JP2910319B2 - 細溝型電気泳動装置 - Google Patents

細溝型電気泳動装置

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は蛍光標識したDNA等の
生物試料を電気泳動により分離検出する装置、たとえば
DNAシーケンサーもしくは遺伝子診断装置に関するも
のである。
【0002】
【従来の技術】従来、DNAの塩基配列決定は放射性元
素でDNAを標識し、ゲル電気泳動分離した後に分離パ
ターンフィルムに転写することにより行なっていた。し
かし、放射性標識を用いる煩雑さに加えて手間と時間の
かかる難点があり、蛍光標識を用いた実時間光検出を用
いた方法が用いられ始めている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】このような蛍光標識と
平板型ゲル(スラブゲル)による方法は高感度が得られ
ない難点があり、測定体積を小さくし感度を上げる工夫
がキャピラリー電気泳動を用いてなされている。しか
し、キャピラリー電気泳動を用いる方法では泳動路を1
本しか確保できないため、スループットが小さい上、D
NAシーケンシングでは末端塩基種A,C,G,および
Tの識別に発光波長の異なる蛍光体を使用する必要があ
り、励起効率の良い光源と蛍光体の組み合わせをすべて
について実現することは困難である。
【0004】本発明の目的はこの問題点を解決し、高感
度でスループットの大きなDNA等の分離検出装置を提
供するものである。
【0005】
【課題を解決するための手段】上記目的は石英あるいは
ガラス平板に多数の溝を作成し、この溝内にゲルを形成
して、キャピラリー型泳動路を構成することにより達成
される。
【0006】
【作用】石英板に堀られた多数の直線(あるいは曲線)
状溝の1つ1つがキャピラリー泳動路と同じ役割を果
す。1cm当り少なくとも10本以上の溝を堀ることがで
きるので横巾10cmの領域に100本以上の泳動路を確
保できる。溝の径を小さくすることにより、DNAバン
ドの体積を小さくできる。検出限界は背景光と目的物か
らの蛍光の大小で決定される。このため小さな体積の中
に試料を押し込めることにより微量検出が実現できる。
【0007】
【実施例】以下、本発明の一実施例を図1〜図4により
説明する。図1に示すゲル保持板となるガラス板1の片
面には巾0.2mm,深さ0.2mmの溝3が1mm間隔できざま
れ細溝付ガラス板が形成される。間隔は0.5mm あるい
はそれ以下にすることもできる。上端から25cmの所に
泳動路と直角にレーザー照射用の溝2(巾0.4mm 深さ
0.3mm)が設けられている,上端は試料注入部であ
り、各溝3の端30はすりばち状に広げられている。そ
の端面の断面は約0.5φ で、試料注入を容易に行なえ
るようにしてある。図2に示すようにこの細溝付ガラス
板1を溝のないガラスの平板4とを密着して重ね合わせ
てキャピラリー泳動路を形成する。これらの泳動路にポ
リアクリルアミドゲルを形成し図2に示したようにセッ
トする。ガラス板3と4の積層体からなる泳動板は垂直
に立てられ、その上部にはゲルが形成された各泳動路の
上端にバッファ溶液が接するよう、上部バッファ槽13
が設けられる。また泳動路の下端は、下部バッファ槽1
2のバッファ溶液に接するように設置される。DNA等
の試料をゲル上端にそれぞれ添加し、バッファ槽13と
12の間に泳動用電圧を印加して泳動分離を行なう。実
施例では、TexaoRed(励起極大波長596nm,発光極大
波長615nm)で標識したDNAを上部から泳動させ分
離した。励起光源5にはPMS(Particle Measurement
Systems)社製He−Neレーザー(発振波長594n
m,出力2.5mW)を用いた。レーザー光はミラー6に
反射させ、溝2を通るように泳動板の側面から入射さ
せ、もってすべての泳動路を均一に照射する。蛍光標識
DNA断片がレーザー照射部を通過する時蛍光を発する
が、線状照射部つまり溝2からの蛍光像は波長選別用フ
ィルター8を通過した後、レンズ9によりイメージ増幅
器11の受光面に結像され、例えばダイオードアレーか
