EP3524982A1 - Rotierbares testelement - Google Patents

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EP3524982A1
EP3524982A1 EP19160587.2A EP19160587A EP3524982A1 EP 3524982 A1 EP3524982 A1 EP 3524982A1 EP 19160587 A EP19160587 A EP 19160587A EP 3524982 A1 EP3524982 A1 EP 3524982A1
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EP
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sample
test element
capillary
zone
axis
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EP19160587.2A
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Christoph Boehm
Norbert Oranth
Juergen Spinke
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F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
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F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
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Publication date
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Definitions

  • the invention relates to a test element which is substantially disc-shaped and flat and is rotatable about a preferably central axis which is perpendicular to the disc-shaped test element plane, comprising a sample application opening for discharging a liquid sample, a capillary-active zone, in particular a porous, absorbent matrix and a sample channel that extends from the sample introduction port to the capillary-active zone. Furthermore, the invention relates to a method for determining an analyte with the aid of the test element.
  • test carriers eg. B. Test strips offered. Prominent examples of these are test strips for the determination of the blood glucose value or test strips for urinalysis.
  • test carriers usually integrate several functions (eg the storage of reagents in dried form or, albeit less frequently, in solution, the separation of undesired sample constituents, in particular of red blood cells from whole blood, in immunoassays, the so-called Free separation; the Dosage of sample volumes; the transport of sample liquid from outside a device into a device; the control of the time sequence of individual reaction steps; etc.).
  • the function of the sample transport is often accomplished by means of absorbent materials (eg papers or fleeces), by means of capillary channels or by application of external driving forces (such as pressure, suction) or by means of centrifugal force.
  • Disc-shaped test carriers so-called LabDiscs or optical BioDiscs, continue the idea of controlled sample transport by means of centrifugal force (centrifugal force).
  • Such disc-shaped, compact disc-like test carriers allow miniaturization by using microfluidic structures and at the same time the parallelization of processes by repeated application of identical structures for the parallel processing of similar analyzes from a sample or identical analyzes from different samples.
  • optical BioDiscs the integration of optically stored digital data for the identification of the test carriers or the control of the analysis systems on the optical BioDiscs is possible.
  • BioDiscs In addition to the miniaturization and parallelization of analyzes and the integration of digital data on optical discs, BioDiscs generally have the advantage that they can be manufactured using established manufacturing methods and measured using established evaluation technology. In the chemical and biochemical components of such optical BioDiscs usually a recourse to known chemical and biochemical components is possible.
  • a disadvantage of the optical LabDiscs or Biodiscs based purely on centrifugal and capillary forces is that the immobilization of reagents is difficult and the accuracy of detection suffers. Especially in detection systems based on specific binding reactions, such.
  • As immunoassays lacks compared to conventional test strip systems, the volume component, especially in the so-called. Bound-Free separation.
  • BioDiscs with channels and channel-like structures for liquid transport on the one hand and voluminous absorbent materials in these structures (at least partially) on the other.
  • WO 2005/001429 (Phan et al. ) describes optical bio-discs which have membrane pieces as reagent carriers in parts of the channel system. The reagents are dissolved by a liquid supplied to the disc, resulting in buffered reagent solutions, which are then contacted with the sample.
  • optical bio-disks which contain absorbent membranes or papers for moving a sample liquid, separating particulate sample components, carrying reagents, and analyzing the sample.
  • the sample is first applied to a blood separation membrane near the outer edge of the bio-disk and migrates radially therethrough to a reagent paper located closer to the center of the bio-disk. Thereafter, the sample is again moved radially outward, ie away from the center of the bio-disk, and flows through a so-called analysis membrane.
  • the outward movement takes place via chromatography, which is supported by rotation of the bio-disk and the centrifugal force acting thereon on the sample.
  • US 2002/0076354 A1 discloses bio-optical discs having, in addition to a channel system for the transport of a liquid sample, a so-called “capture layer".
  • the latter can for example consist of nitrocellulose.
  • the "interception layer” is traversed by means of centrifugal forces during rotation of the disk.
  • a test element with liquid channels in which sample liquid is transported by means of an interplay of capillary force and centrifugal force.
  • a nitrocellulose strip may be provided which carries an agglutination reagent which reacts with the analyte and thus can lead to the formation of so-called bands, which can be optically measured and thus used to determine an analyte concentration in the sample.
  • the nitrocellulose strip With the aid of the nitrocellulose strip it is possible to carry the sample liquid in opposite directions both in parallel to the centrifugal force and in the centrifugal force, in particular if another absorbent material, for example a nitrocellulose absorbent paper, is used to support the suction effect.
  • WO 99/58245 (Larsson et al. ) describes microfluidic test elements in which the movement of the liquids through different surfaces with different surface properties, such. B. different hydrophilicity is controlled.
  • a disadvantage of the concepts of the prior art is that just for specific binding assays, such.
  • immunoassays targeted control of the reaction and residence times of the sample liquid after receiving the reagents and after flowing into the porous, absorbent matrix is not possible.
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • the invention relates to a test element according to claim 1, a system according to claim 13 and a method according to claim 9.
  • Advantageous embodiments and preferred embodiments of the invention are the subject of the dependent claims.
  • test element is essentially disc-shaped and planar. It is rotatable about a preferably central axis which is perpendicular to the disk-shaped test element plane within the test element.
  • the test element is a circular disc, comparable to a compact disc.
  • the invention is not limited to this form of the disc, but can readily be found in non-symmetrical or non-circular discs use.
  • the test element first contains a sample introduction opening into which a liquid sample can be pipetted or introduced in another way.
  • the sample application port may be either close to the axis (i.e., near the center of the disc) or far from the axis (i.e., near the edge of the disc).
  • the test element contains at least one channel, which can transfer the liquid sample from the off-axis position into an axis-near position by means of capillary forces.
  • the sample application opening can open directly into a sample channel.
  • the sample introduction opening can first open into a reservoir located behind it, into which the sample flows before it continues to flow into the sample channel.
  • a hydrophilization of the surfaces of the fluidic structures may be necessary and / or the use of structures that promote the formation of capillary forces.
  • the test element contains a capillary-active zone, in particular in the form of a porous, absorbent matrix or a capillary channel, which comprises at least part of the liquid Sample absorbs.
  • the capillary active zone has an off-axis first end and an off-axis second end.
  • the test element further has a sample channel extending from the sample application port to the off-axis first end of the capillary active zone, particularly the porous absorbent matrix. At least once, the sample channel passes through an area close to the axis, which is closer to the preferably central axis than the first end of the capillary-active zone remote from the axis.
  • the capillary-active zone in particular the porous, absorbent matrix
  • the off-axis first end of the capillary active zone is in contact with the sample channel, in which the sample can be moved by capillary forces and / or centrifugal forces and / or other external forces, such as overpressure or underpressure.
  • capillary forces which in the case of a porous absorbent Matrix can also be referred to as suction
  • the capillary-active zone is a porous, absorbent matrix, in particular a paper, a membrane or a nonwoven.
  • the capillary-active zone in particular the porous, absorbent matrix, usually contains one or more zones with immobilized reagents.
  • binding reagents such as specific binding partners, such as antigens, antibodies, (poly) haptens, streptavidin, polystreptavidin, ligands, receptors, capture probes, and the like , immobilized. They serve to selectively from the flowing through the capillary active sample the analyte or from Analyte derived and related species intercept.
  • binding partners may be immobilized in the form of lines, dots, patterns in or on the material of the capillary active zone, or indirectly, e.g. B. via so-called beads to be bound to the capillary-active zone.
  • an antibody to the analyte may be immobilized on the surface of the capillary active zone or in the porous, bibulous matrix, which will then capture the analyte (in this case an antigen or hapten) from the sample and also in the capillary Immobilize zone such as the absorbent matrix.
  • the analyte can be made detectable by further reactions, for example by further contacting with a labeled bindable partner, for example by a label which can be visually, optically or fluorescently detected.
  • the capillary-active zone in particular the porous, absorbent matrix, adjoins, with the second end close to the axis, another absorbent material or an absorbent structure, so that this or this liquid can absorb from the zone.
  • the porous absorbent matrix and other material overlap slightly for this purpose.
  • the further material or the further absorbent structure serves on the one hand to support the suction effect of the capillary-active zone, in particular the porous absorbent matrix, on the other hand as a receiving zone for liquid, which has already passed through the capillary-active zone.
  • the further material may consist of the same or different materials as the matrix.
  • the matrix may be a membrane and the other absorbent material may be a nonwoven or a paper. Other combinations are of course possible as well.
  • the test element according to the invention is characterized in a preferred embodiment in that the sample channel contains zones of different dimensions and / or for different functions.
  • the sample channel may contain a zone containing reagents that are soluble in the sample or suspendable in the sample.
  • the different zones in the sample channel may also differ in that there are zones with capillary activity and those without.
  • zones of high hydrophilicity and low hydrophilicity may be included.
  • the individual zones can virtually seamlessly pass into one another or be separated from one another by certain barriers, for example valves, in particular non-closing valves, such as geometric valves or hydrophobic barriers.
  • the reagents in the sample channel are preferably in dried or lyophilized form. However, it is also possible that reagents are present in liquid form in the test element according to the invention.
  • the reagents can be introduced into the test element in a manner known per se.
  • the test element preferably contains at least two layers, a bottom layer into which the fluidic structures are introduced, and a cover layer, which as a rule contains no further structures apart from the inlet openings for liquids and the vent openings.
  • the introduction of reagents during the preparation of the test device is usually carried out before the upper part of the test element (cover layer) is applied to the lower part (bottom layer). At this time, the fluidic structures are open in the lower part, so that a dosage of the reagents in liquid or dried form is readily possible.
  • the introduction of the reagents can be done for example by printing or dispensing.
  • the reagents into the test element by placing them in the test element impregnated in absorbent materials such as papers, nonwovens or membranes. After placing the reagents and inserting the absorbent materials, such as the porous, absorbent matrix (membrane) and optionally other absorbent materials (waste nonwoven, etc.) are Upper and lower part of the test element connected to each other, for example, clipped, welded, glued and the like.
  • the bottom layer in addition to the fluidic structures also has the inlet openings for liquids and the vent openings.
  • the cover layer may be formed completely without openings, with the possible exception of a central recess for receiving a drive unit.
  • the upper part simply consist of a plastic film which is glued or welded to the lower part.
  • the sample channel contains a zone for separating particulate matter from the liquid sample.
  • a zone for separating particulate matter from the liquid sample.
  • red blood cells erythrocytes
  • serum which is usually better suited for subsequent visual or optical detection methods than the heavily colored blood.
  • the separation of cellular sample components by centrifugation, d. H. by fast rotation of the test element after filling with liquid sample contains suitably dimensioned and geometrically designed channels and / or chambers for this purpose.
  • the test element for the separation of cellular blood components contains an erythrocyte collection zone (erythrocyte chamber or erythrocyte trap) and a serum or plasma collection zone (serum or plasma chamber).
  • valves In particular so-called non-closing or geometric valves or hydrophobic barriers, especially in the sample channel. These valves serve as capillary stops. Through it can be ensured that a specific temporal and spatial control of the sample flow through the sample channel and the single zone of the test element is possible.
  • the sample channel may have a sample metering zone, which allows a precise measurement of the - initially in excess abandoned - sample.
  • the sample metering zone extends from the sample application opening via a corresponding piece of a sample channel to a valve in the fluidic structure, in particular a geometric valve or a hydrophobic barrier.
  • the sample application opening can initially receive an excess of sample material.
  • the sample either driven by capillary forces or by centrifugation, flows from the sample application zone into the channel structure and fills it up to the valve. Excess sample initially remains in the sample application zone.
  • a sample excess chamber adjacent to the sample application zone and branching off from the sample channel is filled, for example by capillary forces or by centrifuging the test element. It must be ensured that the sample volume to be measured is initially not transported across the valve by suitably selecting the valve. As soon as excess sample is trapped in the appropriate overflow chamber, a precisely defined sample volume is located between the valve of the sample channel on one side and the inlet to the sample overflow chamber on the other side. By applying external forces, in particular by starting another centrifugation, this defined sample volume is now moved beyond the valve. All fluidic areas that lie after the valve and come into contact with the sample are now filled with a precisely defined sample volume.
  • the sample channel may also have an inflow for other liquids except the sample liquid.
  • a second channel open, the z. B. can be filled with a washing or reagent liquid.
  • the inventive system of measuring device and test element is used to determine an analyte in a liquid sample.
  • the measuring device contains at least one drive for the rotation of the test element and an evaluation optics for evaluating the visual or optical signal of the test element.
  • the optics of the measuring device can be used for fluorescence measurement with spatially resolved detection.
  • d. H. planar evaluation optics is typically used to illuminate the detection area of the test element and possibly the excitation of optically detectable markers an LED or a laser.
  • the detection of the optical signal is by CMOS or CCD (typically 640 x 480 pixels).
