JP2005532060A - 細胞の確認 - Google Patents

Abstract

マイクロ流体デバイスの中で細胞を確認する方法であって、
上記デバイスはセンサーを有するチャンバーを含み、
上記確認は、細胞がチャンバー表面に付着しないような条件下で実施する
ことを特徴とする方法。

Description

本発明は、細胞培養条件を最適化するために細胞（特にその代謝）を観察又は確認し、かつ、高速で大量にスクリーニングする方法、及び、上記方法に使用するのに適切なデバイスに関する。

マイクロ流体デバイスは、一般的に、少なくとも一寸法が１ｍｍ以下のチャネル又はチャンバーを少なくとも１つ含む。特に興味深いのは、化学的プロセス及び生物学的プロセスを実施及び／又は確認するのに適切なマイクロ流体デバイスである。このデバイスは、大規模な工程を微視的に模擬するために使用でき、これにより、流体及び試薬の使用量を最小限にできる。

マイクロ流体デバイスは、細胞の代謝を確認するために使用してよい。細胞の外部環境が生物的、化学的及び物理的に変化すると、遺伝子の発現パターンが上方制御及び下方制御を受けて特定され、その結果、細胞環境内における代謝産物の濃度及び流量が変化する。全ての生細胞は栄養素を取り入れ、これを分解して有用なエネルギー及び不要物を産生する。例えば、ほとんど全ての細胞は、アルカリ性栄養素や酸性栄養素を取り込むことにより、又は、有機酸、ＣＯ_２若しくはＮＨ_４ ^＋を産生することにより、周囲のｐＨを変化させる。このような細胞代謝は、シリコンを基盤とする微量生理機能測定計（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）で確認することができる（非特許文献１、２）。この測定計は、真核細胞が周囲のｐＨを変化させる速度を温度調節微量フローチャンバー中でリアルタイムにおいて測定するものである。

しかしながら、この微量生理機能測定計には多くの制限がある。例えば、この測定計の基部である光アドレス可能電位計測センサー（ＬＡＰＳ）は高価な微細工学シリコン技術に依存しており、かつ、容量が比較的大きい（μＬ）。また、上記デバイスは精巧な計器を要し、生物に悪影響を及ぼす無機表面を使用するものであり、現在の設定では１種の検体（ｐＨ）しか確認できない。

従来の細胞のマイクロ流体デバイスは、比較的容量の大きい（μＬ単位）チャネル及びチャンバーを含む。マイクロ流体デバイスの大きさは、試薬／試料の量が最小限ですむようにできるだけ小さい方が好ましい。

マイクロ流体技術では少量の試薬及び流体を処理するため、細胞の観察及び確認は、マイクロ流体チャンバー及びチャネルの表面積／容量の割合、並びに、チャネル又はチャンバーの内部表面に形成されるバイオフィルムの性質に大いに左右される可能性がある。従来のマイクロ流体チャネル及びチャンバーの容量は、一般的にμＬ単位に限られている。容量がこれより小さい場合（ｎＬ単位）、容量の減少が表面積の減少によって反映されず、平滑でないバイオフィルム形成の影響がより明確になる。

また、マイクロ流体デバイスの大きさは、使用する任意のセンサーの大きさによっても制限される可能性がある。マイクロ流体技術が直面する上記以外の問題としては、廉価なデバイス及びマイクロ流体回路の提供、高速で大量に接種する方法の確立、並びに、細胞活性のリアルタイムの検出が挙げられる。
Ｗａｄａら，１９９１年，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：６００−６０１ ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら，１９９２年，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２

従来のマイクロ流体デバイスは、一般的に、フォトリソグラフィー加工でチャネル、反応チャンバー又はアレイを作成することによって、ガラス、シリカ又はシリコンを基盤とする基板の中に作成される。これらの基板を使用して出来のよいデバイス試作品が作成されてきたが、マスク製造、チャネルエッチング及びシーリング、並びに、ボンディング及びパッケージングを含む関連する作成技術の実施は一般的に困難かつ／又は高価である。ウェーハの大きさが比較的小さく、加工コストが非常に高く、配置、細工、設計の変更及び修正に費用がかかり、かつ、三次元的に設計するために高価な位置合わせ設備及びエッチング又は切断設備が必要であるため、超微細機械デバイスは大量生産できない。

