DE60315992T2

DE60315992T2 - Überwachung von zellen

Info

Publication number: DE60315992T2
Application number: DE60315992T
Authority: DE
Inventors: Christopher Robin Lowe; Craig J. Gershater; Colin Alexander Tennis Court Rd. DAVIDSON
Original assignee: Smart Holograms Ltd
Current assignee: Smart Holograms Ltd
Priority date: 2002-07-09
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2023-07-10
Also published as: CA2491896A1; GB0215879D0; EP1535064B1; DE60315992D1; ATE371867T1; AU2003246931A1; AU2003246931B2; JP2005532060A; US20060051733A1; EP1535064A2; WO2004005922A2; WO2004005922A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beobachtung oder Überwachung von Zellen, insbesondere ihres Metabolismus, um die Kulturbedingungen zu optimieren. Ferner betrifft die Erfindung ein Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz und eine für ein derartiges Verfahren geeignete Vorrichtung.
Hintergrund der Erfindung
Eine Mikrofluidvorrichtung umfasst typischerweise mindestens einen Kanal oder eine Kammer mit einer Größe, die in mindestens einer Abmessung einen Wert von 1 mm oder weniger aufweist. Von besonderem Interesse sind Mikrofluidvorrichtungen, die sich zur Durchführung und/oder Überwachung von chemischen und biologischen Vorgängen eignen. Diese Vorrichtungen können zur Simulation von großtechnischen Verfahren in einem mikroskopischen Niveau eingesetzt werden, um dadurch die Volumina an Fluidmaterialien und Reagenzien auf ein Minimum zu beschränken.
Eine Mikrofluidvorrichtung kann zur Überwachung des Zeltmetabolismus verwendet werden. Veränderungen im äußeren biologischen, chemischen und physikalischen Milieu einer Zelle legen bestimmte Muster einer herauf- und herunterregulierten Genexpression fest und führen zu Veränderungen in den Konzentrationen und Flüssen von Metaboliten innerhalb der zellulären Umgebung. Sämtliche lebenden Zellen nehmen Nahrungsmittel auf und bauen diese ab, um wertvolle Energie und Abfallprodukte zu erzeugen. Beispielsweise verändern fast sämtliche Zellen den pH-Wert ihrer Umgebung, indem sie alkalische oder saure Nährstoffe aufnehmen oder organische Säuren, CO₂ oder NH₄ ⁺ erzeugen. Ein Zellmetabolismus dieses Typs kann mit einem Mikrophysiometer auf Siliciumbasis überwacht werden, der die Geschwindigkeit, mit der eukaryontische Zellen den pH-Wert ihrer unmittelbaren Umgebung verändern, in Echtzeit in thermoregulierten Mikrovolumen-Fließkammern misst; vergl. Wada et al., Clin. Chem., Bd. 37 (1991), S. 600–601; und McConnell et al., Science, Bd. 257 (1992), S. 1906–1912.
Dieses Mikrophysiometer unterliegt einer Anzahl von Einschränkungen. Beispielsweise stützt sich der lichtaddressierbare, potentiometrische Sensor (LAPS), auf dem dieses System beruht, auf eine teure Silicium-Mikrotechnik und weist ein relativ hohes Mikrovolumen (mehrere μl) auf. Außerdem erfordert die Vorrichtung eine ausgeklügelte instrumentelle Ausrüstung, bedient sich biofeindlicher anorganischer Oberflächen und ist gemäß der derzeitigen Konfiguration nur zur Überwachung eines einzigen Analyten (pH-Wert) befähigt.
Herkömmliche zelluläre Mikrofluidvorrichtungen umfassen Kanäle und Kammern mit einem relativ großen Volumen (in der Größenordnung von μl). Die Größe einer Mikrofluidvorrichtung ist vorzugsweise so klein wie möglich, so dass die Mengen an Reagenzien/Proben auf ein Minimum beschränkt werden können.
Da die Mikrofluidtechnologie sich mit winzigen Volumina an Reagenzien und fluiden Materialien bedient, hängt die Beobachtung und Überwachung von Zellen in kritischer Weise vom Oberflächen/Volumen-Verhältnis der Mikrofluidkammern und -kanäle sowie von der Natur des Biofilms, der die innere Oberfläche eines Kanals oder einer Kammer bildet, ab. Herkömmliche Mikrofluidkanäle und -kammern sind typischerweise auf Volumina in μl-Größenordnung beschränkt. Wenn das Volumen kleiner ist (beispielsweise in der Größenordnung von nl), geht die Volumenverringerung nicht mit einer Verringerung der Oberfläche einher und der Einfluss einer ungleichmäßigen Biofilmbildung ist noch ausgeprägter.
Die Größe einer Mikrofluidvorrichtung kann auch durch die Größe eines verwendeten Sensors beschränkt sein. Weitere Probleme bei der Mikrofluidtechnologie umfassen die Bereitstellung von kostengünstigen Vorrichtungen und Mikrofluidkreisläufen, die Schaffung von Inokulationsverfahren mit hohem Durchsatz und den Echtzeitnachweis einer zellulären Aktivität.