  • the beam path is direct or folded (eg via mirrors or prisms).
  • the illumination or excitation is typically effected by means of an illumination line which illuminates the detection area of the test element, preferably perpendicular to the detection and control lines.
  • the detection can be done here via a diode array.
  • the rotational movement of the test element can be utilized for the illumination and evaluation of the second dimension in order to scan with the diode array over the area of the test element to be evaluated.
  • a DC motor with encoder or a stepper motor can be used as drive for rotating and positioning of the test element.
  • the temperature of the test element in the device is made indirectly, for example by heating or cooling the plate on which rests the disc-shaped test element in the device.
  • the measurement of the temperature is preferably carried out without contact.
  • the method according to the invention serves to detect an analyte in a liquid sample.
  • the sample is first placed in the sample application opening of the test element. Subsequently, the test element is rotated, preferably about its preferably central axis; However, it is also possible to carry out the inventive method so the rotation takes place around another axis, possibly also outside the test element. In this case, the sample is transported from the sample application opening to the off-axis end of the capillary-active zone, in particular the porous, absorbent matrix.
  • the rotation of the test element is then slowed down so that the sample or a material recovered from the sample as it flows through the sample (for example, a mixture of the sample with reagents, a sample modified by pre-reactions with reagents from the test element, one of certain components liberated sample such as serum or plasma from whole blood after removal of the erythrocytes, etc.) from the off-axis to the near-axis end of the capillary-active zone, in particular the porous, absorbent matrix is transported.
  • the analyte is finally detected visually or optically in the capillary-active zone, in particular in the porous, absorbent matrix, or in a downstream zone.
  • the initiation of migration of the sample (or material recovered from the sample) through the capillary active zone can be precisely timed and controlled by selectively slowing down or stopping the rotation of the test element. Only when the amount of capillary force (suction force) in the capillary active zone exceeds the amount of centrifugal force directed counter to it will it be possible to move the sample into and through the capillary active zone.
  • the liquid transport in the capillary-active zone can be targeted. For example, a possible pre-reaction or preincubation of the sample or a temperature control of the sample can be awaited before the rotation of the test element is slowed down or stopped so as to allow the sample to flow into the capillary-active zone.
  • the transport of the sample (or a material obtained from the sample) through the capillary-active zone can be selectively slowed or stopped by renewed rotation of the test element about its preferably central axis.
  • the centrifugal forces occurring during the rotation counteract the capillary force which moves the sample fluid from the end of the capillary-active zone remote from the axis to the end near the axis. So is a targeted Control, in particular slowing, the flow rate of the sample in the capillary active zone possible, up to the reversal of the flow direction. In this way, for example, the residence time of the sample in the capillary-active zone can be controlled.
  • the detection can be carried out according to the principle of the sandwich assay or in the form of a competitive assay.
  • test element after the rotation of the test element, a further liquid is applied to the test element, which is transported after the sample from the off-axis to the near-axis end of the capillary active zone, in particular the porous, absorbent matrix.
  • the further liquid may in particular be a buffer, preferably a washing buffer, or a reagent liquid.
  • the invention has the following advantages:
  • the capillary-active zone, in particular the porous, absorbent matrix transports the liquid from an off-axis end to an end near the axis, ie from the periphery of the disk-shaped test element in the direction of the axis of rotation.
  • the centrifugal force which can also be used to move the liquids, counteracts this direction of transport exactly.
  • the use of the porous absorbent matrix which serves essentially as a scavenger matrix for bound-free separation in immunoassays, allows efficient capture of sample components during the immunoassay.
  • a porous absorbent matrix membrane
  • membrane membrane
  • the invention is not limited to such a matrix.
  • FIGS. 1 to 9 show different preferred embodiments of the test element (1) according to the invention.
  • each of the substrate (2) containing the fluidic structures and the central recess (drive hole 3) is shown.
  • the disk-shaped test element (1) according to the invention also generally comprises a cover layer, which in the figures provides clarity is not shown half.
  • the cover layer can also carry structures, but as a rule it will have no structures other than the openings for the samples and / or further liquids to be dispensed onto the test element.
  • the cover layer can also be designed completely without openings be, for example in the form of a film, which is connected to the substrate and terminates the structures therein.
  • FIGS. 1 to 9 show fluidic structures that perform largely the same functions, although they differ in detail from embodiment to embodiment.
  • the basic structure and the basic function will therefore be described in more detail here with reference to the embodiment according to FIG. 1 be explained.
  • the embodiments according to Figure 2 to 9 will then be explained in more detail only on the basis of the specific differences to each other in order to avoid unnecessary repetition.
  • FIG. 1 shows a first preferred embodiment of the disc-shaped test element (1) according to the invention.
  • the test element (1) contains a substrate (2) containing the fluidic and microfluidic and chromatographic structures.
  • the substrate (2) is covered by a corresponding counterpart (cover layer) (not shown) which contains sample feed and vents corresponding to the structures in the substrate (2).
  • Both the cover layer and the substrate (2) have a central recess (3) which, in cooperation with a corresponding drive unit in a measuring device, makes it possible to rotate the disk-shaped test element (1).
  • the test element (according to one of the FIGS.
  • Sample liquid in particular whole blood, is supplied to the test element (1) via the sample application opening (4). Driven by capillary forces and / or centrifugal forces, the sample liquid fills the sample dosing zone (5).
  • the sample metering zone (5) can also contain the dried reagents. She gets through the Capillary stops (6 and 8), which may be formed for example as a hydrophobic barrier or as a geometric / non-closing valve limited.
  • the limitation of the sample dosing zone (5) by the capillary stops (6, 8) ensures that a defined sample volume is taken up and passed on into the fluidic zones which lie downstream of the sample dosing zone (5).
  • channel (9) is used to start the separation of red blood cells and other cellular sample components.
  • the reagents contained in the sample dosing zone (5) are already dissolved in the sample when the sample enters the channel (9).
  • the entry of the sample in channel (9) via the capillary stop (8) leads to a mixing of the reagents in the sample.
  • the reagent-sample mixture is directed into the fluidic structures (10) (serum / plasma collection zone) and (11) (erythrocyte collection zone). Due to the centrifugal forces acting on the reagent-sample mixture, plasma or serum is separated from red blood cells. The red blood cells collect in the erythrocyte collection zone (11), while the plasma essentially remains in the collection zone (10).
  • test elements which use membranes or nonwovens to separate particulate sample components (e.g. glass fiber nonwovens or asymmetrically porous plastic membranes to separate red blood cells from whole blood, generally as blood separating membranes or nonwovens)
  • sample volume can be utilized much more effectively with the test elements according to the invention since there are practically no dead volumes (eg volume of the fiber interspaces or pores) from which the sample can not be taken again.
  • dead volumes e.g volume of the fiber interspaces or pores
  • these prior art blood separation membranes and webs tend in part to undesirably adsorb sample components (e.g., proteins) or destroy (lysate) cells, which is also not observed with the test elements of the present invention.
  • the reagent-plasma mixture (which has formed in the presence of the analyte in the case of an immunoassay, for example sandwich complexes of analyte and antibody conjugates) by the suction of the porous-absorbent matrix (12) incorporated into and passed through them.
  • the immobilized binding partners contained in the membrane (12) capture the analyte-containing complexes in the detection zone and bound unbound labeled conjugate in the control zone.
  • the nonwoven (13) adjoining the porous, absorbent matrix supports the movement of the sample through the membrane (12).
  • the fleece (13) also serves to receive the sample after flowing through the membrane (12).
  • wash buffer is pipetted into the sample application opening (4).
  • the washing buffer flows through the corresponding fluidic structures of the test element (1) and, in particular, washes the membrane (12), where the bound analyte complexes are now located, thus removing excess reagent residues.
  • the washing step may be repeated one or more times so as to improve the signal-to-background ratio. This allows an optimization of the detection limit for the analyte and an increase of the dynamic measuring range.
  • the sample channel in which the liquid sample in the test element (1) is transported from the sample application opening (4) to the first remote end of the membrane (12), comprises in the present case the sample metering zone (5), the capillary stop (8), the channel (FIG. 9), the serum / plasma collection zone (10) and the erythrocyte chamber (11).
  • the sample channel may consist of more or fewer individual zones / chambers.
  • FIG. 3 differs from FIG. 1 in that, on the one hand, no container for sample excess (7) adjoins the sample application opening (4) and no capillary stop is present at the end of the sample dosage section (ie a metered sample application is required here) and, on the other hand, that a separate addition opening (16 ) for other liquids, such.
  • a separate addition opening (16 ) for other liquids such.
  • washing buffer, and an associated channel (15) are present, which can transport the buffer to the membrane (12).
  • the transport of the buffer to the membrane (12) can be based on capillary forces or centrifugal forces.
  • the embodiment according to FIG. 5 is largely identical to the embodiment according to FIG. 3 , The two embodiments differ only by the shape of the waste nonwoven fabric (13) and in that the test element according to FIG. 5 a capillary stop (8) at the end of the sample dosing (5).
  • the embodiment according to FIG. 6 again is substantially identical to the embodiment according to FIG. 5 and differs therefrom by the additional presence of a sample surplus container (7) in the region between the sample metering orifice (4) and the sample metering zone (5).
  • a sample surplus container (7) in the region between the sample metering orifice (4) and the sample metering zone (5).
  • no metered application of the sample is required (analog FIG. 1 ).
  • FIG. 7 corresponds essentially to the test element (1) of FIG. 6 , Both embodiments have the same fluidic structures and functions. Only the arrangement and geometric Design is different.
  • the embodiment according to FIG. 7 has additional vents (17), due to the different dimensions of the fluidic structures compared to FIG. 6 are necessary to allow filling of the structures with samples or washing liquid.
  • Channel (9) is designed here as a thin capillary, which is filled only during rotation of the test element (ie overcoming the capillary stop (8) is possible only by means of centrifugal force).
  • FIG. 7 possible to remove recovered plasma from the erythrocyte collection zone 11; This is done by the decanter unit 18, which finally discharges into the serum / plasma collection zone 10.
  • FIG. 9 corresponds essentially to the test element (1) of FIG. 6 , Both embodiments have the same fluidic structures and functions. Only the arrangement and geometric design is different.
  • the embodiment according to FIG. 9 basically has a further outward, that is, away from the axis, sample application opening (4). This can be advantageous if the test element (1) for filling with sample is already introduced in a measuring device. In this case, the user can be made more easily accessible to the sample application opening (4) than in the case of test elements according to FIG Figure 1 to 8 is possible, where the sample application opening (4) in each case close to the axis (ie remote from the outer edge of the test element) is arranged.
  • the sample is then transported from the sample application opening (4) in the channel structures.
  • the sample is transferred in a sample metering section (5), and then a serum / plasma separation from the whole blood is effected by rotation.
  • the unwanted cellular sample constituents essentially erythrocytes, accumulate in the erythrocyte trap (11), while serum or plasma accumulate in the zone (10).
  • the serum is removed from the zone (10) via a capillary and transported further into the channel structure (9), where dried reagents are accommodated and are dissolved when the sample flows in.
  • the sample-reagent mixture of channel structure (9) can overcome the capillary stop (14) and thus reach the membrane (12) via the channel (15).
  • the sample-reagent mixture is transported via the membrane (12) into the waste nonwoven (13).
  • FIG. 2 and FIG. 4 differ in that in FIG. 2 a container for sample surplus (7) is provided, while the embodiment according to FIG. 4 does not provide such a function. As in the embodiment according to FIG. 3 Here is a metered application of the sample appropriate.
  • FIG. 8 shows a variant of the embodiments according to Figures 2 and 4 ,
  • the sample is transferred by centrifugation into an erythrocyte separation structure (10, 11).
  • the area denoted by (10) serves as a serum / plasma collection zone (10) from which serum or plasma freed from cells is passed on via a capillary channel (21) after centrifuging.
  • Chamber (20) serves as a collecting reservoir for excess serum or plasma, which after complete filling of the sample dosing section (5) possibly flows from the serum / plasma collection zone (10). All other functions and structures are analogous to FIGS. 1 to 7 ,
  • the hydrophilic or hydrophobic properties of the surfaces of the test element (1) By deliberately designing the hydrophilic or hydrophobic properties of the surfaces of the test element (1), it can be achieved that the sample liquid and / or washing liquids are moved either only with the aid of rotation and the resulting centrifugal forces or by a combination of centrifugal forces and capillary forces. The latter requires at least partially hydrophilized surfaces in the fluidic structures of the test element (1).
  • the test elements according to the invention according to the FIGS. 1 . 2 . 6 . 7 . 8th and 9 an automatic functionality that allows a relatively accurate measurement of a sample aliquot from a surrendered in excess of the test element sample (so-called "metering system").
  • This metering system is a further subject of the present invention. It essentially comprises the elements 4, 5, 6, and 7 of the illustrated test elements (1).
