DE60036420T2

DE60036420T2 - Mikrofluidischer Artikel

Info

Publication number: DE60036420T2
Application number: DE60036420T
Authority: DE
Inventors: Raymond P Saint Paul Johnston; James G. Saint Paul Bentsen; Kurt G. Saint Paul Halverson; Gary E. Saint Paul Krejcarek; Patrick R. Saint Paul Fleming
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2020-07-08
Also published as: DE60011429T3; DK1449585T3; JP2003503715A; WO2001002093A2; EP1196243B2; DE60036420D1; EP1196243B1; EP1196243A2; MXPA02000144A; WO2001002093A3; ES2222217T5; AU6077400A; JP4503897B2; BR0012164A; CA2378144C; ATE268642T1; DE60011429D1; ES2294389T3; CA2378144A1; ATE372830T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Gegenstände, die die Fähigkeit besitzen, Fluide, insbesondere biologische Fluide, zu steuern oder zu transportieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Gegenstände, die die Fähigkeit zur Aufnahme und zum Transport solcher Fluide zu Zwecken anschließender Nachweise besitzen.
Allgemeiner Stand der Technik
Biologische Tests, die die Aufteilung von Proben erfordern, werden traditionell in Teströhren oder Microwell-Platten durchgeführt und erfordern in verschiedenen Phasen manuelles Eingreifen, um Probeentnahme-, Reinigungs-, Reagenszusatz- und Nachweisschritte zu ermöglichen, die erforderlich sind, um den Test selektiv und spezifisch zu machen. Derzeitige Entwicklungen auf diesem Gebiet haben sich auf die Fähigkeit konzentriert, Fluidproben schnell zu bearbeiten, um die Effizienz und Kostengünstigkeit zu erhöhen. In einigen Fällen wurden automatisierte Anlagen zur Behandlung der Proben entwickelt, um den Umfang manuellen Eingreifens zu reduzieren und um die Erkennung von Testreaktionsprodukten in mehreren Mikrokalotten einer Platte zu unterstützen, womit die Geschwindigkeit und die Effizienz des Testens, der Behandlung und der Vorbereitung von Fluidproben erhöht werden. Wegen der Größe der automatisierten Anlagen sind diese Tests jedoch schwierig außerhalb des Labors durchzuführen.
Neben diesen Entwicklungen gibt es einen Trend zur Verringerung der Größe der Instrumente, die zur Analyse und Bearbeitung der Proben verwendet werden. Diese Reduzierung der Größe bietet neben einer erhöhten Analysegeschwindigkeit mehrere Vorteile, wie etwa die Möglichkeit, sehr kleine Proben zu analysieren, die Möglichkeit, eine verkleinerte Menge von Reagenzien zu verwenden, und eine Reduzierung der Gesamtkosten.
Eine Nebenerscheinung dieser Größenverringerungen ist eine erhöhte Notwendigkeit der Genauigkeit bei der Quantität der bereitgestellten Fluidprobe. Mit Volumen im Mikroliterbereich können selbst winzige Abweichungen in der Probenmenge eine deutliche Auswirkung auf die Analyse und die Ergebnisse der Fluidprobentests haben. Demzufolge sind Gegenstände zur Beherbergung der Fluidproben während der Vorbereitung, Behandlung, Testdurchführung und Analyse erforderlich, die extrem genaue Strukturen zum Fluideinschluss und zum Fluidtransport auf oder in den Gegenständen bereitstellen. Hochgenaue Gegenstände zur Mikrofluidbehandlung und -analyse sind aus Glas- oder Siliziumsubstraten hergestellt worden, die lithografisch strukturierte und geätzte Oberflächenmerkmale aufweisen. Mit der Verwendung von lithografisch strukturierten Mikrofluidchips auf Glas- oder Siliziumbasis wurde eine grundlegende Durchführbarkeit für Enzymtests, Immuntests, DNA-Hybridisierungstests, Partikelmanipulationen, Zellanalysen und molekulare Auftrennungen auf der Basis von Mikrofluidchips geschaffen. Es bleibt jedoch auf dem Fachgebiet ein Bedarf bestehen, diese verschiedenen Funktionen zu kombinieren, um die Aufgaben komplexer biologischer Tests zu unterstützen, die für die biomedizinische F&E, die Entdeckung pharmazeutischer Wirkstoffe, für die medizinische Diagnostik, die Lebensmittel- und Landwirtschaftsmikrobiologie, die militärische und die forensische Analyse wichtig sind. Auf Glas und Silizium basierende Chips werfen mehrere praktische Probleme bei der Lösung dieser Aufgaben auf. Diese Probleme betreffen die hohen Herstellungskosten, die Inkompatibilität zwischen einzelnen Prozessen zur Mikrofertigung der Glassubstrate und kontinuierlichen Prozessen zum Einführen der Testreagenzien und die Schwierigkeiten, die mit dem Aufsiegeln einer Glasabdeckung auf den mit Reagenzien imprägnierten Chip einhergehen. Gegenstände aus Kunststoffsubstraten wie etwa Polyimiden, Polyestern und Polycarbonaten wurden ebenfalls vorgeschlagen.
Die Größenreduzierungen auf dem Fachgebiet haben auch einen Bedarf an Geräten und Verfahren zur Einführung einer Fluidprobe in die hochgenauen Strukturen zur Fluideinschluss und zum Fluidtransport erzeugt. Einige derzeitige Verfahren umfassen das Ausgeben der Fluidprobe über eine oder mehrere Pipetten, Kanülen oder andere ähnliche Geräte. Diese mechanische Einführung einer Fluidprobe erfordert die genaue räumliche Übereinstimmung zwischen dem Fluidausgabegerät und dem Testgerät sowie die genaue Messung der Menge der ausgegebenen Fluidprobe.
Um dem Bedarf an Analysesystemen mit hohem Durchsatz (sowohl automatisierte als auch manuelle) gerecht zu werden, wurden Substrate entwickelt, die mit mehreren Bearbeitungs- und Analysegegenständen für Fluidproben ausgestattet sind. Solche Substrate können als flexible Rollware geformt sein, die das simultane und/oder synchrone Testen von Fluidproben, die in den mehreren Gegenständen enthalten sind, ermöglicht. Alternativ können solche Substrate als starre, halbstarre oder biegsame Bahnware geformt sein, die ebenfalls das simultane und/oder synchrone Testen von darin enthaltenen Fluidproben gestatten kann. Optional können die Gegenstände Ware sein, die von der Rolle oder der Bahn getrennt ist, um eingeschränktes Testen zu ermöglichen.
US-A-4,233,029 offenbart ein Flüssigkeitstransportsystem und -verfahren für den gesteuerten Fluidfluss, wobei das Gerät einander gegenüberliegende Flächen enthält, die eine Zone mit gesteuertem Kapillarfluss bereitstellt, wobei jede Fläche Mittel zum Leiten eines Flusses entlang festgelegter Abschnitte umfasst und mindestens eine Fläche Mittel umfasst, die die Einführung von Flüssigkeit zwischen den Flächen ermöglicht.
US-A-3,715,192 offenbart einen Indikatorstreifen, der in analytischen chemischen Verfahren verwendbar ist und ein imprägniertes Kapillarmaterial umfasst, das mindestens einen teilweise transparenten Film auf der einen oder auf der anderen Seite aufweist, wobei ein Film einen Hohlraum bildet, der in Verbindung mit dem Kapillarmaterial steht.
In der Patentschrift US-A-5,477,239 ist ein System zum Bereitstellen eines zusätzlichen Frontbeleuchtungssystems für eine Flüssigkristallanzeige offenbart.
Es besteht weiterhin ein Bedarf an effizientem, kostengünstigem und schnellem Testen von Fluidproben, besonders auf dem Gebiet biologischer Nachweistests wie oben beschrieben, gekoppelt mit einer Notwendigkeit der Genauigkeit bei den Fluidmengen und den Strukturen des Gegenstandes. Diese Kombination hat einen entsprechenden Bedarf an Herstellungs- und Formungsverfahren erzeugt, die die erforderlichen Fluidtestgegenstände auf kostengünstige und effiziente Weise herstellen und gleichzeitig die Genauigkeit in einem einzelnen Gegenstand und von einem Gegenstand zum anderen beibehalten. Außerdem besteht weiterhin eine Notwendigkeit für Konstruktionen von Fluidtestgegenständen, die die verschiedenen Bedürfnisse in den Branchen der diagnostischen, forensischen, pharmazeutischen und anderen biologischen Analyse hinsichtlich der Bearbeitung, des Testens und Analysierens von Fluiden erfüllen und die die oben beschriebenen strengen Vorgaben der Effizienz, Kostengünstigkeit und Genauigkeit einhalten, während sie gleichzeitig auch die Test- und Analyseprozesse vereinfachen. Ferner wäre es vorteilhaft, eine Fluidbearbeitungsarchitektur bereitzustellen, die eine Probe in Aliquote unterteilt, wobei jedes Aliquot mit einer anderen Kombination von Testreagenzien reagieren soll. Es wäre auch vorteilhaft, eine Fluidbearbeitungsarchitektur mit zusätzlichen optischen oder elektronischen Merkmalen bereitzustellen, die den Nachweis von fluorogenen oder chromogenen Indikatoren, elektrochemischen Reagenzien, Agglutinationsreagenzien und dergleichen verbessert.
Kurzdarstellung der Erfindung
Der mikrofluidische Gegenstand der vorliegenden Erfindung erfüllt die Bedürfnisse der Fluidprobentestbranche, indem er für die effiziente und schnelle Bearbeitung von Fluidproben zum Zweck der Durchführung biologischer Tests sorgt. Die vorliegende Erfindung betrifft miniaturisierte Nachweisgegenstände, die koextensive Kanäle umfassen, welche einen ununterbrochenen Fluidfluss über die Länge des Gegenstandes bereitstellen, wobei die Kanäle eine Fluidpobe aufnehmen, die Fluidprobe entlang der Kanäle transportieren und den Nachweis im Zusammenhang mit der Fluidprobe in den Kanälen erleichtern. Die vorliegende Erfindung stellt einen mikrofluidischen Gegenstand gemäß den Ansprüchen bereit.
In mindestens einem Beispiel umfasst ein Nachweisgegenstand mindestens eine Filmkomponente zur Fluidsteuerung mit mindestens einer mikrostrukturierten Fläche, die mehrere koextensive Kanäle darin umfasst. Der Nachweisgegenstand umfasst mindestens eine Nachweiszone, wobei die Nachweiszone für den Nachweis einer Eigenschaft der Fluidprobe innerhalb der Nachweiszone sorgt, insbesondere eines Ergebnisses eines Ereignisses oder einer Bedingung in einem oder mehreren der Kanäle. Die Nachweiszone umfasst mindestens ein Nachweiselement, bei dem es sich um eine beliebige stoffliche Zusammensetzung oder ein Strukturelement handelt, die/das den Nachweis der Eigenschaft erleichtert. Die Erleichterung des Nachweises soll jede Beteiligung am Nachweisprozess und/oder jede beliebige Modifizierung der Fluidprobe zwecks Ermöglichung des Nachweises umfassen. Die Nachweiselemente können sich in den Kanälen, in einer optionalen Deckelschicht, die die Kanäle ganz oder teilweise bedeckt, befinden oder außerhalb des Gegenstandes.
Der Nachweisgegenstand umfasst auch eine Aufnahmezone, die als eine Schnittstelle zwischen der flüssigen Probe und dem Nachweisgegenstand dient. Die Aufnahmezone umfasst bevorzugt zwei oder mehr Kanäle, die in der Lage sind, durch spontanen Flüssigkeitstransport eine Fluidprobe in den Artikel aufzusaugen, und die somit entsprechend hydrophil und außerdem mit einem geeigneten Oberflächenenergieniveau ausgestattet sein müssen, wenn die Kanäle offen und nicht durch eine Deckelschicht bedeckt sind.
In einem anderen Beispiel umfasst der Nachweisgegenstand ein dreidimensionales Feld koextensiver Kanäle, das aus einem mehrschichtigen Stapel von Filmschichten zur Fluidsteuerung gebildet ist. Die gestapelten Filmschichten zur Fluidsteuerung können als ein Nachweisgegenstand für mehrere Parameter verwendet werden, wobei die einzelnen Kanäle des gestapelten Feldes jeweils ein anderes Nachweiselement enthalten können.
Die Nachweisgegenstände können zur Glukosebeobachtung, zum Enzym-basierten Testen, zur Bakterienidentfizierung, zum Festhalten einer Antikörpersonde, zur Charakterisierung biologischer Makromoleküle, für DNA-Mikroarrays, für Sterilisationssicherung und zahlreiche andere biologische Tests verwendet werden. Die Nachweisgegenstände können in kontinuierlichen rollenübergreifenden Prozessen hergestellt werden. Dies ermöglicht den Einschluss von mikroreplizierten Kanälen mit hohem Seitenverhältnis mit Unterstrukturen wie etwa verschachtelten Kanälen, um die Fließdynamik zu verbessern, und variable Seitenverhältnisse, um den Zeitablauf des Fluidflusses oder optische Weglängen zu steuern. Außerdem ermöglichen kontinuierliche Prozesse die Strukturierung organischer oder anorganischer Dünnschichtfilme zur Steuerung der Oberflächenenergie und der chemischen Absorption, die Strukturierung von Probenreinigungselementen, Testreagenzelementen, mikrooptischen und flexiblen Schaltungselementen.
Die vorliegende Erfindung stellt viele Nutzen und Vorteile gegenüber Fluidprobentestgeräten nach dem Stand der Technik bereit, einschließlich der präzisen Steuerung des Fluidflusses innerhalb des Nachweisgegenstandes, womit eine schnelle Fluidaufnahme und -verteilung ermöglicht wird, sowie einer dreidimensionalen Fließsteuerung. Die Fluidströme in dem Gegenstand können geteilt und bei Bedarf wieder vereinigt und dann je nach Bedarf auf andere Weise erneut geteilt werden, was neuartige Vielfachtests ermöglicht. Außerdem können mehrschichtige Gegenstände mit Öffnungen bereitgestellt werden, die die Schichten über Fluide miteinander verbinden.
Außerdem ermöglicht die Verwendung einer offenen, mikrostrukturierten Oberfläche die einfache Einbringung von Netzmitteln in gewünschte Bereiche, um das Fluid zu modifizieren oder um den Nachweis zu erleichtern. Hochgradig mehrfach genutzte, miniaturisierte Nachweisgegenstände können hergestellt werden, indem verschiedene Nachweiselemente in benachbarte Kanäle des Gegenstandes eingesetzt werden, womit der Nachweis verschiedener Ergebnisse in jedem Kanal oder der Nachweis verschiedener Grade oder Konzentrationen desselben Ergebnisses erleichtert wird. Die Verwendung eines undurchlässigen Materials zur Erstellung einer Mikrostruktur eröffnet die Möglichkeit eines offenen Tauchstabes ohne Schutzabdeckung, wobei die Fluidprobe durch Oberflächenspannung, die eine sehr starke Haltekraft sein kann, in den Kanälen gehalten werden kann. Auf der anderen Seite würde die Verwendung eines halbdurchlässigen Materials zur Erstellung der Mikrostruktur den Einsatz einer gesteuerten Fluidverteilung ermöglichen. Optional kann eine Deckel- oder Abdeckschicht bereitgestellt sein, die als Schutzschicht dienen kann, die Einsaugfähigkeit der Aufnahmezone erhöhen kann und/oder den Nachweis erleichtern kann.
Die Fluidtransportbeschaffenheit der mikrostrukturierten Filmschichten zur Fluidsteuerung, die zur Bildung des Nachweisgegenstandes verwendet werden, ermöglicht die problemlose Einführung einer Fluidprobe in die Struktur durch Kapillarwirkung, ohne die Notwendigkeit zusätzlicher Prozesse wie etwa die Probeneingabe mittels Kanüle oder Pipettierung. Dieses Merkmal macht den Nachweisgegenstand schneller und einfacher in der Verwendung, kostengünstiger in der Herstellung und Verwendung und allgemein vielseitiger. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Möglichkeit bereit, die Filmschicht weiter zu bearbeiten, etwa durch das Aufkleben einer Deckelschicht auf die Filmschicht, das Bilden eines mehrschichtigen Gegenstandes und/oder das Bilden anderer Strukturen.
Zu den zusätzlichen Nutzen gehört die Fähigkeit, den Nachweis durch Beobachtung oder Betrachtung der Nachweiszone zu erleichtern, indem offene Kanäle, Fenster oder optisch transparente Deckelschichten bereitgestellt werden. Die Lichtleitung durch eine mikrostrukturierte Deckelschicht oder eine Filmschicht zur Fluidsteuerung wird durch Neigung der Winkel der in der mikrostrukturierten Oberfläche bereitgestellten Kanäle verbessert.
Kurzbeschreibung der mehreren Ansichten der Zeichnungen
1a ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit V-förmigen Kanälen.
1b ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit trapezförmigen Kanälen mit einer flachen Basis.
1c ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit trapezförmigen Kanälen, in deren Basis mehrere V-förmige Unterkanäle gebildet sind.
1d ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit im Wesentlichen rechteckigen Kanälen mit V-förmigen Unterkanälen.
1e ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit V-förmigen Kanälen mit mehreren V-förmigen Unterkanälen.
1f ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit konkaven Kanälen mit V-förmigen Unterkanälen.
1g ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit konvexen Kanälen und mehreren konvexen Unterkanälen.
1h ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit trapezförmigen, steilwandigen Kanälen mit trapezförmigen Unterkanälen.
1i ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit Primärkanälen auf beiden Hauptflächen, wobei die Kanäle auf jeder Fläche seitlich gegeneinander versetzt sind.
1j ist eine Querschnittsansicht eines mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms mit Primärkanälen auf beiden Hauptflächen, wobei die Kanäle auf jeder Fläche direkt einander gegenüber ausgerichtet sind.
2a ist eine Schmalseitenansicht mehrerer gestapelter Schichten aus Fluidsteuerungsfilm, wobei jede Schicht die gleiche Anordnung von mikrostrukturierten Kanälen umfasst.
2b ist eine Schmalseitenansicht mehrerer gestapelter Schichten aus Fluidsteuerungsfilm, wobei jede Schicht verschiedene Anordnungen von mikrostrukturierten Kanälen umfasst.
2c ist eine Schmalseitenansicht mehrerer gestapelter Schichten aus Fluidsteuerungsfilm, wobei die Kanäle benachbarter Schichten gegeneinander versetzt sind.
2d ist eine Schmalseitenansicht mehrerer gestapelter Schichten aus Fluidsteuerungsfilm, wobei mikrostrukturierte Kanäle geschlossene Kapillaren zwischen den Schichten bilden und einige Schichten Primärkanäle auf beiden Hauptflächen aufweisen.
2e ist eine Perspektivansicht mehrerer gestapelter Schichten aus Fluidsteuerungsfilm, wobei ein optionaler, oberseitiger Abdeckfilm oder Deckel verwendet wird, um mindestens einen Abschnitt der Kanäle der obersten Schicht zu verschließen.
2f ist eine Schmalseitenansicht einer einzelnen Schicht aus Fluidsteuerungsfilm, die zu einer mehrschichtigen spiralförmigen Anordnung aufgerollt ist.
3a ist eine Seitenteilansicht eines Flüssigkeitströpfchens auf einer Oberfläche mit einem Berührungswinkel von weniger als 90 Grad.
3b ist eine Seitenteilansicht eines Flüssigkeitströpfchens auf einer Oberfläche mit einem Berührungswinkel von mehr als 90 Grad.
4 ist eine Draufsicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung mit mehreren offenen, parallelen, mikrostrukturierten Kanälen, der eine Aufnahmezone und eine Nachweiszone umfasst.
5 ist eine Teilquerschnittsansicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung mit mehreren mikrostrukturierten Kanälen, die mindestens teilweise durch eine Deckelschicht verschlossen sind.
6a ist eine Draufsicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung mit mehreren offenen, parallelen, mikrostrukturierten Kanälen, die sich am Ende der Aufnahmezone um 90 Grad krümmen.
6b ist eine Perspektivansicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung, der eine mikrostrukturierte Filmschicht zur Fluidsteuerung und eine Deckelschicht mit einer Öffnung an der Aufnahmezone umfasst.
6c ist eine Draufsicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung, der eine Aufnahmezone und eine Nachweiszone umfasst, die jeweils eine andere Anzahl von mikrostrukturierten Kanälen aufweisen als die andere.
7 ist eine Draufsicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung, der mehrere getrennte Ausnahmezonen und mehrere getrennte Nachweiszonen umfasst.
8 ist eine Teilquerschnittsansicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung, der eine Deckelschicht für einen mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilm umfasst.
9 ist eine Teilquerschnittsansicht eines Nachweisgegenstandes mit V-förmigen Kanälen, die senkrecht zur mikrostrukturierten Oberfläche orientiert sind.
10a ist eine Teilquerschnittsansicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung mit V-förmigen Kanälen, die in einem Winkel zur Senkrechten geneigt sind.
10b ist eine Teilquerschnittsansicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung mit V-förmigen Kanälen, die solcherart in einem Winkel geneigt sind, dass eine Seitenwand jedes Kanals parallel zur Senkrechten verläuft.
10c ist eine Teilquerschnittsansicht eines Nachweisgegenstandes, der konvex gekrümmte Kanäle umfasst.
11 ist eine Perspektivansicht eines Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung, der eine Filmschicht zur Fluidsteuerung, eine Deckelschicht und einen Griff umfasst.
12 ist eine Perspektivansicht eines weiteren Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung, der eine Filmschicht zur Fluidsteuerung und eine Deckelschicht umfasst.
13a ist eine Perspektivansicht eines weiteren Nachweisgegenstandes gemäß der vorliegenden Erfindung, der eine Filmschicht zur Fluidsteuerung mit einer mikrostrukturierten Fläche auf beiden Seiten des Films, zwei Deckelschichten und einen Griff umfasst.
13b ist eine Teilquerschnittsansicht des Nachweisgegenstandes der 13a.
14 ist ein Schaubild eines Fertigungsprozesses zur Herstellung von Nachweisgegenständen gemäß der vorliegenden Erfindung.
15 ist eine Teilquerschnittsansicht des Nachweisgegenstandes der 11, der einen physikalischen Träger wie etwa einen Faden umfasst, der sich in jedem Kanal befindet.
16 ist eine Perspektivansicht eines dreidimensionalen Nachweisgegenstandes, der Bindungszonen umfasst, die in jedem verschlossenen Kanal gebildet sind.
17a ist eine Teilquerschnittsansicht einer Filmschicht zur Fluidsteuerung mit mikrostrukturierten Flächen mit V-förmigen Kanälen auf beiden Seiten der Filmschicht, wobei die Kanäle auf jeder Seite in entgegengesetzte Richtungen geneigt sind.
17b ist eine Teilquerschnittsansicht einer Filmschicht zur Fluidsteuerung mit mikrostrukturierten Flächen mit V-förmigen Kanälen auf beiden Seiten der Filmschicht, wobei die Kanäle auf jeder Seite in die gleiche Richtung geneigt sind.
18a ist ein Diagramm des Neigungswinkels zu Prozent Leitungsleistung für einseitige Filmschichten zur Fluidsteuerung mit geneigten Kanälen.
18b ist ein Diagramm des Neigungswinkels zu Prozent Leitungsleistung für doppelseitige Filmschichten zur Fluidsteuerung mit geneigten Kanälen, die in entgegengesetzte Richtungen geneigt sind.