Herkömmliche Mikrofluidvorrichtungen werden im allgemeinen aus Glas, Siliciumdioxid oder Substraten auf Siliciumbasis unter Anwendung photolithographischer Bearbeitungstechniken zur Herstellung von Kanälen, Reaktionskammern oder Anordnungen hergestellt. Während erfolgreiche Prototypvorrichtungen unter Verwendung dieser Substrate hergestellt worden sind, sind die damit verbundenen Herstellungstechniken, einschließlich die Erzeugung von Masken, das Ätzen und Abdichten von Kanälen sowie das Verkleben und Packen, im allgemeinen schwierig und/oder aufwändig in der Realisation. Die Herstellung von Mikrovorrichtungen im Großmaßstab wird durch die Tatsache behindert, dass die Größen der Wafer relativ gering sind, die Bearbeitungskosten prohibitiv sind, der Aufbau, die Werkzeugausrüstung, Konstruktionsänderungen und Revisionen teuer sind und die Einführung der dreidimensionalen Beschaffenheit in die Konstruktion teure Zupassungs- und Ätz- oder Schneideeinrichtungen erfordert.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden Zellen in einer Mikrofluidvorrichtung, die einen Sensor umfasst, gemäß den Ansprüchen überwacht. Dies wird unter solchen Bedingungen durchgeführt, dass ein Anhaften von Zellen an einer Wand der Vorrichtung gehemmt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst eine Mikrofluidvorrichtung eine Kammer, die einen Sensor und Einlässe für eine Probe und für ein Wachstumsmedium gemäß den Ansprüchen aufweist. Eine Wand der Vorrichtung ist so beschaffen, dass bei der Anwendung ein Anhaften von Zellen an der Wand gehemmt wird.
Die Kammer steht vorzugsweise in Verbindung mit einer zweiten, nachgeschalteten Kammer. Die zweite Kammer kann zum Nachweis von zellulären Komponenten, z. B. von exprimierten Proteinen oder Enzymen, verwendet werden. In diesem Fall kommt eine erfindungsgemäße Vorrichtung in Frage, die eine biotische (erste) Kammer in Verbindung mit einer abiotischen (zweiten) Kammer umfasst.
Durch Hemmung der Haftung der Zelle an einer Wand der Kammer wird die Bildung eines Biofilms auf ein Minimum beschränkt oder gehemmt. Die Größe der Mikrofluidvorrichtung ist möglicherweise weniger kritisch als bei herkömmlichen Mikrofluidvorrichtungen, und zwar trotz eines hohen Oberflächen/Volumen-Verhältnisses, da die Einflüsse einer Biofilmbildung auch bei kleinen Volumina (z. B. in der Größenordnung von nl) in ausgeprägter Weise verringert werden.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst vorzugsweise eine Mehrzahl von Mikrofluidkammern, die durch Mikrofluidkanäle verbunden sein können. Eine derartige Anordnung kann zur Untersuchung multifaktorieller Effektoren, wie Kohlenstoff/Stickstoff-Quellen, Vitamin- und Mineralienzufuhr und ihrer Einflüsse auf die mikrobielle Physiologie verwendet werden.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann zu einem raschen, kostengünstigen Verfahren zur Untersuchung des Verhaltens von Vollzellsystemen führen und kann in Bereichen, wie Pharmazeutika und Biotechnologie (Vollzell-Screening, Auffinden von Arzneistoffen, Genomik, Proteomik und Metabolomik, Gewebekultur, Biotransformationen, Erzeugung von chiralen Arzneistoffen), Lebensmittel und Getränke (Wachstumsbedingungen, Optimierung von Medien, fermentierte Produkte, wie Aminosäuren, Vitamine, Gummen, Säuren), Umgebungsaspekte (Abhilfe für Schäden der Biosphäre) und wissenschaftliche Fragen (Mikrobiologie, Genomik, Biochemie), verwendet werden.
Die Erfindung ermöglicht auch erhebliche Kosten- und Zeiteinsparungen bei Reagenzien und ermöglicht die Optimierung von Bedingungen für das Wachstum unter anderem von Bakterien, Pilzen und Säugetierzellen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst eine Mikrofluidkammer mit einem Sensor und Einlässen für eine Probe und ein Wachstumsmedium, sowie vorzugsweise einen Auslass, gemäß den Ansprüchen. Die Reagenzien werden vorzugsweise durch einen oder mehrere Mikrofluidkanäle in die Kammer eingespeist. Ein Auslass der Kammer kann sodann vorzugsweise über einen Mikrofluidkanal in ein Abfallreservoir oder eine andere Kammer führen. Ein Ausgabekanal kann als eine Überlauf- und Probennahmeleitung verwendet werden und kann durch ein ineinandergreifendes gedrucktes Muster von in engem Abstand zueinander stehenden Inseln versperrt werden, um als Filter zu wirken und einen Austritt der wachsenden Zellen aus der Kammer zu verhindern.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung wird vorzugsweise unter Verwendung von Kunststoffmaterial gebildet. Kunststoffe stellen attraktive Materialien für Mikrofluidsysteme dar, da sie billiger sind und leichter handhabbar als Substrate auf der Basis von Siliciumdioxid/Silicium. Ein breites Spektrum von kostengünstigen Polymermaterialien ermöglicht die Auswahl der geeigneten Kunststoffe mit thermischer und chemischer Beständigkeit, für photolithographische und Siebdruckverfahren, zur Oberflächenderivatisierung und zur Verklebung mehrerer Schichten. Kunststoffmaterialien können sowohl lineare als auch vernetzte, undurchsichtige und durchscheinende Kunststoffe umfassen, die die Möglichkeiten für inerte Oberflächen für nicht-wässrige Medien, chemisch modifizierbare Oberflächen und Vorrichtungen, die optisch abgefragt werden können oder die elektrisch leitend sein können, bieten. Im Vergleich zu derzeitigen Substraten auf der Basis von Glas, Siliciumdioxid oder Silicium bietet die Verwendung von Kunststoffen mehrere ausgeprägte Vorteile, einschließlich einer Merkmalsauflösung, die mit der Technologie auf Siliciumbasis gleichwertig ist, kurze Designzyklen, geringe Werkzeugkosten und erhebliche Flexibilität im Design und die Möglichkeit zur Herstellung von Tausenden von Vorrichtungen auf einer einzigen Kunststofffolie. Elektrische Anschlüsse können direkt an der Vorrichtung selbst angebracht werden, ohne dass Klebe-, Montier- oder Packtechniken erforderlich sind. Zu Beispielen für geeignete Kunststoffmaterialien gehören Polyolefine, wie Polypropylen (PP), Polycarbonat, PDMS, Polyvinylchlorid (PVC), Polystyrol, Fluorpolymere und Acrylate, wie Polymethylmethacrylat (PMMA).