  • Sample liquid in particular whole blood, is supplied to the test element (1) via the sample application opening (4). Driven by capillary forces and / or centrifugal forces, the sample liquid fills the sample dosing zone (5).
  • the sample metering zone (5) can also contain the dried reagents.
  • Kapillarstopps (6 and 8) which may be formed for example as a hydrophobic barrier or as geometric / non-closing valves.
  • the limitation of the sample dosing zone (5) by the capillary stops (6, 8) ensures that a defined sample volume is taken up and passed on into the fluidic zones which lie downstream of the sample dosing zone (5).
  • any sample excess is transferred from the sample application port (4) and sample dosing zone (5) to the sample overflow container (7) while the measured amount of sample from the sample dosing zone (5) enters the channel (9 ) is transferred.
  • the illustrated metering system is consequently not necessarily bound to rotatable test elements, but can also find application in other test elements.
  • sample liquid can be applied in excess to a test element.
  • the measurement of a relatively accurate sample aliquot, which is then further processed in the test element also takes place here by the interaction of a metering chamber and an overflow chamber, these two zones - unlike the present invention - by a narrow, but at least during filling always liquid exchange enabling contact.
  • Sample liquid is here directly separated during filling of the test element in a part which is passed through a wide channel in the "metering chamber", and a part which flows through a narrow channel in the "overflow chamber”.
  • the test element is set in rotation and any excess sample is diverted into the "overflow chamber” so that only the desired, measured sample volume remains in the "metering chamber", which is subsequently processed further.
  • a disadvantage of the embodiment of the metering system according to US 5,061,381 is that for sample volumes that are placed on the test element and which correspond exactly to the minimum volume or only slightly larger than the minimum volume, there is a risk that the dosing is underdosed, since always a portion of the sample from the beginning unhindered in the "overflow chamber" flows.
  • a capillary stop hydrophobic barrier or a geometric or non-closing valve
  • the capillary stop prevents that Sample can be added to the sample excess zone before the sample dosing zone is completely filled. Even with sample volumes which are applied to the test element and which correspond exactly to the minimum volume or are only slightly larger than the minimum volume, it is ensured that the sample metering zone is completely filled.
  • a transition from shallower to deeper structures is usually only possible for liquids in the fluidic structures, if external force (eg centrifugal force) acts on them.
  • Such transitions act as geometric (non-closing) valves.
  • the substrate (2) also has the sample and buffer addition openings (4, 16), ventilation openings (17) and the central recess (3).
  • the surface of the substrate (2), which has the fluidic structures, can then be cleaned by means of plasma treatment and hydrophilized.
  • reagents required for analyte detection eg biotinylated anti-analyte antibodies and anti-analyte antibodies labeled with a fluorescence label
  • sample dosing section (5) eg biotinylated anti-analyte antibodies and anti-analyte antibodies labeled with a fluorescence label
  • the reagent solutions are composed as follows: Biotinylated antibody: 50 mM Mes pH 5.6; 100 ⁇ g / ml biotinylated monoclonal anti-troponin T antibody Labeled antibodies 50 mM Hepes pH 7.4, with squaric acid derivative Fluorescent dye JG9 (embedded in polystyrene latex particles) Fluorescently labeled monoclonal anti-troponin T antibodies (0.35 percent solution)
  • the porous matrix (12) (nitrocellulose membrane on plastic carrier film 21 x 5 mm 2 ; 100 ⁇ m PE film reinforced cellulose nitrate membrane (type CN 140 of Sartorius, Germany)
  • An analyte detection line polystreptavidin
  • a control line polyhapten
  • aqueous streptavidin solution (4.75 mg / ml) is applied by line dosing to the above-described cellulose nitrate membrane.
  • the dosage is selected (dosage 0.12 ml / min, web speed 3 m / min) that a line with a width of about 0.4 mm is formed. This line is used to detect the analyte to be determined and contains about 0.95 ⁇ g streptavidin per membrane.
  • an aqueous troponin T polyhapten solution of 0.3 mg / ml is applied under identical dosing conditions. This line serves as a functional check of the test element and contains approx. 0.06 ⁇ g polyhapten per test.
  • the cover (film or injection molded part without Fluidik Modellen, which may or may be hydrophilized) is applied and optionally permanently connected to the substrate (2), preferably glued, welded or clipped.
  • the substrate is turned and in the corresponding recess the waste nonwoven fabric (13) (13 x 7 x 1.5 mm 3 fleece 100 parts of glass fiber (diameter 0.49 to 0.58 microns, length 1000 microns) and 5 Divide polyvinyl alcohol fibers (Kuralon VPB 105-2 from Kuraray) with a basis weight of about 180 g / m 2 ), which is then fixed by means of an adhesive tape in the substrate (2).
  • the waste nonwoven fabric 13 x 7 x 1.5 mm 3 fleece 100 parts of glass fiber (diameter 0.49 to 0.58 microns, length 1000 microns) and 5 Divide polyvinyl alcohol fibers (Kuralon VPB 105-2 from Kuraray) with a basis weight of about 180 g / m 2 ), which is then fixed by means of an adhesive tape in the substrate (2).
  • the quasi self-dosing sample receiving unit (comprising the sample application opening (4), the sample dosing (5) and the structures limiting it (capillary stop (8) and container for excess sample (7)) ensures that regardless of the on the test element (1) discontinued Amount of sample (if it exceeds a minimum volume (in this example 27 ⁇ l)) if different test elements are used, reproducibly the same amount of samples.
  • the reagents in the entire sample metering section (5) preferably in the form of alternating reagent spots (ie smaller, almost punctiform reagent areas), in combination with rapid filling of the sample metering section (5) with sample, homogeneous dissolution of the reagents in the entire sample volume is achieved , Especially if the filling is much faster than the release.
  • a virtually complete dissolution of the reagents so that here again an increased reproducibility compared to conventional, based on absorbent materials test elements (test strips, bio-discs with reagent pads, etc.) is observed.
  • test element On the test element according to Example 1, 27 .mu.l of whole blood to which different amounts of recombinant troponin T were added, abandoned. The test element is then further treated on the basis of the procedure given in Table 1 and finally measured the fluorescence signals for different concentrations.
  • Table 1 Measurement procedure Time (min: sec) Duration (min: sec) Rotation at revolutions per minute action 00:00 01:00 0 Add 27 ⁇ l sample; Dissolve the reagents 01:00 02:00 5000 Erythrocyte separation and incubation 03:00 01:00 800 Chromatography (generate signal) 04:00 12:10 0 Add 12 ⁇ l washing buffer 1) 04:10 02:00 800 Wash buffer transport and chromatography 06:10 12:10 0 Add 12 ⁇ l washing buffer 1) 06:20 02:00 800 Wash buffer transport and chromatography 08:20 12:10 0 Add 12 ⁇ l washing buffer 1) 08:30 02:00 800 Wash buffer transport and chromatography 10:30 0 measure up 1) 100 mM Hepes, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.095% sodium azide.
  • the measured data are in FIG. 10 played.
  • the respective measurement signals (in counts) are plotted against the concentration of recombinant troponin T (c (TnT)) in [ng / ml].
  • the actual troponin T concentration in the whole blood samples was determined using the reference method "Roche Diagnostics Elecsys Troponin T Test".
  • the detection limit for the quantitatively evaluable measuring range with the test element according to the invention is shifted downwards (Cardiac Troponin T: 0.1 ng / ml, invention: 0.02 ng / ml) and the dynamic measuring range after dilated at the top (Cardiac Troponin T: 2.0 ng / ml, invention: 20 ng / ml).
  • the test elements according to the invention show improved precision.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Testelement, das im Wesentlichen scheibenförmig und eben ist und um eine Achse, die senkrecht zur scheibenförmigen Testelementebene liegt, rotierbar ist, enthaltend eine Probenaufgabeöffnung zur Aufgabe einer flüssigen Probe, eine kapillaraktive Zone, insbesondere eine poröse, saugfähige Matrix, mit einem achsenfernen ersten Ende und einem achsennahen zweiten Ende, und einen Probenkanal, der von einem achsennahen Bereich zum achsenfernen ersten Ende der kapillaraktiven Zone reicht. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten mit Hilfe des Testelements.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Testelement, das im Wesentlichen scheibenförmig und eben ist und um eine vorzugsweise zentrale Achse, die senkrecht zur scheibenförmigen Testelementebene liegt, rotierbar ist, enthaltend eine Probenaufgabeöffnung zur Aufgabe einer flüssigen Probe, eine kapillaraktive Zone, insbesondere eine poröse, saugfähige Matrix und einen Probenkanal, der von der Probenaufgabeöffnung zur kapillaraktiven Zone reicht. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten mit Hilfe des Testelements.
  • Prinzipiell kann man die Systeme, die zur Analyse von flüssigen Probenmaterialien oder von Probenmaterialien, die in flüssige Form überführt werden können, in zwei Klassen unterteilen: zum einen gibt es Analysensysteme, die ausschließlich mit sog. Nassreagenzien arbeiten, zum anderen gibt es Systeme, die mit sog. Trockenreagenzien arbeiten. Insbesondere in der medizinischen Diagnostik, aber auch in der Umwelt- und Prozessanalytik, haben sich im Bereich der fest eingerichteten Labors vor allem die ersteren Systeme durchgesetzt, während letztere Systeme vor allem im Bereich der Analytik "vor Ort" eingesetzt werden.
  • Im Bereich der medizinischen Diagnostik werden Analysensysteme mit Trockenreagenzien insbesondere in Form von sog. Testträgern, z. B. Teststreifen angeboten. Prominente Beispiele hierfür sind Teststreifen für die Bestimmung des Blutzuckerwertes oder Teststreifen für Urinuntersuchungen. Solche Testträger integrieren in der Regel mehrere Funktionen (z. B. die Bevorratung von Reagenzien in getrockneter Form oder - wenn auch seltener - in Lösung; die Abtrennung von unerwünschten Probenbestandteilen, insbesondere von roten Blutkörperchen aus Vollblut; bei Immunoassays, die sog. Bound-Free-Trennung; die Dosierung von Probenvolumina; den Transport von Probenflüssigkeit von außerhalb eines Gerätes in ein Gerät hinein; die Steuerung der zeitlichen Abfolge von einzelnen Reaktionsschritten; usw.). Die Funktion des Probentransports wird dabei oft mittels saugfähiger Materialien (z. B. Papiere oder Vliese), mittels Kapillarkanälen oder durch Anwendung äußerer Triebkräfte (wie z. B. Druck; Saugen) oder mittels Zentrifugalkraft bewerkstelligt. Scheibenförmige Testträger, sog. LabDiscs oder optische BioDiscs, führen die Idee des gesteuerten Probentransports mittels Zentrifugalkraft (Fliehkraft) fort. Solche scheibenförmigen, CompactDisc-ähnlichen Testträger ermöglichen die Miniaturisierung durch Nutzung von mikrofluidischen Strukturen und gleichzeitig die Parallelisierung von Vorgängen durch wiederholtes Aufbringen identischer Strukturen für die parallele Abarbeitung ähnlicher Analysen aus einer Probe bzw. identische Analysen aus unterschiedlichen Proben. Gerade im Bereich der optischen BioDiscs ist die Integration von optisch gespeicherten digitalen Daten für die Identifizierung der Testträger oder die Steuerung der Analysensysteme auf den optischen BioDiscs möglich.
  • Neben der Miniaturisierung und Parallelisierung von Analysen und der Integration von digitalen Daten auf optische Discs haben BioDiscs im Allgemeinen den Vorteil, dass sie mittels etablierter Herstellverfahren hergestellt und mittels etablierter Auswertetechnologie gemessen werden können. Bei den chemischen und biochemischen Komponenten solcher optischen BioDiscs ist meist ein Rückgriff auf bekannte Chemie - und Biochemie-Komponenten - möglich. Nachteilig an den rein auf Zentrifugal- und Kapillarkräften beruhenden optischen LabDiscs oder Biodiscs ist, dass die Immobilisierung von Reagenzien schwer ist und die Nachweisgenauigkeit leidet. Insbesondere bei Nachweissystemen, die auf spezifischen Bindereaktionen beruhen, wie z. B. Immunoassays, fehlt im Vergleich zu herkömmlichen Teststreifensystemen die Volumenkomponente, insbesondere bei der sog. Bound-Free-Trennung.
  • Aus diesem Grund gibt es vor allem im Bereich der Immunoassays seit kurzem Ansätze, Hybride aus herkömmlichen Teststreifen und BioDiscs zu etablieren. Das Ergebnis sind BioDiscs mit Kanälen und kanalartigen Strukturen für den Flüssigkeitstransport einerseits und voluminösen saugfähigen Materialien in diesen Strukturen (zumindest teilweise) andererseits.
  • WO 2005/001429 (Phan et al. ) beschreibt optische Bio-Disks, die in Teilen des Kanalsystems Membranstücke als Reagenzienträger aufweisen. Die Reagenzien werden von einer der Disk zugeführten Flüssigkeit gelöst und führen so zu gepufferten Reagenzlösungen, die dann mit der Probe in Kontakt gebracht werden.