18c ist ein Diagramm des Neigungswinkels zu Prozent Leitungsleistung für doppelseitige Filmschichten zur Fluidsteuerung mit geneigten Kanälen, die in die gleiche Richtung geneigt sind.
Definitionen
Fluidsteuerungsfilm („FSF") bezeichnet einen Film, eine Bahn oder eine Schicht mit mindestens einer Hauptfläche, die eine mikroreplizierte Struktur umfasst, die in der Lage ist, ein Fluid zu bearbeiten, zu führen, zu enthalten, spontan aufzusaugen, zu transportieren oder zu steuern.
Fluidtransportfilm („FTF") bezeichnet einen Film, eine Bahn oder eine Schicht mit mindestens einer Hauptfläche, die eine mikroreplizierte Struktur umfasst, die in der Lage ist, ein Fluid spontan aufzusaugen oder zu transportieren.
„Mikroreplizierung" bedeutet die Herstellung einer mikrostrukturierten Fläche durch einen Prozess, bei dem die Merkmale der strukturierten Fläche während der Fertigung eine Genauigkeit des individuellen Merkmals beibehalten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In Bezug auf die beigefügten Figuren versteht es sich, dass in allen der mehreren Figuren gleichartige Komponenten mit gleichartigen Bezugszeichen versehen sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft Gegenstände, die eine Filmkomponente zur Fluidsteuerung umfassen. Zu Beginn dieses Abschnitts werden geeignete Fluidsteuerungsfilme allgemein beschrieben. Es folgen Beschreibungen beispielhafter Gegenstände der vorliegenden Erfindung, die diese Filme umfassen, zusammen mit spezifischen Anwendungen solcher Gegenstände.
Fluidsteuerungsfilme
Geeignete Fluidsteuerungsfilme zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind in den US-Seriennummern 08/905,481; 09/099,269; 09/099,555; 09/099,562; 09/099,565; 09/099,632; 09/100,163; 09/106,506 und 09/235,720 und in den US-Patentschriften 5,514,120 und 5,728,446 beschrieben. Bevorzugte erfindungsgemäße Fluidsteuerungsfilme haben die Form von Bahnen oder Filmen mit mikrostrukturierten Oberflächen, die mehrere offene Kanäle mit hohem Seitenverhältnis (d.h. Kanallänge dividiert durch den benetzten Kanalumfang) umfassen statt einer Fasermasse. Die Kanäle von Fluidsteuerungsfilmen, die in der Erfindung verwendbar sind, stellen bevorzugt mehr effektiven Flüssigkeitsfluss bereit, als er mit Geweben, Schaum oder Faserverbunden erreicht werden kann. Die Wände von Kanälen, die aus Fasern bestehen, weisen relativ zufällige Schwankungen und komplexe Oberflächen auf, die den Fluss von Flüssigkeit durch die Kanäle stören. Im Gegensatz dazu sind die Kanäle in der vorliegenden Erfindung präzise, mit hoher Wiedergabegenauigkeit, von einer vorgegebenen Struktur repliziert und bilden eine Reihe einzelner offener Kapillarkanäle, die sich entlang einer Hauptfläche erstrecken. Diese mikroreplizierten Kanäle, die in Bahnen, Filmen oder Röhren gebildet sind, sind bevorzugt entlang im Wesentlichen jeder Kanallänge und bevorzugter von Kanal zu Kanal einheitlich und regelmäßig.
Fluidsteuerungsfilme der vorliegenden Erfindung können aus einem beliebigen thermoplastischen Material hergestellt werden, das zum Gießen oder Prägen geeignet ist, einschließlich beispielsweise Polyolefinen, Polyestern, Polyamiden, Poly(vinylchlorid), Polyetherestern, Polyimiden, Polyesteramid, Polyacrylaten, Polyvinylacetat, hydrolisierten Derivaten von Polyvinylacetat usw. Polyolefine sind bevorzugt, insbesondere Polyethylen oder Polypropylen, Mischungen und/oder Copolymere davon und Copolymere von Propylen und/oder Ethylen mit geringfügigen Anteilen anderer Monomere wie etwa Vinylacetat oder Acrylaten wie etwa Methyl und Butylacrylat. Polyolefine sind wegen ihrer hervorragenden physikalischen Eigenschaften, der Einfachheit ihrer Verarbeitung und typisch geringeren Kosten als andere thermoplastische Materialien mit ähnlichen Eigenschaften bevorzugt. Polyolefine replizieren ohne Weiteres die Oberfläche einer Guss- oder Prägewalze. Sie sind strapazierfähig, langlebig und behalten ihre Form gut, womit die Handhabung solcher Filme nach dem Gieß- oder Prägevorgang einfach wird. Hydrophile Polyurethane sind ebenfalls wegen ihrer physikalischen Eigenschaften und inhärent hohen Oberflächenenergie bevorzugt. Alternativ können Fluidsteuerungsfilme aus Duroplasten (härtbaren Harzmaterialien) wie etwa Polyurethanen, Acrylaten, Epoxiden und Silikonen gegossen und durch Bestrahlung mit Wärme oder Elektronenstrahlen oder mit Feuchtigkeit gehärtet werden. Diese Materialien können verschiedene Zusatzstoffe enthalten, einschließlich Oberflächenenergiemodifikatoren (wie etwa Tenside und hydrophile Polymere), Weichmacher, Antioxidationsmittel, Pigmente, Trennmittel, Antistatikmittel und dergleichen. Geeignete Fluidsteuerungsfilme können auch unter Verwendung druckempfindlicher Klebematerialien hergestellt werden. In einigen Fällen können die Kanäle mit anorganischen Materialien (z.B. Glas, Keramik oder Metalle) gebildet werden. Bevorzugt behält der Fluidsteuerungsfilm bei Kontakt mit Flüssigkeiten im Wesentlichen seine Geometrie und Oberflächeneigenschaften bei. Der Fluidsteuerungsfilm kann auch derart behandelt sein, dass er biokompatibel wird. Beispielsweise kann eine Heparinbeschichtung aufgetragen sein.
Die Kanäle der Fluidsteuerungsfilme der vorliegenden Erfindung können jede beliebige Geometrie aufweisen, die den gewünschten Flüssigkeitstransport ermöglicht, und bevorzugt eine solche, die ohne Weiteres repliziert werden kann. In einigen Beispielen besitzt der Fluidsteuerungsfilm Primärkanäle nur auf einer Hauptfläche, wie in 1a–1d dargestellt. In anderen Beispielen weist jedoch der Fluidsteuerungsfilm Primärkanäle auf beiden Hauptflächen auf, wie in 1i und 1j dargestellt.
Wie in 1a dargestellt, weist eine Filmschicht zur Fluidsteuerung 112a eine erste Hauptfläche 113 und eine zweite Hauptfläche 115 auf, wobei die erste Hauptfläche 113 mehrere mikrostrukturierte Kanäle 116 aufweist. Die Kanäle 116 sind gemäß dem abgebildeten Beispiel mittels einer Reihe von V-förmigen Seitenwänden 117 und Spitzen 118 in der strukturierten Fläche 113 gebildet. In einigen Fällen können sich die Seitenwände 117 und Spitzen 118 vollständig ohne Änderung von einem Rand der Schicht 112a zum anderen erstrecken – obschon es in einigen Anwendungen gewünscht sein kann, nur entlang eines Abschnitts der strukturierten Fläche 113 die Seitenwände 117 zu kürzen und somit die Spitzen 118 zu verlängern. Das heißt, die Kanäle 116, die zwischen den Spitzen 118 definiert sind, können sich vollständig von einem Rand zu einem anderen Rand der Schicht 112a erstrecken, oder solche Kanäle 116 können lediglich so definiert sein, dass sie sich über einen Abschnitt der Schicht 112a erstrecken. Kanäle, die sich nur über einen Abschnitt erstrecken, können an einem Rand der Schicht 112a beginnen, oder sie können inmitten der strukturierten Fläche 113 der Schicht 112a beginnen und enden. Die Kanäle sind in einer vorgegebenen, bevorzugt geordneten Anordnung über eine durchgehende Fläche aus Polymermaterial definiert.
Die Schicht 112a kann mit den Kanälen 116 in einer offenen Konfigurierung verwendet werden, oder die Schicht 112a kann mit einer Deckelschicht (nicht dargestellt) benutzt werden, die entlang einer oder mehrerer der Spitzen 118 gesichert ist. Bei Verwendung mit einer Deckelschicht definiert die Schicht 112a einzelne Kanäle mit relativ isoliertem Flüssigkeitsfluss und- inhalt.
Wie in 1b dargestellt, ist ein weiteres Beispiel einer Filmschicht zur Fluidsteuerung 112b dargestellt, die die Kanäle 116' umfasst, welche ein breiteres flaches Tal zwischen etwas abgeflachten Spitzen 118' umfasst. In diesem Beispiel erstrecken sich zwischen den Kanalseitenwänden 131 Bodenflächen 130, wohingegen sich im Beispiel der 1a die Seitenwände 117 miteinander zu Linien 119 verbinden. Wie im Beispiel der 1a kann eine Deckelschicht (nicht dargestellt) entlang einer oder mehrerer Spitzen 118' gesichert sein, um getrennte Kanäle 116' zu bilden.
1c stellt ein weiteres Beispiel einer Filmschicht zur Fluidsteuerung 112c dar, die mit breiten Kanälen 132, die zwischen den Spitzen 118'' definiert sind, konfiguriert ist. Statt jedoch eine ebene Fläche zwischen den Kanalseitenwänden 117'' zu schaffen, befinden sich zwischen den Seitenwänden 117'' der Spitzen 118'' mehrere kleine Spitzen 133. Diese kleineren Spitzen 133 definieren somit Sekundärkanäle 134 dazwischen. Die Spitzen 133 können sich auf die gleiche Höhe erheben wie die Spitzen 118'' oder auch nicht und erzeugen wie dargestellt einen ersten breiten Kanal 132, der kleinere Kanäle 134 umfasst, die darin verteilt sind. Die Spitzen 118'' und 133 müssen nicht gleichmäßig in Bezug auf sich selbst und aufeinander verteilt sein.
1e–1j stellen verschiedene alternative Beispiele des Fluidsteuerungsfilms dar, der mit der vorliegenden Erfindung verwendbar ist. Obschon 1a–1j längliche, linear angeordnete Kanäle darstellen, können die Kanäle in anderen Konfigurierungen bereitgestellt sein. Beispielsweise können die Kanäle variierende Querschnittsbreiten entlang der Kanallänge aufweisen, d.h. die Kanäle können über die Länge des Kanals voneinander weg oder aufeinander zu verlaufen. Die Kanalseitenwände können auch in der Verlaufsrichtung des Kanals oder in Richtung der Kanalhöhe konturiert statt gerade sein. Allgemein kommt jede Kanalkonfigurierung in Betracht, die mindestens mehrere einzelne Kanalabschnitte bereitstellen kann, die sich von einem ersten Punkt zu einem zweiten Punkt in dem Fluidtransportgerät erstrecken. Falls gewünscht, können die Kanäle so konfiguriert sein, dass sie über ihre gesamte Länge getrennt bleiben.
Mit Bezug auf 1d umfasst ein bevorzugtes Beispiel einer Filmschicht zur Fluidsteuerung 112d eine Kanalgeometrie mit mehreren rechteckigen Primärkanälen 102, die zwischen ebenen Flächen 101 gebildet sind. Der Primärkanal 102 umfasst Sekundärkanäle 103, die aus mehreren Kerben 105 gebildet sind. Die Kerben 105 (oder Sekundärkanäle 103, wobei die Kanäle V-förmig sind und im Wesentlichen gerade Seitenwände haben) weisen einen eingeschlossenen Winkel, a, zwischen etwa 10° und etwa 120° auf, bevorzugt zwischen etwa 10° und etwa 100° und am bevorzugtesten zwischen etwa 20° und etwa 95° auf. Der von den Kerben eingeschlossene Winkel ist allgemein ein Sekantenwinkel von der Kerbe zu einem Punkt 2 bis 1000 Mikron von der Kerbe an den Seitenwänden, die die Kerbe bilden, bevorzugt ist der eingeschlossene Winkel der Sekantenwinkel an einem Punkt auf halber Höhe der Sekundärkanalseitenwände.
Der vom Primärkanal eingeschlossene Winkel ist nicht entscheidend, außer insofern, als er nicht so groß sein sollte, dass der Primärkanal bei der Kanalisierung von Flüssigkeit unwirksam wird. Allgemein beträgt die Maximalbreite des Primärkanals weniger als 3000 Mikron und bevorzugt weniger als 1500 Mikron. Der eingeschlossene Winkel eines V-förmigen Primärkanals beträgt allgemein etwa 10 Grad bis 120 Grad, bevorzugt 30 bis 90 Grad. Ist der eingeschlossene Winkel des Primärkanals zu klein, so hat der Primärkanal an seiner Basis möglicherweise keine ausreichende Breite, um eine adäquate Anzahl von Sekundärkanälen aufnehmen zu können. Allgemein wird es bevorzugt, dass der eingeschlossene Winkel des Primärkanals größer als der eingeschlossene Winkel der Sekundärkanäle ist, um zwei oder mehr Sekundärkanäle an der Basis des Primärkanals aufzunehmen. Allgemein weisen die Sekundärkanäle einen eingeschlossenen Winkel auf, der mindestens 20 Prozent kleiner ist als der eingeschlossene Winkel des Primärkanals (bei V-förmigen Primärkanälen).
Mit Bezug auf 1d und 1i ist die Tiefe, d, der Primärkanäle 102, 122, bei der es sich um die Höhe der Spitzen oder des oberen Endes über der niedrigsten Kanalkerbe handelt, bevorzugt im Wesentlichen einheitlich. Die Tiefe, d, beträgt geeignet etwa 5 bis etwa 3000 Mikron, typisch etwa 50 bis etwa 3000 Mikron, bevorzugt etwa 75 bis etwa 1500 Mikron und am bevorzugtesten etwa 100 bis etwa 1000 Mikron. Es versteht sich, dass in einigen Ausführungsformen Filme mit Kanälen 102, 122 verwendet werden können, die größere Tiefen, d, aufweisen als die angegebenen Bereiche. Sind die Kanäle 102, 122 übermäßig tief, so wird die Gesamtdicke des Fluidsteuerungsfilms unnötig hoch, und der Film kann tendenziell steifer sein als gewünscht.
1i und 1j stellen die Fluidsteuerungsfilme 112i und 112j mit Primärkanälen auf beiden Hauptflächen 120 und 121 dar. Wie in 1i dargestellt, können die Primärkanäle 122 von einer Fläche 120 zur anderen Fläche 121 seitlich versetzt sein oder können direkt einander gegenüber angeordnet sein, wie in 1j gezeigt. Ein Fluidsteuerungsfilm 112i mit versetzten Kanälen, wie in 1i dargestellt, stellt einen maximalen Umfang an Flächeninhalt zum Fluidtransport bereit, während gleichzeitig eine minimale Menge an Material verwendet wird. Außerdem kann ein Fluidsteuerungsfilm 112i mit versetzten Kanälen derart hergestellt sein, dass er sich aufgrund der reduzierten Dicke und Steifigkeit der Bahn weicher anfühlt als ein Fluidsteuerungsfilm 112j mit übereinstimmend ausgerichteten Kanälen wie in 1j dargestellt. Mit Bezug auf 1j können die Fluidsteuerungsfilme 112j ähnlich denen der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere Durchbrüche oder Öffnungen 124 darin aufweisen, die es ermöglichen, einen Anteil der Flüssigkeit, die die erste Hauptfläche 120 des Fluidsteuerungsfilms 112j berührt, zur zweiten Hauptfläche 121 des Films zu transportieren, um die Flüssigkeitssteuerung zu verbessern und die Vielseitigkeit des Flüssigkeitsflusses zu erhöhen. Die Öffnungen 124 müssen nicht mit einer Kerbe eines Kanals auf einer Linie liegen, sondern können angeordnet sein, wo immer es notwenig oder zweckmäßig ist. Außerdem können die Öffnungen 124 in der Breite von Öffnung zu Öffnung variieren und können in der Breite in Bezug auf die Kanäle variieren. Die Flächen des Fluidsteuerungsfilms innerhalb der Öffnungen 124 sind bevorzugt dafür ausgelegt, den Flüssigkeitsfluss durch die Öffnung 124 zu fördern.
Wie in 1d und 1i beispielhaft dargestellt, befinden sich in jedem Primärkanal 102, 122 mindestens zwei Sekundärkanäle 103, 123 und mindestens zwei Kerben 105, 125, die Kerbe 105, 125 oder die Kerben jedes Sekundärkanals 103, 123 sind durch eine Sekundärspitze 106, 126 voneinander getrennt. Allgemein weist jeder Sekundärkanal 103, 123 im Allgemeinen nur eine Kerbe 105, 125 auf, ein Sekundärkanal 103, 123 weist jedoch zwei Kerben 105, 125 auf, wenn der Sekundärkanal 103, 123 rechteckig ist. Die Sekundärspitze 106, 126 bei V-förmigen Sekundärkanälen 103, 123 ist allgemein durch einen eingeschlossenen Winkel Beta (β) gekennzeichnet, der allgemein gleich (a¹ + a²)/2 ist, wobei a¹ und a² für die eingeschlossenen Winkel der beiden benachbarten V-förmigen Sekundärkanäle 103, 123 stehen, unter der Annahme, dass die beiden Seitenwände, die jeden Sekundärkanal bilden, symmetrisch und nicht gekrümmt sind. Allgemein beträgt der Winkel β etwa 10° bis etwa 120°, bevorzugt etwa 10° bis etwa 90° und am bevorzugtesten etwa 20° bis etwa 60°. Die Sekundärspitze kann auch flach sein (in welchem Fall der eingeschlossene Winkel theoretisch 0° wäre) oder sogar gekrümmt, z.B. konvex oder konkav, ohne deutlichen Winkel oder eingeschlossenen Winkel. Bevorzugt sind mindestens drei Sekundärkanäle 103, 123 und/oder mindestens drei Kerben für jeden Primärkanal 102, 122 vorhanden, einschließlich etwaiger Kerben 108 oder 109, die zu den Kanalseiten wie in 1d dargestellt gehören.
Die Tiefe, d', eines der Sekundärkanäle 103, 123, bei der es sich um die Höhe des oberen Endes der Sekundärspitzen 106 über den Kerben 105, wie in 1d dargestellt, handelt, ist über die Länge der Fluidsteuerungsfilme einheitlich und beträgt typisch mindestens 5 Mikron. Die Tiefe, d', der Sekundärkanäle 103, 123 beträgt allgemein 0,5 bis 80 Prozent der Tiefe der Primärkanäle, bevorzugt 5 bis 50 Prozent. Der Abstand der Kerben 105, 125 auf jeder Seite einer Spitze 106, 126 ist ebenfalls bevorzugt über die Länge des Fluidsteuerungsfilms 1121, 112j einheitlich. Bevorzugt variiert die Tiefe und Breite des Primär- und/oder Sekundärkanals über eine gegebene Länge des Fluidsteuerungsfilms um weniger als 20 %, bevorzugt um weniger als 10 Prozent für jeden Kanal. Schwankungen der Tiefe und Form des Sekundärkanals über diesen Bereich hinaus haben eine beträchtliche negative Auswirkung auf die Geschwindigkeit und Gleichmäßigkeit des Flüssigkeitstransports entlang des Fluidsteuerungsfilms. Allgemein sind die Primär- und Sekundärkanäle durchgehend und störungsfrei.
Nunmehr mit Bezug auf 2a–2f kann die Fluidsteuerungsfilmkomponente ähnlich der der vorliegenden Erfindung auch mehrere Schichten mikroreplizierten Films oder Kanäle in unterschiedlichen Konfigurationen umfassen, insbesondere: einfache Stapel des Fluidsteuerungsfilms oder der Kanäle (siehe 2a–2c), laminierte Schichten des Fluidsteuerungsfilms oder der Kanäle, die geschlossene Kapillaren zwischen Schichten bilden (siehe 2d), sowie Stapel von Schichten mit Primärkanälen auf beiden Hauptflächen (siehe 2d). Die Kanäle, oder mindestens ein Abschnitt der Kanäle, eines unteren Films können durch die Unterseite eines oberen Films verschlossen sein. Beispielsweise kann, wie in 2b dargestellt, in einem Stapel 150 strukturierter Schichten 152, die Unterseite einer Filmschicht 154 die Kanäle 155 einer angrenzenden Filmschicht 156 verschließen. Falls gewünscht, kann ein optionaler oberer Abdeckfilm oder Deckel eingesetzt werden, um die Kanäle des obersten Films zu verschließen, wie in 2e dargestellt. Außerdem können eine oder mehrere der gestapelten Schichten, ob mit einer strukturierten Fläche oder zwei solchen Flächen, eine oder mehrere Öffnungen wie die in 1j dargestellten umfassen, die eine Fluidverbindung zwischen den Schichten des Stapels bereitstellen. Optional kann dann auf Wunsch ein gebildeter Stapel mikrostrukturierter Schichten aufgeschnitten werden, um dünne Anordnungen mit mehreren Kanälen zu bilden.
Wie in 2f dargestellt, kann alternativ der Fluidsteuerungsfilm ähnlich dem der vorliegenden Erfindung als eine einzelne Filmschicht gebildet sein, die rollenartig eingeschlagen ist, um die verschlossenen Kanäle in einer spiralförmigen Anordnung zu erzeugen. Falls gewünscht, kann ein mikroreplizierter Film, der vor dem Einschlagen auf einer Fläche offene Kanäle aufweist, mit einer doppelseitigen Klebeschicht beschichtet und dann aufgerollt werden. Die Klebeschicht leimt die benachbarten Schichten der Rolle aneinander und versiegelt somit die Kanäle. Optional kann dann der aufgerollte Fluidsteuerungsfilm in dünne Kanalscheiben geschnitten werden, die als Testmodule mit mehreren Feldern verwendet werden können.
Die Kanäle können einen eingeschlossenen Winkel von etwa 10 Grad bis etwa 120 Grad aufweisen. Bevorzugt sind die Kanäle etwa 5 bis etwa 3000 Mikron tief, wobei Maße zwischen etwa 50 und etwa 1000 Mikron am meisten bevorzugt sind.
Bestimmte Fluidsteuerungsfilme, die mit der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind in der Lage, spontan und gleichmäßig Flüssigkeiten (z.B. Wasser, Urin, Blut oder andere wässrige Lösungen) entlang der Achse der Filmkanäle zu transportieren. Diese Fähigkeit wird oft als Kapillarwirkung bezeichnet. Zwei allgemeine Faktoren, die die Fähigkeit von Fluidsteuerungsfilmen zum spontanen Transport von Flüssigkeiten beeinflussen, sind (i) die Struktur oder Topographie der Fläche (z.B. Kapillarität, Form der Kanäle) und (ii) die Beschaffenheit der Filmfläche (z.B. Oberflächenenergie). Um den gewünschten Umfang an Fähigkeit zum Flüssigkeitstransport zu erreichen, kann ein Konstrukteur die Struktur oder Topographie des Fluidsteuerungsfilms anpassen und/oder die Oberflächenenergie der Fläche des Fluidsteuerungsfilms anpassen.
Um Kapillarwirkung für einen Fluidsteuerungsfilm zu erzielen, muss die Fläche des Films in der Lage sein, von der zu transportierenden Flüssigkeit „benetzt" zu werden. Allgemein ist die Prädisposition einer festen Fläche zum Benetztwerden durch eine Flüssigkeit durch den Berührungswinkel gekennzeichnet, den die Flüssigkeit mit der festen Fläche bildet, nachdem sie auf eine horizontal angeordnete Fläche gegeben und ihr Zeit zum Stabilisieren gegeben wurde. Dieser Winkel wird manchmal als „statisch ausgeglichener Berührungswinkel" und im Vorliegenden mitunter nur als „Berührungswinkel" bezeichnet.