本発明の要約
本発明のある態様によれば、センサーを有するマイクロ流体デバイスの中で細胞を確認する。これは、細胞がデバイスの壁に付着しないような条件下で実施する。

本発明の別の態様によれば、マイクロ流体デバイスは、センサー、並びに、試料及び増殖培地の入口を有するチャンバーを含む。デバイスの壁は、使用の際に細胞が付着しないようなものである。

チャンバーは、下流の第二チャンバーに接続していることが好ましい。第二チャンバーは、発現タンパク質又は酵素等の細胞構成成分を調べるために使用してよい。この場合、本発明のデバイスは、非生物的（第二）チャンバーに接続した生物的（第一）チャンバーを含むと考えてよい。

細胞がチャンバーの壁に付着しないようにすることによって、バイオフィルムの形成は最小限となる、又は、阻害される。バイオフィルムの形成が少しではあるが明らかに減少するため（例えばｎＬ単位）、表面積／容量の割合が大きくても、上記マイクロ流体チャンバーは従来のマイクロ流体デバイスよりもその大きさが重要ではなくなる可能性がある。

本発明のデバイスはマイクロ流体チャンバーを複数含むことが好ましく、これらはマイクロ流体チャネルで連結されていてよい。上記アレイを、炭素／窒素源、ビタミン及びミネラル補給剤等の多因子性の有効成分、並びに、これらが微生物の生理機能に及ぼす影響を研究するために使用してよい。

本発明のデバイスによって、細胞機構全体の能力を調べるための迅速で廉価な方法が得られる可能性があり、また、このデバイスを医薬及びバイオテクノロジー（全細胞のスクリーニング、薬剤の発見、ゲノミクス、プロテオミクス及びメタボロミクス、組織培養、生体内変化、キラル剤の作成）、食品及び飲料（増殖状態、培地の最適化、アミノ酸、ビタミン、ゴム、酸等の発酵産物）、環境（生物的環境浄化）又は学究界（微生物学、ゲノミクス、生化学）等の分野に使用できる可能性もある。

本発明によって、試薬にかかるコスト及び時間を顕著に削減でき、かつ、（特に微生物、菌類及び哺乳類の）細胞の増殖条件を最適化できる可能性がある。

好ましい実施形態の記載
本発明のデバイスは、センサー、並びに、試料及び増殖培地の入口、並びに、好ましくは出口を有するマイクロ流体チャンバーを含む。試薬は、１個以上のマイクロ流体チャネルを通ってチャンバー中に供給されることが好ましい。そして、チャンバーの出口は、好ましくはマイクロ流体チャネルを通って、廃棄物貯蔵器又は別のチャンバーにつながっていてよい。出力チャネルは、排水ライン及び試料採取ラインとして使用してよく、また、間隔の接近した島の交互貫入（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ）プリントパターンでこの出力チャネルを遮断することにより、増殖中の細胞がチャンバーから流出するのを防ぐフィルターとしてもよい。

本発明のデバイスは、プラスチック材料を使用して形成されることが好ましい。プラスチックはシリカ／シリコンを基盤とする基板よりも安くて扱いが容易なため、マイクロ流体機構に使用するのに魅力的な材料である。ポリマー材料は廉価で種類が豊富なため、耐熱性及び化学耐性、フォトリソグラフィー及びシルクスクリーン印刷、表面誘導（ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）及び多層ボンディングに使用するのに適切なプラスチックを選択できる。プラスチック材料としては、非水性培地用の不活性表面、化学改変可能な表面、及び、光信号の受信又は電気伝導の可能なデバイスを得ることのできる、線状、架橋性、不透明及び半透明のプラスチックが含まれてよい。プラスチックを使用すれば、現在のガラス、シリカ又はシリコンを基盤とする基板と比較して、シリコンに基づく技術と同等の特徴解像度（ｆｅａｔｕｒｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）、短い設計サイクル、低い細工コスト、及び、設計の本質的な柔軟性を含む明らかな利点がいくつかあり、また、プラスチックシート１枚の上に何千個ものデバイスを形成できる可能性がある。また、ボンディング、マウント又はパッケージング技術を用いずに直接デバイス自体に電気的に接続できる。適切なプラスチック材料の例としては、ポリプロピレン（ＰＰ）等のポリオレフィン、ポリカーボネート、ＰＤＭＳ、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスチレン、フルオロポリマー、及び、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等のアクリレートが挙げられる。