  • Aus WO 2005/009581 (Randall et al. ) sind optische Bio-Disks bekannt, die zum Bewegen einer Probenflüssigkeit, zum Abtrennen partikulärer Probenbestandteile, zum Tragen von Reagenzien und zur Analyse der Probe saugfähige Membranen oder Papiere enthalten. Die Probe wird nahe dem äußeren Rand der Bio-Disk zunächst auf eine Blutabtrennmembran aufgebracht und wandert radial durch diese hindurch zu einem Reagenzienpapier, das näher am Zentrum der Bio-Disk untergebracht ist. Danach wird die Probe wieder radial nach außen, d. h. vom Zentrum der Bio-Disk weg, bewegt und durchströmt eine so genannte Analysenmembran. Die Bewegung nach außen erfolgt dabei über Chromatographie, die durch Rotation der Bio-Disk und die dadurch auf die Probe wirkende Zentrifugalkraft unterstützt wird.
  • US 2002/0076354 A1 (Cohen ) offenbart optische Bio-Disks, die neben einem Kanalsystem für den Transport einer flüssigen Probe eine so genannte "Abfangschicht" (engl. "capture layer") aufweisen. Letztere kann beispielsweise aus Nitrozellulose bestehen. Die "Abfangschicht" wird mit Hilfe von Zentrifugalkräften beim Rotieren der Disk durchströmt.
  • US 2005/0014249 (Staimer et al. ) und US 2005/0037484 (Staimer et al. ) beschreiben optische Bio-Disks mit in Kanälen integrierten porösen Materialien, die als chromatographische Trennmedien wirken. Die Probenflüssigkeit wird mittels Zentrifugalkraft von einer zentrumsnahen Probenaufgabestelle durch die Trennmedien nach außen gezwungen und fließt anschließend nach Passieren eines Filters wieder in einem Kanal radial nach innen.
  • US 2004/0265171 (Pugia et al. ) beschreibt ein Testelement mit Flüssigkeitskanälen, bei dem Probenflüssigkeit mittels eines Wechselspiels von Kapillarkraft und Zentrifugalkraft transportiert wird. Innerhalb eines Flüssigkeitskanals kann ein Nitrocellulosestreifen vorgesehen sein, der ein Agglutinationsreagenz trägt, das mit dem Analyten reagiert und so zur Bildung von sogenannten Banden führen kann, die schließlich optisch vermessen werden können und so zur Bestimmung einer Analytkonzentration in der Probe dienen. Mit Hilfe des Nitrocellulosestreifens ist es möglich, die Probenflüssigkeit sowohl parallel zur Zentrifugalkraft als auch der Zentrifugalkraft entgegengesetzt zu transportieren, insbesondere wenn ein weiteres absorptionsfähiges Material, beispielsweise ein saugfähiges Nitrocellulosepapier, zur Unterstützung der Saugwirkung verwendet wird.
  • WO 99/58245 (Larsson et al. ) beschreibt mikrofluidische Testelemente, bei denen die Bewegung der Flüssigkeiten durch unterschiedliche Oberflächen mit unterschiedlichen Oberflächeneigenschaften, wie z. B. unterschiedliche Hydrophilie, gesteuert wird.
  • US 5,242,606 (Braynin et al. ) offenbart kreisförmige, scheibenartige Rotoren für Zentrifugen, die über Kanäle und Kammern zum Transport von Probenflüssigkeiten verfügen.
  • Nachteilig an den Konzepten des Standes der Technik ist, dass gerade für spezifische Bindungsassays, wie z. B. Immunoassays eine gezielte Steuerung der Reaktions- und Verweilzeiten der Probenflüssigkeit nach Aufnahme der Reagenzien und nach dem Einströmen in die poröse, saugfähige Matrix nicht möglich ist.
  • Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik zu beseitigen.
  • Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung gelöst.
  • Gegenstand der Erfindung ist ein Testelement gemäß Anspruch 1, ein System gemäß Anspruch 13 sowie ein Verfahren gemäß Anspruch 9. Vorteilhafte Ausgestaltungen und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.
  • Das erfindungsgemäße Testelement ist im Wesentlichen scheibenförmig und eben. Es ist um eine vorzugsweise zentrale Achse, die senkrecht zur scheibenförmigen Testelementebene innerhalb des Testelements liegt, rotierbar. Typischerweise ist das Testelement eine kreisrunde Scheibe, vergleichbar einer Compactdisc. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Form der Scheibe beschränkt, sondern kann ohne weiteres auch bei nicht-symmetrischen oder nicht-kreisförmigen Scheiben Verwendung finden.
  • Als Bestandteile enthält das Testelement zunächst eine Probenaufgabeöffnung, in die eine flüssige Probe pipettiert oder auf andere Weise eingebracht werden kann. Die Probenaufgabeöffnung kann entweder achsennah (d. h. nahe am Zentrum der Scheibe) oder achsenfern (d. h. in der Nähe des Randes der Scheibe) sein. Für den Fall, dass die Probenaufgabeöffnung achsenfern liegt enthält das Testelement zumindest einen Kanal, der mittels Kapillarkräften die flüssige Probe von der achsenfernen Position in eine achsennahe Position überführen kann.
  • Die Probenaufgabeöffnung kann dabei direkt in einen Probenkanal münden. Es ist jedoch auch möglich, dass die Probenaufgabeöffnung zunächst in ein dahinter liegendes Reservoir mündet, in das die Probe einströmt, bevor sie in den Probenkanal weiterfließt. Durch geeignete Dimensionierung kann dafür gesorgt werden, dass die Probe von der Probenaufgabenöffnung ohne weiteres Zutun in den nachfolgenden fluidischen Strukturen hineinströmt. Dazu kann eine Hydrophilisierung der Oberflächen der fluidischen Strukturen notwendig sein und/oder die Verwendung von Strukturen, die das Entstehen von Kapillarkräften fördern. Es ist jedoch auch möglich, das Befüllen der fluidischen Strukturen des erfindungsgemäßen Testelements aus der Probenaufgabeöffnung erst nach Einwirken einer äußeren Kraft, vorzugsweise einer Zentrifugalkraft, zu ermöglichen.
  • Weiterhin enthält das Testelement eine kapillaraktive Zone, insbesondere in Form einer porösen, saugfähigen Matrix oder eines Kapillarkanals, die zumindest einen Teil der flüssigen Probe aufnimmt. Die kapillaraktive Zone weist ein achsenfernes erstes Ende und ein achsennahes zweites Ende auf.
  • Das Testelement besitzt darüber hinaus einen Probenkanal, der von der Probenaufgabeöffnung zum achsenfernen ersten Ende der kapillaraktiven Zone, insbesondere der porösen, saugfähigen Matrix, reicht. Der Probenkanal durchläuft dabei mindestens einmal einen achsennahen Bereich, der näher an der vorzugsweise zentralen Achse liegt als das achsenferne erste Ende der kapillaraktiven Zone.
  • Wesentlich am Testelement der vorliegenden Erfindung ist, dass die kapillaraktive Zone, insbesondere die poröse, saugfähige Matrix, ein achsennahes zweites Ende aufweist. Das achsenferne erste Ende der kapillaraktiven Zone steht dabei mit dem Probenkanal, in dem die Probe durch Kapillarkräfte und/oder Zentrifugalkräfte und/oder andere externe Kräfte, wie Über- oder Unterdruck, bewegt werden kann, in Kontakt. Sobald die flüssige Probe - ggf. nach Aufnahme von Reagenzien und/oder Verdünnungsmedien und/oder dem Ablaufen von Vorreaktionen - das achsenferne erste Ende der kapillaraktiven Zone erreicht, wird sie in die in sie aufgenommen und durch die Kapillarkräfte (die im Falle einer porösen saugfähigen Matrix auch als Saugkräfte bezeichnet werden können) durch sie hindurch transportiert.
  • Typischerweise ist die kapillaraktive Zone eine poröse, saugfähige Matrix, insbesondere ein Papier, eine Membran oder ein Vlies.
  • Die kapillaraktive Zone, insbesondere die poröse, saugfähige Matrix, enthält in der Regel eine oder mehrere Zonen mit immobilisierten Reagenzien.
  • Typischerweise sind in der kapillaraktiven Zone, insbesondere in der porösen saugfähigen Matrix, spezifische Bindereagenzien, beispielsweise spezifische Bindepartner, wie Antigene, Antikörper, (Poly-)Haptene, Streptavidin, Polystreptavidin, Liganden, Rezeptoren, Nukleinsäurestränge ("capture probes") und dergleichen mehr, immobilisiert. Sie dienen dazu, aus der durch die kapillaraktive Zone fließenden Probe gezielt den Analyten oder vom Analyten abgeleitete und mit diesem in Beziehung stehende Spezies abzufangen. Diese Bindepartner können in Form von Linien, Punkten, Mustern in oder auf dem Material der kapillaraktiven Zone immobilisiert vorliegen oder indirekt, z. B. über sogenannte Beads, an die kapillaraktive Zone gebunden sein. So kann beispielsweise im Fall von Immunoassays ein Antikörper gegen den Analyten auf der Oberfläche der kapillaraktiven Zone oder in der porösen, saugfähigen Matrix immobilisiert vorliegen, der dann den Analyten (in diesem Fall ein Antigen oder Hapten) aus der Probe abfangen und ebenfalls in der kapillaraktiven Zone wie Z. B. der saugfähigen Matrix immobilisieren. Der Analyt kann dabei durch weitere Reaktionen, beispielsweise durch weiteres Inkontaktbringen mit einem markierten bindefähigen Partner, detektierbar gemacht werden, beispielsweise durch ein visuell, optisch oder fluoreszenzoptisch nachweisbares Label.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Testelements grenzt die kapillaraktive Zone, insbesondere die poröse, saugfähige Matrix, mit dem achsennahen zweiten Ende an ein weiteres saugfähiges Material oder eine saugfähige Struktur, so dass dieses bzw. diese Flüssigkeit aus der Zone aufnehmen kann. Typischerweise überlappen die poröse saugfähige Matrix und das weitere Material sich zu diesem Zweck geringfügig. Das weitere Material bzw. die weitere saugfähige Struktur dient dabei einerseits zur Unterstützung der Saugwirkung der kapillaraktiven Zone, insbesondere der porösen saugfähigen Matrix, andererseits als Aufnahmezone für Flüssigkeit, die bereits die kapillaraktive Zone durchlaufen hat. Das weitere Material kann dabei aus denselben oder unterschiedlichen Materialien wie die Matrix bestehen. Beispielsweise kann die Matrix eine Membran sein und das weitere saugfähige Material ein Vlies oder ein Papier. Andere Kombinationen sind natürlich ebenso möglich.
  • Das erfindungsgemäße Testelement zeichnet sich in einer bevorzugten Ausführungsform dadurch aus, dass der Probenkanal Zonen unterschiedlicher Dimensionen und/oder für unterschiedliche Funktionen enthält. Beispielsweise kann der Probenkanal eine Zone enthalten, die in der Probe lösliche oder in der Probe suspendierbare Reagenzien enthält.
  • Diese können beim Ein- oder Durchströmen der flüssigen Probe in dieser gelöst oder suspendiert werden und eine Reaktion mit dem Analyten in der Probe oder mit anderen Probenbestandteilen eingehen.
  • Die unterschiedlichen Zonen im Probenkanal können sich auch dadurch unterscheiden, dass es Zonen mit Kapillaraktivität gibt und solche ohne. Darüber hinaus können Zonen mit hoher Hydrophilie und niedriger Hydrophilie enthalten sein. Die einzelnen Zonen können quasi nahtlos ineinander übergeben oder durch gewisse Barrieren, beispielsweise Ventile, insbesondere nicht schließende Ventile, wie geometrische Ventile oder Hydrophobsperren voneinander getrennt sein.
  • Die Reagenzien im Probenkanal liegen bevorzugt in getrockneter oder lyophilisierter Form vor. Es ist jedoch auch möglich, dass Reagenzien in flüssiger Form im erfindungsgemäßen Testelement vorliegen.