Bei der Auswahl geeigneter Materialien sind die entsprechenden Eigenschaften in mechanischer, chemischer, elektrischer, akustischer und optischer Hinsicht, Gasdurchlässigkeit, Oberflächenmorphologie, Sterilisierbarkeit, biologische Verträglichkeit und, was von besonderer Bedeutung ist, die Fähigkeit, die Materialien zu verbinden, zu ätzen oder zu bedrucken, zu berücksichtigen. Die möglichen Einflüsse von Additiven, wie Stabilisatoren, Füllstoffen, Weichmachern und farbgebenden Mitteln, z. B. auf das zelluläre Wachstum und die Lebensfähigkeit, sind ebenfalls zu berücksichtigen.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann eine mehrschichtige Konstruktion umfassen. Ein Material des vorstehend beschriebenen Typs eignet sich in besonderer Weise als ein Substrat.
Ein derartiges Substrat kann darin ausgebildete Mikrofluidkammern/-kanäle aufweisen. Vorzugsweise ist auf dem Substrat ein unterschiedliches, leichter bearbeitbares Material, z. B. ein Epoxyharz, als eine "Matrix"-Schicht ausgebildet und die Mikrofluidkammern/-kanäle sind darin ausgebildet. Gegebenenfalls können sodann die Wände dieser Bestandteile behandelt oder beschichtet werden, um ein Anhaften von Zellen zu hemmen. Die Vorrichtung kann anschließend fertiggestellt werden, indem man eine weitere Schicht eines Materials vom Substrattyp oben auf die Mikrofluidschicht aufbringt.
Die einzelnen Schichten können nach bekannten Techniken gebildet und miteinander verbunden werden. Geeignete Bildungstechniken, wie Drucken und Formen, Verkleben oder Laminieren, können zur Verbindung der Schichten herangezogen werden. Gleichermaßen kann die Mikrofluidvorrichtung durch bekannte Mikrobearbeitungsverfahren gebildet werden, einschließlich Abtragen unter Verwendung eines Exzimerlasers oder eines anderen Lasers.
Das Substrat ist vorzugsweise undurchlässig. Um Proben/Reagenzien und dergl. einzuführen oder um eine Überwachung des Sensors zu ermöglichen, können ein oder mehr Löcher durch Stanzen oder Bohren, z. B. unter Verwendung eines Lasers, vorgesehen werden. Alternativ oder zusätzlich soll das Substratmaterial das Durchstechen mit einer Nadel ermöglichen, durch die Materialien abgegeben werden können.
Die Kammer oder Kammern weisen typischerweise ein Volumen von mindestens 50 nl auf, beispielsweise bis zu 10 μl, häufig nicht mehr als 500 nl, 1 μl oder 2 μl. In einem Substrat mit einer Dicke von 500 μm würden Löcher mit einer Weite von 1,0, 1,5 und 2,0 mm zu Kammern mit einem Volumen von etwa 400 nl, 900 nl bzw. 1,6 μl führen.
Ein Merkmal der Erfindung besteht darin, dass das Anhaften von Zellen an einer Wand der Kammer gehemmt wird. Durch Hemmen des Anhaftens von Zellen an den Wänden der Kammer wird die Bildung eines Biofilms gesteuert.
Es gibt zahlreiche Verfahren zur Hemmung der Anhaftung von Zellen. Hierzu gehören die Beschichtung der Innenseite einer Kammer und/oder von Kanälen mit einem hydrophilen Material, z. B. mit Polyvinylalkohol (PVA), und die Einverleibung eines nicht-metabolisierbaren Inhibitors auf der Basis eines mannosespezifischen Adhesins (z. B. Methyl-α-D-mannopyranosid) im Wachstumsmedium.
Die Wand der Kammer ist vorzugsweise glatt. Ein Substrat, wie PMMA oder PP, ist glatt, und die Glattheit eines Epoxyharzes kann gesteuert werden, z. B. durch Ultraschallbehandlung, Entgasung oder Zentrifugieren vor dem Auftragen. Ferner kann eine Behandlung mit Säuren oder Alkalien dazu beitragen, die Ausbildung von Nukleisierungspunkten auf ein Minimum zu beschränken.