適切な材料を選択する際には、関連する特性、例えば、力学的、化学的、電気的、音波的及び光学的な特性、並びに、気体透過性、表面形態、滅菌性、生体適合性、並びに、特に、その材料に連結、エッチング又はプリントできるかどうかについても考慮するべきである。また、安定剤、充填剤、可塑剤及び着色剤等の添加物が、例えば細胞の増殖及び生存力に及ぼす可能性のある影響についても考慮するべきである。

本発明のデバイスは、多層構造を含んでよい。上記に記載するような材料は、基板として特に適切である。

上記のような基板の中にマイクロ流体チャンバー／チャネルを形成してよい。しかしながら、好ましくは、それ以外のより加工しやすい材料（エポキシ樹脂等）で基板上に「マトリックス」層を形成し、その中にマイクロ流体チャンバー／チャネルを形成する。必要であれば、このような特徴を有する壁を、細胞が付着しないように処理又は被覆してよい。そして、マイクロ流体に特徴的な層の上に基板用材料の層を更に付与して、デバイスを完成させてよい。

層はそれぞれ、公知の技術によって形成し、共に連結させてよい。適切な形成方法としてはプリント及び成型が挙げられる。層を連結するために、接着剤又はラミネーションを使用してよい。また、マイクロ流体は、エキシマー又は他のレーザーを使用したアブレーションを含む公知の微細工学工程によって形成してよい。

基板は透過性でないことが好ましい。試料／試薬等を導入するために、又は、センサーを監視できるようにするために、例えばレーザーで、基板に穴を１個以上開けてよい。この代わりに、又は、これに加えて、基板材料に針を貫通させて材料を通す穴を開けることが好ましい。

各チャンバーの容量は一般的に少なくとも５０ｎＬ、例えば１０μＬ以下であるが、５００ｎＬ以下、１μＬ以下又は２μＬ以下の場合が多い。厚さ５００μｍの基板においては、幅１．０ｍｍ、１．５ｍｍ及び２．０ｍｍの穴があると、各チャンバーの容量は約４００ｎＬ、９００ｎＬ及び１．６μＬとなる。

本発明の特徴は、チャンバーの壁に細胞が付着しないということである。チャンバーの壁に細胞が付着しないようにすることによって、バイオフィルムの形成が制御される。

細胞が付着しないようにするためには多くの方法がある。チャンバー及び／又はチャネルの内部を親水性物質（例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ））で被覆して、代謝不可能なマンノース特異的付着因子（例えばメチルα−Ｄ−マンノピラノシド）阻害剤を増殖培地中に配合するという方法が、上記方法に含まれる。

チャンバーの壁は平滑であることが好ましい。ＰＭＭＡ又はＰＰ等の基板は平滑であり、エポキシ樹脂の平滑度は、塗布する前に例えば超音波処理、脱気又は遠心分離することによって調節できる。また、酸又はアルカリで処理することによって、核形成点を最小限にすることが可能である。