らなる高感度ラインセンサー、あるいは例えばCCDの
ような二次元光検出器10で検出される。図3は測定中
の一時期の蛍光像の強度分布を示したもので、蛍光標識
DNA断片の通過中の泳動路部分から蛍光が見られる。
図4は試料としてλファージを制限酸素HindIIIで
切断し、切断部に蛍光標識を入れたDNA断片を泳動さ
せた例である。特定の泳動路から出る蛍光の時間変化を
示したものでDNA断片スペクトルに相当する。DNA
バンドの巾は約0.7mm で1つのバンド当り2×10
-19mole という微量のDNAを含んでいるに過ぎないが
S/N良くピークが検出されている。
【0008】上述の実施例では泳動板を垂直にして用い
たが、図5に示したような泳動板を用い水平位置で動作
させる事も可能である。この泳動板では、溝3がきざま
れた細溝付ガラス板1と密着させるもう1枚のガラス板
4´には図5(a)に示すように試料注入口とする穴1
6を各溝3に対応させて設け、容易に試料注入を行なう
事ができる利点がある。
【0009】さらに、各溝3の他方の端に近い位置に対
応する位置には、各溝に共通に泳動断片流出のための長
方形の穴15が設けられる。細溝付ガラス板1とガラス
板4´が密着され、これにより生じるキャピラリー、及
び上記の穴15,16にゲルが形成されて複数のキャピ
ラリー泳動路となる。なお、溝3は試料注入口16に対
応する位置から断片流出口15に対応する位置に渡って
設けられていれば良いが、図1に示すようにガラス板1
の一端から他端に渡って設けられていても良い。いずれ
にしても、泳動路は試料注入口から断片流出口までとな
り、試料注入口16がガラス板の端面でなくガラス板4
´の主面に並んでいるので、試料注入が容易となる。こ
のような泳動板は図5(b)に示すように水平に設置さ
れ、試料注入口16の位置,及び断片流出口15の位置
にはバッファ槽13´及び12´がそれぞれ設置され
る。試料注入口16にそれぞれ分析する試料液が注入さ
れた後、各バッファ槽をバッファ溶液で満たし、電圧印
加により電気泳動を行なって溝2にレーザー光を照射し
て断片の通過を検出する。これらの実施例においてDN
Aを多色蛍光標識し、発する蛍光をプリズム等を用いて
波長選別受光することにより、スループットの向上ある
いはDNAシーケンシングにおけるA、C,G,T,D
NA末端を発光波長の差により識別する機能を具備させ
ることもできる。
【0010】また以上の実施例では、泳動媒質としてポ
リアクリルアミドゲルを用いたが、この他にアガロース
等のゲルおよび導電性の液体などを用いてもよいことは
明白である。
【0011】以上の実施例ではゲル保持板(平板)に溝
を作ったが、細溝付平板は図6に示す実施例のように平
板に線状あるいはリボン状の突起物を固着したり、又は
平板間にガラス線、高分子線あるいはリボン17(材質
はポリエチレンテレフタレート、アクリルなど)あるい
は他の絶縁性素材あるいは高電気抵抗素材からなるワイ
ヤーあるいはリボンを挟み込み保持し、多数の泳動路3
を形成することもできる。リボンやワイヤーは各泳動路
を分離する役目を果す。図6の実施例では細溝付平板と
平板を密着して重ね合わせキャピラリー泳動路を形成す
るが、線状あるいはリボン状の突起物を2枚の平板の双
方にそれぞれ交互に固着したのち、密着して重ね合わせ
ても同様にキャピラリー泳動路を形成することができ
る。
【0012】溝がきざまれる平板3、及びこれと密着さ
せる平板4もしくは4´としては、石英ガラス,耐熱強
化ガラス等のガラス材が適切であるが、ある程度の熱伝
導性を有する絶縁物であれば使用することができる。エ
ッチング可能な感光性ガラスを使用すれば正確に多数の
溝をエッチングにより再現性良く形成することができ
る。一方、導電性を有する板材料であっても、板あるい
は板に溝をきざんだ後に表面を絶縁物質でコーティング
して用いることも可能である。例えば、表面を酸化被
膜、もしくは窒化被膜で絶縁層とした金属板をいずれか
の平板に使用すれば、電気泳動で生じる熱を排出するの
に有利となる。
【0013】DNAなどの検出には図1に示した側面入
射方式の他、励起光スキャンの方式を用いてもよい。
来の平板型ゲルを用いたDNA計測ではゲルの厚さ0.