  • Die Reagenzien können in an sich bekannter Weise in das Testelement eingebracht werden. Bevorzugt enthält das Testelement mindestens zwei Schichten, eine Bodenschicht, in die die fluidischen Strukturen eingebracht sind und eine Deckschicht, die in der Regel außer den Einlassöffnungen für Flüssigkeiten und den Entlüftungsöffnungen keine weiteren Strukturen enthält. Das Einbringen von Reagenzien während der Herstellung des Testdevices erfolgt in der Regel bevor das Oberteil des Testelements (Deckschicht) auf das Unterteil (Bodenschicht) aufgebracht wird. Zu diesem Zeitpunkt liegen die fluidischen Strukturen im Unterteil offen, so dass eine Dosierung der Reagenzien in flüssiger oder getrockneter Form ohne weiteres möglich ist. Das Einbringen der Reagenzien kann dabei beispielsweise durch Drucken oder Dispensieren erfolgen. Es ist auch möglich, die Reagenzien dadurch in das Testelement einzubringen, dass sie in saugfähigen Materialien, wie Papieren, Vliesen oder Membranen imprägniert in das Testelement eingelegt werden. Nach dem Platzieren der Reagenzien und dem Einlegen der saugfähigen Materialien, beispielsweise der porösen, saugfähigen Matrix (Membran) und gegebenenfalls weiterer saugfähiger Materialien (Waste-Vlies etc.) werden Ober- und Unterteil des Testelements miteinander verbunden, beispielsweise verklipst, verschweißt, verklebt und dergleichen mehr.
  • Alternativ ist es möglich, dass die Bodenschicht neben den fluidischen Strukturen auch die Einlassöffnungen für Flüssigkeiten und die Entlüftungsöffnungen aufweist. In diesem Fall kann die Deckschicht völlig ohne Öffnungen ausgebildet sein, gegebenenfalls mit Ausnahme einer zentralen Aussparung zur Aufnahme einer Antriebseinheit. Besonders in diesem Fall kann das Oberteil einfach aus einer Kunststofffolie bestehen, die auf das Unterteil aufgeklebt oder mit diesem verschweißt wird.
  • Üblicherweise enthält der Probenkanal eine Zone zum Abtrennen partikulärer Bestandteile aus der flüssigen Probe. Insbesondere falls als Probenmaterial Blut oder andere Körperflüssigkeiten mit zellulären Bestandteilen verwendet werden, dient diese Zone dem Abtrennen der zellulären Probenbestandteile. Aus Blut kann so durch Abtrennen insbesondere der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) nahezu farbloses Plasma oder Serum gewonnen werden, das sich für nachfolgende visuelle oder optische Nachweismethoden in der Regel besser eignet als das stark gefärbte Blut.
  • Vorzugsweise erfolgt das Abtrennen zellulärer Probenbestandteile durch Zentrifugation, d. h. durch schnelles Rotieren des Testelements nach Befüllen mit flüssiger Probe. Das erfindungsgemäße Testelement enthält zu diesem Zweck geeignet dimensionierte und geometrisch gestaltete Kanäle und/oder Kammern. Insbesondere enthält das Testelement für die Abtrennung von zellulären Blutbestandteilen eine Erythrozytensammelzone (Erythrozytenkammer oder Erythrozytenfalle) und eine Serum- bzw. Plasmasammelzone (Serum- bzw. Plasmakammer).
  • Zur Steuerung des Fließens der Probenflüssigkeit im Testelement kann dieses vor allem im Probenkanal Ventile, insbesondere sogenannte nicht-schließende (non-closing) oder geometrische Ventile oder Hydrophobsperren, enthalten. Diese Ventile dienen als Kapillarstopps. Durch sie kann sichergestellt werden, dass eine gezielte zeitliche und räumliche Steuerung des Probenflusses durch den Probenkanal und die einzelne Zone des Testelements möglich wird.
  • Insbesondere kann der Probenkanal eine Probendosierzone aufweisen, die ein genaues Abmessen der - zunächst im Überschuss aufgegebenen - Probe erlaubt. In einer bevorzugten Ausführungsform reicht die Probendosierzone von der Probenaufgabeöffnung über ein entsprechendes Stück eines Probenkanals bis zu einem Ventil in der Fluidikstruktur, insbesondere einem geometrischen Ventil oder einer Hydrophobsperre. Die Probenaufgabeöffnung kann dabei zunächst einen Überschuss an Probenmaterial aufnehmen. Die Probe fließt entweder getrieben durch Kapillarkräfte oder durch Zentrifugation angetrieben von der Probenaufgabenzone in die Kanalstruktur und füllt diese bis zum Ventil. Überschüssige Probe bleibt dabei zunächst in der Probenaufgabezone. Erst wenn die Kanalstruktur bis zum Ventil gefüllt ist, wird eine an die Probenaufgabezone angrenzende und vom Probenkanal abzweigende Probenüberschusskammer befüllt, beispielsweise durch Kapillarkräfte oder durch Zentrifugieren des Testelements. Dabei muss sichergestellt werden, dass durch geeignete Wahl des Ventils das abzumessende Probenvolumen vorerst nicht über das Ventil hinweg transportiert wird. Sobald überschüssige Probe in der entsprechenden Überlaufkammer abgefangen ist, befindet sich zwischen dem Ventil des Probenkanals auf der einen Seite und dem Eingang zur Probenüberlaufkammer auf der anderen Seite ein genau definiertes Probenvolumen. Durch Anlegen externer Kräfte, insbesondere durch Starten einer weiteren Zentrifugation wird dieses definierte Probenvolumen nun über das Ventil hinaus bewegt. Alle fluidischen Bereiche, die nach dem Ventil liegen und mit der Probe in Kontakt kommen, werden nun zunächst mit einem genau definierten Probenvolumen befüllt.
  • Der Probenkanal kann weiterhin einen Zufluss für weitere Flüssigkeiten außer der Probenflüssigkeit aufweisen. Beispielsweise kann in den Probenkanal ein zweiter Kanal münden, der z. B. mit einer Wasch- oder Reagenzflüssigkeit befüllbar ist.
  • Das erfindungsgemäße System aus Messgerät und Testelement dient zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe. Das Messgerät enthält dabei unter anderem zumindest einen Antrieb für die Rotation des Testelements und eine Auswerteoptik zum Auswerten des visuellen oder optischen Signals des Testelements.
  • Vorzugsweise kann die Optik des Messgeräts zur Fluoreszenzmessung mit ortsaufgelöster Detektion eingesetzt werden. Bei zweidimensionaler, d. h. flächiger Auswerteoptik, wird typischerweise zur Beleuchtung des Nachweisbereichs des Testelements und ggf. der Anregung von optisch detektierbaren Markierungen eine LED oder ein Laser eingesetzt. Die Detektion des optischen Signals erfolgt mittels CMOS oder CCD (typischerweise mit 640 x 480 Pixel). Der Strahlengang ist direkt oder gefaltet (z. B. über Spiegel bzw. Prismen).
  • Bei anamorphotischer Optik wird typischerweise die Beleuchtung bzw. Anregung mittels Beleuchtungsstrich, der den Nachweisbereich des Testelements vorzugsweise senkrecht zu den Nachweis- und Kontrollstrichen beleuchtet, bewirkt. Die Detektion kann hier über eine Diodenzeile erfolgen. Für die Beleuchtung und Auswertung der 2. Dimension kann in diesem Fall die Drehbewegung des Testelements ausgenutzt werden, um so mit der Diodenzeile über den auszuwertenden flächigen Bereich des Testelements zu scannen.
  • Als Antrieb zum Rotieren und Positionieren des Testelements kann ein DC-Motor mit Encoder oder ein Schrittmotor eingesetzt werden.
  • Vorzugsweise wird die Temperierung des Testelements im Gerät indirekt vorgenommen, beispielsweise durch Heizen oder Kühlen der Platte, auf die das scheibenförmige Testelement im Gerät aufliegt. Die Messung der Temperatur erfolgt vorzugsweise kontaktlos.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe. Dabei wird die Probe zunächst in die Probenaufgabeöffnung des Testelements aufgegeben. Anschließend wird das Testelement - bevorzugt um seine vorzugsweise zentrale Achse - rotiert; es ist jedoch auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren so auszuführen, dass die Rotation um eine andere, möglicherweise auch außerhalb des Testelements gelegene Achse, erfolgt. Dabei wird die Probe von der Probenaufgabeöffnung zum achsenfernen Ende der kapillaraktiven Zone, insbesondere der porösen, saugfähigen Matrix, transportiert. Die Rotation des Testelements wird dann soweit verlangsamt bzw. gestoppt, dass die Probe oder ein beim Durchströmen des Testelements aus der Probe gewonnenes Material (beispielsweise ein Gemisch der Probe mit Reagenzien, eine durch Vorreaktionen mit Reagenzien aus dem Testelement veränderte Probe, eine von bestimmten Bestandteilen befreite Probe wie Serum oder Plasma aus Vollblut nach Abtrennen der Erythrozyten, etc.) vom achsenfernen zum achsennahen Ende der kapillaraktiven Zone, insbesondere der porösen, saugfähigen Matrix, transportiert wird. Der Analyt wird schließlich in der kapillaraktiven Zone, insbesondere in der porösen, saugfähigen Matrix, oder einer ihr nachgelagerten Zone visuell oder optisch nachgewiesen.
  • Der Start der Wanderung der Probe(oder eines aus der Probe gewonnen Materials) durch die kapillaraktive Zone kann durch gezieltes Verlangsamen bzw. Stoppen der Rotation des Testelements zeitlich genau festgelegt und gesteuert werden. Nur wenn der Betrag Kapillarkraft (Saugkraft) in der kapillaraktiven Zone den Betrag der ihr entgegengesetzt gerichteten Zentrifugalkraft übersteigt, ist ein Bewegen der Probe in und durch kapillaraktive Zone möglich. Der Flüssigkeitstransport in der kapillaraktiven Zone lässt sich so gezielt starten. Beispielsweise kann so eine eventuelle Vorreaktion oder Vorinkubation der Probe oder eine Temperierung der Probe abgewartet werden, bevor die Rotation des Testelements so weit verlangsamt bzw. gestoppt wird, dass ein Einströmen der Probe in die kapillaraktive Zone ermöglicht wird.
  • Der Transport der Probe (oder eines aus der Probe gewonnen Materials) durch die kapillaraktive Zone kann durch erneute Rotation des Testelementes um seine vorzugsweise zentrale Achse gezielt verlangsamt oder gestoppt werden. Die bei der Rotation auftretenden Zentrifugalkräfte wirken der Kapillarkraft, die die Probenflüssigkeit vom achsenfernen Ende der kapillaraktiven Zone hin zum achsennahen Ende bewegen, entgegen. So ist eine gezielte Steuerung, insbesondere Verlangsamung, der Flussgeschwindigkeit der Probe in der kapillaraktiven Zone möglich, bis hin zur Umkehrung der Flussrichtung. Auf diese Weise kann beispielweise die Verweildauer der Probe in der kapillaraktiven Zone gesteuert werden.
  • Insbesondere ist es also möglich, die mit dem erfindungsgemäßen Testelement und Verfahren die Wanderungsrichtung der flüssigen Probe und/oder der weiteren Flüssigkeit durch die kapillaraktive Zone durch die Rotation des Testelements umzukehren, wobei dies auch mehrfach möglich ist, um so ein Hin- und Herbewegen der Flüssigkeit zu erreichen. Durch ein gezieltes Wechselspiel von Kapillarkräften, die die Flüssigkeit in der kapillaraktiven Zone von außen (d. h. vom achsenfernen Ende) nach innen (d. h. zum achsennahen Ende) transportieren, und entgegengesetzt gerichteten Zentrifugalkräften ist es unter anderem möglich, die Bindungseffizienz der Bindereaktionen in der kapillaraktiven Zone zu steigern, lösliche Reagenzien besser zu lösen und mit der Probe oder anderen Flüssigkeiten zu durchmischen, oder die Wascheffizienz ("bound-free separation") bei Affinitätsassays zu erhöhen.
  • Insbesondere im Zusammenhang mit Immunoassays kann der Nachweis nach dem Prinzip des Sandwichassays oder in Form eines kompetitiven Tests durchgeführt werden.
  • Es ist auch möglich, dass nach der Rotation des Testelements eine weitere Flüssigkeit auf das Testelement aufgegeben wird, die nach der Probe vom achsenfernen zum achsennahen Ende der kapillaraktiven Zone, insbesondere der porösen, saugfähigen Matrix, transportiert wird.
  • Die weitere Flüssigkeit kann insbesondere ein Puffer, bevorzugt ein Waschpuffer, oder eine Reagenzflüssigkeit sein. Durch die Zugabe der weiteren Flüssigkeit kann insbesondere im Zusammenhang mit Immunoassays ein im Vergleich zu herkömmlichen Teststreifen verbessertes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis erzielt werden, da die Zugabe der Flüssigkeit quasi als Waschschritt nach der Bound-Free-Trennung eingesetzt werden kann.