バイオリアクターチャンバーに酸素を多量に供給することによって、微生物の増殖を促進してよい。デバイスは、例えば酸素、ＣＯ_２又はＮＨ_３が透過できるような気体透過性物質の内部表層を含むことが好ましい。また、内部表面は、（偏性）嫌気性菌を考慮して酸素を透過しないものであってもよい。気体透過性のプラスチックの例としては、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）及びポリメチルペンテン（ＰＭＰ）等のポリアルケンが挙げられる。これらは光学的に純粋であって、化学的耐性を有するものでもある。ポリアルケンは疎水性で、「低エネルギー」プラスチックである。エポキシ層に付着させるためには、表面をある程度活性化することが必要である。また、使用する際に、微生物の付着を防ぐために表面をできるだけ親水性にすることが望ましい。これは、酸素プラズマ法でポリアルケン表面をエッチングすることにより達成できる。この場合、ポリアルケンを例えばＰＶＡで被覆して、表面が疎水性に逆戻りすることを防ぐのが好ましい。また、ポリアルケンの表面をクロム酸で処理することもできる。この処理によってプラスチック表面が酸化し、親水性になる。これらの方法により、大腸菌及びカゼイ菌等の微生物の付着が９０％まで減少することが分かっている。

本発明のデバイスは、フルオロポリマー層を含むことが好ましい。フッ化エチレンプロピレンポリマー（ＦＥＰ）等のフルオロポリマーは、優れた気体透過性及び光学特性を有する。しかしながら、フルオロポリマーは反応性が低いため、塗布する前に前処理する必要がある。これには、ナフタレンナトリウム錯体（ｓｏｄｉｕｍ ｎａｐｔｈａｌｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）等の還元剤を使用する方法がある。この還元剤については、多様な混合物（例えば、Ｗ．Ｌ．ゴア・アンド・アソシエーツ社製Ｔｅｔｒａ−Ｅｔｃｈ）が市販されており、入手可能である。例えば（硝酸等の）酸化剤を使用して、再酸化を制御することが必要な場合がある。

生物的プロセスを包括的に調べるためには、生物的相及び非生物的相を評価することが必要である。細胞増殖、並びに、生態系の代謝及び生産パラメーターを生物的プロセスで定義し、一方、（化学的かつ／又は物理的な）代謝の産物によって非生物的プロセスを定義する。

デバイスは、生物的チャンバーと非生物的チャンバーとを組み合わせて含むことが好ましい。非生物的チャンバーは、生物的チャンバー中における細胞プロセスの産物の各性質を標的として設計した捕獲、分離及び解析機構を含んでよい。この場合、バイオリアクターチャンバーは「擬ケモスタット」として見なしてよく、ここから溢れた液体を元にして下流で代謝産物を分析する試料とする。また、栄養刺激及び環境刺激に対する代謝応答のパターンを調べてよい。そして、その観察結果を、調査の対象である微生物を定性的かつ定量的に調べるために使用できる。更にその結果を、栄養的要素、環境的要素及び時間的要素を定義するために使用してよい。

また、本発明のデバイスは、適切な親和性吸着剤又はＨｉｓ−ｔａｇ結合剤により特定のタンパク質を捕獲して、これにより適切なセンサー（例えばホログラフィックセンサー又は音波センサー）でその存在を確認するために使用してもよい。直接的な磁気生成で誘導されるパルス音波を用いる方法は、音波の損失が共鳴形式における損失よりも顕著に小さいこと、及び、周波数の連続スペクトルによる呼びかけが可能であるために対象のタンパク質、細胞又はオリゴヌクレオチドを識別できることから、プラスチック基板に適合する。

デバイスは、意図する用途に合わせて設計してよい。例えば、異なる炭素源及び窒素源、ビタミン、増殖因子、ミネラル補給剤及び前駆体等の１種以上の増殖培地を投与するために多チャネル式で材料を投入すること、並びに、チャンバー内にセンサーを追加して設置することも、上記の意味に含まれる。チャンバーは、撹拌器、好ましくは直径２０〜１００μｍの磁気ビーズを含むことが好ましい。他に考えられるものとしては、マイクロチャンバー、たてよこ比の大きいマイクロチャネル、マイクロ流体駆動機構、流量特性、ポンプ、撹拌器及び保持用フィルターのプリント並びに／又はフォトリソグラフィーエッチング、並びに、下流の解析モジュールの作製が挙げられる。