3〜0.5mm,DNAバンドの巾2〜5mmが用いられて
いた。すなわち泳動路の断面積は小さい方でも0.6mm 2
内外であった。一方、本発明では、0.04mm 2 、更に溝
の巾を小さくすることで0.01mm 2 あるいはそれ以下の
泳動路断面積を得ることも可能である。面積を小さくし
た事で1〜2桁の微量サンプルでの測定が可能となっ
た。また作製する溝も1mmに1〜2本は作れるので従来
10cmに20〜30本しか確保できなかった泳動路数を
100本以上にすることができ、スループットの向上に
大きな効果がある。また、泳動路間隔が1mmあるいはそ
れ以下なので温度差が小さく、泳動路によりDNAの泳
動速度に差がでないのでDNAを1種の蛍光体で標識し
泳動路の差で末端DNA塩基種を識別するシーケンシン
グにも有効に活用できる。
【0014】
【発明の効果】本発明によれば、泳動路の断面積を溝に
より小さく制限することができ、DNAバンドの体積を
小さくできるので微量の試料で計測することができる。
また本発明では、溝は1mmに1〜2本、作れるので泳動
路数を100本以上にすることができ、スループットの
向上に大きな効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図1】溝付ガラス板の平面図。
【図2】測定装置の概念図。
【図3】測定された信号の一例。
【図4】特定位置における蛍光強度変化を測定したDN
A断片スペクトル。
【図5】水平型泳動漕の例。
【図6】泳動路分離リボン付泳動板の見取り図。
【符号の説明】
1…細溝付ガラス板、2…レーザ照射溝、3…泳動用細
溝、4…平板、5…レーザー、6…ミラー、7…レーザ
ー光、8…フィルター、9…レンズ、10…1次元ある
いは2次元光検出器、11…イメージ増幅器、12…下
部バッファー槽、13…上部バッファー槽、14…DN
A断片ピーク、15…DNA断片流出口、16…DNA
断片注入口、17…泳動分離リボン。

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】複数の溝が設けられた第1の板状体と、前
    記第1の板状体に密着する第2の板状体とを具備し、前
    記第1板状体と前記第2の板状体とにより形成される複
    数の直線状の泳動路を泳動した試料を、泳動開始点から
    一定の距離だけ離れた位置に設けられ、前記複数の直線
    状の泳動路と直交する直線状の領域に沿って、レーザー
    光を照射して検出することを特徴とする細溝型電気泳動
    装置。
  2. 【請求項2】複数の第1の溝と、前記複数の第1の溝と
    交叉する方向に第2の溝とが設けられた第1の板状体
    と、前記第1の板状体に密着する第2の板状体とを具備
    し、前記第1板状体と前記第2の板状体とにより形成さ
    れ泳動媒質が充填される複数の泳動路を泳動した試料
    を、前記第2の溝にレーザー光を照射して検出すること
    を特徴とする細溝型電気泳動装置。
  3. 【請求項3】複数の第1の溝と、前記複数の第1の溝と
    交叉する方向に第2の溝とが設けられた第1の板状体
    と、前記複数の第1の溝の位置に対応させて試料を注入
    する複数の注入口を有し前記第1の板状体に密着する第
    2の板状体とを具備し、前記第1板状体と前記第2の板
    状体とにより形成される複数の泳動路を泳動した前記試
    料を、前記第2の溝にレーザー光を照射して検出するこ
    とを特徴とする細溝型電気泳動装置。
  4. 【請求項4】複数の第1の溝と、前記複数の第1の溝と
    交叉する方向に第2の溝とが設けられた第1の板状体
    と、前記複数の第1の溝の位置に対応させて試料を注入
    する複数の注入口と前記試料が流出する流出口とを有し
    前記第1の板状体に密着する第2の板状体とを具備し、
    前記第1板状体と前記第2の板状体とにより形成される
    複数の泳動路を泳動した前記試料を、前記第2の溝にレ
    ーザー光を照射して検出することを特徴とする細溝型電
    気泳動装置。
  5. 【請求項5】複数の第1の溝と、前記複数の第1の溝と
    交叉する方向に第2の溝とが設けら れた第1の板状体
    と、前記第1の板状体に密着する第2の板状体とを具備
    し、前記第1の板状体、前記第2の板状体の少なくも一
    方の板状体はガラスで形成され、前記第1板状体と前記
    第2の板状体とにより形成される複数の泳動路を泳動し
    た試料を、前記第2の溝にレーザー光を照射して検出す
    ることを特徴とする細溝型電気泳動装置。
  6. 【請求項6】複数の第1の溝と、前記複数の第1の溝と
    交叉する方向に第2の溝とが設けられた第1の板状体
    と、前記第1の板状体に密着する第2の板状体とを具備
    し、前記第1の板状体、前記第2の板状体の少なくも一
    方の板状体は、表面が絶縁物で被覆された導電性板材で
    あり、前記第1板状体と前記第2の板状体とにより形成
    される複数の泳動路を泳動した試料を、前記第2の溝に