Bakterielles Wachstum kann durch Erhöhung der Sauerstoffzufuhr in die Bioreaktorkammer gefördert werden. Die Vorrichtung umfasst vorzugsweise eine innere Oberflächenschicht aus einem gasdurchlässigen Material, das beispielsweise gegenüber Sauerstoff, CO₂ oder NH₃ durchlässig ist. Alternativ kann die innere Oberfläche bei einem (obligatorischen) Anaerobier gegenüber Sauerstoff undurchlässig sein. Zu Beispielen für gasdurchlässige Kunststoffe gehören Polyalkene, z. B. Polyethylen geringer Dichte (LDPE) und Polymethylpenten (PMP). Diese Kunststoffe sind optisch klar und chemisch resistent. Bei Polyalkenen handelt es sich um hydrophobe Kunststoffe von "geringer Energie". Für die Haftung an einer Epoxyschicht ist eine gewisse Oberflächenaktivierung erforderlich. Ferner ist es erstrebenswert, die Oberfläche soweit wie möglich hydrophil auszugestalten, um das Anhaften von Bakterien während der Verwendung zu verhindern. Dies kann erreicht werden, indem man eine Polyalken-Oberfläche unter Anwendung eines Sauerstoff-Plasma-Verfahrens ätzt. In diesem Fall wird das Polyalken vorzugsweise beschichtet, z. B. mit PVA, um eine Rückbildung zu einer hydrophoben Oberfläche zu verhindern. Alternativ kann die Oberfläche des Polyalkens mit Chromsäure behandelt werden. Dadurch wird die Oberfläche des Kunststoffes oxidiert und hydrophil ausgestaltet. Es wurde gezeigt, dass durch diese Techniken die Anhaftung von Bakterien, wie E. coli und L. casei, bis zu 90 % verringert werden kann.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst vorzugsweise eine Fluorpolymerschicht. Fluorpolymere, wie fluoriertes Ethylen-Polypropylen (FEP), weisen eine hervorragende Gasdurchlässigkeit und hervorragende optische Eigenschaften auf. Jedoch weisen Fluorpolymere eine geringe Reaktivität auf und machen daher vor dem Auftragen eine Vorbehandlung notwendig. Ein Verfahren besteht in der Verwendung eines Reduktionsmittels, z. B. eines Natriumnaphthalid-Komplexes. Dieses Mittel ist in verschiedenen handelsüblichen Gemischen verfügbar (z. B. Tetra-Etch der Fa. W. L. Gore Associates). Eine gesteuerte Reoxidation, z. B. unter Verwendung eines Oxidationsmittels, wie Salpetersäure, kann erforderlich sein.
Die umfassende Untersuchung von biologischen Prozessen erfordert eine Beurteilung sowohl der biotischen als auch der abiotischen Phasen. Die biotische Phase definiert das Zellwachstum, die Stoffwechselparameter und die Produktivitätsparameter eines biologischen Systems, während die abiotische Phase durch Stoffwechselprodukte definiert ist, die chemischer und/oder physikalischer Natur sein können.
Die Vorrichtung umfasst vorzugsweise eine biotische Kammer in Kombination mit einer abiotischen Kammer. Die abiotische Kammer kann Abfang-, Trenn- und Analysensysteme umfassen, die so konzipiert sind, dass sie auf individuelle Profile von Produkten der zellulären Vorgänge, die in der biotischen Kammer ablaufen, abgestellt sind. Dabei kann eine Bioreaktorkammer als ein "Quasi-Chemostat" angesehen werden, in dem die überlaufende Flüssigkeit eine Probenquelle für die nachgeschaltete Analyse der Stoffwechselprodukte ergibt. Muster der Stoffwechselreaktion auf durch Nährstoffe und Umgebung bedingte Reize können untersucht werden. Diese Beobachtungen können sodann dazu herangezogen werden, eine qualitative und quantitative Beurteilung des zu untersuchenden Mikroorganismus vorzunehmen. Die Ergebnisse können anschließend zur Definition der kritischen Nährstoff-, Umgebungs- und Zeitkomponenten herangezogen werden.
Gleichermaßen kann eine erfindungsgemäße Vorrichtung auch zum Abfangen von spezifischen Proteinen über geeignete Affinitätsadsorptionsmittel oder His-tag-Bindungsmittel sowie zur Überwachung ihrer Anwesenheit mit einem geeigneten Sensor, z. B. einem holographischen oder einem akustischen Sensor, verwendet werden. Die Möglichkeit der Verwendung von gepulsten akustischen Wellen die durch eine magnetische direkte Erzeugung induziert werden, ist mit Kunststoffsubstraten kompatibel, da akustische Verluste erheblich geringer als die Verluste, die beim Resonanzformat auftreten, sind und ein Abfragen mit einem kontinuierlichen Spektrum von Frequenzen möglich ist, was die Erstellung eines "Fingerabdrucks" von Zielproteinen, Zellen oder Oligonucleotiden erlaubt.