チャンバーは、（例えば、バイオマス（細胞数）又は温度の変化、及び、増殖に関連する重要な特性（ｐＨ、溶存酸素、酸化還元電位、基質濃度）の変化を感知することによって）細胞活性を確認するために１種以上のセンサーを有する。バイオリアクターチャンバー内の制御盤中に、複数のセンサーを互いに隣接して配置してよい。センサーはウェル周囲に配置してよく、このことにより、光路長を透明にできるだけでなく、撹拌器の作動装置としても作用する。チャンバーには（好ましくはデジタルカメラ及び画像ソフトを備えた）顕微鏡を取り付けてよく、これを使用して真核生物の細胞プロセスを確認してよい。

ホログラフィックセンサーの技術は、一般的に本発明に適合している。ホログラフィックセンサーを使用すると、気体、イオン、代謝産物、抗原及び細胞全体等の様々な検体を、迅速な応答によってリアルタイムで確認できる。センサーは、気体（例えばＯ_２、ＣＯ_２）、グルコース、ｐＨ、乳酸塩、グルタミン酸塩／グルタミン、温度、酸化還元、イオン（例えばアンモニウムイオン）及び細胞産物（抗生物質、酵素、発現タンパク質）等の検体の組み合わせに対して感受性があるものであってよい。このような適切なホログラムは、ＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９５／２６４９９及びＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９９／６３４０８に記載されている。

センサー電極は、ｐＨ、溶存酸素、グルコース又はその他の生化学的基質をｉｎ ｓｉｔｕにおいて測定するために使用できる。ｐＨ感受性電極は、五酸化タンタル（タンタル（Ｖ）イソプロポキシドからプリント、ゾル−ゲル構成、１００〜１１０℃で硬化）、二酸化イリジウム、白金二酸化又は二酸化ルテニウム（ポリマーペーストと重量比１：２で混合した焼結二酸化ルテニウム水和物からプリント）等の金属酸化物を含んでよい。溶存酸素感受性電極は、金、又は、プラスチック基板、白金マイクロアレイ電極及び銀／臭化銀疑似対照を含む三層構造、並びに、内部に電解質ゲルを封入した気体透過性ＰＴＦＥ膜を含んでよい。温度又は酸化還元電位は、プリントされた白金から形成されていてもよい。バイオマスは、光源としての黄色ＬＥＤ（γ_ｍａｘ５９２ｎｍ）、検出器としてのシリコン光ダイオード／増幅器、並びに、チャンバーの中及び外へ光を伝達する光ファイバー光導体を使用して、５８０〜６００ｎｍの光呼びかけ信号によって測定してもよい。また、膜蛍光、色変化等の技術を更に使用してもよい。

ルテニウムを基盤とするセンサー、特に蛍光消光ルテニウムを基盤とする酸素センサーを使用してもよい。ルテニウムイオン１個及びフェナントロリンを基盤とするリガンド３個を有するこのような化合物としては様々なものが入手可能であり、酸素含有量を測定するためにポリマーマトリックスの中に固定できる。蛍光を基盤とするその他のセンサーを使用できる。イオン濃度、気体濃度、ｐＨ等の変化を伴って蛍光を増加又は減少させる化合物としては様々なものがある。また、（特にｐＨ等の変数に対して）使用できる単純な色変化反応としては様々なものがある。

チャンバーからのデータは、（適切なアナログインターフェースを組み込んだコンピューターを含むことが好ましい）データロガー上に蓄積できる。インターフェース回路類は、高度で単調な測定を間隔をあけて実施すること（例えば１５秒毎に４８時間）、又は、シグナルを同時に「スナップショット」すること（例えばセンサー数が４００個を超える場合等）ができるように柔軟であることが好ましい。これらの回路によって作製したデータは、データロギング、解析及びリアルタイムフィードバック制御機構等のコンピューターによって使用できるであろう。大規模な並列細胞培養機構を使用した生物的プロセス又は非生物的プロセスの効率的な調査及び開発には、高次元のデータ生成及び解析を使用することが必要である。実験を設計、制御及び解析するために、多元的な方法及びその他の統計方法を組み込むことが好ましい。ホログラフィー等の解析応答可変データセット（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄａｔａ ｓｅｔ）から情報及び知識を抽出するために、主成分分析等の多変量解析法を使用できる。本質的に異なっている生物的データ列及び非生物的データ列を組み合わせることによってアルゴリズムセンサー及び間接的動力源を構築し、代謝状態、生理状態及び細胞状態についての情報及び知識を得てもよい。