Nunmehr mit Bezug auf 3a und 3b ist der Berührungswinkel, θ, der Winkel zwischen einer Linientangente zur Oberfläche eines Tropfens einer Flüssigkeit auf einer Oberfläche an seinem Berührungspunkt mit der Oberfläche und der Ebene der Fläche. Ein Flüssigkeitstropfen, dessen Tangente senkrecht zur Ebene der Fläche stünde, hätte einen Berührungswinkel von 90°. Ist der Berührungswinkel größer als 90°, wie in 3b dargestellt, so wird die feste Fläche als nicht von der Flüssigkeit benetzt betrachtet und wird als inhärent „hydrophob" bezeichnet. Hydrophobe Filme umfassen Polyolefine wie etwa Polyethylen oder Polypropylen.
Beträgt der Berührungswinkel 90° oder weniger, wie in 3a dargestellt, wird die feste Fläche typisch als von der Flüssigkeit benetzt betrachtet. Flächen, auf denen Tropfen aus Wasser oder wässrigen Lösungen einen Berührungswinkel von weniger als 90° aufweisen, werden üblicherweise als „hydrophil" bezeichnet. Im Vorliegenden wird „hydrophil" nur als Bezeichnung für die Oberflächeneigenschaften eines Materials verwendet, d.h. dass es von wässrigen Lösungen benetzt wird, und drückt nicht aus, ob das Material wässrige Lösungen absorbiert oder nicht. Demzufolge kann ein Material als hydrophil bezeichnet werden, unabhängig davon, ob eine Bahn des Materials für wässrige Lösungen durchlässig oder undurchlässig ist. So können hydrophile Filme, die in den erfindungsgemäßen Fluidsteuerungsfilmen verwendet werden, aus Filmen gebildet sein, welche aus inhärent hydrophilen Harzmaterialien bestehen, wie beispielsweise Poly(vinylalkohol). Flüssigkeiten, die auf einer Fläche einen Berührungswinkel von fast Null ergeben, werden als die Fläche vollständig benetzend betrachtet.
Je nach der Beschaffenheit des mikroreplizierten Filmmaterials selbst und der Beschaffenheit der transportierten Flüssigkeit kann es erwünscht sein, die Fläche des Films anzupassen oder zu modifizieren, um ausreichende Kapillarkräfte des Films zu gewährleisten. Zum Beispiel kann die Struktur der Fläche des Fluidsteuerungsfilms so modifiziert werden, dass die Oberflächenenergie des Films beeinflusst wird. Die erfindungsgemäßen Fluidsteuerungsfilme können verschiedene Topographien aufweisen. Wie voranstehend beschrieben, bestehen bevorzugte Fluidsteuerungsfilme aus mehreren Kanälen mit V-förmigen oder rechteckigen Querschnitten und Kombinationen aus diesen, sowie aus Strukturen mit Sekundärkanälen, d.h. mit Kanälen in den Kanälen. Für offene Kanäle verhält sich die gewünschte Oberflächenenergie der mikrostrukturierten Fläche von Fluidsteuerungsfilmen mit V-Kanälen derart, dass: Theta = (90° – Alpha/2),wobei Theta (θ) für den Berührungswinkel der Flüssigkeit mit dem Film und Alpha (a) für den durchschnittlichen eingeschlossenen Winkel der sekundären V-Kanalkerben steht. (Siehe z.B. 1g.)
Es wurde beobachtet, dass Sekundärkanäle mit kleineren eingeschlossenen Winkelgrößen allgemein eine größere vertikale Kapillarwirkungsstrecke bereitstellen. Ist jedoch Alpha zu klein, so wird die Fließgeschwindigkeit deutlich geringer. Ist Alpha zu groß, so stellt der Sekundärkanal möglicherweise nicht die gewünschte Kapillarwirkung bereit. Mit kleiner werdendem Alpha muss, um einen ähnlichen Flüssigkeitstransport zu erzielen, der Berührungswinkel Theta der Flüssigkeit nicht so klein sein, wie der Berührungswinkel Theta bei Kanälen mit größeren Winkelgrößen sein muss. Daher kann durch Modifizieren der Geometrie der strukturierten Oberfläche des Fluidsteuerungsfilms die Oberflächenenergie und somit die Fähigkeit des Films zur Kapillarwirkung verändert werden, um die Fähigkeit des Films zum Flüssigkeitstransport zu verbessern.
Ein weiteres Beispiel für die Modifizierung der Oberfläche des Films, um ausreichende Kapillarkräfte des Films zu gewährleisten, ist das Modifizieren der Fläche um zu gewährleisten, dass sie ausreichend hydrophil ist. Biologische Proben, die mit den Fluidsteuerungsfilmen der vorliegenden Erfindung in Berührung kommen, sind wässrig. Daher müssen solche Filme, wenn sie als erfindungsgemäße Fluidsteuerungsfilme verwendet werden, im Allgemeinen modifiziert werden, z.B. durch Oberflächenbehandlung, Aufbringen von Oberflächenbeschichtungen oder -mittel oder den Einschluss ausgewählter Mittel derart, dass die Fläche hydrophil wird und einen Berührungswinkel von 90° oder weniger aufweist, womit die Benetzungs- und Flüssigkeitstransporteigenschaften des Fluidsteuerungsfilm verbessert werden. Verfahren, um die Fläche hydrophil zu machen, umfassen: (i) den Einschluss eines Tensids; (ii) den Einschluss oder die Oberflächenbeschichtung mit einem hydrophilen Polymer, (iii) die Behandlung mit einem hydrophilen Silan und (iv) die Behandlung mit einer anorganischen Dünnschichtbeschichtung wie etwa SiO₂, die bei Kontakt mit Feuchtigkeit hydrophil wird. Es kommen auch andere Verfahren in Betracht.
Es kann jedes bekannte geeignete Verfahren verwendet werden, um eine hydrophile Oberfläche auf Fluidsteuerungsfilmen zu erreichen, die mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es können Oberflächenbehandlungen angewendet werden wie etwa das lokale Aufbringen eines Tensids, Plasmabehandlung, Vakuumbedampfen, Polymerisation hydrophiler Monomere, Aufpfropfen hydrophiler Moietäten auf die Filmoberfläche, Korona- oder Flammenbehandlung usw. Ein beispielhaftes Verfahren zur Oberflächenmodifizierung der Filme der vorliegenden Erfindung ist das lokale Aufbringen einer einprozentigen wässrigen Lösung eines Materials, das 90 Gewichtsprozent oder mehr an:
enthält, wobei n = 8 (97 Prozent), n = 7 (3 Prozent) ist, und 10 Gewichtsprozent oder weniger an:
enthält, wobei n = 8 (97 Prozent), n = 7 (3 Prozent) ist. Die Herstellung solcher Mittel ist in der US-Patentschrift 2,915,554 (Ahlbrecht u.a.) offenbart.
Alternativ kann ein Tensid oder ein anderes geeignetes Mittel als interner Zusatzstoff zum Zeitpunkt der Filmextrusion mit dem Harz gemischt werden. Es wird typisch bevorzugt, ein Tensid in die Zusammensetzung zu geben, aus der der Fluidsteuerungsfilm besteht, statt sich auf das lokale Auftragen einer Tensidbeschichtung zu verlassen, da lokal aufgetragene Beschichtungen dazu neigen, die Kerben der Kanäle zu füllen, d.h. abzustumpfen, und damit den gewünschten Flüssigkeitsfluss zu stören, auf den sich die Erfindung richtet. Ein illustrierendes Beispiel eines Tensids, das in Polyethylen-Fluidsteuerungsfilme einbezogen werden kann, ist TRITON^TM X-100, ein nicht-ionisches Octylphenoxypolyethoxyethanol-Tensid, das z.B. zu etwa 0,1 und 0,5 Gewichtsprozent verwendet wird.
Bevorzugte Beispiele der vorliegenden Erfindung behalten die gewünschten Flüssigkeitstransporteigenschaften während der gesamten Lebensdauer des Produkts bei, in das der Fluidsteuerungsfilm eingebracht wird. Um zu gewährleisten, dass das Tensid über die gesamte Lebensdauer des Fluidsteuerungsfilms verfügbar ist, steht das Tensid bevorzugt während der gesamten Lebensdauer des Gegenstandes in ausreichender Menge in dem Gegenstand zur Verfügung oder ist auf der Oberfläche des Fluidsteuerungsfilms unbeweglich gemacht. Zum Beispiel kann ein Tensid mit Hydroxyl-Funktion an einem Fluidsteuerungsfilm immobilisiert werden, indem das Tensid mit einer Di- oder Trialkoxysilan-funktionalen Gruppe funktionalisiert wird. Das Tensid kann dann auf die Fläche des Fluidsteuerungsfilms aufgetragen werden oder der Gegenstand kann damit imprägniert und anschließend Feuchtigkeit ausgesetzt werden. Die Feuchtigkeit würde zur Hydrolyse und der anschließenden Kondensation zu einem Polysiloxan führen. Hydroxy-funktionale Tenside (insbesondere 1,2-Diol-Tenside) können auch durch die Verbindung mit Borat-Ionen immobilisiert werden. Geeignete Tenside umfassen anionische, kationische und nicht-ionische Tenside; nicht-ionische Tenside können jedoch wegen ihres relativ geringen Störpotenzials bevorzugt sein. Polyethoxylierte und Polyglucosid-Tenside sind insbesondere bevorzugt, einschließlich polyethoxyliertem Alkyl-, Aralkyl- und Alkenylalkoholen, Ethylenoxid- und Propylenoxid-Copolymeren wie etwa „Pluronic" und Tetronic", Alkylpolyglucosiden, Polyglycerylestern und dergleichen. Andere geeignete Tenside sind in der Seriennr. 08/576,255 offenbart. Alternativ kann dem Gegenstand ein hydrophiles Monomer zugesetzt und in situ zu einem sich durchdringenden Polymernetz polymerisiert werden. Zum Beispiel können ein hydrophiles Acrylat und ein Initiator zugesetzt und durch Wärme oder aktinische Strahlung polymerisiert werden.
Geeignete hydrophile Polymere umfassen: Homo- und Copolymere von Ethylenoxid; hydrophile Polymere, die Vinyl-ungesättigte Monomere wie etwa Vinylpyrrolidon, Karbonsäure, Sulfonsäure oder Phosphonsäure-funktionale Acrylate wie etwa Acrylsäure, Hydroxy-funktionale Acrylate wie etwa Hydroxyethylacrylat, Vinylacetat und seine hydrolisierten Derivate (z.B. Polyvinylalkohol), Acrylamide, polyethoxylierte Acrylate und dergleichen umfassen; hydrophile modifizierte Zellulosen sowie Polysaccharide wie etwa Stärke und modifizierte Stärken, Dextran und dergleichen.
Wie oben erläutert, kann ein hydrophiles Silan oder eine Mischung hydrophiler Silane auf die Fläche des Fluidsteuerungsfilms aufgetragen werden, oder der Gegenstand kann damit imprägniert werden, um die Eigenschaften des Fluidsteuerungsfilms oder Gegenstandes anzupassen. Geeignete Silane umfassen die anionischen Silane, die in US 5,585,186 offenbart sind, sowie nicht-ionische oder kationische hydrophile Silane. Kationische Silane können in bestimmten Fällen bevorzugt sein und haben den Vorteil, dass für bestimmte dieser Silane antimikrobielle Eigenschaften angenommen werden.
Wie ebenfalls vorangehend beschrieben, können anorganische Dünnschichtbeschichtungen wie etwa SiO₂ selektiv auf Abschnitten des Fluidsteuerungsfilms abgeschieden werden, oder der Gegenstand, z.B. die Innenfläche von Mikrokanälen, kann damit imprägniert werden. Die Abscheidung kann entweder prozessintern während der Fertigung des Fluidsteuerungsfilms erfolgen oder in einem nachträglichen Vorgang. Beispiele geeigneter Abscheidungstechniken umfassen Vakuumzerstäubung, Elektronenstrahlbedampfung, Abscheidung aus der Lösung und Gasphasenabscheidung. Die SiO₂-Beschichtung des Fluidsteuerungsfilms kann den zusätzlichen Nutzen bringen, einen transparenteren Film zu erzeugen als jede andere Art von Beschichtung oder Zusatzstoff. Außerdem neigt eine SiO₂-Beschichtung nicht wie andere Beschichtungen oder Zusatzstoffe dazu, sich mit der Zeit abzuwaschen.
Die anorganischen Beschichtungen können verschiedene Funktionen ausführen. Zum Beispiel können die Beschichtungen verwendet werden, um die Hydrophilie des Fluidsteuerungsfilms zu erhöhen oder Hochtemperatureigenschaften zu verbessern. Das Aufbringen bestimmter Beschichtungen kann beispielsweise das Aufsaugen eines Leimungsgels, Filtrierungsgels oder Testreagensgels in die Mikrokanäle erleichtern. Leitfähige Beschichtungen können verwendet werden, um Elektroden oder Membranen für piezoelektrisches oder peristaltisches Pumpen zu bilden. Beschichtungen können auch als Sperrschichten zum Verhindern der Ausgasung verwendet werden.
Es kann ein Gegenstand wie etwa eine Kapillare aus einem Fluidsteuerungsfilm gebildet werden, die die Fähigkeit zum spontanen Fluidtransport wie oben beschrieben besitzt, und sie kann entweder mit offenen oder geschlossenen Kanälen konfiguriert sein. Damit eine Kapillare mit geschlossenen Kanälen, die aus einem Fluidsteuerungsfilm besteht, funktioniert, ist die Kapillare bevorzugt ausreichend hydrophil, um es dem gewünschten Fluid zu ermöglichen, die Fläche des Fluidsteuerungsfilms zu benetzen. Damit eine Kapillare mit offenen Kanälen funktioniert, muss das Fluid nicht nur die Fläche des Fluidsteuerungsfilms benetzen, sondern die Oberflächenenergie des Films muss auch eine geeignete Höhe derart haben, dass der Berührungswinkel Theta zwischen dem Fluid und der Oberfläche gleich oder kleiner als 90 Grad minus der Hälfte es Kerbenwinkels Alpha ist, wie oben erläutert.
Nachweisgegenstände
Nunmehr mit Bezug auf 4 ist ein miniaturisierter Nachweisgegenstand, der vorliegend als Nachweisgegenstand 200 bezeichnet wird, aus mindestens einer Schicht 202 eines Fluidsteuerungsfilms wie oben beschrieben gebildet, der mehrere koextensive Kanäle 204 umfasst, die sich bevorzugt ununterbrochen über die Länge des Gegenstandes erstrecken. In der vorliegenden Verwendung beschreibt der Begriff „koextensiv" einen durchgehenden Fließweg durch einen Kanal. Über die Länge der Kanäle 204 umfasst der Nachweisgegenstand 200 eine Aufnahmezone 210 und eine Nachweiszone 220. Die Kanäle 204 stellen ein Mittel bereit, um eine flüssige Probe durch spontanen und gleichmäßigen Flüssigkeitstransport oder Kapillarwirkung in die Aufnahmezone 210, zwischen der Aufnahmezone 210 und der Nachweiszone 220 und in die Nachweiszone 220 über die gesamte Länge der Kanäle 204 zu saugen oder zu transportieren. Obschon sie als einzelne und nicht überlappende Bereiche des Gegenstandes 200 dargestellt sind, versteht es sich, dass sich die Aufnahmezone 210 und die Nachweiszone 220, falls gewünscht, teilweise oder vollständig überlagern.
Der Nachweisgegenstand 200 ist dafür ausgelegt, an einer Aufnahmezone 210 eine Fluidprobe aufzunehmen, die dann in einer bestimmten Weise so getestet werden kann, dass eine nachweisbare Eigenschaft an der Nachweiszone 220 hervorgerufen wird. Die zu testende Fluidprobe kann von einer Quelle gewonnen werden wie insbesondere aus einem physiologischen Fluid einschließlich Blut, Serum, Plasma, Speichel, Augenflüssigkeit, Liquor, Eiter, Schweiß, Abscheidungen, Urin, Milch oder dergleichen, oder von einer Quelle wie etwa einer Lebensmittel- oder Getränkeprobe, einem Sterilisationstestreagens oder einer Probe der biologischen Forschung. Die Probe kann einer Vorbehandlung unterzogen werden wie etwa insbesondere Auszug, Zusatz, Auftrennung, Verdünnung, Konzentrierung, Filtrierung, Destillierung, Dialyse oder dergleichen. Neben physiologischen Fluiden können auch andere flüssige Testproben eingesetzt werden, und die interessierenden Komponenten können entweder Flüssigkeiten oder Feststoffe sein, wobei die Feststoffe in einem flüssigen Medium gelöst oder suspendiert sind. Diese anderen Proben können sich auf solche Fachgebiete beziehen wie Sterilisierungsüberwachung, Lebensmittel-Mikrobiologie, Wassertestverfahren und Drogentestverfahren. Nachweisgegenstände der vorliegenden Erfindung sind allgemein für den Nachweis biologischer Materialien verwendbar, die in der biomedizinischen F&E, bei der Entdeckung pharmazeutischer Wirkstoffe, in der medizinischen Diagnostik, der Lebensmittel- und Landwirtschaftsmikrobiologie, der militärischen und forensischen Analyse verwendet werden.
Wie oben beschrieben, kann die Fluidsteuerungsschicht wie etwa die Schicht 200 als integraler Bestandteil des Gegenstandes 200 gebildet sein. Alternativ kann die Filmstruktur zur Fluidsteuerung (z.B. ihre mikroreplizierte Struktur von Kanälen 204) als eine abnehmbare Komponente in den Nachweisgegenstand 200 integriert sein, wobei der Gegenstand ferner eine Trägerkomponente umfasst, die an einer Abdeckschicht befestigt sein kann oder nicht, was einen Austausch der Fluidsteuerungsschicht ermöglicht. Optional kann die Filmschicht zur Fluidsteuerung 202 entfernbar in einen Nachweisgegenstand wie die nachfolgend beschriebenen zum Nachweis einer Eigenschaft in der Fluidprobe an der Nachweiszone integriert sein und kann für jeden nachfolgenden Test ausgewechselt und ersetzt werden. Es versteht sich, dass die mikroreplizierte Struktur oder Schicht prozessextern von dem Nachweisgegenstand 200 oder zusammen mit einem Umformungsvorgang für den Nachweisgegenstand 200 hergestellt werden.
Der Nachweisgegenstand 200 kann mit offenen Kanälen 204 gebildet sein. Optional, wie in 5 dargestellt, kann ein Nachweisgegenstand 230 mit geschlossenen Kanälen 232 gebildet werden, wobei eine Abdeck- oder Deckelschicht 235 auf einem oder allen Kanälen 232 und/oder auf der gesamten Länge der Kanäle 232 oder nur auf einem Abschnitt der Länge der Kanäle 232 angeordnet und möglicherweise versiegelt ist. Geeignete Deckelschichten sind ausführlicher im Nachfolgenden beschrieben.
Die Aufnahmezone 210 dient als Schnittstelle zwischen der flüssigen Probe und dem Nachweisgegenstand 200. Die Aufnahmezone 210 stellt bevorzugt eine ausreichende Aufnahmefläche bereit, um das gewünschte Volumen der Probe in die Mikrostruktur des Gegenstandes 200 einzuführen. Zu diesem Zweck umfasst die Aufnahmezone 210 bevorzugt zwei oder mehr Kanäle 204, die in der Lage sind, eine Fluidprobe wie oben beschrieben durch spontanen Flüssigkeitstransport in den Gegenstand 200 zu saugen. Daher müssen die Kanäle 204 angemessen hydrophil sein, derart, dass sie in der Lage sind, von der zu testenden Flüssigkeitsprobe benetzt zu werden. Sind die Kanäle 204 offen, müssen die Kanäle 204 zusätzlich mit einem angemessenen Obrflächenenergieniveau versehen sein, um eine Kapillarwirkung zu erzielen und die Probe in die Kanäle 204 wie oben erläutert einzuführen. Auch wird bei der Verwendung mehrerer Kanäle 204 die Fluidbewegung sichergestellt für den Fall, dass ein einzelner Kanal blockiert wird oder kein Fluid in die Nachweiszone 220 saugt. Obschon die Aufnahmezonen der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, eine Fluidprobe ohne Hilfe in den Nachweisgegenstand zu saugen, versteht es sich, dass, falls gewünscht, zusätzlich andere Fluidtransportverfahren bereitgestellt sein können wie etwa Druckunterschiede, Elektrophorese oder Pumpen.
Ein Beispiel einer Aufnahmezone 210 ist in 4 dargestellt. In diesem Beispiel sind die Kanäle 204 an einer Seite 201 des Gegenstandes 200 solcherart offen, dass die Kanäle 204 in Fluidberührung mit der flüssigen Probe gebracht werden können, was durch die Kapillarwirkung des Gegenstandes 200 zum Transport der Probe in die Kanäle 204 führt. Nunmehr mit Bezug auf 6a ist ein weiteres Beispiel eines Nachweisgegenstandes 270 dargestellt, der aus einer Filmschicht zur Fluidsteuerung 273 mit mehreren mikrostrukturierten Kanälen 272 gebildet ist. Die Kanäle 272 umfassen an einer Seite 271 des Gegenstandes 270 eine Biegung derart, dass sich die Richtung der Kanäle 272 um 90 Grad ändert. Infolgedessen umfasst eine Aufnahmezone 275 mehrere Kanalöffnungen, die sich an der Längsseite des Gegenstandes 270 statt über die Breite wie bei Gegenstand 200 öffnen. An der entgegengesetzten Seite des Gegenstandes 270 ist eine Nachweiszone 276 bereitgestellt. In ähnlicher Weise können die Kanäle eines Nachweisgegenstandes in jede beliebige Richtung gerichtet und/oder neu gerichtet sein, wie es zur Erfüllung der Anforderungen an den Gegenstand notwendig ist.
Nunmehr mit Bezug auf 6b ist noch ein weiteres Beispiel für einen Nachweisgegenstand 280 dargestellt, der aus einer Filmschicht zur Fluidsteuerung 281 mit mehreren mikrostrukturierten Kanälen 282 gebildet ist. Es ist auch eine Deckelschicht 283 bereitgestellt, die die Kanäle 282 bedeckt. In dieser Ausführungsform sind die Kanäle 282 an den Enden nicht offen, weder über die Breite noch an der Längsseite, sondern liegen stattdessen an der oberen Fläche 284 durch eine Öffnung 285, die in der Deckelschicht 283 gebildet ist, frei, die wiederum eine Aufnahmezone 286 bildet. Die Fluidprobe kann an der Öffnung 285 eingeführt werden und in die mehreren Kanäle 282 aufgesaugt werden und somit durch den Gegenstand 280 in die Nachweiszone 287 fließen, die ebenfalls an der entgegengesetzten Seite des Gegenstandes 280 bereitgestellt ist.
Wie in 6c dargestellt, können sich die Kanäle 242 in einer Aufnahmezone 241 in der Anzahl von den Kanälen 244 in einer Nachweiszone 243 eines bestimmten Nachweisgegenstandes 240 unterscheiden. Obschon er mit weniger Kanälen 242 in der Aufnahmezone 241 als Kanälen 244 in der Nachweiszone 243 dargestellt ist, kann der Gegenstand 240 derart konfiguriert sein, dass das Gegenteil zutrifft – mehr Aufnahmekanäle 242 als Nachweiskanäle 244. In jedem dieser Fälle jedoch bleibt der Fluss der Probenflüssigkeit von der Aufnahmezone 241 zur Nachweiszone 243 kontinuierlich und ununterbrochen.