Die Konstruktion der Vorrichtung kann auf den vorgesehenen Anwendungszweck maßgeschneidert sein. Dies kann die Bereitstellung von Mehrkanal-Zufuhreinlässen zur Dosierung von mehr als einem Wachstumsmedium, z. B. von verschiedenen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Vitaminen, Wachstumsfaktoren, mineralischen Ergänzungsmitteln und Vorstufen, und von zusätzlichen Sensoren in der Kammer beinhalten. Die Kammer umfasst vorzugsweise einen Rührer, vorzugsweise ein Magnetkügelchen mit einem Durchmesser von 20–100 μm. Zu weiteren Möglichkeiten gehören das Drucken und/oder photolithographische Ätzen der Mikrokammer, Mikrokanäle mit großem Seitenverhältnis, Mikrofluid-Antriebsmechanismen, Strömungseigenschaften, Pumpen, Rühren und Rückhaltefilter sowie die Herstellung von nachgeschalteten und analytischen Modulen.
Die Kammer umfasst einen oder mehrere Sensoren zur Überwachung der zellulären Aktivität, z. B. durch Nachweis von Veränderungen der Biomasse (Zellzahl) oder der Temperatur sowie von Veränderungen von Schlüsselmerkmalen, die mit dem Wachstum verbunden sind (pH-Wert, gelöster Sauerstoff, Redoxpotential, Substratkonzentrationen). Mehrere Sensoren können in einer Kontrollstation in der Bioreaktorkammer nebeneinander angeordnet sein. Der oder die Sensoren können um den Umfang der Vertiefung herum angeordnet sein, wobei sie nicht nur eine klare optische Weglänge ermöglichen, sondern auch als eine Betätigungsvorrichtung für einen Rührer dienen. Eine Kammer kann mit einem Mikroskop (das vorzugsweise mit einer Digitalkamera und Bildsoftware ausgestattet ist) versehen sein, das zur Überwachung von eukaryontischen zellulären Vorgängen verwendet werden kann.
Die holographische Sensortechnologie ist in idealer Weise für die vorliegende Erfindung geeignet. Ein holographischer Sensor kann zur Überwachung einer Vielzahl von Analyten, wie Gasen, Ionen, Metaboliten, Antigenen und Vollzellen, in Echtzeit unter Erzielung rascher Reaktionszeiten verwendet werden. Der Sensor kann gegenüber Kombinationen von Analyten, wie Gasen (z. B. O₂, CO₂), Glucose, pH-Wert, Lactat, Glutamat/Glutamin, Temperatur, Redoxzustand, Ionen (z. B. Ammoniumionen) und zellulären Produkten (Antibiotika, Enzyme, exprimierte Proteine) empfindlich sein. Geeignete Hologramme dieses Typs sind in WO-A-95/26499 und WO-A-99/63408 beschrieben.
Sensorelektroden können für die in situ-Messung von pH-Wert, gelöstem Sauerstoff, Glucose oder anderen biochemischen Substraten verwendet werden. pH-Fühlelektroden können Metalloxide, wie Tantalpentoxid (gedruckt mit Tantal(V)-isopropoxid, Sol-Gel-Bildung und Härtung bei 100–110°C) oder den Dioxiden von Iridium, Platin oder Ruthenium (gedruckt mit vorgesintertem Rutheniumdioxid-hydrat im Gemisch mit einer Polymerpaste im Gewichtsverhältnis von 1:2), umfassen. Eine Elektrode zum Erfassen von gelöstem Sauerstoff kann eine Gold- oder Dreilagenkonstruktion umfassen, die ein Kunststoffsubstrat, eine Platin-Mikromatrixelektrode und eine Silber/Silberbromid-Pseudoreferenz und eine gasdurchlässige PTFE-Membran unter Einschluss eines internen Elektrolytgels umfassen. Ein Temperatur- oder Redoxpotential kann ebenfalls mit gedrucktem Platin gebildet werden. Die Biomasse kann durch optisches Abfragen bei 580–600 nm unter Verwendung einer bernsteinfarbenen LED (γ_max 592 nm) als Lichtquelle, eines Silicium-Photodioden/Verstärkers als Detektor und von faseroptischen Lichtleitern zum Transport des Lichtes in die Kammer und aus dieser heraus gemessen werden. Zu weiteren Techniken, die eingesetzt werden können. gehören die Membranfluoreszenz, Farbänderungen und dergl.
Ein Sensor auf der Basis von Ruthenium kann ebenfalls verwendet werden, insbesondere ein Fluoreszenzauslöschungs-Sauerstoffsensor auf der Basis von Ruthenium. Eine Anzahl von derartigen Verbindungen mit einem Rutheniumion-Liganden und 3 Liganden auf der Basis von Phenanthrolin sind verfügbar und können zur Bestimmung des Sauerstoffgehalts in einer Polymermatrix immobilisiert werden. Weitere Sensoren auf Fluoreszenzbasis können verwendet werden. Es gibt eine Anzahl von Verbindungen, die bei Veränderungen der Ionenkonzentrationen, Gaskonzentrationen, des pH-Werts und dergl., die Fluoreszenz erhöhen oder verringern. Gleichermaßen gibt es einen Bereich von einfachen Farbänderungsreaktionen, die ausgenützt werden können, insbesondere für variable Größen, wie den pH-Wert.