本発明のデバイスは、マイクロ流体チャンバーを（マイクロチャネルで任意に連結して）並べたアレイの形態であってよい。このアレイは、生物的チャンバー及び非生物的チャンバーを並べたものであってよい。例えば、チャンバーの数が非常に多い場合でも（アレイ上の各チャンバーにはそれぞれ異なる増殖培地を供給する）その性能を確認する目的で、システムに原料を供給し、かつ、システムを管理し、かつ、システムを制御するためにこのようなアレイを使用してよい。必要であれば、マイクロ流体の接触、並びに、流体工学的な大規模多重送信、光呼びかけ信号機構及び入出力接触子（ｉｎｐｕｔ／ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔａｃｔｓ）に関連したスケールアップをデバイス内で確実に達成できるようにするために、アレイの構成について入念に考慮しなければならない。このアレイは、任意の生物的相、非生物的相及び解析相を適切に配置した二次元アレイ、テープ、ディスク又はドラムの形態の中に形成してよい。より一般的には、センサーは、１個以上のチャンバー（各対を適切なチャネルで相互に連結してよい）の中に並べたアレイの形態であってよい。アレイの配置（例えば列及び行）は、適切な光学検出装置又はその他の検出装置に適合するものであればよい。

本発明は特に、細胞培養（例えば組織培養及び発酵プロセス）についての研究に適切である。現在のところ、発酵の進行についての研究技術では、多くの代謝有効成分について同時に（単独で、又は、相互作用する因子と組み合わせて）研究することが困難である。しかしながら、生産量を最大にできる発酵法をできるだけ速やかに定めるためには、この研究が必要である。従って、微生物の生理機能における何百何千もの有効成分を同時に試験できるシステムを考案する必要がある。このことは、本発明のデバイスを、好ましくはアレイ状に並べて使用することによって実現できる可能性がある。

また、本発明は、糸状体微生物、前駆物質の生体内変化、（胞子を含む）複合培養の接種、新規の細胞間伝達型生理活性抗菌化合物、及び、代謝経路を遺伝子工学で改変した細胞に関する研究において使用してもよい。上記以外の本発明の用途としては、突然変異で分離した細胞の（機能的ゲノミクスを裏付けとする）迅速な解析、抗生物質の生産及びその感受性の高速大量スクリーニング、アゴニスト／アンタゴニストを調べるための、及び、重要な生物医薬化合物を生産する細胞機構を調べるための細胞バイオアッセイの自動化、細胞のエネルギー束及び代謝状態及び生理状態及び混合培養系及びその相互作用及び細胞毒性物質が環境に及ぼす影響及び受容体を介した応答及びサブタイプ及びシグナル変換経路及びリガンド依存性イオンチャネルの調査が挙げられる。

以下の実施例によって本発明を説明する。

エポキシ樹脂をプリントしたポリカーボネート基板を使用して、マイクロ流体デバイスを作製した。樹脂層を使用して、入出力マイクロチャネル並びにマイクロ流体チャンバーを定めた。各デバイスのチャンバー中に異なる濃度（０．０２〜０．２Ｍ）の塩酸を導入し、４５分間静置してエポキシ基を硬化させた。その後、デバイスの洗浄を、洗浄水のｐＨがバックグラウンドの水のｐＨと等しくなるまで滅菌蒸留水で行い、乾燥させた。その後、大腸菌細胞及び増殖培地の試料をチャンバー中に導入して培養した。

１時間経ってもバイオフィルムはほとんど観察されなかったことから、エポキシ基の硬化によって、チャンバー中のエポキシ樹脂表面への細胞の付着が顕著に減少することが分かった。