Mit repräsentativem Bezug auf 4 können die Kanäle 204 in der Aufnahmezone 210 koextensiv benachbart sein. Wie jedoch in 7 dargestellt, können die Kanäle 252 des Nachweisgegenstandes 250, falls gewünscht, in zwei oder mehr einzelne Aufnahmezonen mit mehreren Kanälen wie etwa 253, 254, 255 unterteilt sein, um mehr als eine flüssige Probe in den Nachweisgegenstand 250 einzuführen. Wegen der extrem dünnen Beschaffenheit der Filmschichten zur Fluidsteuerung, die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt sind, kann die Aufnahmezone eines Nachweisgegenstandes, falls gewünscht, je nach dem Bedarf des Benutzers zum Zeitpunkt eines Tests möglicherweise in zwei oder mehr getrennte Aufnahmezonen unterteilt werden. Optional können Perforierungen oder andere Hilfen zur Kanalaufteilung bereitgestellt sein, um die Auftrennung in mehrere Aufnahmezonen zu erleichtern, falls und wann immer erforderlich. Die getrennten Aufnahmezonen 253, 254, 255 können über den gesamten Nachweisgegenstand 250 getrennt bleiben und somit in getrennte und ihnen zugeordnete Nachweiszonen (nicht spezifisch dargestellt) fließen. Alternativ können die getrennten Aufnahmezonen 253, 254, 255 aufeinander zu verlaufen, um den Fluss in eine gemeinsame Nachweiszone (nicht dargestellt) zu ermöglichen, oder sie können aufeinander zu verlaufen und sich dann wieder in verschiedene Nachweiszonen 256, 257 aufteilen (wie nachfolgend ausführlicher beschrieben).
Die Kanäle 204 sind von der Aufnahmezone 210 bis zur Nachweiszone 220 durchgehend und stellen somit die Kontinuierlichkeit des Probenflusses durch den Nachweisgegenstand 200 bereit. Obschon in der beispielhaften Ausführungsform mit parallelen Kanälen dargestellt, versteht es sich, dass Nachweisgegenstände auch andere Anordnungen umfassen können, insbesondere aufeinander zu verlaufende, auseinander verlaufende und/oder sich kreuzende Kanäle, solange ein ununterbrochener Fluidfluss zwischen der Aufnahmezone und der Nachweiszone beibehalten wird. In bevorzugten Beispielen ist der Probenfluss in den Kanälen 204 auch getrennt, indem die flüssige Probe in jeden einzelnen Kanal eintritt und die Probe innerhalb eines spezifischen Kanal von der Aufnahmezone 210 bis zur Nachweiszone 220 in diesem Kanal verbleibt. Das heißt, ein Transport der Probe über die Kanäle hinweg tritt im Allgemeinen nicht auf. Eine Deckelschicht wie etwa die Deckelschicht 235, die an der Filmsteuerungsschicht 202 befestigt ist, kann die Trennung der Kanäle 204 erleichtern, indem sie jeden Kanal einschließt und jeden Kanal gegen angrenzende Kanäle 204 versiegelt. Offene Kanäle 204 bleiben jedoch wegen der Oberflächenspannung der Flüssigkeit in den Kanälen 204 im Wesentlichen ebenfalls getrennt. Außerdem können für Nachweisgegenstände aus mehreren Schichten wie jene, die in 2a–2f dargestellt und nachfolgend ausführlicher beschrieben werden, oder für Schichten mit mehreren mikrostrukturierten Flächen wie jene, die in 1i–1j dargestellt sind, Öffnungen bereitgestellt sein, die eine Fluidverbindung zwischen den Schichten oder zwischen den Flächen einer Schicht ermöglichen.
Die Fähigkeit der Nachweisgegenstände der vorliegenden Erfindung zu kontinuierlichem Fluss unterscheidet sich von anderen traditionelleren Nachweisgegenständen, die einen Einlass umfassen, in den eine flüssige Probe eingeführt oder vorgelegt wird und von dem aus die Probe in andere Bereiche des Gegenstandes fließt. In diesen traditionelleren Gegenständen werden Probenhandhabungs- und -eingabemechanismen wie etwa Kanülen verwendet, um Flüssigkeit in den Gegenstand durch den Einlass einzuführen, bei dem es sich oft um eine Öffnung handelt, die sich in einen Hohlraum oder einen Behältnisbereich öffnet, von dem aus die flüssige Probe in den übrigen Gegenstand fließt. Alternativ kann ein Probenhandhabungs- und -eingabemechanismus eine Probe direkt in einzelne Kanäle eingeben oder liefern. In der vorliegenden Erfindung jedoch ist kein solcher Probenhandhabungs- und -eingabemechanismus erforderlich, es ist lediglich Fluidberührung zwischen der Aufnahmezone 210 und einer flüssigen Probe notwendig. Die vorliegende Erfindung vereinfacht somit den Nachweisprozess und verringert Arbeitsaufwand, Zeit-, Materialbedarf und somit Kosten.
In einigen Beispielen grenzt die Nachweiszone 220 unmittelbar an die Aufnahmezone 210 an, oder es kann eine Überlappung der Nachweiszone 220 und der Aufnahmezone 210 geben. In anderen Ausführungsformen kann die Trennung der Aufnahme- und der Nachweiszone 210, 220 erwünscht sein, so dass eine Übergangs- oder Zwischenzone 215 von Kanälen 204 bereitgestellt ist. Die Zwischenzone 215 kann zu funktionalen Zwecken wie etwa einer Zeitverzögerung geschaffen sein, wobei eine nachzuweisende Probenanalyse eine Zeitdauer erfordert, während der eine Reaktion oder ein anderer Prozess stattfindet, und das Fließen entlang einer zusätzlichen Kanallänge stellt die gewünschte Zeitverzögerung vor dem Erreichen der Nachweiszone 220 bereit. Außerdem kann die Zwischenzone 215 einen Bereich zur Probenaufbereitung vor dem Nachweis bereitstellen, einschließlich der Einführung erforderlicher Verbindungen in die Probe, des Kontaktes der Probe mit einer oder mehreren Zusammensetzungen zur Filterung oder zu anderen Zwecken und/oder einschließlich des Probenflusses um oder durch eine Struktur, die zwecks Erzeugung einer Turbulenz oder anderer Probenvermischung in dem Kanal angeordnet ist. Optional kann auch oder stattdessen ein Abschnitt der Nachweiszone 220 zur Aufbereitung der Probe vor dem Nachweis verwendet werden. Alternativ kann die Zwischenzone 215 zu strukturellen Zwecken bereitgestellt sein, wie etwa zur Verstärkung des Gegenstandes 200, zur Vergrößerung des Gegenstandes 200 zwecks einfacherer Handhabung oder aus anderen angemessenen Gründen. Es versteht sich jedoch, dass die Zwischenzone 215, falls vorhanden, sowohl funktionalen als auch strukturellen Zwecken dienen kann.
Wieder mit Bezug auf 4 umfasst die Nachweiszone 220 bevorzugt einen oder mehrere der Kanäle 204, die einen kontinuierlichen und ununterbrochenen Fluidfluss für die flüssige Probe bereitstellen, die an der Aufnahmezone 210 in den Nachweisgegenstand 200 aufgenommen wurde. In ähnlicher Weise wie die mehreren Aufnahmezonen 253, 254, 255, die oben beschrieben und in 7 dargestellt sind, kann der Nachweisgegenstand 250 auch mehrere Nachweiszonen wie 256 und 257 umfassen, die es ermöglichen, eine oder mehrere Testproben separat zu analysieren und nachzuweisen. Optional kann der Nachweisgegenstand 250 mehrere Nachweiszonen 256, 257 und nur eine einzige Aufnahmezone (ähnlich der in 4 dargestellten Zone 210) umfassen. Es ist auch möglich, dass eine einzige Nachweiszone von einem Benutzer, falls gewünscht, zum Zeitpunkt des Tests aufgeteilt wird, um mehrere Nachweiszonen bereitzustellen.
Die Nachweiszone 220 sorgt für den Nachweis einer Eigenschaft der Fluidprobe innerhalb der Nachweiszone 220, insbesondere eines Ergebnisses eines Ereignisses wie etwa einer chemischen oder biologischen Reaktion oder einer Bedingung wie etwa Temperatur, pH-Wert oder elektrische Leitfähigkeit, in einem oder mehreren der Kanäle 204. Die Nachweiszone 220 umfasst mindestens ein Nachweiselement (nicht dargestellt), bei dem es sich um eine beliebige stoffliche Zusammensetzung oder ein beliebiges Strukturelement handelt, die/das den Nachweis der Eigenschaften erleichtert. Erleichterung des Nachweises soll jegliche Beteiligung am Nachweisprozess und/oder jegliche Modifizierung der Fluidprobe zum Zweck der Ermöglichung des Nachweises umfassen. Das Nachweiselement kann insbesondere Hardware-Geräte wie etwa ein mikrooptisches, mikroelektronisches oder mikromechanisches Gerät, Testreagenzien und/oder Probenreinigungsmaterialien umfassen. Das Nachweiselement ist bevorzugt in Fluidberührung mit der flüssigen Probe angeordnet, die in einer Weise, die der Art des bereitgestellten Nachweiselements entspricht, zur Nachweiszone 220 transportiert wird, etwa in den Kanälen 204. Das Nachweiselement kann jedoch stattdessen angrenzend an die Kanäle 204, etwa in der in 5 dargestellten Deckelschicht 235 oder an einem anderen geeigneten Ort, angeordnet sein, entweder im Fluidkontakt oder nicht im Fluidkontakt mit der Fluidprobe. Optional können eines oder mehrere Nachweiselemente in den Kanälen 204 angeordnet sein, wobei sich eines oder mehrere Nachweiselemente in der Deckelschicht 235 oder an einem anderen Ort nach Wahl befindet. Alternativ können eines oder mehrere Nachweiselemente in den Kanälen 204 und/oder in der Deckelschicht 235 angeordnet sein, wobei eines oder mehrere Nachweiselemente extern zum Nachweisgegenstand 200 angeordnet sind. Zusätzliche Nachweiselemente können auch, falls gewünscht, in den Kanälen 204 außerhalb der Nachweiszone angeordnet sein, um die Probenaufbereitung für den Nachweis zu unterstützen, wie beispielsweise ein Probenreinigungsmaterial, das vor der Nachweiszone 220 bereitgestellt ist und ein Testreagens enthält.
Es kann ein einzelnes Nachweiselement verwendet werden, um den Nachweis von Eigenschaften aus der Fluidprobe in einem oder mehreren Kanälen 204 zu erleichtern. Alternativ können mehrere Elemente verwendet werden, um den Nachweis von Eigenschaften aus der Fluidprobe in einem oder mehreren Kanälen 204 zu erleichtern. Die mehreren Nachweiselemente können alle von der gleichen Art sein, oder sie können unterschiedlicher Art sein, die in der Lage sind, den Nachweis verschiedener Eigenschaften aus der/den bereitgestellten flüssigen Probe(n) zu erleichtern. In einer Ausführungsform kann in jedem einzelnen Kanal 204 innerhalb der Nachweiszone 220 des Nachweisgegenstandes 200 ein anderes Nachweiselement bereitgestellt sein und den Nachweis verschiedener Eigenschaften in jedem Kanal 204 erleichtern. Alternativ kann dieselbe Art von Nachweiselement, jedoch in verschiedenen Konzentrationen oder Mengen, in jedem einzelnen Kanal 204 bereitgestellt sein und den Nachweis unterschiedlicher Grade von Eigenschaften in jedem Kanal 204 erleichtern. Solche unterschiedlichen Nachweiselemente können innerhalb der Nachweiszone 220 von Kanal zu Kanal versetzt sein, um die Einfachheit des Nachweises in benachbarten Kanälen 204 zu erhöhen. In Ausführungsformen mit mehreren Nachweiselementen wie etwa 256 und 257 in 7 können eines oder mehrere Nachweiselemente in jeder Zone 256, 257 bereitgestellt sein, die den Nachweis derselben oder unterschiedlicher Eigenschaften oder verschiedener Grade von Eigenschaften in jeder Zone 256, 257 zu erleichtern.
Wie oben erläutert, können die Nachweiselemente Hardwaregeräte umfassen wie insbesondere eines oder mehrere mikroelektronische, mikrooptische und/oder mikromechanische Geräte. Beispiele für mikroelektronische Elemente umfassen Leiterspuren, Elektroden, Elektrodenkissen, Mikroheizelemente, elektrostatisch angetriebene Pumpen und Ventile, mikroelektromechanische Systeme (MEMS) und dergleichen. Die mikroelektrischen Elemente können auch beispielsweise flexible Mikroschaltungen umfassen, um den elektrochemischen oder auf Leitfähigkeit basierenden Nachweis zu unterstützen oder um optische Elemente zu unterstützen, die eine externe Energieversorgung erfordern. Beispiele für mikrooptische Elemente umfassen Lichtwellenleiter, Wellenleiterdetektoren, reflektierende Elemente (z.B. Prismen), Strahlenteiler, Linsenelemente, Festkörperlichtquellen und -detektoren und dergleichen. Die mikrooptischen Elemente können auch beispielsweise mikroreplizierte optische Elemente umfassen, wie etwa Mikrolinsen, auf Wellenlängen selektive Gitter und leitungsverstärkende Mikrostrukturen. Beispiele für mikromechanische Elemente umfassen Filter, Ventile, Pumpen, pneumatische und hydraulische Leitungen und dergleichen. Diese Hardwaregeräte können in die Abdeckschicht, in jede der beiden Flächen des Fluidsteuerungsfilms, in ein zusätzliches Polymersubstrat, das an den Fluidsteuerungsfilm geleimt ist, oder in eine Kombination daraus integriert werden.
Die Hardwaregeräte dienen verschiedenen Funktionen. Beispielsweise können mikroelektronische Geräte, die mit der Fluidprobe an bestimmten Punkten in der Nachweiszone in Berührung kommen, dafür ausgelegt sein, eine Änderung in der Leitfähigkeit oder eine Änderung in der Konzentration eines elektrochemischen Mittels als Reaktion auf die Menge eines in der Probe vorliegenden Analyten zu messen. Mikroelektronische Geräte, die mit dem Fluid in Berührung kommen, können auch dafür ausgelegt sein, die Probe in einem Abschnitt der Nachweiszone zu konzentrieren, durch freie Feldelektrophorese auf der Grundlage der Ladung des biologischen Analyten allein oder in Kombination mit anderen Testreagenzien.
Es ist auch möglich, Hardwaregeräte zu konstruieren, die das Fluid nicht berühren. Beispielsweise können mikroelektronische Geräte so ausgelegt sein, dass sie derart in großer Nähe zu den Kanälen der Nachweiszone liegen, dass sie zum Erhitzen und Abkühlen von Fluidproben in den Kanälen verwendet werden können, oder um verschiedene Temperaturen innerhalb des Nachweisgegenstandes zu erzeugen. Beispielsweise können erhöhte Temperaturen verwendet werden, um die Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Fragements zu beschleunigen oder um das Wachstum einer bestimmten wachsenden Mikrobenkolonie zu beschleunigen. Außerdem können mikroelektronische Geräte, die in großer Nähe zu den Kanälen der Nachweiszone liegen, dafür ausgelegt sein, eine Antenne zu bilden, um Änderungen der Wechselstromimpedanz nachzuweisen, die zum Nachweis von Analyten in einem mikrofluidischen Auftrennungssystem verwendbar sind.
Es gibt mehrere verschiedene Möglichkeiten, mikroelektronische, mikrooptische und/oder mikromechanische Geräte in die Filmschicht zur Fluidsteuerung oder in die erfindungsgemäßen Nachweisgegenstände zu integrieren. Beispielsweise können die Geräte in die Abdeckfilmschicht integriert sein, wie oben erwähnt und ausführlich in der gemeinsam besessenen und ebenfalls anhängigen Anmeldung Seriennr. 09/099,562 beschrieben. Ein anderes Verfahren zum Integrieren von Hardwaregeräten in den Gegenstand umfasst das Bereitstellen eines flexiblen Polymersubstrats, das eine Reihe elektrischer Leiterspuren trägt (z.B. Leiterspuren aus Nickel, Gold, Platin, Palladium, Kupfer, leitende, mit Silber aufgefüllte Tinten oder leitende, mit Kohlenstoff aufgefüllte Tinten), und dann das Bilden der mikrostrukturierten Fläche auf einer Fläche dieses Substrats. Beispiele geeigneter Substrate umfassen diejenigen, die in Klun u.a., US-Patentschrift 5,227,008 und Gerber u.a., US-Patentschrift 5,601,678 beschrieben sind. Das Substrat wird dann zu der Filmschicht zur Fluidsteuerung.
Die mikrostrukturierte Fläche, die die mikroelektronischen Geräte umfasst, kann auf unterschiedliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann die leitende, mit Leiterspuren versehene Fläche des Substrats in Berührung mit einem Formwerkzeug gebracht werden, das eine Formoberfläche aufweist, die mit einer Struktur der mikrostrukturierten Fluidsteuerungsstruktur versehen ist. Nach der Berührung wird das Substrat geprägt, um die mikrostrukturierte Fläche auf derselben Fläche wie die Leiterspuren zu bilden. Die Leiterspurenstruktur und die Formoberfläche sind derart gestaltet, dass die Leiterspuren mit entsprechenden Merkmalen der Fluidsteuerungsstruktur zusammenpassen.
Es ist auch möglich, mit demselben Formwerkzeug die mikrostrukturierte Fläche auf die Fläche des Substrats zu prägen, die der mit Leiterspuren versehenen Fläche gegenüber liegt. In diesem Fall, wird die Fläche ohne Leiterspuren vor dem Prägen mit einer Reihe elektrisch leitender Durchgangslöcher oder Durchgangsöffnungen versehen, um die Leiterspuren mit entsprechenden Strukturen der mikrostrukturierten Fläche zu verbinden.
Alternativ ist es möglich, ein separates Polymersubstrat, das mit mikroelektronischen, mikrooptischen und/oder mikromechanischen Geräten versehen ist, an die mikrostrukturierte Fläche eines Polymersubstrats zu leimen, wobei z.B. ein strukturiertes Haftmittel derart verwendet wird, dass die Leiterspuren mit entsprechenden Merkmalen der mikrostrukturierten Fläche zusammentreffen.
Es ist auch möglich, mikroelektronische, mikrooptische und/oder mikromechanische Geräte in ein separates Polymersubstrat einzuführen, das an die Filmschicht zur Fluidsteuerung geleimt ist. Um diese Aufgabe zu erfüllen, wird als Substrat ein flexibles Substrat mit einer Reihe elektrisch leitender Durchgangslöcher und Erhebungen an einer seiner Hauptflächen verwendet. Die mikrostrukturierte Fläche wird dann wie oben beschrieben auf der mit Durchgangslöchern und Erhebungen versehenen Fläche des Substrats geformt.
Es ist auch möglich, mikroelektronische, mikrooptische und/oder mikromechanische Geräte in ein separates Polymersubstrat einzuführen, das nach dem Formen an die Filmschicht zur Fluidsteuerung laminiert wird. Noch ein weiteres Verfahren, um den Gegenstand mit mikroelektronischen, mikrooptischen und/oder mikromechanischen Geräten auszustatten, umfasst das Bereitstellen eines Polymersubstrats mit mikrostrukturierter Oberfläche auf einer Fläche und das Abscheiden einer Struktur elektrisch leitender Metallspuren direkt auf dieser Fläche mit Hilfe herkömmlicher Metallabscheidungs- und Photolithographietechniken.
Wie oben erläutert, können die Nachweiselemente Testreagenzien und Probenreinigungsmaterialien umfassen. Die Testreagenzien können beispielsweise fluorogene oder chromogene Indikatoren, elektrochemische Reagenzien, Agglutinationsreagenzien, Analyt-spezifische Bindungsstoffe, Vervielfältigungsmittel wie etwa Enzyme und Katalysatoren, photochrome Mittel, dielektrische Zusammensetzungen, Analyt-spezifische Reporter wie etwa mit Enzymen verbundene Antikörpersonden, DNA-Sonden, RNA-Sonden, fluoreszierende oder phosphoreszierende Perlen umfassen. Die Probenreinigungsmaterialien können beispielsweise Filterelemente, chromatographische oder elektrophoretische Elemente, Analyt-spezifische Bindungsstoffe (z.B. Antikörper, Antikörperfragmente, DNA-Sonden) und FEststoffträger für diese umfassen. Zahlreiche mögliche Testreagenzien und Reinigungsmaterialien sind unten in der Erläuterung der verschiedenen Anwendungen der Nachweisgegenstände der vorliegenden Erfindung und der Beispiele angeführt. Es ist möglich, selektiv Testreagenzien, biologische Sonden, biokompatible Beschichtungen, Reinigungsgele und dergleichen auf verschiedenen Abschnitten des Fluidsteuerungsfilms abzuscheiden. Alternativ können diese Materialien in einer vorab festgelegten Struktur auf der Fläche der Deckelschicht abgeschieden werden, die für die Berührung mit dem Fluidsteuerungsfilm ausgelegt ist.
Die oben beschriebenen Nachweiselemente ermöglichen den Nachweis durch mehrere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren. Diese Verfahren können Farbveränderungen, Fluoreszenz, Lumineszenz, Turbidität, Änderungen der elektrischen Leitfähigkeit oder Spannung, Lichtabsorption, Lichtleitung, pH-Wert, Änderung der physikalischen Phase oder dergleichen umfassen. Der Nachweis der Eigenschaften durch diese Verfahren kann manuell wie etwa durch visuelle Beobachtung oder durch Anschluss an eine geeignete Sonde erfolgen, oder er kann automatisch mit Hilfe einer oder mehrerer Arten von Nachweismechanismen erfolgen, einschließlich beispielsweise eines Mikroplattenlesegeräts zum Nachweis der Emission von Lumineszenz. Andere Nachweisverfahren sind unten in der Erläuterung verschiedener Anwendungen der Nachweisgegenstände der vorliegenden Erfindung und der Beispiele angeführt.
Die gestapelten Filmschichten zur Fluidsteuerung, die oben beschrieben und in 2a–2f dargestellt sind, können als ein Nachweisgegenstand für mehrere Parameter verwendet werden, wobei die einzelnen Kanäle des gestapelten Feldes jeweils ein anderes Nachweiselement enthalten. Auf diese Weise können einzelne Kanäle ein positives Ergebnis liefern (wie beispielsweise eine Farbveränderung), während andere Kanäle dies nicht tun, sowohl innerhalb einer einzelnen Schicht als auch von Schicht zu Schicht. Wie bei einem einschichtigen Gegenstand können solche Nachweiselemente und/oder Testreagenzien gegeneinander versetzt sein, von Kanal zu Kanal und/oder von Schicht zu Schicht, um die Einfachheit des Nachweises zwischen benachbarten Kanälen und Schichten zu unterstützen. Diese Konstruktion stellt ein Mittel bereit, um den Fluidfließweg (dreidimensional) derart zu konstruieren, dass eine Probe im Verlaufe des Fließens durch den Nachweisgegenstand durch die Kanäle in einer Schicht fließen kann und es ihr optional gestattet werden kann, zwischen den Schichten zu fließen (wie etwa durch Öffnungen innerhalb einer Schicht wie oben beschrieben).