Daten aus der Kammer können in einer Datenregistriereinrichtung gespeichert werden, die vorzugsweise einen mit einem geeigneten analogen Interface ausgerüsteten Rechner umfasst. Die Interface-Schaltung ist vorzugsweise flexibel, um einfache, qualitativ hochwertige Niederfrequenzmessungen (z. B. alle 15 Sekunden über einen Zeitraum von 48 Stunden) oder gleichzeitige "Schnappschüsse" der Signale (z. B. von über 400 Sensoren) zu ermöglichen. Die durch diese Schaltungen erzeugten Daten stehen dem Rechner zur Verfügung, so dass eine Datenregistrierung, Analysen und Echtzeit-Feedback-Steuersysteme gewährleistet sind. Die wirksame Untersuchung und Ausnutzung von biotischen und abiotischen Vorgängen unter Verwendung von in massiver Weise parallelen Zellkultursystemen erfordert die Anwendung der Erzeugung und Analyse von Daten in hoher Dimension. Multifaktorielle und andere statistische Verfahren werden vorzugsweise für die experimentelle Entwicklung, Kontrolle und Analyse einbezogen. Mehrdimensionale Methoden, z. B. die "Pincipal Components Analysis" können zur Ableitung von Informationen und Erkenntnissen aus den variablen Datensätzen der holographischen und anderen analytischen Reaktionen verwendet werden. Algorithmische Sensoren und Inferenzapparate können ebenfalls entwickelt werden, die ungleichartige biotische und abiotische Datenströme vereinigen, um Informationen und Erkenntnisse über den metabolischen, physiologischen und zellulären Status zu gewinnen.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann in Form einer Anordnung von Mikrofluidkammern, die gegebenenfalls durch Mikrokanäle verbunden sind, vorliegen. Es kann sich um eine Anordnung von biotischen und abiotischen Kammern handeln. Beispielsweise kann eine derartige Anordnung dazu verwendet werden, um Zufuhr-, Handhabungs- und Kontrollsysteme zur Überwachung des Verhaltens von einer oder mehreren Kammern zu erreichen, wobei jede Kammer in der Anordnung mit verschiedenen Wachstumsmedien versehen ist. Soweit erforderlich, muss sorgfältig auf die Konfiguration der Anordnung geachtet werden, um zu gewährleisten, dass die Mikrofluidkontakte und die Gesichtspunkte, die sich aus einer Maßstabsvergrößerung im Zusammenhang mit den makroskopischen Fluidik-Multiplexen, optischen Abfragesystemen und Eingabe/Ausgabe-Kontakten ergeben, innerhalb der Vorrichtung erreichbar sind. Die Anordnung kann als zweidimensionale Anordnung, im Band-, Scheiben- oder Trommelformat vorliegen, wobei beliebige biotische, abiotische und analytische Phasen in entsprechender Weise angeordnet sind. Allgemeiner ausgedrückt, können die Sensoren in Form einer Anordnung innerhalb von einer oder mehreren Kammern vorliegen, wobei beliebige Paare von Kammern mit einem geeigneten Kanal verbunden sein können. Das Layout der Anordnung, z. B. in Reihen und Spalten, soll lediglich mit der entsprechenden optischen oder anderweitigen Nachweisvorrichtung kompatibel sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Studium von Zellkulturen, z. B. Gewebekultur- und Fermentationsverfahren. Die derzeitige Technologie zur Untersuchung der Fermentationsentwicklung bemüht sich, eine große Anzahl von metabolischen Effektoren (entweder einzeln oder in Kombinationen von in Wechselwirkung tretenden Faktoren, zu untersuchen. Dies ist erforderlich, um möglichst rasch das für eine maximale Produktivität geeignete Fermentationsverfahren festzulegen. Somit besteht ein Bedürfnis, ein System zu entwickeln, das gleichzeitig Hunderte oder Tausende von Effektoren der mikrobiellen Physiologie testen kann. Dies kann unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, vorzugsweise in Form einer Anordnung, realisiert werden.
Die vorliegende Erfindung kann auch zum Studium von filamentösen Mikroorganismen, der Biotransformation von Vorläufermolekülen, der mehrfachen Kulturinokulation (unter Einschluss von Sporen), neuer bioaktiver antibakterieller Verbindungen mit Zell-Zell-Signalgebung und von in Bezug auf den Stoffwechsel manipulierten Zellen verwendet werden. Zu weiteren Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung gehören die rasche Analyse von mutationsmäßig segregierten Zellen (zur Unterstützung der funktionellen Genomik), das mit hohem Durchsatz ablaufende Screening der Erzeugung von Antibiotika und deren Empfindlichkeitsparameter, die Automatisierung von zellulären biologischen Tests zur Bewertung von Agonisten/Antagonisten, zelluläre Systeme zur Erzeugung von biopharmazeutischen Schlüsselverbindungen, die Messung von zellulären Energieströmen, der metabolische und physiologische Status, gemischte Kultursysteme und deren Wechselwirkungen, Umwelteinflüsse von zytotoxischen Mitteln, rezeptorvermittelte Reaktionen, Subtypen und Signalleitungswege sowie Liganden-Durchlass-Ionenkanäle.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
Mikrofluidvorrichtungen wurden unter Verwendung eines Polycarbonat-Substrats, das mit einem Epoxyharz bedruckt war, hergestellt. Die Harzschicht wurde zur Begrenzung von Einlass- und Auslass-Mikrokanälen und der Mikrofluidkammer verwendet. Salzsäure wurde in die Kammer einer jeden Vorrichtung in verschiedenen Konzentrationen (0,02 bis 0,2 M) eingeleitet und 45 Minuten darin belassen, um die Epoxygruppen zu härten. Die Vorrichtungen wurden sodann mit sterilem destilliertem Wasser gespült, bis der pH-Wert der Spülflüssigkeit dem Grundwert des Wassers entsprach, und anschließend getrocknet. Eine Probe von E. coli-Zellen und ein Wachstumsmedium wurden sodann in die Kammer eingeführt und eine Züchtung wurde durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass die Härtung der Epoxygruppen in signifikanter Weise die Anhaftung der Zellen an der Oberfläche des Epoxyharzes in der Kammer verringerte, wobei nach 1 Stunde nur ein geringer Biofilm festgestellt wurde.