  • Die Erfindung weist die folgenden Vorteile auf:
    Die Kombination des Flüssigkeitstransports mittels Zentrifugalkräften und mittels Saugkräften in kapillaraktiven Zonen, insbesondere in porösen, saugfähigen Matrixmaterialien, erlaubt eine präzise Steuerung von Flüssigkeitsströmen. Erfindungsgemäß transportiert die kapillaraktive Zone, insbesondere die poröse, saugfähige Matrix, die Flüssigkeit von einem achsenfernen Ende hin zu einem achsennahen Ende, d. h. von der Peripherie des scheibenförmigen Testelements hin in Richtung der Drehachse. Die Zentrifugalkraft, die ebenfalls zum Bewegen der Flüssigkeiten benutzt werden kann, wirkt dieser Transportrichtung genau entgegen. Durch gezielte Steuerung der Rotation des Testelements (wie z. B. schnelleres/langsameres Rotieren, An- und Abschalten der Rotationsbewegung) ist es deshalb möglich, den Fluss der Probenflüssigkeit in der kapillaraktiven Zone, insbesondere in der porösen, saugfähigen Matrix, zu verlangsamen oder zu stoppen, so dass gezielte und definierte Reaktionsbedingungen eingehalten werden können. Gleichzeitig erlaubt die Verwendung der porösen, saugfähigen Matrix, die im Wesentlichen als Abfangmatrix für die Bound-Free-Separation in Immunoassays dient, ein effizientes Abfangen von Probenbestandteilen im Verlauf des Immunoassays. Insbesondere ist es durch das Wechselspiel von Zentrifugal- und Kapillarkräften (Saugkräften) möglich, ohne gesteigerten technischen Aufwand ein Hin- und Herbewegen der Probe über eine Reagenzienzone, insbesondere eine Zone mit immobilisierten Reagenzien (v. a. Abfangzone für heterogene Immunoassays), zu ermöglichen und so ein effektiveres Auflösen der Reagenzien, Mischen der Probe mit Reagenzien bzw. ein Abfangen von Probenbestandteilen an immobilisierten Bindepartnern zu gewährleisten. Gleichzeitig ist es möglich, Verarmungseffekte bei der Bindung von Probenbestandteilen (v. a. Analyt) an immobilisierte Bindepartner auszuschalten und so die Bindeeffizienz zu steigern (d. h. an Analyt verarmte Probenteile können beim Hin- und Herbewegen der Probe über die Abfangzone und/oder durch effizientes Durchmischen durch analytreiche Probenteile ersetzt werden). Darüber hinaus kann durch das Hin- und Herbewegen von Flüssigkeiten in der kapillaraktiven Zone ein möglichst effizientes Ausnutzen der kleinen Flüssigkeitsvolumina nicht nur für Reaktionszwecke (hier wird insbesondere das Probenvolumen ausgenutzt) sondern auch für Waschzwecke, beispielsweise zur besseren Diskriminierung von gebundenem und freiem Label in der Abfangzone, bewirkt werden. Dadurch lassen sich effektiv die Proben- und Flüssigreagenzienmenge sowie Waschpuffermengen minimieren.
  • Durch die vorzugsweise zentrale Lage der Drehachse innerhalb des Testelements ist es möglich, sowohl das Testelement selbst als auch das dazugehörige Messgerät möglichst kompakt zu gestalten. Bei chipförmigen Testelementen, wie sie beispielsweise in Figur 1 und 2 von US 2004/0265171 gezeigt sind, liegt die Drehachse außerhalb des Testelements. Ein dazugehöriger Drehteller oder Rotor ist somit zwangsläufig größer als bei einem Testelement mit identischen Ausmaßen, bei dem aber die Drehachse innerhalb des Testelements, vorzugsweise zentral angeordnet ist, wie dies bei den erfindungsgemäßen Testelementen der Fall ist.
  • Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele und Figuren näher erläutert. Hierbei wird jeweils auf immunologische Sandwich-Assays Bezug genommen. Die Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Sie kann auf andere Arten der Immunoassays, insbesondere auch auf kompetitive Immunoassays, oder andere Arten von spezifischen Bindeassays (beispielsweise solche, die als Bindepartner Zucker und Lectine, Hormone und deren Rezeptoren, oder auch komplementäre Nukleinsäurepaare verwenden) ebenfalls angewandt werden. Typische Vertreter dieser spezifischen Bindeassays sind dem Fachmann an sich bekannt (im Zusammenhang mit Immunoassays wird hier ausdrücklich auf die Figuren 1 und 2 und die dazugehörigen Beschreibungspassagen des Dokuments US 4,861,711 Bezug genommen) und können auf die vorliegende Erfindung ohne weiteres übertragen werden. In den nachfolgenden Beispielen und Figuren wird als typischer Vertreter der kapillaraktiven Zone des erfindungsgemäßen Testelements eine poröse saugfähige Matrix (Membran) beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf eine solche Matrix beschränkt. Beispielsweise ist es möglich, statt der Matrix einen kapillaraktiven Kanal, der gegebenenfalls auch noch Mikrostrukturen zur Steuerung der Flüssigkeitsströme oder zum Bereitstellen bzw.
  • Immobilisieren von Reagenzien oder zum Mischen von Flüssigkeiten und/oder Reagenzien aufweisen kann.
    • Figur 1 zeigt in schematischer Darstellung eine Aufsicht auf eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testelements. Der Klarheit halber ist dabei lediglich die Schicht des Testelements dargestellt, die die fluidischen Strukturen enthält. Die gezeigte Ausführungsform enthält dabei nur eine Öffnung zum Einbringen von Proben- und/oder Waschflüssigkeit. Die Abtrennung störender Probenbestandteile erfolgt in dieser Ausführungsform, nach dem die Probe mit Reagenzien kontaktiert wurde.
    • Figur 2 zeigt schematisch eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testelements. Auch hier wurde lediglich die Struktur abgebildet, die die fluidischen Elemente des Testelements aufweist. In dieser Ausführungsform des Testelements gibt es zwei separate Proben- und Waschpufferaufgabeöffnungen. Eine Abtrennung der zellulären Probenbestandteile erfolgt hier bereits, bevor die Probe mit Reagenzien in Kontakt gebracht wird.
    • Figur 3 zeigt eine Variante der Ausführungsform gemäß Figur 1 in schematischer Darstellung. Auch hier erfolgt die Abtrennung zellulärer Probenbestandteile, nach dem die Probe mit Reagenzien in Kontakt gebracht wurde. Allerdings weist die Struktur gemäß Figur 3 eine separate Zuführung für Waschflüssigkeit auf.
    • Figur 4 zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testelements in schematischer Ansicht analog Figur 2.
    • Figur 5 stellt eine geringfügige Weiterentwicklung des Testelements gemäß Figur 3 dar. Im Unterschied zur Ausführungsform gemäß Figur 3 enthält Figur 5 eine andere geometrische Anordnung des Waste-Vlieses und eine andere Art von Ventil am Ende des Probendosierabschnittes.
    • Figur 6 zeigt schematisch eine Aufsicht auf eine Weiterentwicklung des Testelements gemäß Figur 5. Im Unterschied zu der Ausführungsform gemäß Figur 5 enthält die Ausführungsform gemäß Figur 6 eine fluidische Struktur zur Aufnahme eines Probenüberschusses.
    • Figur 7 ist eine schematische Darstellung einer weiteren Variante des Testelements gemäß Figur 3. Funktional sind die fluidischen Strukturen im Wesentlichen analog denen von Figur 3. Allerdings sind sie geometrisch anders ausgerichtet und gestaltet.
    • Figur 8 zeigt schematisch eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testelements. Die Strukturen in Figur 8 entsprechen dabei im Wesentlichen den Funktionen, die durch das Testelement gemäß Figur 4 bereits bekannt sind.
    • Figur 9 zeigt schematisch eine Aufsicht auf eine Alternative zum Testelement gemäß Figur 6. Im Unterschied zu der Ausführungsform gemäß Figur 6 enthält die Ausführungsform gemäß Figur 9 eine achsenferne Probenaufgabeöffnung, die die Probe über eine Kapillare zunächst näher ans Zentrum des Testelements heranführt, das heißt in einen achsennahen Bereich.
    • Figur 10 zeigt den typischen Kurvenverlauf für Troponin T-Messungen in Vollblutproben (Konzentration an Troponin T in ng/ml aufgetragen gegen die Signalstärke (counts)). Die Proben wurden mit rekombinantem Troponin T auf die jeweilige Konzentration aufgestockt. Die Daten gehören zu Beispiel 2 und wurden mit Hilfe von Testelementen gemäß Figur 6/ Beispiel 1 erhalten.
  • Die Ziffern und Abkürzungen in den Figuren haben die folgende Bedeutung:
    • 1
    scheibenförmiges Testelement (Disk)
    2
    Substrat (z. B. ein- oder mehrteilig, Spritzguss, gefräst, aus Schichten aufgebaut etc.)
    3
    zentrale Aussparung (Antriebsloch)
    4
    Probenaufgabeöffnung
    5
    Probendosierzone (Dosierabschnitt des Kanals)
    6
    Kapillarstopp (z. B. hydrophobe Barriere, geometrisches/nicht-schließendes Ventil)
    7
    Behälter für Probenüberschuss
    8
    Kapillarstopp (z. B. hydrophobe Barriere, geometrisches/nicht-schließendes Ventil)
    9
    Kanal
    10
    Serum-/Plasmasammelzone (Serum-/Plasmakammer)
    11
    Erythrozytensammelzone (Erythrozytenkammer)
    12
    poröse, saugfähige Matrix (Membran)
    13
    Waste (Vlies)
    14
    Kapillarstopp (z. B. hydrophobe Barriere, geometrisches/nicht-schließendes Ventil)
    15
    Kanal
    16
    Zugabeöffnung für weitere Flüssigkeiten, z. B. Waschpuffer
    17
    Entlüftungsöffnung
    18
    Dekantierkanal
    19
    Kapillarstopp (z. B. hydrophobe Barriere, geometrisches/nicht-schließendes Ventil)
    20
    Auffangreservoir
    21
    Kapillarkanal
  • Die Figuren 1 bis 9 zeigen unterschiedliche bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Testelements (1). Im Wesentlichen ist jeweils das Substrat (2), enthaltend die fluidischen Strukturen und die zentrale Aussparung (Antriebsloch 3), abgebildet. Neben dem Substrat, das zum Beispiel ein oder mehrteilig sein kann, und mittels Spritzguss, Fräsen oder durch Laminieren von entsprechenden Schichten aufgebaut sein kann, enthält das erfindungsgemäße, scheibenförmige Testelement (1) auch in der Regel eine Deckschicht, die in den Figuren der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt ist. Grundsätzlich kann die Deckschicht ebenfalls Strukturen tragen, in der Regel aber wird sie außer den Öffnungen für die Proben und/oder weiteren auf das Testelement aufzugebenden Flüssigkeiten keinerlei Strukturen aufweisen. Die Deckschicht kann auch vollkommen ohne Öffnungen gestaltet sein, beispielsweise in Form einer Folie, die mit dem Substrat verbunden ist und die darin befindlichen Strukturen abschließt.
  • Die Ausführungsformen, die in den Figuren 1 bis 9 dargestellt sind, zeigen fluidische Strukturen, die weitgehend gleiche Funktionen erfüllen, auch wenn sie im Detail von Ausführungsform zu Ausführungsform sich unterscheiden. Der grundsätzliche Aufbau und die grundsätzliche Funktion soll deshalb hier näher anhand der Ausführungsform gemäß Figur 1 erläutert werden. Die Ausführungsformen gemäß Figur 2 bis 9 werden anschließend lediglich anhand der spezifischen Unterschiede zueinander näher erläutert, um unnötige Wiederholungen zu vermeiden.
  • Figur 1 zeigt eine erste bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen, scheibenförmigen Testelements (1). Das Testelement (1) enthält ein Substrat (2), welches die fluidischen und mikrofluidischen sowie chromatographischen Strukturen enthält. Das Substrat (2) ist durch ein entsprechendes Gegenstück (Deckschicht) abgedeckt (nicht gezeigt), welches Probenaufgabe und Lüftungsöffnungen enthält, die zu den Strukturen im Substrat (2) korrespondieren. Sowohl die Deckschicht als auch das Substrat (2) weisen eine zentrale Aussparung (3) auf, die im Zusammenwirken mit einer entsprechenden Antriebseinheit in einem Messgerät ein Rotieren des scheibenförmigen Testelements (1) ermöglichen. Alternativ ist es möglich, dass das Testelement (gemäß einer der Figuren 1 bis 9) keine solche zentrale Aussparung (3) aufweist und der Antrieb über eine entsprechend den äußeren Konturen des Testelements gestaltete Antriebseinheit des Messgeräts rotiert wird, beispielsweise einen rotierenden Teller, in den das Testelement in eine seiner Form entsprechenden Vertiefung eingelegt wird.