Wie oben angegeben, kann der Nachweisgegenstand, wie etwa der in 4 dargestellte Gegenstand 200, mit offenen Kanälen 204 gebildet sein, oder der Nachweisgegenstand, wie etwa der in 5 dargestellte Gegenstand 230, kann einen optionalen Abdeckfilm oder eine Deckelschicht 235 umfassen, der/die geschlossene Kanäle 232 bildet. Die Deckelschicht 235 kann mit Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, an der anderen Schicht 231 befestigt sein, insbesondere durch Kleben, Schweißen oder mechanische Befestigung. Die Deckelschicht 235 kann an den Spitzen 233 der einzelnen Kanäle 232 versiegelt sein oder kann nur am Umfang des Gegenstandes 230 versiegelt sein. Die Deckelschicht 235 kann aus einem flachen, relativ ebenen Film, einer solchen Bahn oder einer anderen geeigneten Schicht wie dargestellt bestehen.
Nunmehr mit Bezug auf 8 kann eine Deckelschicht 265 eines Nachweisgegenstandes 260 optional ein mikrostrukturierter Fluidsteuerungsfilm derart sein, dass die Deckelschicht 265 mehrere Kanäle 266 umfasst, die in ähnlicher Weise gebildet sind wie die Kanäle 262 der Filmschicht zur Fluidsteuerung 261. Optional kann die mikrostrukturierte Deckelschicht 265 auch als ein hydrophiler Fluidsteuerungsfilm mit den oben angegebenen Eigenschaften derart sein, dass die Deckelschicht 265 ebenfalls zum spontanen und gleichmäßigen Transport von Flüssigkeiten fähig ist. Die Kanäle 266 können von der gleichen Art oder Struktur sein wie die Kanäle 262, oder sie können wie dargestellt eine andere Struktur aufweisen.
Nunmehr mit Bezug sowohl auf 5 als auch auf 8 kann die Deckelschicht 235, 265 alle oder nur einen Abschnitt der Kanäle 232, 262 bedecken. Die teilweise Abdeckung kann bereitgestellt werden, indem alle Kanäle 232, 262 teilweise abgedeckt werden, indem einige, aber nicht alle Kanäle 232, 262 vollständig abgedeckt werden oder indem einige Kanäle 232, 262 teilweise abgedeckt werden. Die Kanalabdeckung, ob vollständig oder teilweise, kann aus verschiedenen Gründen wünschenswert sein. In einigen Beispielen kann die Deckelschicht 235, 265 hauptsächlich als eine Schutzschicht über den Kanälen 232, 262 dienen, oder sie kann dazu dienen, die Kanäle zu verschließen, um getrenntes Fließen bereitzustellen oder um die Kapillarwirkung an der Aufnahmezone zu verstärken. Alternativ kann die Deckelschicht 265 ein Fluidsteuerungsfilm sein, der für eine Fluidflussfunktion derart dient, dass die Deckelschicht 265 ein Nachweisgegenstand in sich selbst sein kann, oder die Deckelschicht 265 dient dazu, die Kapillarwirkung an der Aufnahmezone zu verstärken. In einem weiteren Beispiel kann die Deckelschicht 235, 265 als Teil der Nachweiszone fungieren, etwa indem sie eines oder mehrere Nachweiselemente umfasst, die in Fluidberührung mit der Probe in den Kanälen 232, 262 wie oben beschrieben steht.
Außerdem kann die Deckelschicht 235, 265 einen Sichtbereich in der Nachweiszone bereitstellen, aus dem Testeigenschaften beobachtet und/oder nachgewiesen werden können. Dieser Sichtbereich kann ein unbedeckter Bereich aufgrund der teilweisen Abdeckung der Kanäle 232, 262 sein, oder er kann ein Fenster an einer gewünschten Position sein. Das Fenster kann dahingehend offen sein, dass die Deckelschicht 235, 265 eine Öffnung umfasst, die die Kanäle 232, 262 freilegt. Alternativ kann das Fenster solcherart geschlossen sein, dass die Deckelschicht 235, 265 die Kanäle 232, 262 bedeckt, kann jedoch nach Wunsch mit einem transparenten Bereich versehen sein, der sich in der Nachweiszone befindet. Der transparente Bereich kann bereitgestellt werden, indem ein Abschnitt transparenten Films vorhanden ist, der an der gewünschten Position in die Deckelschicht 235, 265 eingesetzt ist, oder der transparente Bereich kann durch die Verwendung einer transparenten Deckelschicht 235, 265 bereitgestellt werden.
In Beispielen mit einer mikrostrukturierten Deckelschicht 265 kann die Transparenz der Deckelschicht 265 durch die mikrostrukturierte Fläche des Fluidsteuerungsfilms verringert oder anderweitig beeinflusst sein. Diese Verringerung der Transparenz kann daraus resultieren, dass der Kanalwinkel die Retroreflektion des Films beeinflusst und einen Verlust an Lichtleitung verursacht. Nunmehr mit Bezug auf 9 wird für eine Filmschicht zur Fluidsteuerung 300 mit V-förmigen Kanälen 302 mit eingeschlossenen. Winkeln, Alpha, von 90 Grad, die so ausgerichtet sind, dass die Winkelmittelpunkte 306 senkrecht (d.h. im Winkel von 90 Grad) zur Hauptfläche der Filmschicht 304 liegen, der Winkel des Einfallslichts ein wesentlicher Faktor für die Transparenz der Filmschicht. Bei bestimmten Einfallswinkeln tritt ein Phänomen auf, das als totale interne Reflektion (oder TIR) bekannt ist und zu einem Verlust der Lichtleitung durch die Filmschicht führt TIR tritt allgemein an einer Schnittstelle zwischen einem dichteren Medium wie etwa der Filmschicht und einem weniger dichten Medium wie etwa Luft auf, basierend auf einer Beziehung zwischen den Brechungsindexen der beiden Medien und dem Einfallswinkel. Der kleinste Einfallswinkel, bei dem TIR auftritt, ist als kritischer Winkel bekannt. Bei Filmschichten mit mikrostrukturierten Flächen wie etwa Schicht 300, erzeugt TIR eine Situation, in der Einfallslicht (mit dem Phantompfeil 309 dargestellt), das auf eine erste Fläche oder Seitenwand 307 eines Kanals 302 auftrifft, die TIR durchläuft und zur anderen Seitenwand 308 des Kanals 302 wandert und wiederum TIR durchläuft, was bewirkt, dass das Licht an der Seitenwand 308 zurück in die Richtung austritt, aus der es kam. Infolgedessen tritt kein Licht an der gegenüber liegenden Fläche 305 aus der Filmschicht 300 aus und somit wird kein sichtbares Licht durch die Filmschicht 300 geleitet.
Es gibt verschiedene Verfahren, um dieses optische Problem zu umgehen. Das erste besteht darin, die eingeschlossenen Winkel der Kanäle flacher (d.h. größer als 90 Grad) zu machen, so dass TIR nicht an beiden Kanalseitenwänden auftritt. Es gibt jedoch eine Grenze, wie flach die Kanalwinkel sein können, bevor sich dies auf die Fähigkeit der Kanäle zur Kapillarwirkung auswirkt. Es wurde festgestellt, dass, um die Kapillarwirkung einer Filmschicht zur Fluidsteuerung zu optimieren, der eingeschlossene Winkel der Kanäle bevorzugt weniger als 90 Grad beträgt. Es wurde festgestellt, dass ein Kompromisswinkel von etwa 100 Grad sowohl die Kapillarwirkung als auch die Lichtleitung gestattet, obschon keine der beiden Funktionen optimiert wird.
Ein zweites Verfahren, das die vorliegende Erfindung betrifft, ist das Neigen des eingeschlossenen Winkels der Kanäle weg von der Senkrechten. Das heißt, die Mittellinie der eingeschlossenen Winkel wird aus der Senkrechten der mikrostrukturierten Fläche der Filmschicht geneigt. Nunmehr mit Bezug auf 10a ist eine Filmschicht zur Fluidsteuerung 310 mit mehreren V-förmigen Kanälen 312, jeder mit einem eingeschlossenen Winkel Alpha, dargestellt. In dieser Ausführungsform der Erfindung ist die Mittellinie des eingeschlossenen Winkels 314 in einem Neigungswinkel Phi aus der Senkrechten 313 gegenüber der mikrostrukturierten Fläche 311 angeordnet. Obschon ein solches Neigen der Kanalwinkel den Bereich der Einfallswinkel vergrößert, die die TIR von einer ersten Seitenwand eines Kanals 312 durchlaufen, verringert es den Bereich von Winkeln, die TIR von der anderen Seitenwand des Kanals 312 durchlaufen und erhöht somit die Lichtleitung durch die Filmschicht 310. Ist, wie in 10b dargestellt, eine der Seitenwände 324 der Kanäle 322 parallel zur Senkrechten 323 der mikrostrukturierten Fläche der Filmschicht 320 und liegt die andere Seitenwand 325 in einem kleineren als dem TIR-Winkel (d.h. kleiner als der kritische Winkel), so ist der Film vollständig lichtleitend und wirkt lediglich als ein ablenkender Film durch Brechung, das heißt, der Film 320 beugt das Licht, während des durch den Film 320 fällt. Es versteht sich jedoch, dass die Lichtleitung für gewöhnlich vom Blickpunkt des Betrachters solcherart abhängt, dass das Neigen der Kanalwinkel die Transparenz in eine Richtung verbessern kann, die Transparenz in eine andere Richtung jedoch verringern kann.
Ein drittes Verfahren zur Umgehung des Problems besteht darin, Kanäle zu verwenden, die keine ebenen Seitenwände aufweisen. Wenn, mit Bezug auf 10c, ein Fluidsteuerungsfilm 330 Kanäle 332 aufweist, die eher wie ein umgekehrter Eiffelturm als eine umgekehrte Pyramide geformt sind, wird Licht, das mehr auf die Fläche der Seitenwände 334 fällt, geleitet. Die Fläche würde tendenziell wie eine zylindrische Linse wirken. Es würden gute Kapillarwirkungseigenschaften der Filmschicht 330 beibehalten, da der eingeschlossene Winkel Alpha jedes Kanals 332 variiert und, obschon ein Abschnitt des Kanals 332 einen großen eingeschlossenen Winkel wie etwa Alpha 2 aufweist, weist mindestens ein Abschnitt des Kanals 332 einen kleinen eingeschlossenen Winkel wie etwa Alpha 1 auf. Außerdem würde eine gute Volumenkapazität beibehalten, weil sich die Kanäle 332 an der Oberfläche 331 verbreitern.
Wiederum mit Bezug auf 8 kann eine optische Verbesserung der Deckelschicht 265 nur in der Nachweiszone bereitgestellt sein, in einem Sichtbereich oder als Fenster. Optional kann die gesamte Deckelschicht 265 optisch verbessert werden, um das Betrachten des Fluidflusses über den gesamten Nachweisgegenstand 260 zu unterstützen. Alternativ kann die Filmschicht zur Fluidsteuerung wie etwa 261 aus verschiedenen Gründen optisch verbessert sein und mit oder ohne Deckelschicht 265 verwendet werden. Gründe für die optische Verbesserung der Filmschicht zur Fluidsteuerung 261 können den Wunsch umfassen, durch die Filmschicht 261 hindurch zu blicken, um eine identifizierbare Grafik, Farbe oder ein Textstück wie etwa Markenabbilder oder Markennamen, Modellnummer, gültiger Datenbereich oder andere solche Angaben zu sehen, die für einen Benutzer und den durchgeführten Test wichtig sein können. Ein anderer Grund kann es sein, den Fluidfluss in dem Nachweisgegenstand 260 zu beobachten, um die richtige Befüllung des Gegenstandes 260 vor dem zu analysierenden Test zu überprüfen, um ordentliche Ergebnisse zu gewährleisten. Ein weiterer Grund kann die Einbeziehung eines Farbstoffs in die Filmschicht 261 sein, um den Nachweis zu unterstützen, was leider tendenziell die Lichtleitung durch die Filmschicht 261 beeinträchtigt. Noch ein weiterer Grund kann es sein, nachweisbare Eigenschaften in verschiedenen Schichten eines mehrschichtigen, gestapelten Nachweisgegenstandes (nicht dargestellt) zu begutachten. Andere Gründe für optische Verbesserung können sich dem Fachmann erschließen.
In gleicher Weise kann es nutzbringend sein, optisch verbesserten, mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilm für mikrofluidische Prozesse und/oder andere Geräte als die vorliegend beschriebenen Nachweisgegenstände bereitzustellen. Diese Prozesse und/oder Geräte können passiven oder aktiven Fluidtransport oder Fluidkontrolle umfassen. Anwendungen können beispielsweise Windeln, Tupfer, absorbierende Matten, Bandagen, Wundversorgungsgeräte, Ableiter, Abdecktücher, Vakuumgeräte, Filter, Auftrennmedien, Wärmeaustauscher, Flüssigkeitsspendergeräte und andere mikrofluidische Geräte zum Testen und/oder Handhaben von Fluidproben umfassen. Solche Anwendungen können mit physiologischen Fluiden wie oben beschrieben verwendbar sein oder mit anderen Fluiden wie etwa hydraulischen Fluiden, Schmierfluiden, natürlichen und/oder synthetischen Fluiden oder dergleichen oder in jedem beliebigen mikrofluidischen Gerät, mit jedem beliebigen Fluid, bei dem die optische Verbesserung des Gerätes nutzbringend wäre.
Nunmehr mit Bezug auf 11 ist ein Nachweisgegenstand 400 dargestellt, der eine Filmschicht zur Fluidsteuerung 402 umfasst, die benachbarte, koextensive Kanäle 404 umfasst, welche den Transport eines Fluids von einer Aufnahmezone 410 zu einer Nachweiszone 420 ermöglichen. Außerdem ist eine Deckelschicht 408 bereitgestellt, die die Kanäle 404 der Filmschicht 402 im Wesentlichen vollständig abdeckt. Der Nachweisgegenstand 400 kann die Form eines „Tauchstift"-Gegenstandes haben und kann optional einen Griffabschnitt 405 umfassen, um beispielsweise die Positionierung oder das Eintauchen der Aufnahmezone 410 in eine Fluidprobe zu erleichtern. In dieser Ausführungsform umfasst die Nachweiszone 420 ein „offenes" Fenster 421, das als rechteckige Öffnung in der Deckelschicht 408 gebildet ist. Das Fenster 421 schafft Zugang zu den Kanälen 404 der Nachweiszone 420 sowie ungehinderte Beobachtung der Eigenschaften des Tests oder der Tests, die in dem Nachweisgegenstand 400 stattfinden. Dieser Gegenstand 400 kann zur gleichzeitigen Ausführung einer Vielzahl von Tests ausgelegt sein, beispielsweise chemische oder biologische Tests, wobei jeder Kanal 404 ein eigenes Testreagens enthält. Das in jedem Kanal 404 bereitgestellte Testreagens kann ein unterschiedliches Testreagens sein oder eine Konzentrationsabstufung desselben Reagens'. Das Testreagens kann ein getrockneter Feststoff sein, der erneut hydriert wird, wenn die Aufnahmezone 410 mit einer Testlösung in Berührung kommt, die in die Kanäle 404 gesaugt wird und in Berührung mit den getrockneten Feststoffen kommt. Alternativ kann das Testreagens in einem Hydrogel enthalten sein, das das gesamte Volumen mindestens eines Abschnitts der Länge des Kanals 404 oder nur einen Abschnitt des Volumens eines oder mehrerer Kanäle 404 einnimmt. Das Testreagens kann auch kovalent an der Oberfläche eines oder mehrerer Kanäle 404 verankert sein, oder es kann auf die Oberfläche einer physikalischen Trägerstruktur, die in einem oder mehreren Kanälen 404 bereitgestellt ist (wie nachfolgend ausführlicher beschrieben) beschichtet oder an ihr verankert sein.
Nunmehr mit Bezug auf 14 ist ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen Nachweisgegenstandes 400 als kontinuierlicher Prozess 600 dargestellt. Ein Abroller 610 stellt eine kontinuierliche Rolle 620 mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilms 625 bereit, der mehrere einzelne mikrostrukturierte Kanäle 626 mit einer gewünschten Querschnittskonfigurierung umfasst. Ein Pumpsystem 630 umfasst einen Nadelmehrfachverteiler 631 mit mehreren Nadeln 632, die dazu dienen, ein einzelnes Reagens 635 oder ein anderes gewünschtes Material in die parallelen Kanäle 626 des Fluidsteuerungsfilms 625 einzubringen. Das bereitgestellte Reagens 635 kann sich je nach Wunsch von Kanal zu Kanal unterscheiden, kann zwischen den Kanälen abwechseln oder kann in bestimmten Kanälen das gleiche sein. Es ist ein Trocknungssystem 640 bereitgestellt, um das in die Kanäle 626 eingesetzte Material bei Bedarf zu trocknen, und dann kann, falls gewünscht, eine optionale Deckelschicht 650 auf die offene Kanaloberfläche laminiert werden. Die Bahn fertiger Nachweisgegenstände 655 wird denn an einer Aufrollstation 660 zur späteren Umformung wie etwa durch Aufschneiden in Streifen in kleine Diagnosegeräte aufgerollt.
Nunmehr mit Bezug auf 12 ist eine andere Ausführungsform eines Nachweisgegenstandes 450 dargestellt, der eine Filmschicht zur Fluidsteuerung 452 mit koextensiven Kanälen 454 umfasst, welche den Transport von Fluid von einer Aufnahmezone 460 zu einer Nachweiszone 470 erleichtern. Der Nachweisgegenstand 450 umfasst auch eine Deckelschicht 456, die ein geschlossenes, aber transparentes Fenster 472 aufweist, das in der Nachweiszone 470 angeordnet ist. In dieser Ausführungsform umfassen die Kanäle 454 leitendes Material 458, das über die gesamte Länge der Kanäle 454 bereitgestellt gezeigt ist, um den dielektrischen Nachweis in der Nachweiszone 470 zu erleichtern. Falls die Nachweiszone 470 mit einer vollständig transparenten Deckelschicht 456 versehen ist, um die Beobachtung der Testeigenschaften über die gesamte Länge des Gegenstandes 450 zu ermöglichen, so kann von ihr gesagt werden, dass sie die Aufnahmezone 460 überlagert, die sich über die Länge des Nachweisgegenstandes 450 erstreckt.
Nunmehr mit Bezug auf 13a und 13b ist in wieder einem anderen Beispiel ein doppelter Nachweisgegenstand 500 dargestellt, der als Tauchstift mit einem Griff 501 gebildet ist. Der Nachweisgegenstand 500 umfasst eine Filmschicht zur Fluidsteuerung 505, die mit Kanälen 506, 508 auf beiden Seiten der Schicht 505 konfiguriert ist, ähnlich der in 1i dargestellten Schicht 112i. Der Gegenstand 500 umfasst auch zwei Deckelschichten 507, 509, die zum Verschließen der Kanäle 506 bzw. 508 bereitgestellt sind. Die Nachweiszonen 510, 512 für jede Seite der Filmschicht 505 sind mit Sichtbereichen versehen, wie etwa 511, der für die Deckelschicht 507 dargestellt ist. Wie bei anderen, oben beschriebenen Deckelschichten kann der Sichtbereich 510 als offenes Fenster, als geschlossenes und transparentes Fenster, als transparente Deckelschicht oder in einer anderen geeigneten Konfigurierung angeordnet sein. Die Nachweiszonen 510, 512 können eine Art von Nachweiselement umfassen, welches das gleiche für beide Zonen 510, 512 ist, oder sie können eine Art von Nachweiselement umfassen, welches sich für beide Zonen 510, 512 unterscheidet, oder sie können mehrere Nachweiselemente umfassen, die die gleichen oder verschiedene für die Zonen 510, 512 sind. Zusätzlich oder alternativ kann der Nachweisgegenstand 500 eine Art von Testreagens umfassen, das sich innerhalb oder außerhalb der Nachweiszonen 510, 512 befindet und das das gleiche für beide Seiten des Films 505 ist, oder er kann eine Art von Testreagens umfassen, das sich innerhalb oder außerhalb der Nachweiszonen 510, 512 befindet und das für beide Seiten des Films 505 unterschiedlich ist, oder er kann mehrere Testreagenzien umfassen, die für beide Seiten des Films 505 die gleichen oder verschiedene sind. Der doppelte Nachweisgegenstand 500 ermöglicht es, dass mehrere mit einer einzigen Aufnahme von Probeflüssigkeit gleichzeitige Tests an einer Probe stattfinden und dann nachgewiesen werden, womit noch größere Vielseitigkeit und Geschwindigkeit bei den Probentests bereitgestellt wird.
In wiederum einem weiteren Beispiel kann ein physikalischer Träger zum Erleichtern des Nachweises eines Zielmaterials eingesetzt werden. Physikalische Träger, die mit Gegenständen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen insbesondere Fäden, Perlen, poröse Medien oder Gele. Diese Träger können in einem oder mehreren eines Nachweisgegenstandes angeordnet sein und dienen als ein Auffangort für Zielmaterial. Diese Träger befinden sich bevorzugt in der Nachweiszone des Gegenstandes, können sich aber, falls gewünscht, auch außerhalb der Nachweiszone befinden, um die Probenaufbereitung zum späteren Nachweis in der Nachweiszone zu unterstützen. Eines oder mehrere Testreagenzien können kovalent an den bereitgestellten physikalischen Trägern verankert oder anderweitig an einem Träger immobilisiert sein (d.h. entweder direkt durch Absorption oder über eine Bindungsgruppe), um eine Fühlerverbundstruktur in der Nachweiszone des Gegenstandes zu bilden. Es können freistehende Membranen aus verschiedenen Polymeren gebildet sein, einschließlich Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylidenchlorid, Polyvinylchlorid (PVC), Polysulfone, Zellulose, funktionalisierte Zellulose und Nylon, sowie aus Silica wie etwa Silica-Xerogel oder porösem Glas. Verwendbare Substrate sind bevorzugt für Ionen und die fraglichen biologischen Moleküle durchlässig. Ein Beispiel eines vorgeformten Trägers ist Alpha-Zellulose in der Form eines Baumwollmullpapiers. Ein zweites Beispiel eines Trägers ist hydrophiles poröses Polypropylen, das mit PVC beschichtet ist, wie in der PCT-Patentveröffentlichung WO 92/07899 beschrieben, die per Verweis vollständig Bestandteil des Vorliegenden ist. Ein drittes Beispiel ist Hexandiamin-funktionale Zellulose, wie in der US-Patentschrift 5,958,782 beschrieben, die per Verweis vollständig Bestandteil des Vorliegenden ist. Ein viertes Beispiel sind Dimethylazlacton-funktionale Polymere.
Wiederum mit Bezug auf 11 sowie auf einen Querschnitt des Gegenstandes 400, der in 15 dargestellt ist, kann der Nachweisgegenstand 400 ein winziges Stück Faden 430 umfassen, das in eine Nut eines oder mehrerer Kanäle 404 eingelegt sein kann. Der Faden 430 stellt einen Träger bereit, der eine Sonde für das Auffangen des Ziels darstellt. Der verfügbare Flächeninhalt und die Flussunterbrechung, die von dem Faden 430 verursacht wird, kann ein verbessertes Mittel zum schnellen Nachweis mit einem hohen Signal-zu-Rauschen-Verhältnis bereitstellt. Der Faden 430 kann sich über die gesamte Länge des Gegenstandes erstrecken oder kann sich innerhalb der Nachweiszone 420 nur über eine kurze Strecke erstrecken, die als ausreichend bestimmt wurde, um das gewünschte Auffangen des Ziels bereitzustellen. Optional kann der physikalische Träger innerhalb der Kanäle durch eine andere mikrostrukturierte Fläche wie etwa eine mikrostrukturierte Deckelschicht (nicht dargestellt) bereitgestellt werden, die je nach Bedarf in die Kanäle passt. Dies würde die physische Trennung des Trägers durch Entfernung der Trägerschicht zur nachfolgenden Lagerung oder Verarbeitung erleichtern.