Beispiel 2
E. coli-Zellen wurden in einem nicht-bewegten LB-Wachstumsmedium in drei Polycarbonat/Epoxyharz-Mikrofluidvorrichtungen gezüchtet. Eine Vorrichtung umfasste LB-Medium mit einem Gehalt an zusätzlicher Mannose, während in der anderen Vorrichtung das LG-Medium das nicht-metabolisierbare Mannose-Analoge Methyl-α-mannopyranosid umfasste. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die einzelnen Vorrichtungen mit Kristallviolett gefärbt und die Anzahl an Bakterien, die pro Gesichtsfeld hafteten (bei 600x Vergrößerung) wurde gezählt.
1 zeigt, dass die Anwesenheit von Mannose und des Mannose-Analogen zu einer signifikanten Verringerung des Ausmaßes der bakteriellen Anhaftung führte.
Beispiel 3
Eine Mikrofluidvorrichtung wurde durch Laminieren eines Polycarbonat-Substrats und von Epoxy- und LDPE-Schichten gebildet. Das LDPE stellte ein Mittel zur Einführung einer Nadel für die Materialzufuhr dar. Das geformte Epoxyharz wurde mit Säure behandelt und mit Polyvinylalkohol (PVA) beschichtet. Anschließend wurde eine Vernetzung mit saurem Glutaraldehyd durchgeführt. Überschüssiger Glutaraldehyd wurde sodann ausgewaschen. Statische E. coli/LB-Kulturen wurden zur Bewertung des Grads der Biofilmbildung herangezogen.
2 zeigt, dass die Anwesenheit des hydrophilen, vernetzten PVA in signifikanter Weise das Ausmaß der Biofilmbildung beschränkt. Für jedes Paar von Säulen (a, b und c) zeigt die linke Säule das bakterielle Zählergebnis auf dem Epoxyharz, während die rechte Säule das Zählergebnis auf dem Polycarbonat angibt.
Beispiel 4
Eine Reihe von Vorrichtungen mit einer Polycarbonat-Rückseite und einer Beschichtung mit Epoxyharz wurde hergestellt. Zwei Teile Epoxyharz wurden unter Anwendung eines üblichen Mischverfahrens hergestellt. Aliquotanteile wurden zur Entfernung eines Teils der Luftblasen einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Nach Beschichtung der einzelnen Vorrichtungen mit PVA wurden die Vorrichtungen getrennt, um die Anzahl an aufgerissenen Luftbläschen, die an der Oberfläche vorlagen, zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die Ultraschallbehandlung zu einer Verringerung der Anzahl an aufgebrochenen Luftbläschen um etwa 50 % führte. Die Vorrichtungen wurden sodann zur Fermentierung von statischen Terrific Broth-Kulturen von E. coli verwendet.
Eine genaue Untersuchung der aufgerissenen Luftbläschen ergab, dass zwar der Großteil der Bläschen keinerlei Zunahme in Bezug auf das Ausmaß an anhaftenden Bakterien zeigte, dass einige aber mit dicken Zellkolonien bedeckt waren. Diese bedeckten Bläschen zeigten deutliche "scharfe" Eigenschaften, wobei die Ränder eindeutig und ausgeprägt waren. Etwa 5 % der aufgerissenen Bläschen fielen in diese Kategorie.
3 zeigt die Anzahl an Bakterien, die an einer Polycarbonat/Epoxyharz-Vorrichtung hafteten und eine "scharfe" Oberfläche aufwiesen (erzeugt durch Lamination mit LDPE, das entfernt wurde, nachdem das Epoxyharz gehärtet war), sowie eine Vorrichtung mit einer "glatten" Oberfläche. Die glatte Oberfläche ist gegenüber einer bakteriellen Anhaftung und somit einer Biofilmbildung weniger anfällig.
Beispiel 5
Sechs Mikrofluidvorrichtungen auf Polycarbonatbasis wurden unter Verwendung einer Polyalken (LDPE)-Überzugsschicht hergestellt. Zwei der Vorrichtungen wurden 30 Sekunden mit Sauerstoffplasma und zwei weitere 90 Sekunden mit Sauerstoffplasma behandelt, wodurch man zwei Sätze von Vorrichtungen erhielt, die jeweils in unterschiedlichem Ausmaß behandelt wurden. Ein Satz wurde mit PVA behandelt, während die Vorrichtungen des anderen Satzes nicht auf diese Weise behandelt wurden. Sodann wurde E. coli in den Kammern der einzelnen Vorrichtungen gezüchtet.
Polyalkene sind hydrophob und begünstigen somit eine bakterielle Anhaftung. Durch Beschichtung des Polyalkens mit hydrophilen PVA lässt sich eine Verringerung der Bakterienzählung erwarten.
4 zeigt die anfängliche Bakterienzählung sowie die nach 6 und 24 Stunden. Sowohl die Plasmabehandlung des Polyalkens als auch die Zugabe von PVA verringern das Ausmaß der bakteriellen Anhaftung.
