektrischen Spezifitätsselektion von elektrisch geladenen Makromolekülen umfassend die Schritte: e) Bereitstellung von Sensorpositionen, die fest mit einer ersten Sorte von Erkennungsmolekülen versehen sind, eine zweite Sorte von
Makromolekülen reversibel gebunden haben und durch Schritte a) bis c) gemäß Anspruch 18 erhältlich sind, und f) Beaufschlagung der Mobilisierungselektroden oder der Sensorelektroden mit einem genügend hohen elektrischen Potential geeigneter Polarität und genügend langer Dauer zur Lösung aller
Bindungen von Makromolekülen auf den Sensorelektroden bis auf die Bindungen mit der höchsten Bindungsstärke.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass das elektrische Potential geeigneter Polarität und genügend langer Dauer pulsierend ist.
33. Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der ersten Sorte von Erkennungsmolekülen und der zweiten Sorte von daran reversibel gebundenen Makromolekülen auf der Sensorelektrode um Antigen- Antikörper oder um Nukleinsäuresequenzen handelt.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der auf der Sensorelektrode verbleibenden immobilisierten
Makromoleküle mittels cyclovoltammetrischer oder impedanzanalytischer Verfahren, insbesondere mittels Impedanzspektroskopie durchgeführt wird.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der auf der Sensorelektrode verbleibenden. immobilisierten Makromoleküle mittels eines Redox-Recyclings erfolgt.
36. Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass vor der elektrischen Detektion eine elektrische Spezifitätsselektion vorgenommen wird, indem die Sensorelektroden mit einem Potential beaufschlagt werden, das von der Polarität und der Höhe her so gewählt ist, dass alle Bindungen von Makromolekülen auf den Sensorelektroden bis auf die Bindungen mit der höchsten Bindungsstärke gelöst werden.
37. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 31 zur Immunodetektion.
38. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 1 zur elektrischen Auslesung von Hybridisierungsvorgängen in der Nukleinsäurechemie.
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