  • Probenflüssigkeit, insbesondere Vollblut, wird dem Testelement (1) über die Probenaufgabeöffnung (4) zugeführt. Angetrieben durch Kapillarkräfte und/oder Zentrifugalkräfte füllt die Probenflüssigkeit die Probendosierzone (5). Die Probendosierzone (5) kann dabei auch die getrockneten Reagenzien beinhalten. Sie wird durch die Kapillarstopps (6 und 8), die beispielsweise als hydrophobe Barriere oder als geometrisches/nicht schließendes Ventil ausgebildet sein können, begrenzt. Die Begrenzung der Probendosierzone (5) durch die Kapillarstopps (6, 8) gewährleistet dabei, dass ein definiertes Probenvolumen aufgenommen und in die fluidischen Zonen, die stromabwärts der Probendosierzone (5) liegen, weitergegeben wird. Bei Rotation des Testelements (1) wird ein eventueller Probenüberschuss von der Probenaufgabeöffnung (4) und der Probendosierzone (5) in den Behälter für Probenüberschuss (7) überführt, während die abgemessene Menge an Probe aus der Probendosierzone (5) in den Kanal (9) überführt wird.
  • Bei entsprechenden Rotationsgeschwindigkeiten wird in Kanal (9) die Abtrennung roter Blutkörperchen und anderer zellulärer Probenbestandteile gestartet. Die in der Probendosierzone (5) enthaltenen Reagenzien sind beim Eintritt der Probe in den Kanal (9) bereits gelöst in der Probe vorhanden. Der Eintritt der Probe in Kanal (9) über den Kapillarstopp (8) führt dabei zu einer Durchmischung der Reagenzien in der Probe.
  • Die Möglichkeit der zeitlichen Steuerung der Rotationsvorgänge, die mit dem erfindungsgemäßen Testelement möglich sind, erlaubt dabei eine gezielte Steuerung der Verweilzeiten und damit der Inkubationszeit der Probe mit Reagenzien und der Reaktionszeiten.
  • Während der Rotation wird die Reagenz-Proben-Mischung in die fluidischen Strukturen (10) (Serum-/Plasmasammelzone) und (11) (Erythrozytensammelzone) geleitet. Aufgrund der Zentrifugalkräfte, die auf die Reagenz-Proben-Mischung wirken, wird Plasma bzw. Serum von roten Blutkörperchen getrennt. Die roten Blutkörperchen sammeln sich dabei in der Erythrozytensammelzone (11), während das Plasma im Wesentlichen in der Sammelzone (10) verbleibt.
  • Im Gegensatz zu Testelementen, die Membranen oder Vliese zum Abtrennen partikulärer Probenbestandteile nutzen (beispielsweise Glasfaservliese oder asymmetrisch poröse Kunststoffmembranen zum Abtrennen roter Blutkörperchen aus Vollblut, allgemein als Blut abtrennende Membranen oder Vliese bezeichnet) kann das Probenvolumen mit den erfindungsgemäßen Testelementen wesentlich effektiver ausgenutzt werden, da praktisch keine Totvolumina (z. B. Volumen der Faserzwischenräume oder Poren) vorhanden sind, aus denen die Probe nicht wieder entnommen werden kann. Außerdem neigen diese Blut abtrennenden Membranen und Vliese des Standes der Technik teilweise zur unerwünschten Adsorption von Probenbestandteilen (z. B. Proteinen) oder zur Zerstörung (Lyse) von Zellen, was mit den erfindungsgemäßen Testelementen ebenfalls nicht beobachtet wird.
  • Wird die Rotation des Testelements (1) angehalten oder verlangsamt, wird das Reagenz-Plasma-Gemisch (in dem sich bei Anwesenheit des Analyten im Falle eines Immunoassays, beispielsweise Sandwichkomplexe aus Analyt- und Antikörperkonjugaten gebildet haben) durch die Saugwirkung der porös-saugfähigen Matrix (12) in diese aufgenommen und durch diese hindurchgeleitet. Im Fall von Immunoassays werden durch die immobilisierten Bindepartner, die in der Membran (12) enthalten sind, die analythaltigen Komplexe in der Nachweiszone abgefangen und in der Kontrollzone ungebundenes, gelabeltes Konjugat gebunden. Das an die poröse, saugfähige Matrix angrenzende Vlies (13) unterstützt dabei die Bewegung der Probe durch die Membran (12). Das Vlies (13) dient darüber hinaus der Aufnahme der Probe nach dem Durchströmen der Membran (12).
  • Nachdem die flüssige Probe die fluidische Struktur des Testelements (1) von der Probenaufgabeöffnung (4) bis zum Vlies (13) durchströmt hat, wird in einem nachfolgenden Schritt Waschpuffer in die Probenaufgabeöffnung (4) pipettiert. Durch dieselbe Kombination von Kapillar-, Zentrifugal- und chromatographischen Kräften durchströmt der Waschpuffer die entsprechenden fluidischen Strukturen des Testelements (1) und wäscht insbesondere die Membran (12), wo sich nunmehr die gebundenen Analytkomplexe befinden und entfernt so überschüssige Reagenzreste. Der Waschschritt kann ein oder mehrmals wiederholt werden, um so das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu verbessern. Das erlaubt eine Optimierung der Nachweisgrenze für den Analyten und eine Erhöhung des dynamischen Messbereichs.
  • Der Probenkanal, in dem die flüssige Probe im Testelement (1) von der Probenaufgabeöffnung (4) zum achsenfernen ersten Ende der Membran (12) transportiert wird, umfasst im vorliegenden Fall die Probendosierzone (5), den Kapillarstopp (8), den Kanal (9), die Serum-/Plasmasammelzone (10) und die Erythrozytenkammer (11). In anderen Ausführungsformen kann der Probenkanal aus mehr oder weniger Einzelzonen/-breichen/- kammern bestehen.
  • Die Figuren 3, 5, 6, 7 und 9 zeigen im Wesentlichen analoge Ausführungsformen zu Figur 1. Figur 3 unterscheidet sich von Figur 1 dadurch, dass sich einerseits an die Probenaufgabeöffnung (4) kein Behälter für Probenüberschuss (7) anschließt und am Ende des Probendosierabschnitts (5) kein Kapillarstopp vorhanden ist (d. h. hier ist ein dosierter Probenauftrag erforderlich) und andererseits dadurch, dass eine separate Zugabeöffnung (16) für weitere Flüssigkeiten, wie z. B. Waschpuffer, und ein dazugehöriger Kanal (15) vorhanden sind, der den Puffer zur Membran (12) transportieren kann. Der Transport des Puffers zur Membran (12) kann dabei auf Kapillarkräften oder Zentrifugalkräften beruhen.
  • Die Ausführungsform gemäß Figur 5 ist weitgehend identisch mit der Ausführungsform gemäß Figur 3. Die beiden Ausführungsformen unterscheiden sich lediglich durch die Form des Waste-Vlieses (13) und dadurch, dass das Testelement gemäß Figur 5 einen Kapillarstopp (8) am Ende des Probendosierabschnitts (5) aufweist.
  • Die Ausführungsform gemäß Figur 6 ist wiederum im Wesentlichen identisch mit der Ausführungsform gemäß Figur 5 und unterscheidet sich von dieser durch das zusätzliche Vorhandensein eines Behälters für Probenüberschuss (7) im Bereich zwischen der Probendosieröffnung (4) und der Probendosierzone (5). Hier ist kein dosiertes Aufbringen der Probe erforderlich (analog Figur 1).
  • Die Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testelements (1) gemäß Figur 7 entspricht im Wesentlichen dem Testelement (1) der Figur 6. Beide Ausführungsformen weisen die gleichen fluidischen Strukturen und Funktionen auf. Lediglich die Anordnung und geometrische Ausgestaltung ist unterschiedlich. Die Ausführungsform gemäß Figur 7 weist zusätzliche Entlüftungsöffnungen (17) auf, die aufgrund der andersartigen Dimensionierung der fluidischen Strukturen im Vergleich zu Figur 6 notwendig sind, um ein Befüllen der Strukturen mit Proben oder Waschflüssigkeit zu ermöglichen. Kanal (9) ist hier als dünne Kapillare ausgestaltet, die erst beim Rotieren des Testelements befüllt wird (d. h. ein Überwinden des Kapillarstopps (8) ist nur mittels Zentrifugalkraft möglich). Bereits während der Rotation ist es mit dem Testelement (1) gemäß Figur 7 möglich, gewonnenes Plasma aus der Erythrozytensammelzone 11 abzuführen; dazu dient die Dekantiereinheit 18, die schließlich in die Serum-/Plasmasammelzone 10 mündet.
  • Die Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testelements (1) gemäß Figur 9 entspricht im Wesentlichen dem Testelement (1) der Figur 6. Beide Ausführungsformen weisen die gleichen fluidischen Strukturen und Funktionen auf. Lediglich die Anordnung und geometrische Ausgestaltung ist unterschiedlich. Die Ausführungsform gemäß Figur 9 weist grundsätzlich eine weiter außen, das heißt achsferne, Probenaufgabeöffnung (4) auf. Dies kann vorteilhaft sein, wenn das Testelement (1) zum Befüllen mit Probe bereits in einem Messgerät eingebracht ist. Dem Benutzer kann in diesem Fall die Probenaufgabeöffnung (4) leichter zugänglich gemacht werden als dies bei Testelementen gemäß Figur 1 bis 8 möglich ist, wo die Probenaufgabeöffnung (4) jeweils achsnah (d. h. entfernt vom äußeren Rand des Testelements) angeordnet ist.
  • Im Gegensatz zur Ausführungsform gemäß Figur 1, 3, 5, 6, 7 und 9 findet in den Ausführungsformen gemäß Figur 2, 4 und 8 die Abtrennung der zellulären Probenbestandteile aus der Probenflüssigkeit statt, bevor die Probe mit Reagenzien in Kontakt kommt. Das hat den Vorteil, dass die Verwendung von Vollblut oder Plasma bzw. Serum als Probenmaterial nicht zu unterschiedlichen Messergebnissen führt, da stets zunächst Plasma bzw. Serum mit den Reagenzien in Kontakt kommt und das Auflöse-/Inkubations-/Reaktionsverhalten damit praktisch gleich sein sollte. Auch in den Ausführungsformen gemäß Figur 2, 4 und 8 wird die flüssige Probe zunächst über die Probenaufgabeöffnung (4) auf das Testelement (1) aufgegeben. Durch Kapillarkräfte und/oder Zentrifugalkräfte wird die Probe anschließend von der Probenaufgabeöffnung (4) in die Kanalstrukturen weitertransportiert. In den Ausführungsformen gemäß Figur 2 und 4 wird die Probe nach dem Aufgeben in die Probenaufgabeöffnung (4) in einem Probendosierabschnitt (5) überführt und anschließend durch Rotation eine Serum-/Plasmaabtrennung vom Vollblut bewirkt. Die unerwünschten zellulären Probenbestandteile, im Wesentlichen Erythrozyten, sammeln sich dabei in der Erythrozytenfalle (11), während Serum bzw. Plasma sich in der Zone (10) ansammeln. Über eine Kapillare wird das Serum aus der Zone (10) entnommen und in die Kanalstruktur (9) weitertransportiert, wo getrocknete Reagenzien untergebracht sind und beim Einströmen der Probe gelöst werden. Durch nochmaliges Rotieren des Testelements (1) kann die Proben-Reagenz-Mischung aus Kanalstruktur (9) den Kapillarstopp (14) überwinden und so über den Kanal (15) zur Membran (12) gelangen. Beim Verlangsamen oder Anhalten der Rotation wird die Proben-Reagenz-Mischung über die Membran (12) in das Waste-Vlies (13) transportiert.
  • Die Ausführungsformen gemäß Figur 2 und Figur 4 unterscheiden sich dabei darin, dass in Figur 2 ein Behälter für Probenüberschuss (7) vorgesehen ist, während die Ausführungsform gemäß Figur 4 eine solche Funktion nicht vorsieht. Wie in der Ausführungsform gemäß Figur 3 ist hier ein dosiertes Aufbringen der Probe zweckmäßig.
  • Figur 8 zeigt eine Variante der Ausführungsformen gemäß Figuren 2 und 4. Hier wird die Probe unmittelbar nach der Probenaufgabeöffnung (4) nach Passieren eines ersten geometrischen Ventils (19) durch Zentrifugieren in eine Erythrozytenabtrennstruktur (10, 11) überführt. Der mit (10) bezeichnete Bereich dient dabei als Serum-/Plasmasammelzone (10), aus der von Zellen befreites Serum bzw. Plasma nach dem Zentrifugieren über einen Kapillarkanal (21) weitergeleitet wird. Kammer (20) dient als Auffangreservoir für überschüssiges Serum bzw. Plasma, das nach vollständigem Befüllen des Probendosierabschnitts (5) unter Umständen aus der Serum-/Plasmasammelzone (10) nachfließt. Alle anderen Funktionen und Strukturen sind analog den Figuren 1 bis 7.
  • Durch gezieltes Gestalten der hydrophilen bzw. hydrophoben Eigenschaften der Oberflächen des Testelements (1) kann erreicht werden, dass ein Bewegen der Probenflüssigkeit und/oder Waschflüssigkeiten entweder nur mit Hilfe der Rotation und der daraus resultierenden Zentrifugalkräfte erfolgt oder durch eine Kombination von Zentrifugalkräften und Kapillarkräften. Letzteres erfordert zumindest teilweise hydrophilisierte Oberflächen in den fluidischen Strukturen des Testelements (1).