ポリカーボネート／エポキシ樹脂のマイクロ流体デバイス３個の中で、大腸菌細胞をＬＢ増殖培地中で震盪せずに培養した。１個のデバイスにはマンノースを添加したＬＢ培地を導入し、別のデバイスには、代謝不可能なマンノース類似体（メチルα−マンノピラノシド）を含むＬＢ培地を導入した。３７℃で４時間インキュベートした後、各デバイスをクリスタルバイオレットで染色し、視野内の付着微生物数を計数した（倍率６００倍）。

図１は、ことを示す。

ポリカーボネート基板、エポキシ層及びＬＤＰＥ層を積層することにより、マイクロ流体デバイスを作製した。ＬＤＰＥにより、材料を運搬するための針を導入できる。形成したエポキシ樹脂を、酸及びポリビニルアルコール（ＰＶＡ）皮膜で処理し、続いて酸性グルタルアルデヒドで架橋させた。その後、過剰量のグルタルアルデヒドを洗浄して除去した。大腸菌／ＬＢ培地の静置培養を使用して、バイオフィルム形成の程度を調べた。

図２は、親水性の架橋ＰＶＡの存在によって、バイオフィルムの形成が顕著に抑制されたことを示す。各カラム（ａ、ｂ及びｃ）については、左のカラムがエポキシ樹脂上の微生物数を示し、右のカラムがポリカーボネート上の微生物数を示す。

ポリカーボネートで支持し、エポキシ樹脂で被覆したデバイスを複数個作製した。標準的な混合法によってエポキシ樹脂を二通り作製し、その一方を超音波処理して気泡を一部除去した。各デバイスは、ＰＶＡで被覆した後、表面上に存在する破裂した気泡の数によって分けた。超音波処理によって、破裂した気泡の数が約５０％減少することが分かった。その後、デバイスを使用して、大腸菌静置培養物を発酵させた。

破裂した気泡を詳細に調べたところ、大半の気泡では付着微生物の数は全く増加していなかったが、密集した細胞コロニーで覆われた気泡もあったことが明らかになった。このように覆われた気泡は縁が明瞭ではっきりしており、「角があり」特徴的であった。破裂した気泡の約５％をこの種類に分類した。

図３は、（ＬＤＰＥを積層し、エポキシ樹脂を一度硬化させた際にＬＤＰＥを除去して作製した、）表面に「角がある」ポリカーボネート／エポキシ樹脂のデバイスに付着した微生物の数、及び、表面が「平滑な」デバイスに付着した微生物の数を示す。平滑な表面には微生物が付着しにくく、このため、バイオフィルムが形成されにくい。

上層にポリアルケン（ＬＤＰＥ）皮膜を含むポリカーボネートに基づくマイクロ流体デバイスを６個作製した。これらのデバイスのうち２個を３０秒間、別の２個を９０秒間、酸素プラズマで処理して、処理度の異なるデバイスを二組得た。その後、そのうちの一組のデバイスをＰＶＡで処理し、一方、もう一組にはこの処理を行わなかった。その後、各デバイスのチャンバー中で大腸菌を培養した。

ポリアルケンは疎水性であり、従って微生物の付着を促進する。ポリアルケンを親水性のＰＶＡで被覆することによって、微生物数が減少すると予想された。

図４は、初期の微生物数、並びに、６時間後及び２４時間後の微生物数を示す。ポリアルケンのプラズマ処理によっても、また、ＰＶＡの添加によっても、微生物の付着量が減少する。

上層にフッ化エチレンプロピレンポリマー（ＦＥＰ）を含むポリカーボネート／エポキシ樹脂マイクロ流体デバイスを３個作製した。このうち１個のデバイスは、ＦＥＰをナフタレンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｎａｐｔｈａｌｉｄｅ）で前処理することによって作製した。別のデバイスは、ＦＥＰをナフタレン錯体で前処理し、ＰＶＡで被覆することによって作製した。その後、各デバイスのマイクロ流体チャンバー中で大腸菌を培養した。ナフタレンナトリウム錯体は、ＦＥＰの反応性を上昇させてデバイスの生産性を上げるために使用した。