Nunmehr mit Bezug auf 16 kann in noch einem weiteren Beispiel ein Gegenstand 550 bereitgestellt werden, der als dreidimensionales Feld aus Zonen gebildet ist, die biologische Sonden binden. Es ist ein Stapel mikrostrukturierter Schichten 551 dargestellt, die jeweils mehrere Kanäle 552 umfassen, in dem jeder Kanal 552 eine Bindungszone 555 enthält, wie etwa ein Hydrogel. Die Bindungszonen 555 können das Volumen der eingeschlossenen Kanäle 552 vollständig füllen (wie dargestellt), oder die Bindungszonen 555 können teilweise auf einer oder beiden Seiten der eingeschlossenen Kanäle 552 wie etwa den Seitenwänden 556 oder Kanalbasis 557 gebildet sein. Die Bindungszonen 555 können ein Biomolekül wie etwa ein Oligonukleotid, Enzym oder einen Antikörper enthalten, oder sie können ein Reporter-Molekül wie etwa ein fluorogenes oder chromogenes Enzymsubstrat enthalten. Die Bindungszonen 555 werden durch physikalische Sperren, umfassend die Seitenwände 556, die Kanalbasis 557 und die Unterseite 558 einer angrenzenden Schicht 551 oder einer Deckelschicht 553, an ihrer Position gehalten und von benachbarten Bindungszonen 555 isoliert. Bevorzugt ist jede Bindungszone an ihren Enden offen, wie etwa die Vorderseite 559 und die Rückseite 560, was die effiziente Durchleitung von Lösung durch die Bindungszonen 555 bereitstellt.
In bevorzugten Ausführungsformen überwindet diese Art eines Gegenstandes 550 der vorliegenden Erfindung mit dreidimensionalem Feld die Geschwindigkeits- und Empfindlichkeitsbeschränkungen der Anordnungen nach dem Stand der Technik. Der Gegenstand 550 erreicht dies bevorzugt, indem er einzelne dreidimensionale Gelzonen 555 bereitstellt, die durch physikalische Barrieren, die von den mikrostrukturierten Kanälen 552 gebildet werden, voneinander isoliert sind. Die Kanäle 552 stellen eine Diffusionssperre gegen lösliche Reporter-Moleküle bereit und ermöglichen die Verwendung eines Enzym-verbundenen Nachweises. Dies erhöht die Empfindlichkeit gegenüber dem Nachweis mit nur fluoreszierend markierten Zielen. Die Gelzonen 555 sind bevorzugt an ihren Enden 559, 560 offen und gestatten so einer Lösung, sich mittels Kapillarwirkung durch die Zonen 555 zu bewegen. Alternativ kann Flüssigkeit mit Hilfe von positivem und negativem Druck durch die Gelzonen 555 geleitet werden. Elektrophorese kann ebenfalls verwendet werden, um die schnelle Diffusion von Biomolekülen in die Gelzonen 555 zu erleichtern. Durch die Verwendung dieser Verfahren sind die Hybridisierungs- und Waschschritte nicht durch die Diffusionsgeschwindigkeit der Ziellösung in das Gel 555 beschränkt. Deshalb können Gelzonen 555 mit längeren Weglängen verwendet werden, was wiederum zu erhöhter Nachweisempfindlichkeit führt.
Es sind zahlreiche Anwendungen für die Nachweisgegenstände der vorliegenden Erfindung möglich.
Einige der möglichen Anwendungen wie unten ausgeführt helfen dabei, verschiedene mögliche Zusammensetzungen für Testreagenzien und/oder Probenreinigungsmaterialien, sowie mögliche Nachweisverfahren und -mechanismen darzustellen. Eine besonders relevante Anwendung des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung ist bei dem Nachweis und der Unterscheidung von Bakterien. Wachsende Mikrokolonien scheiden oft extrazelluläre Enzyme aus. In einer Ausführungsform können diese Enzyme mit Hilfe von Substratindikatoren mit fluorogenen oder chromogenen Enzymen, die sich in der Nachweiszone des Gegenstandes befindet, nachgewiesen werden. Solche Indikatoren weisen einen fluoreszenten oder kolorimetrischen Farbstoff auf, der kovalent an ein biologisches Molekül gebunden ist, das das Enzym erkennen kann. Wenn das Enzym die kovalente Verbindung aufspaltet, wird der Farbstoff freigesetzt, was es ermöglicht, die fluoreszierenden oder kolorimetrischen Eigenschaften des Farbstoffs visuell nachzuweisen oder spektrophotometrisch zu messen. Das Enzym kann mehr als eine Million fluoreszierender Indikatormoleküle pro Enzymmolekül umwandeln. Da das Fluoreszenznachweisverfahren extrem empfindlich ist, stellt dies ein Verfahren bereit, das Signal von einer wachsenden Mikrokolonie derart zu verstärken, dass es in einer kurzen Zeit nachgewiesen werden kann.
Ein Beispiel, wo solche Gegenstände verwendbar sind, ist der Nachweis von E. coli und Coliformen in Lebensmittelproben. E. coli ist ein wichtiger Indikator für fäkale Verschmutzung in Umwelt- und Lebensmittelproben, während die Coliformanzahl ein wichtiger Indikator für bakteriologische Verschmutzung ist. Bei der Qualitätskontrolle von Wasser und Lebensmitteln ist es sehr wichtig, sowohl auf Coliformanzahl und E. coli zu untersuchen. Mit Hilfe eines Gegenstandes der vorliegenden Erfindung kann in einer ersten Nachweiszone auf Coliforme getestet werden, mit einem 4-Methylumbelliferon(4-MU)-Derivat, das für den Nachweis von β-D-Galactosidase(β-Gal)-Aktivität spezifisch ist. Dieses Substrat ist 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactosid (MUGal), das durch β-Gal hydrolysiert wird und blaues fluoreszierendes 4-MU freisetzt. In einer zweiten Nachweiszone kann auf E. coli getestet werden, mit einem 4-MU-Derivat, das für den Nachweis von β-D-Glucuronidase(Z-Gud)-Aktivität spezifisch ist. Dieses Substrat ist 4 Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid (MUGud), das durch β-Gud hydrolysiert wird und wiederum 4-MU freisetzt. Zum selektiven Nachweis von E. coli in einem primären Isolationsmedium kann zuerst eine aerobe Inkubation in einem selektiven Wachstumsmedium erfolgen, das das Wachstum von gram-positiven Strängen hemmt. Auf diese Weise werden β-Gud-Aktivitäten von anderen Strängen als E. coli unterdrückt. Außerdem helfen die Inkubation bei 44°C und der Nachweis der Gasbildung bei dem ausschließlichen Nachweis von E. coli.
Ein Nachweisgegenstand, der eine Tafel verschiedener fluorogener Enzymsubstrate umfasst, die in jeder der Nachweiszonen angeordnet sind, kann ebenfalls vorteilhaft verwendet werden, um einen unbekannten Mikroorganismus auf der Grundlage einer Bestimmung seines Enzymaktivitätsprofils nachzuweisen oder zu identifizieren. Viele Enzyme wurden identifiziert, die für bestimmte Gruppen von Bakterien spezifisch sind, und es ist wahrscheinlich, dass in Zukunft andere Enzyme identifiziert werden, die eine solche Spezifität aufweisen (siehe allgemein Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1989, Williams and Wilkins, USA). Zum Beispiel weisen die meisten gram-positiven Bakterien L-Alaninaminopeptidase-Aktivität auf. Coloforme Bakterien (eine Gruppe von gram-negativen Bakterien) drücken zusätzlich Galactosidase-Aktivität aus. E. coli-Bakterien (eine Spezies in der Coliform-Gruppe) drücken zusätzlich β-Glucuronidase-Aktivität aus. Das Enzym β-Glucuronidase findet sich in der Bakteriengruppe Enterococcus. Das Hefepathogen Candida albicans weist N-Acetyl-β-Glucosaminidase-Aktivität auf.
Die Gegenstände der vorliegenden Erfindung können für eine schnelle Identifizierung von Mikroorganismen oder Enzymen sorgen, die aus klinischen Proben, Lebensmittelproben, Kosmetika, Getränkeproben, Wasser- und Bodenproben isoliert wurden. Klinische Proben können Urin-, Stuhl-, Wund-, Rachen-, Genitalproben oder normalerweise sterile Körperfluide wie etwa Blut oder Liquor umfassen. Die Mikroorganismen werden gewöhnlich vor der Identifizierung aus der Probe isoliert. Bei Tests auf antibiotische Empfänglichkeit und minimale hemmende Konzentration zeigt das Fehlen von Enzymaktivität in der Gegenwart von Antibiotika im Vergleich zum Vorhandensein von Enzymaktivität einer Kontrollprobe eine antibiotische Wirkung an. Die Zusammensetzungen, Gegenstände und Systeme sind verwendbar, um Krankheitszustände zu testen (z.B. zeigt übermäßig viel Alkaliphosphatase in der Samenflüssigkeit Prostatakrebs an; auch ergibt die Aktivität von N-Acetyl-β-Glucosaminidase im Urin ein empfindliches Maß für die Gesundheit der Nieren). Sie sind auch zur Identifizierung eines Organismus in einer Probe verwendbar. In den meisten Fällen sind die zu bestimmenden Organismen Bakterien. Es können jedoch auch andere Mikroorganismen wie etwa Pilze identifiziert werden.
Im Gebrauch wird eine bakterielle Suspension aufgeteilt, indem sie in jede der verschiedenen Aufnahmezonen des Nachweisgegenstandes aufgesaugt wird. Die aufgeteilten Proben sickern in jede der mehreren Nachweiszonen, wo sie mit jedem der verschiedenen fluorogenen Enzymsubstrate inkubieren, die zur Bestimmung des Enzymaktivitätsprofils erforderlich sind. Typisch wird nach einer relativ kurzen Inkubationszeit von 2–30 Minuten ein nachweisbares Produkt entwickelt. Die Menge des entsprechenden Enzyms in jeder Subprobe wird dann durch spektrophotometrische Analyse jeder Nachweiszone bestimmt.
Die Anzahl fluorogener Enzymsubstrate, die zur Identifizierung eines bestimmten Mikroorganismus erforderlich ist, hängt von dem Mikroorganismus ab. In einigen Fällen kann eine einzige Kammer genug sein. In anderen Fällen sind mehrere Kammern, die jeweils ein spezifisches fluorogenes Enzymsubstrat oder eine Konzentration des Substrats enthalten, erforderlich, um einen Mikroorganismus von einem anderen mit einem sehr ähnlichen Profil zu unterscheiden. Beispielprofile sind in der US-Patentschrift 4,591,554 und in der US-Patentschrift 5,236,827 dargelegt.
Der Grad der Reaktion eines Enzyms mit jedem der Substrate kann bestimmt werden, indem jede Reaktionskammer mit einem fluoreszierenden Nachweissystem untersucht wird. In spezifischen Umsetzungen wird so bald nach der Beimpfung wie zweckmäßig eine anfängliche Fluoreszenzablesung vorgenommen. Nachfolgende Ablesungen erfolgen in regelmäßigen Abständen und werden verwendet, um die Reaktionsgeschwindigkeiten zu berechnen oder um das Einsetzen des Nachweises für jede Reaktionskammer zu bestimmen. Diese Informationen werden zu einer Prozessoranordnung übertragen, die die Daten mit einer Gruppe von Standardgeschwindigkeitsdaten für Mikroorganismen vergleicht und eine Identifizierung bestimmt.
Gegenstände der vorliegenden Erfindung, die ferner Tafeln fluorogener Enzymsubstrate umfassen, können verwendet werden, um auf eine große Anzahl häufig auftretender Mikroorganismen zu testen, wozu uneingeschränkt folgende Mikroorganismen gehören: Aeromonas hydrophilia, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacteroides fragilis, Bacteroides intermedium, Candida albicans, Citrobacter freundii, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumoniae, Lactococcus lactis, Mycobacterium fortuitum, Neisseria gonorrhoeae, Organella morganii, Peptostreptococcus anaerobius, Peptococcus magnus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginos, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas pudita, Salmonella typhimurium, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus simulans, Streptococcus agalactiae B, Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus faecalis D, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, und Xanthomonas maltophilia.
In einem Beispiel ist eine Nachweisanordnung angeordnet und dafür ausgelegt, die Intensität oder den Ort emittierter Signale oder eines emittierten Signals von den verschiedenen Nachweiszonen des Gegenstandes nachzuweisen. Der Ausgabewert vom Nachweisgegenstand wird typisch mit einem Analog-digital-(A/D-)Wandler in ein digitales Signal umgewandelt und zu einer Prozessoranordnung übertragen. Die Prozessoranordnung ist dafür angeordnet und eingerichtet, die ausgegebenen Signale/das ausgegebene Signal bei der Bestimmung der Konzentration, des Ortes oder Anzahl von Biomolekülen, Biomakromolekülen oder Mikroorganismen zu verarbeiten und zu analysieren. Diese Prozessoranordnung kann Teil einer eigenständigen Einheit oder Teil eines zentralen Computers oder eines lokalen Netzwerks sein. Optional kann die Prozessoranordnung eine Zuordnungsdatenbank enthalten, die die verarbeiteten Daten für jedes Fühlelement entsprechenden Identifikatoren für Proben oder Gegenstände, z.B. einer Lebensmittelprobe, einer Drogen- oder Arzneimittelprobe, einer klinischen Probe, einem sterilisierten Gegenstand usw. zuordnet.
Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet umfasst die Integrierung selektiver Bindungsstoffe in die Nachweiszone(n) zur Verwendung in Anwendungen der klinischen Diagnostik und der Reihenuntersuchung mit hohem Durchsatz. In diesem Format wird ein Zielmolekül mit Hilfe einer Auffangsonde (z.B. einer Antikörper- oder DNA-Sonde) nachgewiesen, die an einem spezifischen Ort in der Nachweiszone verankert ist. Während die Probe von der Aufnahmezone in die Nachweiszone gesaugt wird, wird das Zielbiomolekül selektiv von der Auffangsonde festgehalten. Ein primäres oder sekundäres Nachweisreagens (z.B. eine Antikörper- oder eine DNA-Sonde, die mit einer fluoreszierenden, phosphoreszierenden, radioaktiven oder anderen nachweisbaren Spezies markiert ist) wird ebenfalls selektiv an das Ziel gebunden. Nachdem ungebundene Reagenzien aus der Nachweiszone gesaugt wurden, wird das zum Nachweisreagens gehörende Signal bestimmt. Im Falle eines Enzym-verbundenen Immunsorbent-Tests (ELISA) wird eine mit Enzym konjugierte Antikörper-Reportersonde eingeführt, die an die aufgefangenen Ziele bindet. Die zurückbehaltene Enzymaktivität wird mit Hilfe eines fluorogenen Enzymsubstrats nachgewiesen.
Homogene Immuntesttechniken sind allgemein schneller und bequemer als ihre heterogenen Gegenstücke bei der Verwendung in dem Nachweisgegenstand der vorliegenden Erfindung. In diesem Testformat gehört zu jeder Nachweiszone ein fluorogenes Enzymsubstrat, das mit einem makromolekularen Substrat konjugiert ist, welches mit dem zu testenden biologischen Zielmolekül identisch ist. In diesem Fall konkurrieren das Probenziel und das konjugierte Ziel (mit dem fluorogenen Enzymsubstrat) um die Bindung an einen feststehenden Pool von Antikörpern in den einzelnen Nachweiszonen. Binden die Antikörper erst an das konjugierte Ziel, so weisen sie einen Überschuss des zugesetzten Enzyms auf, und das fluorogene Enzymziel ist vor Abspaltung geschützt. Mit der steigenden Menge des Probenziels nimmt die Anzahl von Antikörpern, die für den Schutz des konjugierten Ziels zur Verfügung stehen, ab, und das fluoreszierende Signal von enzymatisch abgespaltenem Konjugat erhöht sich. Die Menge an Probe, die in jede Nachweiszone eingeführt wird, kann über die Auslegung der Geometrien der Aufnahme- und/oder der Nachweiszone variiert werden. US-Patentschrift 4,259,233 lehrt die Verwendung von mit β-Galactosylumbelliferon markiertem Protein und Polypeptid-Konjugaten in Immuntests.
Beispiele für homogene Immuntests, die mit den erfindungsgemäßen Gegenständen nachweisbar sind, umfassen jene für Hormone wie etwa Insulin, chorionisches Genadotropin, Thyroxin, Lithyromin und Estriol; Antigene und Hapten wie etwa Ferritin, Bradykinin, Prostaglandine und tumorspezifische Antigene; Vitamine wie etwa Biotin, Vitamin B₁₂, Folsäure, Vitamin E, Vitamin A und Ascorbinsäure; Metaboliten wie etwa 3',5'-Adenosinmonophosphat und 3',5'-Guanosinmonophosphat; pharmakologische Wirkstoffe oder Drogen, insbesondere die nachfolgend beschriebenen; Antikörper wie etwa mikrosomale Antikörper und Antikörper gegen Hepatitis und Allergene sowie spezifische Bindungsrezeptoren wie Thyroxinbindendes Globulin, Avidin, den intrinsischen Faktor und Transcobalamin.
Diese Arten von Tests sind insbesondere für den Nachweis von Hapten (und deren Analogen) mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1000 verwendbar, insbesondere von Wirkstoffen und ihren Analogen, umfassend die Aminoglycosid-Antibiotika wie etwa Streptomycin, Neomycin, Gentamicin, Tobramycin, Amikacin, Kanamycin, Sisomicin und Netilmicin; Antikrampfmittel wie etwa Diphenylhydantoin, Phenobarbital, Primidon, Carbamazepin, Ethosuximid und Natriumvalproat; Bronchienerweiterungsmittel wie etwa Theophyllin; kardiovaskuläre Wirkstoffe wie etwa Quinidin und Procainamid; Missbrauchsdrogen wie etwa Morphin, Barbiturate und Amphetamine und Tranquilizer wie etwa Valium und Librium.
Polypeptide, die mit Gegenständen der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können, umfassen Angiotensin I und II, C-Peptid, Oxytocin, Vasopressin, Neurophysin, Gastrin, Secretin, Glucagon, Bradykinin und Relaxin. Proteine, die nachgewiesen werden können, umfassen die Klassen der Protamine, Mucoproteine, Glykoproteine, Globuline, Albumine, Skleroproteine, Phosphoproteine, Histone, Lipoproteine, Chromoproteine und Nukleoproteine. Beispiele für spezifische Proteine sind Präalbumin, a₁-Lipoprotein, Humanserumalbumin, a₁-Säureglykoprotein, a₁-Antitrypsin, a₁-Glykoprotein, Transcortin, Thyroxin-bindendes Globulin, Haptoglobin, Hämoglobin, Myoglobin, Ceruloplasmin, a₂-Lipoprotein, a₂-Makroglobulin, β-Lipoprotein, Erythropoietin, Transferin, Homopexin, Fibrinogen, Immunglobuline wie etwa IgG, IgM, IgA, IgD und IgE und ihre Fragmente, z.B. Fe und Fab, Komplementfaktoren, Prolactin, Blutgerinnungsfaktoren wie etwa Fibrinogen und Thrombin, Insulin, Melanotropin, Somatotropin, Thyrotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, leutinisierendes Hormon, Gonadotropin, Schilddrüsenstimmulationshormon, Plazentalactogen, intrinsischer Faktor, Transcobalamin, Serumenzyme wie etwa Alkaliphosphatase, lactische Dehydrogenase, Amylase, Lipasephosphat, Cholinesterase, Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Glutamat-Pyruvat-Transaminase und Uropepsin, Endorphine, Enkephaline, Protamine, Gewebsantigen, bakterielle Antigene und virale Antigene wie etwa Hepatitis-Antigen (z.B. HB₁Ag, HB_cAg und HB_eAg).
Die Enzymfragmentrekombination bietet einen alternativen Ansatz für homogene Tests in Nachweiszonen der vorliegenden Erfindung. Von gentechnisch veränderten Fragmenten von β-Galactosidase-Enzym aus E. coli ist bekannt, dass sie sich in vitro zu aktiven Enzymen rekombinieren. Diese Reaktion kann als homogenes Signalsystem für Reihenuntersuchungen mit hohem Durchsatz verwendet werden. In dieser Art von Test wird ein biologischer Ligand wie etwa ein Arzneiwirkstoff an eines der Enzymfragmente konjugiert. Der Ligand allein beeinträchtigt nicht die Enzymfragmentrekombination. Wird jedoch ein Antikörper, Rezeptor oder ein anderes biologisches Makromolekül zugesetzt, das spezifisch an den Liganden bindet, so wird die Enzymfragmentrekombination sterisch behindert, und es geht Enzymaktivität verloren. In diesem Format enthält die Nachweiszone Ligand-Enzymfragment-Konjugat und freien Rezeptor in getrockneter Form. Die Hydrierung durch die Probe führt zur konkurrierenden Bindung des Rezeptors durch den Zielliganden und das Ligand-Enzym-Konjugat. Die Rezeptorbindungseffizienz an den Liganden wird aus der Kinetik der enzymatischen Abspaltung von zugesetztem Enzymsubstrat bestimmt.
Die Konzentration von Glukose und Lactat im Blut ist extrem wichtig zur Aufrechterhaltung der Homöostase. In einem klinischen Versuchsaufbau können mit Hilfe elektrochemsicher Sensoren genaue und relativ schnelle Bestimmungen der Glukose- und Lactatwerte aus Blutproben ermittelt werden. In einem Beispiel eines Glukosemessgeräts, das den mikrofluidischen Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfassen kann, umfasst die Nachweiszone ein elektrochemisch basiertes Glukosenachweiselement. Die Probe wird von der Aufnahmezone aufgenommen und zu einer oder mehreren Nachweiszonen kanalisiert, die Elektroden aus modifiziertem Enzym umfassen. In einem bevorzugten Beispiel weisen die Elektroden eine Basisschicht mit mikroflexiblen Schaltungen auf, die auf den Fluidsteuerungsfilm oder auf die Abdeckschicht gedruckt sind. Die mikroflexiblen Leiterspuren können nominal aus Kupfer bestehen und dienen dazu, die aktiven Elektroden in den Nachweiszonen mit einem Messgerät zu verbinden, das dazu angeordnet und eingerichtet ist, die Konzentration von Glukose auf der Grundlage eines Amperemeter-Ablesewerts von den Elektroden nachzuweisen. Die Referenzelektrode ist bevorzugt mit Silber beschichtet, und die Substratelektrode ist bevorzugt mit Gold beschichtet.
Die Arbeitselektrode ist mit einem Enzym beschichtet, das in der Lage ist, Glukose zu oxidieren, und mit einer Mediatorverbindung, die Elektronen aus dem Enzym zur Elektrode leitet, was zu einem messbaren Strom führt, wenn Glukose vorliegt. Repräsentative Mediatorverbindungen umfassen Ferrocyanid, Metallocen-Verbindungen wie etwa Ferrocen, Quinone, Phenazinium-Salze, Redox-Indikator DCPIP und mit Imidazol substituierte Osmium-Verbindungen. Arbeitselektroden dieser Art können auf viele verschiedene Weisen formuliert sein. Beispielsweise wurden Mischungen aus leitendem Kohlenstoff, Glukoseoxidase und einem Mediator zu einer Paste oder Tinte formuliert und auf ein Substrat aufgetragen, wie in den US-Patentschriften 5,286,362 und 5,951,836 beschrieben. Außerdem können mehrschichtiges Drucken und Analyt-selektive Membranschichten erforderlich sein, um die Elektrodenleistung zu optimieren, wie in der US-Patentschrift 5,529,676 erläutert.