Beispiel 6
Drei Mikrofluidvorrichtungen aus Polycarbonat/Epoxyharz wurden hergestellt, die eine Überzugsschicht aus fluoriertem Ethylenpolypropylen (FEP) umfassten. Eine der Vorrichtungen wurde durch Vorbehandlung des FEP mit Natriumnaphthalid gebildet. Eine weitere Vorrichtung wurde durch Vorbehandlung von FEP mit dem Naphthalinkomplex und Beschichtung mit PVA gebildet. Sodann wurde E. coli in der Mikrofluidkammer der einzelnen Vorrichtungen gezüchtet. Ein Natriumnaphthalin-Komplex wurde zur Erhöhung der Reaktivität von FEP und somit zur Unterstützung der Herstellung der Vorrichtung verwendet.
5 zeigt die Bakterienzählung der einzelnen Vorrichtungen. Obgleich eine Beschichtung der FEP-Schicht mit Natriumnaphthalin-Komplex die Anzahl an anhaftenden Bakterien erhöht, liegt die Gesamtzahl der anhaftenden Zellen immer noch in dem Bereich, der für andere Kunststoffmaterialien, die typischerweise in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendet werden, festgestellt würde. Die Beschichtung der FEP-Schicht mit PVA bewirkte eine deutliche Verringerung der bakteriellen Anhaftung. FEP ist aufgrund seiner erstrebenswerten Beschaffenheit in Bezug auf Gasdurchlässigkeit und optische Eigenschaften ein bevorzugtes Material.
Beispiel 7
Zwei Polycarbonat-Mikrofluidvorrichtungen wurden hergestellt, die sauerstoffdurchlässige Überzugsschichten umfassten. Eine Vorrichtung umfasste eine Polymethylpenten (TPX)-Überzugsschicht und die andere eine FEP-Überzugsschicht. Anschließend wurde E. coli in der Mikrofluidkammer einer jeden Vorrichtung gezüchtet.
Es wurde festgestellt, dass die rasche aerobe Wachstumsphase des fakultativen Anaerobiers E. coli durch Verwendung eines stärker sauerstoffdurchlässigen Kunststoffes verlängert werden konnte. TPX ist gegenüber Sauerstoff durchlässiger als FEP und unterstützt, wie 6 zeigt, eine längere aerobe, exponentielle Wachstumsphase, bevor der Sauerstoff zu einem limitierenden Nährstoff wird.

Claims

Verfahren zur Überwachung von Zellen in einer Mikrofluidvorrichtung, wobei die Vorrichtung eine Kammer umfasst, die ein Volumen von nicht mehr als 1 μl aufweist und einen Sensor umfasst, und wobei das Überwachen unter solchen Bedingungen erfolgt, dass das Anhaften von Zellen an der Oberfläche der Kammer gehemmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kammeroberfläche ein gasdurchlässiges Material umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Gas um CO₂, NH₃ oder O₂ handelt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei es sich beim Material um ein Fluorpolymer handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Kammeroberfläche ein hydrophiles Material umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich beim hydrophilen Material um Polyvinylalkohol handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Kammer aus einem Epoxyharz gebildet ist, das schichtförmig auf ein Kunststoffsubstrat aufgebracht ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich beim Kunststoffmaterial um Polycarbonat handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Kammer eine Mehrzahl von Sensoren umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Sensor gegenüber Sauerstoff, Kohlendioxid, Ammoniumionen oder dem pH-Wert empfindlich ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich beim Sensor um einen optischen Sensor handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich beim Sensor um einen holographischen Sensor handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich beim Sensor um einen elektrochemischen oder akustischen Sensor handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Sensor gegenüber einem Recktanten oder Produkt einer Fermentation empfindlich ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Volumen der Kammer 50 nl bis 1 μl beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend das Zuführen eines Wachstumsmediums in die Kammer, wobei der Sensor gegenüber einem Recktanten oder einem Produkt des Zellwachstums empfindlich ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Wachstumsmedium ein nicht-metabolisierbares Mannose-Analogon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich beim Analogon um Methyl-α-D-mannopyranosid handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend das Zuführen einer Komponente von oder abgeleitet von den Zellen in eine zweite Mikrofluidkammer, die einen Sensor umfasst und in Verbindung mit der ersten Kammer, die die Komponente nachweist, steht.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei der Komponente um ein Produkt des Zellwachstums handelt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei der Komponente um ein exprimiertes Protein oder Enzym handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei der Sensor der zweiten Kammer wie in einem der Ansprüche 10 bis 15 definiert ist.
Mikrofluidvorrichtung, die sich zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche eignet, umfassend eine Kammer mit einem Volumen von nicht mehr als 1 μl, die einen Sensor und Einlässe für eine Probe und für ein Wachstumsmedium aufweist, wobei die Kammeroberfläche so beschaffen ist, dass bei der Verwendung ein Anhaften von Zellen daran gehemmt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 23, die eines der Merkmale gemäß der Definition in den Ansprüchen 2 bis 15 umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, umfassend eine Mehrzahl von den Kammern.
Vorrichtung nach Anspruch 25, wobei die Kammern in Form eines Arrays vorliegen.
Vorrichtung nach Anspruch 25 oder Anspruch 26, wobei ein Paar von Kammern durch einen Kanal verbunden ist.