図５は、各デバイスの微生物数を示す。ＦＥＰ層をナフタレンナトリウム錯体で被覆することによって付着微生物数が増加するが、付着細胞の総数は、本発明のデバイス中で一般的に使用する他のプラスチック材料を用いた場合の範囲内のままである。ＦＥＰ層をＰＶＡで被覆することによって、微生物の付着が確実に減少した。ＦＥＰは、気体透過性及び光学特性が望ましいことから、好ましい材料である。

酸素透過性の上層を含むポリカーボネートマイクロ流体デバイスを２個作製した。このデバイスのうち１個はポリメチルペンテン（ＴＰＸ）上層を含み、もう一方はＦＥＰ上層を含むものであった。その後、各デバイスのマイクロ流体チャンバー中で大腸菌を培養した。

通性嫌気性生物である大腸菌の急速で好気的な増殖期は、酸素透過性のより高いプラスチックを使用することによって長くなる可能性があることが分かった。ＴＰＸはＦＥＰよりも酸素透過性が高く、図６中に示すように、酸素が制限栄養分になるまで好気的な指数増殖期をより長く維持する。

微生物の付着量に及ぼすマンノース及びマンノース類似体の影響。 バイオフィルム形成に及ぼすエポキシ樹脂及びポリカーボネートの影響。 微生物の付着量に及ぼすデバイス表面の影響。 微生物の付着量に及ぼすプラズマ処理及びＰＶＡ添加の影響。 微生物の付着量に及ぼすＦＥＰ層処理の影響。 大腸菌の増殖に及ぼす酸素透過性の影響。

Claims (27)

1. マイクロ流体デバイスの中で細胞を確認する方法であって、
   前記デバイスはセンサーを有するチャンバーを含み、
   前記確認は、細胞がチャンバー表面に付着しないような条件下で実施する
   ことを特徴とする方法。
2. 前記チャンバー表面は、気体透過性材料を含む
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記気体はＣＯ_２、ＮＨ_３又はＯ_２である
   ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記材料はフルオロポリマーである
   ことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
5. 前記チャンバー表面は、親水性材料を含む
   ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記親水性材料はポリビニルアルコールである
   ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 前記チャンバーは、プラスチック基板上を被覆したエポキシ樹脂の中に形成する
   ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記プラスチック材料はポリカーボネートである
   ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 前記チャンバーはセンサーを複数有する
   ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記センサーは、酸素、二酸化炭素、アンモニウムイオン又はｐＨに対して感受性がある
    ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記センサーは光センサーである
    ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記センサーはホログラフィックセンサーである
    ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記センサーは電気化学センサー又は音波センサーである
    ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記センサーは、発酵反応物又は発酵産物に対して感受性がある
    ことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記チャンバーの容量は５０ｎＬ〜１０μＬである
    ことを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 増殖培地をチャンバー中に導入することを更に含み、
    前記センサーは、細胞増殖反応物又は細胞増殖産物に対して感受性がある
    ことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記増殖培地は代謝不可能なマンノース類似体を含む
    ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 前記類似体はメチルα−Ｄ−マンノピラノシドである
    ことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 細胞構成成分又は細胞由来成分を第二マイクロ流体チャンバー中に導入することを更に含み、
    前記第二マイクロ流体チャンバーは、センサーを有し、かつ、前記成分を調べる第一チャンバーに連結している
    ことを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記成分は細胞増殖産物である
    ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. 前記成分は発現タンパク質又は酵素である
    ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
22. 前記第二チャンバーのセンサーは請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のものである
    ことを特徴とする請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
23. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法に使用するのに適切なマイクロ流体デバイスであって、
    センサー、並びに、試料及び増殖培地の入口を有するチャンバーを含み、
    チャンバー表面は、使用の際に細胞が付着しないようなものである
    ことを特徴とするデバイス。
24. 請求項２〜１５に記載の任意の特徴を有する
    ことを特徴とする請求項２３に記載のデバイス。
25. チャンバーを複数含む
    ことを特徴とする請求項２３又は２４に記載のデバイス。
26. 前記チャンバーはアレイの形態である
    ことを特徴とする請求項２５に記載のデバイス。
27. チャンバーの対はチャネルで連結している
    ことを特徴とする請求項２５又は２６に記載のデバイス。

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