In einem alternativen Beispiel des Glukosemessgeräts, das den mikrofluidischen Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfassen kann, umfasst die Nachweiszone ein kolorimetrisches Fühlerelement. Dieses Fühlerelement besteht aus einer hydrophilen Membran wie etwa einer Nylon-Membran und Reagenzien, die bei der Durchführung einer kolorimetrischen Bestimmung der Glukosekonzentration verwendbar sind. In dieser Ausführungsform enthält die Membran Glukoseoxidase, Peroxidase, 3-Methyl-2-Benzothiazolinhydrazonhydrochlorid (MBTH) und 3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB). Eine Probe wird aus der Aufnahmezone in die Nachweiszone gesaugt. In der Nachweiszone wird die im Blut vorhandene Glukose von der Glukoseoxidase in einer Reaktion verbraucht, die Wasserstoffperoxid erzeugt. Das Wasserstoffperoxid wird von dem Peroxidase-Enzym in Gegenwart des MBTH-DMAB-Paares verbraucht, um ein Licht-absorbierendes Produkt mit einem Absorptionsmaximum bei etwa 635 gemäß bekannter Chemie zu erzeugen (siehe US-Patentschrift 5,179,005 ). Es können Reflektionsmessungen der Reaktionszone eines beimpften Kanals zur Bestimmung der Konzentration von Glukose in dem Teststreifen verwendet werden. Die Genauigkeit der Bestimmung kann mit einem Feld von Reaktionszonen verbessert werden, die verschiedenen Probenvolumen oder verschiedenen Konzentrationen der Reagenzien entsprechen, und indem alle verfügbaren Daten verwendet werden.
In noch einem weiteren Beispiel des Glukose-Sensors, der den mikrofluidischen Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfassen kann, umfasst die Nachweiszone ein auf Fluoreszenz basierendes Glukosenachweissystem. In dieser Ausführungsform ist ein auf Fluoreszenz basierender Sauerstoffsensor wie jener, der in der US-Patentschrift 5,409,666 beschrieben ist, mit einer Membranschicht beschichtet, die Glukoseoxidase umfasst. In der Nachweiszone werden die Glukose und der Sauerstoff, die in der Probe vorliegen, von der Glukoseoxidase verbraucht. Dies verbraucht den Sauerstoff in der Nähe des auf Fluoreszenz basierenden Sauerstoffsensors, was zu einer Zunahme der Fluoreszenz führt. Ein Kontrollkanal, in dem die Glukoseoxidase fehlt, zeigt keine Veränderung und kann dazu dienen, ein fluoreszierendes Referenzsignal bereitzustellen. Die fluoreszierenden Signale können mit einem auf Kompakt-LEDs basierenden Lesegerät abgelesen werden, das Lichtquellen, Detektoren und einen A/D-Wandler umfasst. Der Fluidsteuerungsfilm wird einfach in das Lesegerät eingelegt und es wird eine Messung vorgenommen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles, bequemes und kostenarmes Gerät für Probentests bereit, insbesondere wenn eine Vielzahl von Tests (z.B. biologische Tests) erforderlich ist. Das Gerät der vorliegenden Erfindung bietet mehrere Vorteile gegenüber den „Kalottenfeld"-Geräten, die derzeit auf dem Fachgebiet für eine Vielzahl von Tests verwendet werden. Bevorzugte Geräte der vorliegenden Erfindung benutzen ein relativ kleines Volumen der in den Kanälen enthaltenen Probe. Dies ermöglicht eine schnellere Reaktion auf biologische Reaktionen. Auch wird das mehrfache Pipettieren der Probe in einzelne Kalotten abgeschafft. Jeder Kanal kann gleichzeitig beimpft werden, indem ein Rand oder die Oberfläche des Geräts mit einer betreffenden Fluidprobe in Berührung gebracht wird. Bevorzugtere Geräte der vorliegenden Erfindung kosten auch weniger als die genannten Kalotten. Sie verbrauchen bevorzugt nicht nur weniger Reagens für jeden Test, sondern das Gerät kann bevorzugt in einem kontinuierlichen Prozess hergestellt werden, z.B. unter Verwendung eines einzigen mikrostrukturierten Films oder einer einfachen zweiteiligen Konstruktion eines geprägten, mikrostrukturierten unteren Films und eines versiegelbaren Abdeckfilms. Außerdem schafft die Möglichkeit, dreidimensionale gestapelte Strukturen mit dem mikrostrukturierten Fluidsteuerungsfilm zu erstellen, die Möglichkeit, die Oberfläche technisch zu bearbeiten, um Fluidbewegung zu festgelegten Orten bereitzustellen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind angeführt, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu unterstützen, und sollen nicht dahingehend interpretiert werden, dass sie deren Schutzumfang beschränkt. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich alle Anteile und Prozentsätze auf das Gewicht.
Die unten beschriebenen Beispiele 1 und 2 demonstrieren die Verwendbarkeit des Mehrfachparameter-Testgeräts für zwei häufige mikrobiologische Tests. Der Fachmann auf dem Gebiet biologischer Tests sollte einzuschätzen wissen, dass das Gerät der vorliegenden Erfindung in vielen verschiedenen Verfahren verwendet werden kann, die derzeit mit dem Format einer Mikrotiterplatte mit 96 Kalotten durchgeführt werden.
Beispiel 1.
Bakterielle Identifizierung
Durchlauf 1a: Herstellung geprägter Filme.
Es wurden Filme mit parallelen Kanälen auf einen Schaumträger extrusionsgeprägt, wie in der US-Patentanmeldung Seriennr. 08/905,481 beschrieben. Der Querschnitt jedes Kanals hatte die Form eines umgekehrten Trapezes mit einer Basis von etwa 0,75 mm und einer Höhe von etwa 1,0 mm. Der Seitenwandwinkel betrug etwa 15 Grad. Jeder Kanal wurde durch eine „ebene Fläche" von etwa 0,75 mm getrennt. Die Kanäle wurden mit einem Deckfilm (ScotchPak Nr. 6, 3M Company) versiegelt, wobei eine Zweiwalzenlaminierstation verwendet wurde, die auf 149°C (300°F) erhitzt war.
Durchlauf 1b: Substratprofilbestimmung.
Es wurde ein handelsübliches ID-Set (BBL Enterotube II, Becton Dickenson Co.) mit den 12, in Tabelle 1 angegebenen Tests als Vergleich zum Mikrokanalgerät verwendet. Das Hydrogel aus jeder Kammer des ID-Sets wurde mit einem Spachtel entfernt und in eine Teströhre gegeben. Das Hydrogel wurde geschmolzen, indem die Röhren. in einen vorgeheizten Block mit etwa 88°C (190°F) gegeben wurden. Das geschmolzene Gel wurde mit einer Transferpipette aus der Teströhre entnommen. Die Spitze der Pipette wurde in die Öffnung eines Mikrokanals gesetzt, der aus einem geprägten Film und einer Abdeckung wie oben beschrieben bestand. Das Gel wurde in den Kanal abgegeben und es wurde ihm gestattet abzukühlen. Diese Prozedur wurde wiederholt, um die benachbarten Mikrokanäle zu füllen. Nachdem alle 12 Kanäle gefüllt wurden, wurde der Film senkrecht zur Richtung der Kanäle in 2,54 cm (1 Inch) breite Streifen geschnitten.
Mit einem Prompt-Beimpfungssystem (Baxter Healthcare Corporation, Microscan Division, W. Sacramento, CA) wurde nach den Anweisungen des Herstellers eine Suspension von Escherichia coli ATCC 51813 hergestellt. Die endgültige Bakterienkonzentration betrug 10⁵ pro Milliliter. Etwa 10 Milliliter der Bakteriensuspension wurden in ein steriles Becken (Labcor Products, Frederick MD) gegossen. Ein Rand des Mikrokanalgeräts wurde in die Lösung getaucht, wobei das Gel am Ende jedes Kanals berührt wurde. Eine Kontrolle wurde ebenfalls auf diese Weise unter Verwendung eines sterilen Puffers beimpft. Der Versuch und die Kontrolle wurden flach in eine angefeuchtete Petrischale gelegt und 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Enterotube II wurde entsprechend den Herstelleranweisungen beimpft und inkubiert.

Das Substratprofil, wie es durch das Mikrokanalgerät bestimmt wurde, wurde durch Farbänderungen in jedem Kanal in Bezug auf das Kontrollgerät bestimmt. Dies wurde mit dem handelsüblichen Set verglichen, wobei die erzielten Ergebnisse in Tabelle 1 unten („+” bezeichnet eine Farbänderung) enthalten sind. Das Substratprofil, das mit dem Mikrokanalgerät bestimmt wurde, stimmte mit dem Profil der Enterotube II überein.

	Tabelle 1
Test	Microkanalgerät	Enterotube II
Glukose	+	+
Lysin	+	+
Ornithin	+	+
H2S/Indole	nicht bestimmt (NB)	(NB)
Adonitol	–	–
Lactose	+	+
Arabinose	+	+
Sorbitol	+	+
Vogues-Proskauer	NB	NB
Dulcitol/PA	+	+
Harnstoff	+	+
Zitrat	–	–

Beispiel 2
Minimale Hemm-Konzentration (MIC)
Durchlauf 2a: Herstellung von Mikrokanalfilmen.
Polyethylen-Mikrokanalfilme wurden auf einer hydraulischen Presse heißgeprägt, gemäß dem Verfahren, das in der US-Patentanmeldung Seriennr. 08/905,481 beschrieben ist. Die für dieses Experiment verwendeten Kanäle wiesen einen rechteckigen Querschnitt von etwa 0,087 mm (0,022 Inch) Tiefe mal etwa 1,96 mm (0,077 Inch) Breite auf. Die Kanäle wurden mit ScotchPak Nr. 33 (3M Company) mit Hilfe eines Bügeleisens bedeckt, das auf 149°C (300°F) erhitzt war, wobei eine Reihe von Kapillarkanälen gebildet wurde.
Durchlauf 2b: MIC-Test mit Mikrokanälen
Es wurde eine Verdünnungsreihe von Tetracyclin in VRB-Medien (7,0 g Bactopepton; 3,0 g Hefeextrakt; 1,5 g Gallensalze pro Liter) hergestellt, die den fluoreszierenden Indikator Methylumbelliferylglucuronid (MUG, 0,5 mg/ml) enthielt. Es wurden folgende Tetracyclin-Konzentrationen hergestellt: 40; 4; 0,4; 0,04 und 0,004 Mikrogramm/ml. Etwa 1 ml jeder Lösung wurde in eine Teströhre gegeben. Jeder Röhre wurde eine Suspension von Escherichia coli ATCC 51813 (100 Mikroliter mit etwa 10 Bakterien/ml) zugesetzt. Es wurde eine Kanüle verwendet, um jede Lösung in benachbarte Mikrokanäle zu übertragen (1,6 Mikroliter/Kanal). Sowohl die Kontrollröhren als auch das Mikrokanalgerät wurden 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben unter ultravioletter Strahlung beobachtet. Es wurde Floureszenz sowohl in den Kontrollröhren als auch in den Mikrokanälen in den Lösungen beobachtet, die 0,4; 0,04; 0,004 Mikrogramm/ml Tetracyclin enthielten. Es wurde keine Floureszenz in den Proben mit 40 und 4 Mikrogramm/ml beobachtet, was anzeigt, dass die minimale Hemm-Konzentration in diesem Beispiel 4 Mikrogramm/ml betrug.
Beispiel 3
Gelfelder aus Mikrokanalfilmbahnen
Durchlauf 3a: Herstellung des Mikrokanalfilms
Mikrokanalfilm wurde gemäß dem Verfahren von Johnston ( US-Patentschrift 5,514,120 ) extrusionsgeprägt. Für die unten angegebenen Beispiele wurden zwei Prägewerkzeuge verwendet. Werkzeug 1 produzierte einen Mikrokanalfilm mit einem „V-Kanal"-Querschnittsprofil. Die Mikrokanäle wiesen einen dreieckigen Querschnitt mit einer Basis von etwa 0,3 mm und einer Höhe von etwa 0,35 mm auf. Werkzeug 2 produzierte Mikrokanäle mit einem quadratischen Querschnitt von etwa 0,2 mm mal 0,2 mm. Außerdem bildeten die Mikrokanäle von Werkzeug 2 eine Gruppe von 4 kleineren „verschachtelten" Kanälen (~50 × 50 Mikron) an der Basis jedes Mikrokanals.
Durchlauf 3b: Herstellung eines kubischen Feldes, das isolierte Gelzonen mit offenen Enden enthält
Dieser Durchlauf dient dazu, ein „leeres" Feld zu zeigen, das isolierte Gele mit offenen Enden enthält, wobei jedes Gelelement gleich ist. Ein Oligonukleotid-Feld aus einem solchen Gerät aufzubauen, würde die Verwendung eines reaktiven Gels und optional ein Zuleitungsgerät wie etwa einen Mikropipettierroboter erfordern, um modifizierte Oligonukleotide auf jedes einzelne Feldelement aufzutragen.
Es wurde ein Polyethylen-Mikrokanalfilm, der Triton X 35 (0,5 Gew.%) enthielt, mit dem Werkzeug 2 gemäß dem Verfahren von Johnston extrusionsgeprägt. Ein Abschnitt eines doppelseitigen Klebebandes (3M, Nr. 34-7035-9513-1) wurde an den Rückseiten von Filmabschnitten (1,3 cm × 6 cm) befestigt, wobei die Mikrokanäle parallel zur Längsabmessung des Bandes verliefen. Die Filmabschnitte, die das Klebeband enthielten, wurden dann in der Längsrichtung „gestapelt", womit eine mehrschichtige Struktur erzeugt wurde, die ein quadratisches Feld von Kapillarkanälen enthielt. Falls gewünscht, kann der Stapel mit einer Haftmittelschicht (statt des doppelseitigen Bandes) oder mit einem anderen geeigneten Verbindungsverfahren wie etwa Wärme oder Ultraschallkleben zusammengefügt werden. Es wurde eine Lösung aus Agarose (1 Gewichts-%, BioRad) hergestellt, indem die Lösung über die Schmelztemperatur des Gels gemäß den Herstelleranweisungen hinaus erhitzt wurde. Es wurde grüne Lebensmittelfarbe zugesetzt, um einen optischen Kontrast zu schaffen. Ein offenes Ende der mehrschichtigen Kapillarstruktur wurde in die Lösung gegeben, die durch Kapillarwirkung in die Kanäle gesaugt wurde. Die mehrschichtige Struktur wurde aus der Lösung entfernt und abgekühlt, wodurch das Gel verfestigt wurde.
Es wurde ein Feld aus isolierten Gelen mit offenen Enden hergestellt, indem mit einer Rasierklinge ein dünner Abschnitt (~ 1 mm) vom Ende der mehrschichtigen Struktur abgeschnitten wurde. Das Feld enthält etwa 1.100 isolierte Gelzonen mit offenen Enden pro Quadratzentimeter.
Durchlauf 3c: Spiralfeld mit isolierten Gelzonen mit offenen Enden.
Dieser Durchlauf beschreibt eine alternative Technik zum Bilden eines Feldes von Gelzonen mit offenen Enden. Es wurde ein Streifen Mikrokanalfilm mit einem Haftmittel an der Rückseite (z.B. ein doppelseitiges Klebeband) wie oben beschrieben hergestellt, wobei die Mikrokanäle senkrecht zur Längsrichtung des Trägers verliefen. Der Film wurde um einen Plastikstab (2 mm Durchmesser) gewickelt, bis ein Durchmesser von 7 mm erreicht war, womit eine Spiralstruktur von Gelzonen erzeugt wurde. Der aufgewickelte Film wurde in einen Abschnitt einer Wärmeschrumpfröhre gegeben, und die Anordnung wurde 15 Sekunden lang mit einer Wärmepistole erhitzt. Ein Ende des aufgewickelten Films wurde in geschmolzenen Agar (wie oben beschrieben zubereitet) getaucht, wodurch der Agar in die Mikrokanäle gesaugt wurde. Der Anordnung wurde dann gestattet abzukühlen, womit das Gel in den Kanälen verfestigt wurde. Es wurde eine Scheibe mit Kanälen vom Ende der Anordnung abgeschnitten.
Die Form des Spiralfeldes bietet mehrere potentielle Vorteile: Der Hybridisierungsnachweis mit dieser Art von Struktur kann mit einem optischen CD-Scansystem durchgeführt werden. Auch passt das in diesem Beispiel beschriebene runde Feld in den Boden der Kalotten in einer Mikrotiterplatte mit 96 Kalotten. Dies ermöglicht etwa 500 Feldelemente pro Kalotte.
Durchlauf 3d: Herstellung eines Gelfeldes, das abwechselnde Gelzonen enthält.
Die vorhergehenden Durchläufe dienten dazu, das Konzept von Feldern mit einer „leeren" Gruppe von Gelzonen zu demonstrieren. Oligonukleotidfelder würden aufgebaut werden, indem jedem Feldelement modifizierte Oligonukleotide zugesetzt würden, beispielsweise mittels Mikropipettierung oder Tintenstrahldruck. Zu Herstellungszwecken kann es vorteilhaft sein, diesen zweiten Schritt zu beseitigen, indem einzelne Mikrokanäle mit Gel -immobilisierten Oligonukleotiden gefüllt werden. Ein geeignetes Verfahren zum gleichzeitigen Füllen benachbarter Mikrokanäle verwendet einen Nadelmehrfachverteiler. Siehe 3. Bahnen, die auf diese Weise hergestellt sind, können gestapelt und in Felder wie oben beschrieben geschnitten werden, was die Notwenigkeit beseitigt, Oligonukleotide in einem zweiten Mikrospenderschritt zuzusetzen.
Ein Mehrfachverteiler mit einer Reihe von Kanülennadeln, die an den Mikrokanälen eines Mikrokanalfilms ausgerichtet sind, wurde wie folgt hergestellt. Ein Abschnitt Mikrokanalfilm aus Durchlauf 3a wurde in einen Streifen von etwa 7,6 cm (3 Inch) Länge geschnitten. Zwölf 15-cm-Kanülennadeln (6 Inch lang, Größe 22, Fisher Scientific) wurden in benachbarte Kanäle gesetzt, wobei die Spitzen etwa 1/27 cm (1/2 Inch) über das Ende des Films überstanden. Eine Schicht Epoxidleim (5-Minuten-Epoxid, 3M Company) wurde auf die Anordnung gegeben und ihr gestattet, auszuhärten. Zwölf wässrige Lösungen mit 0,25% Guar wurden hergestellt. Die folgenden Farben wurden den Lösungen mit Lebensmittelfarbe zugesetzt: Hellrot, Gelb, Braun, Dunkelblau, Dunkelgrün, Dunkelorange, Klar, Purpurrot, Hellorange, Hellgrün, Hellblau und Dunkelrot. Die Lösungen wurden in 20-CC-Kanülen gegeben und danach in eine Kanülenpumpe mit 12 Stationen geladen (Harvard Apparatus, South Natick, MA). Die Kanülen wurden über Teflonröhren (3 mm Außendurchmesser, Voltrex, SPC Technology, Chicago, IL) mit dem Mehrfachverteiler verbunden.
Ein Abschnitt von Mikrokanalfilm aus Durchlauf 3a wurde in einen Abschnitt mit etwa 61 cm (2 Fuß) Länge geschnitten. Der Lösungsmehrfachverteiler wurde an einem Ende des Films angeordnet, wobei die Nadeln auf dem Boden der Mikrokanäle ruhten. Der Nadelmehrfachverteiler wurde in der Position gehalten, während der Film darunter manuell gezogen wurde. Währender der Film gezogen wurde, wurden die Kanülenkolben mit einer ausreichenden Geschwindigkeit nach unten gedrückt, um die Mikrokanäle ohne Fluid-zu-Fluid-Verbindung über die „ebene" Fläche zu füllen. Der beschichtete Film wurde bei 37°C getrocknet und danach mit einer Abdeckung (ScotchPak Nr. 6) beklebt wie in Beispiel 2 beschrieben.
Beispiel 4.
In diesem Beispiel zeigen wir, wie die Kapillarstruktur als ein Test mit Antikörpersondenbefestigung für Bovinserumalbumin verwendet werden kann.
Durchlauf 4a: Herstellung hydrophober Polypropylen-/Polyethylen-Copolymerfilme
Ein Filmmuster wurde durch Heißprägen von Polypropylen gemäß Beispiel 3a in einem. Werkzeug hergestellt, das einen V-förmigen Kanal mit den folgenden Maßen mikroreplizierte: 750 μm (Mikron) tiefer Kanal, 40-Grad-Kerbe.
Durchlauf 4b: Azlacton-Beschichtung von hydrophoben Polyethylen-/Polypropylen-Mikrostrukturen
Die Filmmuster wurden dann mit einer 2%igen Lösung der in der US-Patentschrift 5,602,202 beschriebenen Grundierung, die mit Cyclohexan verdünnt war, beschichtet. Die Beschichtung erfolgte durch Tauchen des Films in die Grundierungslösung und durch das anschlißende 10-minütige Trocknen des Films bei 80°C. Danach wurde der Film in eine 2%ige Lösung von Methylmethacrylat:Vinyldimethylazlacton (70:30) in Methylethylketon getaucht and dann mindestens 30 Minuten an der Luft getrocknet.
Durchlauf 4c: Herstellung von Kapillaren zum Antikörperauffangen, die für Bovinserumalbumin spezifisch sind.
Die wie oben beschrieben hergestellten Filme wurden mit einem Antikörper gegen Bovinserumalbumin derivatisiert. Verbleibende Azlacton-Stellen wurden mit Myoglobin aus Pferdeherz neutralisiert (um die nicht-spezifische Bindung des BSA-Ziels zu verhindern). Die Kapillaren wurden dann auf das spezifische Auffangen von Biotin-BSA(b-BSA)-Konjugat getestet. Das Auffangen wurde mit einem Streptavidin-Alkaliphosphatase(S-AP)-Konjugat und 1 mM 4-Nitrophenylphosphat (4-NPP) in einem standardmäßigen Enzym-verbundenen Immunosorbent-Testformat (ELISA) visualisiert. Die enzymatische Abspaltung des 4-NPP durch die gebundene s-AP ergab eine leuchtend gelbe Farbe, die innerhalb der ersten 30 Sekunden sichtbar wurde. Kontrollkapillaren, die nur eine Azlacton-Beschichtung und einen Myoglobin-Block aufwiesen, zeigten keine Farbänderung in dem ELISA-Test. Antikörperauffangkapillaren, die keinem b-BSA ausgesetzt wurden, zeigten ebenfalls keine Farbänderung in dem ELISA-Test. Einzelheiten dieses Beispiels sind nachfolgend angegeben.
Durchlauf 4d: Reaktion mit Glycin zur Bildung von karboxylierten Kapillaren.