    レーザー光を照射して検出することを特徴とする細溝型
    電気泳動装置。
  7. 【請求項7】複数の溝が設けられた第1の板状体と、前
    記第1の板状体に密着する第2の板状体とを具備し、前
    記複数の溝は前記第1の板状体を削り形成され、前記第
    1板状体と前記第2の板状体とにより形成される複数の
    直線状の泳動路を泳動した試料を、泳動開始点から一定
    の距離だけ離れた位置に設けられ、前記複数の直線状の
    泳動路と直交する直線状の領域に沿って、レーザー光を
    照射して検出することを特徴とする細溝型電気泳動装
    置。
  8. 【請求項8】複数の第1の溝と、前記複数の第1の溝と
    交叉する方向に第2の溝とが設けられた第1の板状体
    と、前記第1の板状体に密着する第2の板状体とを具備
    し、前記複数の第1の溝は、線状あるはリボン状の突起
    物を板状体に固着させて形成するか、又は2枚の板状体
    の間にリボンあるいはワイヤー状の物体を挟み込んで形
    成され、前記第1板状体と前記第2の板状体とにより形
    成される複数の泳動路を泳動した試料を、前記第2の溝
    にレーザー光を照射して検出することを特徴とする細溝
    型電気泳動装置。
  9. 【請求項9】蛍光標識した試料を電気泳動、分離する複
    数の泳動路と、前記泳動路に前記試 料を供給する手段
    と、分離された前記試料の蛍光標識に励起光を照射する
    励起光源と、前記蛍光標識から発生した蛍光を検出する
    光検出器とを具備し、前記複数の泳動路は、複数の第1
    の溝と、前記複数の第1の溝と交叉する方向に第2の溝
    とが設けられた第1の板状体と、前記第1の板状体に密
    着する第2の板状体とにより挟まれて形成された複数の
    平行な泳動路であり、前記励起光は前記第2の溝に照射
    されることを特徴とする細溝型電気泳動装置。
  10. 【請求項10】複数の第1の溝と、レーザー光が照射さ
    れ試料を検出する第2の溝が前記複数の第1の溝と交叉
    する方向に設けられた第1の板状体と、前記第1の板状
    体に密着する第2の板状体とを具備し、前記第1板状体
    と前記第2の板状体とにより形成される複数の泳動路を
    前記試料が泳動する泳動路とすることを特徴とする電気
    泳動板。
  11. 【請求項11】複数の第1の溝と、レーザー光が照射さ
    れ試料を検出する第2の溝が前記複数の第1の溝と交叉
    する方向に設けられた第1の板状体と、前記第1の板状
    体に密着する第2の板状体とを具備し、前記第1板状体
    と前記第2の板状体とにより形成され泳動媒質が充填さ
    れる複数の泳動路を前記試料が泳動する泳動路とするこ
    とを特徴とする電気泳動板。
  12. 【請求項12】複数の第1の溝と、レーザー光が照射さ
    れ試料を検出する第2の溝が前記複数の第1の溝と交叉
    する方向に設けられた第1の板状体と、前記複数の第1
    の溝の位置に対応させて前記試料を注入する複数の注入
    口を有し前記第1の板状体に密着する第2の板状体とを
    具備し、前記第1板状体と前記第2の板状体とにより形
    成される複数の泳動路を前記試料が泳動する泳動路とす
    ることを特徴とする電気泳動板。
  13. 【請求項13】複数の第1の溝と、レーザー光が照射さ
    れ試料を検出する第2の溝が前記複数の第1の溝と交叉
    する方向に設けられた第1の板状体と、前記複数の第1
    の溝の位置に対応させて前記試料を注入する複数の注入
    口と前記試料が流出する流出口 とを有し前記第1の板状
    体に密着する第2の板状体とを具備し、前記第1板状体
    と前記第2の板状体とにより形成される複数の泳動路を
    前記試料が泳動する泳動路とすることを特徴とする電気
    泳動板。
  14. 【請求項14】複数の第1の溝と、レーザー光が照射さ
    れ試料を検出する第2の溝が前記複数の第1の溝と交叉
    する方向に設けられた第1の板状体と、前記第1の板状
    体に密着する第2の板状体とを具備し、前記第1の板状
    体、前記第2の板状体の少なくも一方の板状体はガラス
    で形成され、前記第1板状体と前記第2の板状体とによ
    り形成される複数の泳動路を前記試料が泳動する泳動路
    とすることを特徴とする電気泳動板。
  15. 【請求項15】複数の第1の溝と、レーザー光が照射さ
    れ試料を検出する第2の溝が前記複数の第1の溝と交叉
    する方向に設けられた第1の板状体と、前記第1の板状
    体に密着する第2の板状体とを具備し、前記第1の板状
    体、前記第2の板状体の少なくも一方の板状体は、表面
    が絶縁物で被覆された金属板であり、前記第1板状体と
    前記第2の板状体とにより形成される複数の泳動路を前
    記試料が泳動する泳動路とすることを特徴とする電気泳
    動板。
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