Mit Azlacton beschichtete Kanäle wurden mit 1 M Glycin in standardmäßigem Derivatisierungspuffer (1 M Na2SO4, 50 mM EPPS, pH-Wert 8,0) verreagiert, um eine karboxylierte Oberfläche zu ergeben. Es wurde Erhitzung mit Mikrowellen benutzt, um die Reaktion zu beschleunigen. Die Proben wurden in eine Mulde gegeben, die neutral roten pH-Wert 8,0 oder Methylen-Blau in H₂O/MeOH enthielten. Für beide Indikatorlösungen zeigte der mit Glycin derivatisierte Kanal ein Aufsaugen der gesamten Länge der Probe (5 cm), während Proben, die Azlacton/Grundierung oder nur die Grundierung enthielten, kein nennenswertes Kapillarverhalten zeigten. Ähnliches Verhalten wurde beobachtet, wenn die Derivatisierungslösung nur 1 mM Glycin enthielt.
Durchlauf 4e:
Eine Variante dieses Versuchs bestand darin, Kanäle auf einem einzigen Substrat abwechselnd selektiv mit Antikörpern zu derivatisieren und zu zeigen, dass nur die abwechselnden Kanäle ein positives kolorimetrisches ELISA-Ergebnis ergeben. Dies verweist auf die Möglichkeit, Felder von Sondenauffangkapillaren (Antikörper- oder DNA-Ziele) herzustellen, in denen benachbarte Kapillaren für verschiedene Analyten spezifisch sind.
Durchlauf 4f:
In einer anderen Variante wurde ein Ende des Kapillarfeldes mit Glycin beschichtet, das andere Ende mit Antikörper, beide Enden wurden mit Myoglobin gesperrt. In diesem Falle wurde eine Probe durch den Glycinbereich zum Auffangbereich der Antikörpersonde gesogen, wo der ELISA-Test eine kolorimetrische Reaktion ergab.
Durchlauf 4g:
In einer weiteren Variante wurde jedes der beiden Enden des Kapillarfeldes mit Antikörpern beschichtet, die Mitte wurde mit Glycin beschichtet, und der gesamte Chip wurde mit Myoglobin gesperrt. Das erste Ende wurde dann mit b-BSA und s-AP behandelt und gewaschen. Dieses Ende wurde dann einer BSA-Lösung ausgesetzt, die in die Kanäle aufgesaugt wurde. Dies löste einen Teil des b-BSA:s-AP-Konjugats von dem ersten Ende und wurde am zweiten Ende wieder aufgefangen, wie der ELISA-Test ergab. In einem Kontrollversuch war der Puffer nicht annähernd so wirksam bei dem Lösen des Konjugats. Dieser Versuch zeigt die Möglichkeit auf, einen Reporter aus einem Antikörperauffangfeld zu lösen und ihn an einem nachgeordneten Punkt in einem konkurrierenden Lösetest wieder aufzufangen.
Durchlauf 4h:
Es wurde entdeckt, dass man die Aufsauggeschwindigkeit in V-Kanälen steuern kann, indem das Verhältnis von Glycin zu Myoglobin in dem Block variiert wird. Dies kann bei der Steuerung der Materialmenge, die in verschiedene Bereiche eines Gegenstandes aufgesaugt werden, von Wert sein. Diese Oberflächenwirkung kann auch mit der Steuerung der Kanalmerkmale kombiniert werden.
Derivatisierungsbedingungen:
1mg/mL Anti-BSA in Derivitisierungspuffer (1M Natriumsulfat/50 mM EPPS-Puffer, pH-Wert 8,0); von 30 Minuten bis über Nacht reagieren lassen; in Sperrpuffer (50 mM EPPS/Saline-Puffer, pH-Wert 8,0) waschen.
Sperrbedingungen:
5mg/ml Pferdeherz-Myoglobin in Sperrpuffer; von 30 Minuten bis über Nacht reagieren lassen; mit Sperrpuffer waschen.
ELISA-Bedingungen:
100 μg/mL Biotin-LC-BSA in AP-Puffer (25 mM BTP pH-Wert 8,5; 2 mM Mg++; 0,4 mM Zn++); 30 Minuten reagieren lassen; mit AP-Puffer waschen; 2,5 μg/mL Streptavidin-LC-BSA in AP-Puffer; 30 Minuten reagieren lassen; mit AP-Puffer waschen; 1 mM 4-NPP in Substratpuffer (1M Diethanolamin-Puffer/0,5 mM MgCl2 in Puffer mit pH-Wert 9,0); Reaktion visuell beobachtet. Vorkonjugierung von Biotin-LC-BSA und Streptavidin-LC-BSA beschleunigt den Test.
Beispiel 5.
Biologischer Indikatorchip zur Gewährleistung der Sterilisierung

Mit Azlacton beschichtete Polyethylen-/Polypropylen-V- Kanäle, die wie oben hergestellt wurden, wurden mit Hilfe der oben umrissenen Verfahren mit Anti-Kaninchen-IgG-Alkaliphosphatase- Konjugat derivatisiert, mit Myoglobin gesperrt und gewaschen. Dieser Versuch zeigt die Enzymaktivität, um effektive Sterilisierung anzuzeigen. Das IgG-Konjugat ist für das Ergebnis nicht wichtig, war aber ein zweckmäßiges Reagens. Proben wurden in leere Röhren mit und ohne Filter und mit oder ohne Sorbitalvorbehandlung der Kanäle eingesetzt. Diese wurden dann kurzen Sterilisierungszyklen unterzogen, gefolgt vom Aufsaugen von 4-NPP in Substratpuffer. Die Ergebnisse waren wie folgt:

		Tabella 5 a
Durchlauf Nr.	Sterilisationszyklus	Filter	Sorbitol	Resultat
1	5 min @ 250 F	–	–	keine Aktivität
2	5 min @ 250 F	+	–	keine Aktivität
3	5 min @ 250 F	+	+	keine Aktivität
4	2 min @ 250 F	+	–	keine Aktivität
5	2 min @ 250 F	+	+	keine Aktivität
6	48 h @ RT	+	–	leuchtend gelb
7	48 h @ RT	–	+	leuchtend gelb

Diese Resultate zeigen an, dass die Enzymaktivität an den Kapillaren stabil ist, jedoch durch den Sterilisierungsvorgang, wie für einen angenommenen BI-Indikator gewünscht, zerstört wird. In einem Produkt kann es erwünscht sein, ein robusteres Enzym als b-D-Glucosidase oder einen Träger für ein solches Enzym wie etwa Bacillus stearothermophilus zu verwenden, die beide mit Hilfe der oben beschriebenen Azlacton-Chemie kovalent an den Kapillaren verankert werden können.
Beispiel 6.
Mikrokanalgeräte mit Bereichen aus linearem Feststoffträger
Dieses Beispiel dient dazu, ein Gerät darzustellen, in dem ein linearer Feststoffträger mit großem Flächeninhalt, der mit einem immobilisierten biologischen Wirkstoff derivatisiert ist, in einen Mikrokanal integriert ist. Der lineare Feststoffträger stellt ein effektives Mittel zum Festsetzen eines Bindungsstoffes in einem bestimmten Bereich des Mikrokanals bereit. Außerdem schafft der Träger aufgrund seines großen Flächeninhalts ein verstärktes Signal. Schließlich wird eine verbesserte Vermischung erreicht, wenn Fluid durch den Bereich läuft, der den linearen Träger enthält.
In den unten angeführten Durchläufen ist der lineare Feststoffträger ein gewebter Faden, der mit einem reaktiven Copolmer beschichtet ist. Das Copolmer enthält eine reaktive Moietät, die an nukleophile Gruppen an Biomolekülen, beispielsweise Lysinreste eines Proteins mit Amin-Funktionalität, bindet. Der beschichtete Faden wird für eine Zeit, die für das Eintreten von Bindungen ausreicht, in einer Lösung getränkt, die den biologischen Wirkstoff enthält. Nach der Bindung wird der modifizierte Faden in einen Mikrokanal eingesetzt. Dann wird eine Abdeckung hinzugefügt, wodurch eine geschlossene Kapillarstruktur erzeugt wird.
Durchlauf 6a: Herstellung eines linearen Feststoffträgers mit immobilisiertem Enzym
Schwarzer Viskosefaden (etwa 120 Mikron Außendurchmesser, Coats and Clark, Inc.) wurde in Abschnitte von etwa 1 cm Länge geschnitten. Die Abschnitte wurden in einer Lösung aus Azlacton/Dimethylarylamin-Copolymer (30/70 Gew./Gew., 5% Feststoffe in Isopropanol/Methylethylketon-Lösemittel [20:1]) getränkt, der mittels typischer Lösungspolymerisation hergestellt wurde, welche auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, wie es in der US-Patentschrift 4,304,705 beschrieben ist, die per Verweis vollständig Bestandteil des Vorliegenden ist. Der Lösung wurde Ethylendiamin bis zu einer Konzentration zugesetzt, die ausreicht, um 5 % der Azlacton-Moietäten in dem Copolymer zu vernetzen. Nach einer Stunde wurden die Fäden entfernt und in eine Zentrifugenröhre gegeben. Die Fäden wurden mit destilliertem Wasser (3 mal unter Ultraschall), Natriumphosphatpuffer (3 mal, 50-millimolar, pH-Wert 10) und destilliertem Wasser (3 mal) gespült.
Das Enzym wurde an den Polymer-beschichteten Fäden nach dem Verfahren immobilisiert, das in Immobilized Affinity Ligand Techniques, Seite 95 (Academic Press, Inc., G. Hermanson, A. Mallia, P. Smith, Hrsg., 1992) beschrieben ist. Der Polymer-beschichtete Faden wurde in einer Lösung aus Natriumphosphatpuffer (25 mM; 0,15-molares Natriumchlorid; 0,1 % Triton X-100; pH-Wert 7,4) getränkt, die das Enzym Beta-Glucuronidase (100 mg/ml) enthielt. Nach 20 Minuten wurden die Fäden, die immobilisiertes Enzym enthielten, entnommen und entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren gespült.
Durchlauf 6b: Demonstration von Enzymaktivität an beschichteten Fäden
Der folgende Durchlauf zeigt, dass das Enzym Beta-Glucuronidase kovalent an dem beschichteten Faden befestigt ist und dass die enzymatische Aktivität nach der Immobilisierung beibehalten wird.
Vier Mikrozentrifugenröhren wurden wie folgt hergestellt. Röhre „A" enthielt die oben beschriebene Beta-Glucuronidase-Enzymlösung (etwa 20 Mikroliter). Röhre „B" enthielt einen Fadenabschnitt mit gebundener Beta-Glucuronidase. Röhre „C" enthielt einen Fadenabschnitt, der vor dem Schritt der Enzymimmobilisierung mit Ethanolamin (50 mM in Waser) behandelt wurde. Dieser „abgeschreckte" Faden wurde dann gemäß dem oben beschriebenen Verfahren mit dem Beta-Glucuronidase-Enzym behandelt. Röhre „D" war leer.

Jeder Röhre wurde 1 Milliliter einer Lösung zugesetzt, die das fluorogene Enzymsubstrat Methylumberiferyllbeta-D-Glucuronide enthielt (50mg/ml; 50 mM Natriumphosphatpuffer; pH-Wert 8,5). Die Röhren wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann unter ultraviolettem Licht (365 Nanometer) auf das Vorliegen von fluoreszierendem Produkt beobachtet. Die Tabelle unten fasst diese Resultate zusammen.

Tabelle 6a
Probe	Erzeugung von fluoreszierendem Produkt
Röhre „A"-Enzymlösung	+
Röhre „B"-an Faden gebundenes Enzym	+
Röhre "C"-abgeschreckter, mit Enzym behandelter Faden	–
Röhre "D"-Substrat ohne Enzym	–

Durchlauf 6c: Mikrokanalgerät mit integriertem linearen Feststoffträger
Dieser Durchlauf dient dazu zu zeigen, dass lineare Feststoffträger, die einen immobilisierten biologischen Wirkstoff enthalten, in Kanäle in einem Mikrokanalgerät integriert werden können.
Ein Abschnitt des Films, der allgemein gemäß Durchlauf 3a hergestellt wurde und parallele Mikrokanäle enthielt, wurde auf etwa 3 cm Länge und 1 cm Breite zugeschnitten. Die Mikrokanäle besaßen einen dreieckigen Querschnitt von etwa 300 Mikron Basis mit einer Höhe von etwa 200 Mikron. Ein Faden (1 cm Länge), der wie oben beschrieben mit Enzym behandelt war, wurde im mittleren Bereich eines Mikrokanals angeordnet. In einem benachbarten Mikrokanal wurde der „abgeschreckte" Faden (Röhre „C" oben) angeordnet. Ein mit Wärme versiegelbarer Abdeckfilm (ScotchPak-Film, 3M Company) wurde 5 Sekunden lang mit einem erhitzten Bügeleisen (193°C) auf die Oberseite des Mikrokanalfilms laminiert, wodurch parallele „Röhren" erzeugt wurden, die Fadenabschnitte enthielten. Ein Rand des Geräts wurde in eine Lösung des fluorogenen Enzymsubstrats Methylumberiferyll-beta-D-Glucuronid (50mg/ml; 50 mM Natriumphosphatpuffer; pH-Wert 8,5) getaucht, was bewirkte, dass sich die Kanäle durch Kapillarwirkung füllten. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde unter ultraviolettem Licht in dem Kanal, der den Faden mit immobilisiertem Enzym enthielt, erhebliche Fluoreszenz beobachtet. In dem Kanal, der den „abgeschreckten" Faden enthielt, wurde keine Fluoreszenz beobachtet.
Ein Fachmann wüsste einzuschätzen, dass eine Vielzahl reaktiver Beschichtungen auf dem linearen Träger verwendet werden kann, die die Bindung biologischer Wirkstoffe erleichtern. Während der in diesem Beispiel beschriebene biologische Wirkstoff ein Enzym ist, kann eine Vielzahl biologischer Wirkstoffe verwendet werden, beispielsweise ein Antikörper, ein Antigen, eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid oder ein Kohlenhydrat. Das vorliegend beschriebene Beispiel kann auch dahingehend erweitert werden, dass es mehrere Abschnitte aus linearem Träger umfasst, die in einem einzigen Kanal aneinander gereiht sind. Auf diese Weise kann ein Feld von Bindungsstellen erzeugt werden, wobei mehrere Kanäle mehrere Bereiche von Bindungszonen enthalten.
Beispiel 7.
Fluidsteuerungsfilm mit hoher Lichtleitung
In diesem Beispiel der vorliegenden Erfindung wird dargestellt, wie die Neigung der Kanalwinkel die Lichtleitung durch eine mikrostrukturierte Filmschicht zur Fluidsteuerung verbessert werden kann.
Durchlauf 7a:
Fluidsteuerungsfilme, die zum Aufsaugen von Blut und Wundabsonderungen konstruiert sind, wurden mit V-förmigen Kanälen, die in Polyolefin- und Polycarbonat-Materialien gebildet wurden, mit eingeschlossenen Winkeln von 99 Grad hergestellt. Die Filme, die keine hydrophile Oberfläche aufwiesen, wie etwa die Polycarbonate, wurden mit dem Tensid Triton^TM X35 und Wasser besprüht, um sie zu funktionstüchtigen Fluidtransportfilmen zu machen. Die Kanäle waren um 19,5 Grad geneigt.
Eine ähnlich geformte Filmschicht zur Fluidsteuerung mit nicht geneigten, eingeschlossenen Winkeln von 90 Grad zeigt wegen der Retroreflektion von Licht ein silbriges Aussehen, wenn sie aus der Senkrechten oder frontal betrachtet wird. Durch Neigen des Winkels der Kanäle in dem vorliegenden Beispiel wurde die Transparenz des Films erheblich verbessert. Es wurden verschiedene Kanaltiefen von 4 Mikrometern, 8 Mikrometern, 16 Mikrometern und 24 Mikrometern bewertet und alle zeigten eine sichtbare Verbesserung der Lichtleitung.
Durchlauf 7b:
In einer anderen Variante können Fluidsteuerungsfilme mit V-förmigen Kanälen mit eingeschlossenen Winkeln von 99 Grad auf einer Hauptfläche hergestellt werden, die eine spezifische Kanaltiefe von 24 Mikrometern und einen Kanalabstand von 56,2 Mikrometern aufweisen. (Siehe 10a für eine repräsentative Darstellung). Wie in Tabelle 7a dargestellt, können bei einer Anzahl von Fluidsteuerungsfilmen deren Kanäle mit sich vergrößernden Winkeln von 0 bis 45 Grad geneigt werden, während die Kanaltiefe und der Kanalabstand konstant gehalten wird. In dem Maße, wie sich der Neigungswinkel vergrößert, verkleinert sich der eingeschlossene Winkel solcherart, dass bei einem Neigungswinkel von 45 Grad der eingeschlossene Winkel nur 74,96 Grad beträgt. TABELLE 7a

Neig.-winkel (Grad) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Eingeschl. Winkel (Grad) 99,0 0 98,8 2 98,2 6 97,2 8 95,8 1 93,7 5 90,9 2 87,0 8 81,9 0 74,9 6
In ähnlicher Weise kann eine Serie von Fluidsteuerungsfilmen gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, die geneigte Kanäle auf beiden Hauptflächen der Filmschichten aufweisen. Nunmehr mit Bezug auf 17a können in einer Serie von Filmen die Winkel der Kanäle in entgegengesetzte Richtungen geneigt sein. Mit Bezug auf 17b können in einer weiteren Serie von Filmen die Winkel der Kanäle in die gleiche Richtung geneigt sein.
Die daraus resultierenden Serien von Fluidsteuerungsfilmen können dann aus 0 Grad (oder aus der Senkrechten) und aus +90 Grad bis –90 Grad betrachtet werden. Der Prozentsatz des geleiteten Lichts wird dann für jeden geneigten Winkel an jeder der drei Arten von Filmen aufgezeichnet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in 18a–c dargestellt. Wie ersichtlich ist, leitet ein nicht geneigter einseitiger Film mit 99 Grad Licht zu etwa 63 Prozent. Dieser Prozentsatz erhöht sich auf 85 Prozent bei einem Neigungswinkel von 45 Grad. Ein nicht geneigter doppelseitiger Film mit 99 Grad leitet Licht zu etwa 80 Prozent. Dieser Prozentsatz erhöht sich bei einem Neigungswinkel von 45 Grad auf 90 Prozent bei Neigung in entgegengesetzte Richtungen. In einer dritten Variante fällt ein nicht geneigter doppelseitiger Film mit 99 Grad bei Neigung in die gleiche Richtung von anfänglichen 80 Prozent auf etwa 65 Prozent. Diese unterschiedlichen Ergebnisse demonstrieren die veränderliche Beschaffenheit der wahrgenommenen Lichtleitung auf der Grundlage des Betrachtungspunktes und des Winkels.
Beispiel 8
SiO2-Beschichtung zwecks erhöhter Hydrophilie
In diesem Beispiel ist dargestellt, wie eine Beschichtung mit SiO2 die hydrophile Beschaffenheit des Fluidsteuerungsfilms erhöht.
Es wurden Fluidsteuerungsfilme mit V-Kerben und verschachtelten Kanälen hergestellt, indem ein Poly(methylmethacrylat)-Film (DRG-100, Rohm and Haas) in einer Presse mit einem Nickel-Formwerkzeug umgeformt wurde. Der Film und das Formwerkzeug wurden 15 Sekunden lang bei einer Temperatur von 199°C und einem Druck von 3,5 × 10⁶ Pascal miteinander in Kontakt gebracht, wonach der Druck in einem Zeitraum von 10 Minuten auf 6,2 × 10⁶ Pascal gesteigert wurde. Danach wurde die Temperatur 15 Sekunden lang auf 74°C erhöht, während der Druck bei 6,2 × 10⁶ Pascal gehalten wurde.
Das Polymersubstrat wurde dann in einzelne Segmente (3 × 3 Inch) geteilt, die als Chips bezeichnet werden. Abschnitte jedes Chips wurden mit einer Maske aus Magic Mending^TM Tape (3M Company) beklebt, um ein Ende des Kanalbereichs abzudecken. Die Chips wurden auf die Plattform einer Mark-50-Elektronenstrahl-Wärmeverdampfungskammer gelegt. In der Mark 50 wurden etwa 800 bis 1000 Angström SiO₂ auf der mikrostrukturierten Fläche des Chips abgeschieden. Nachdem die Chips der Mark 50 entnommen wurden, wurden die Masken entfernt.
Die mikrostrukturierten Flächen der Chips wurden auf der Oberseite poliert und mit Paketband 3M Nr. 355 (3M Company) beklebt, das mit einem Walzenabroller aufgetragen wurde, um Kapillarfelder mit einem mit SiO2 beschichteten Ende zu erzeugen (da das andere Ende gegen die Behandlung maskiert wurde). Die mit SiO2 behandelten Enden der Chips wurden in einen Natriumphosphatpuffer mit pH-Wert 7,5 getaucht. Der Puffer wurde sofort durch die Kanäle hinauf zum Rand des maskierten Bereichs gesaugt. Das andere Ende der Kanäle saugte keine Probe auf. Ein Kontrollchip, der auf die gleiche Weise, jedoch ohne die SiO2-Beschichtung hergestellt wurde, saugte unter den gleichen Bedingungen ebenfalls kein Fluid in die Kanäle. Diese Ergebnisse bestätigen einen geringen Berührungswinkel in dem mit SiO2 behandelten Abschnitt des Chips. Sie bestätigten auch, dass das SiO2 erfolgreich in die Kanäle mit hohem Seitenverhältnis überging, die der Beschichtung unterzogen wurden.
Dem Fachmann werden sich verschiedene Modifizierungen und Änderungen der vorliegenden Erfindung erschließen, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Obschon die vorliegende Erfindung in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, wird der Fachmann erkennen, dass Änderungen in der Form und in Einzelheiten vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Außerdem soll die Erfindung nicht als auf alle ihre Details beschränkt betrachtet werden, da Modifizierungen und Variationen an ihr vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Mikrofluidischer Gegenstand mit verbesserter optischer Durchlässigkeit, der mindestens eine mindestens teilweise optisch durchlässige Filmschicht zur Fluidsteuerung zum Transportieren eines Fluids aufweist, die mindestens eine mikrostrukturierte Hauptfläche aufweist, welche mehrere Mikrokanäle mit nicht parallelen Seitenwänden aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokanal-Seitenwände in Bezug zueinander einen eingeschlossenen Winkel zwischen den Seitenwänden definieren, wobei dieser Winkel eine Mittellinie aufweist und die Mittellinie des eingeschlossenen Winkels und eine zu der mikrostrukturierten Hauptfläche normale Linie einen Neigungswinkel bilden.
Mikrofluidischer Gegenstand nach Anspruch 1, wobei mindestens ein Abschnitt der Mikrokanäle in der Form ähnlich ist und mindestens ein eingeschlossener Winkel in dem Abschnitt geneigt ist.
Mikrofluidischer Gegenstand nach Anspruch 2, wobei alle Mikrokanäle in der Form ähnlich sind und im Wesentlichen den gleichen eingeschlossenen Winkel aufweisen und der eingeschlossene Winkel geneigt ist.
Mikrofluidischer Gegenstand nach Anspruch 1, wobei eine erste und eine zweite Hauptfläche der Filmschicht zur Fluidsteuerung mit mehreren Mikrokanälen, welche nicht parallele Seitenwände aufweisen, mikrostrukturiert sind, wobei die Mikrokanal-Seitenwände an jeder der Hauptflächen in Bezug zueinander einen eingeschlossenen Winkel zwischen den Seitenwänden definieren, wobei dieser Winkel eine Mittellinie aufweist, und wobei die Mittellinie des eingeschlossenen Winkels und eine zu der mikrostrukturierten Hauptfläche normale Linie einen geneigten Winkel bilden.