  • Wie weiter oben im Zusammenhang mit Figur 1 bereits beschrieben, weisen die erfindungsgemäßen Testelemente gemäß den Figuren 1, 2, 6, 7, 8 und 9 eine automatische Funktionalität auf, die ein verhältnismäßig genaues Abmessen eines Probenaliquots aus einer im Überschuss auf das Testelement aufgegebenen Probe erlaubt (so genanntes "Metering-System"). Dieses Metering-System ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Es umfasst im Wesentlichen die Elementen 4, 5, 6, und 7 der dargestellten Testelemente (1). Probenflüssigkeit, insbesondere Vollblut, wird dem Testelement (1) über die Probenaufgabeöffnung (4) zugeführt. Angetrieben durch Kapillarkräfte und/oder Zentrifugalkräfte füllt die Probenflüssigkeit die Probendosierzone (5). Die Probendosierzone (5) kann dabei auch die getrockneten Reagenzien beinhalten. Sie wird durch die Kapillarstopps (6 und 8), die beispielsweise als hydrophobe Barriere oder als geometrische/nicht schließende Ventile ausgebildet sein können, begrenzt. Die Begrenzung der Probendosierzone (5) durch die Kapillarstopps (6, 8) gewährleistet dabei, dass ein definiertes Probenvolumen aufgenommen und in die fluidischen Zonen, die stromabwärts der Probendosierzone (5) liegen, weitergegeben wird. Bei Rotation des Testelements (1) wird ein eventueller Probenüberschuss von der Probenaufgabeöffnung (4) und der Probendosierzone (5) in den Behälter für Probenüberschuss (7) überführt, während die abgemessene Menge an Probe aus der Probendosierzone (5) in den Kanal (9) überführt wird. Alternativ ist es auch möglich, anstelle der durch Rotation erzeugten Kraft, die die Probe bewegt, auch andere Kräfte hierzu einzusetzen, z. B. durch Anlegen eines Überdrucks auf der Probeneingangsseite bzw. eines Unterdrucks an der Probenausgangsseite. Das dargestellte Metering-System ist folglich nicht zwingend an rotierbare Testelemente gebunden, sondern kann auch in anderen Testelementen Anwendung finden.
  • Ähnliche Metering-Systeme sind beispielsweise aus US 5,061,381 bekannt. Auch in diesem Dokument wird ein System beschrieben, bei dem Probenflüssigkeit im Überschuss auf ein Testelement aufgegeben werden kann. Das Abmessen eines verhältnismäßig genauen Probenaliquots, das anschließend im Testelement weiterverarbeitet wird, erfolgt hierbei ebenfalls durch das Zusammenspiel einer Dosierzone ("metering chamber") und einer Zone für den Probenüberschuss ("overflow chamber"), wobei diese beiden Zonen - anders als bei der vorliegenden Erfindung - durch einen zwar schmalen, aber zumindest beim Befüllen stets Flüssigkeitsaustausch ermöglichenden Kontakt stehen. Probenflüssigkeit wird hier beim Befüllen des Testelements unmittelbar aufgetrennt in einen Teil, der durch einen breiten Kanal in die "metering chamber" geleitet wird, und einen Teil, der durch einen schmalen Kanal in die "overflow chamber" fließt. Nach dem vollständigen Befüllen der "metering chamber" wird das Testelement in Rotation versetzt und ein eventueller Probenüberschuss in die "overflow chamber" abgeleitet, so dass in der "metering chamber" nur das gewünschte, abgemessene Probenvolumen verbleibt, welches anschließend weiter verarbeitet wird.
  • Nachteilig an der Ausgestaltung des Metering-Systems gemäß US 5,061,381 ist, dass bei Probenvolumina, die auf das Testelement aufgegeben werden und die genau dem Mindestvolumen entsprechen oder nur geringfügig größer sind als das Mindestvolumen, die Gefahr besteht, dass die Dosierzone unterdosiert wird, da ja stets ein Anteil der Probe von Anfang an ungehindert in die "overflow chamber" fließt.
  • Dieses Problem wird bei der vorliegend vorgeschlagenen Ausgestaltung des Metering-Systems dadurch gelöst, dass zwischen Dosierzone und der Zone für den Probenüberschuss ein Kapillarstopp (hydrophobe Barriere bzw. ein geometrisches bzw. nicht-schließendes Ventil) angeordnet wird. Beim Befüllen des Testelements mit Probe wird deshalb zunächst die Probe praktisch ausschließlich in die Dosierzone geleitet. Der Kapillarstopp verhindert dabei, dass Probe in die Zone für den Probenüberschuss einfließen kann, bevor die Probendosierzone vollständig gefüllt ist. Auch bei Probenvolumina, die auf das Testelement aufgegeben werden und die genau dem Mindestvolumen entsprechen oder nur geringfügig größer sind als das Mindestvolumen, ist so sichergestellt, dass die Probendosierzone vollständig gefüllt ist.
    • Beispiel 1 Herstellung eines Testelements gemäß Figur 6 1.1. Herstellung des Substrats (2)
  • Mittels Spritzguss wird aus Polycarbonat (PC) (alternativ ist auch Polystyrol (PS), ABS-Kunststoff oder Polymethylmethacrylat (PMMA) als Material möglich) ein Substrat (2) gemäß Figur 6 gefertigt (Abmessungen ca. 60 x 80 mm2). Die einzelnen Kanäle und Zonen (fluidische Strukturen) haben dabei die folgenden Dimensionen (Tiefe der Strukturen (t) und ggf. deren Volumen (V); die Ziffern verweisen auf Figur 6 und die darin gezeigten Strukturen):
    • Kapillare zwischen 4 und 5: t = 500 µm
    • Nr.7: t= 700 µm
    • Nr.5: t= 150 µm; V= 26,5 mm3
    • Nr.8: t= 500 µm
    • Nr.9: t= 110 µm
    • Nr.10: t= 550 µm
    • Nr.11: t= 130 µm; V= 15 mm3
    • Nr.15: t= 150 µm; V= 11,4 mm3
  • Ein Übergang von weniger tiefen auf tiefere Strukturen ist dabei in der Regel für Flüssigkeiten in den Fluidikstrukturen nur möglich, wenn von außen Kraft (z. B. Zentrifugalkraft) einwirkt. Solche Übergänge wirken als geometrische (nicht-schließende) Ventile.
  • Das Substrat (2) weist neben den fluidischen Strukturen (s. o.) noch die Proben- und Pufferzugabeöffnungen (4, 16), Entlüftungsöffnungen (17) und die zentrale Aussparung (3) auf.
  • Die Oberfläche des Substrats (2), die die fluidischen Strukturen aufweist, kann anschließend mittels Plasmabehandlung gereinigt und hydrophiliert werden.
    • 1.2. Einbringen der Reagenzien
  • Ein Teil der für den Analytnachweis erforderlichen Reagenzien (z. B. biotinylierte Anti-Analyt-Antikörper und mit einem Fluoreszenzlabel markierte Anti-Analyt-Antikörper) werden mittels Piezodosierung als Lösung abwechselnd als punktförmige Reagenzienspots in den Probendosierabschnitt (5) eingebracht und anschließend getrocknet, so dass praktisch seine gesamte innere Fläche mit Reagenzien belegt ist.
  • Die Reagenzlösungen sind dabei wie folgt zusammengesetzt:
    Biotinylierter Antikörper: 50 mM Mes pH 5.6,; 100 µg/ml biotinylierte monoklonale Anti-Troponin T-Antikörper
    Gelabelte Antikörper 50 mM Hepes pH 7.4, mit Quadratsäurederivat Fluoreszenzfarbstoff JG9(in Polystyrol-Latexpartikel eingebettet) fluoreszenzmarkierte monoklonale Anti-Troponin T-Antikörper (0,35-prozentige Lösung)
    • 1.3. Einlegen der Membran (12)
  • In eine entsprechende Aussparung im Substrat (2) wird die poröse Matrix (12) (Nitrocellulosemembran auf Kunststoffträgerfolie; 21 x 5 mm2; mit 100 µm PE-Folie verstärkte Cellulosenitrat-Membran (Typ CN 140 von Sartorius, Deutschland)), in die mittels Strichimprägnierung (s. u.) eine Analytnachweislinie (Polystreptavidin) und eine Kontrolllinie (Polyhapten) eingebracht wurde, eingelegt und ggf. mittels doppelseitigem Klebeband fixiert.
  • Auf die zuvor beschriebene Cellulosenitrat-Membran wird durch Strichdosierung eine wässrige Streptavidinlösung (4,75 mg/ml) aufgebracht. Hierzu wird die Dosierung so gewählt (Dosiermenge 0,12 ml/min, Bahngeschwindigkeit 3 m/min), dass ein Strich mit einer Breite von ca. 0,4 mm entsteht. Dieser Strich dient zum Nachweis des zu bestimmenden Analyts und enthält ca. 0,95 µg Streptavidin pro Membran.
  • In einem Abstand von etwa 4 mm flussabwärts vom Streptavidinstrich wird unter identischen Dosierungsbedingungen eine wässrige Troponin T-Polyhapten-Lösung mit 0,3 mg/ml aufgebracht. Dieser Strich dient als Funktionskontrolle des Testelements und enthält ca. 0,06 µg Polyhapten pro Test.
    • 1.4. Aufbringen der Abdeckung
  • Anschließend wird die Abdeckung (Folie oder Spritzgussteil ohne Fluidikstrukturen, die bzw. das ggf. hydrophiliert sein kann) aufgebracht und gegebenenfalls mit dem Substrat (2) permanent verbunden, vorzugsweise verklebt, verschweißt oder verklipst.
    • 1.5. Einlegen des Waste-Vlieses (13)
  • Schließlich wird das Substrat gewendet und in die entsprechende Aussparung das Waste-Vlies (13) (13 x 7 x 1,5 mm3 großes Vlies aus 100 Teilen Glasfaser (Durchmesser 0,49 bis 0,58 µm, Länge 1000 µm) und 5 Teilen Polyvinylalkoholfasern (Kuralon VPB 105-2 von Kuraray) mit einem Flächengewicht von ca. 180 g/m2) eingelegt, welches dann mittels eines Klebebandes im Substrat (2) fixiert wird.
  • Durch die quasi selbstdosierende Probenaufnahmeeinheit (umfassend die Probenaufgabeöffnung (4), den Probendosierabschnitt (5) und den ihn begrenzenden Strukturen (Kapillarstopp (8) und Behälter für Probenüberschuss (7)) wird gewährleistet, dass unabhängig von der auf das Testelement (1) aufgegebenen Probenmenge (sofern sie ein Mindestvolumen (in diesem Beispiel 27 µl) überschreitet) bei Verwendung unterschiedlicher Testelemente reproduzierbar gleiche Probenmengen verwendet werden.
  • Durch die Verteilung der Reagenzien im gesamten Probendosierabschnitt (5), vorzugsweise in Form sich abwechselnder Reagenzienspots (d. h. kleiner, fast punktförmiger Reagenzienbezirke), in Kombination mit einer raschen Befüllung des Probendosierabschnitt (5) mit Probe wird ein homogenes Lösen der Reagenzien im gesamten Probenvolumen erreicht, insbesondere falls das Befüllen deutlich schneller erfolgt als das Lösen. Darüber hinaus erfolgt ein praktisch vollständiges Lösen der Reagenzien, so dass auch hier wieder eine gesteigerte Reproduzierbarkeit im Vergleich zu herkömmlichen, auf saugfähigen Materialien basierenden Testelementen (Teststreifen, Bio-Disks mit Reagenzienpads etc.) beobachtet wird.
    • Beispiel 2 Nachweis von Troponin T mit Hilfe des Testelements aus Beispiel 1
  • Auf das Testelement gemäß Beispiel 1 werden 27 µl Vollblut, dem unterschiedliche Mengen an rekombinantem Troponin T beigemischt wurden, aufgegeben. Das Testelement wird anschließend anhand des in Tabelle 1 angegebenen Ablaufs weiterbehandelt und abschließend die Fluoreszenzsignale für unterschiedliche Konzentrationen gemessen. Tabelle 1: Messablauf
    Zeit (min:sec) Dauer (min:sec) Rotation mit Umdrehungen pro Minute Aktion
    00:00 01:00 0 27 µl Probe aufgeben; Lösen der Reagenzien
    01:00 02:00 5000 Erythrozytenseparation und Inkubation
    03:00 01:00 800 Chromatographie (Signal generieren)
    04:00 00:10 0 12 µl Waschpuffer1) aufgeben
    04:10 02:00 800 Waschpuffertransport und Chromatographie
    06:10 00:10 0 12 µl Waschpuffer1) aufgeben
    06:20 02:00 800 Waschpuffertransport und Chromatographie
    08:20 00:10 0 12 µl Waschpuffer1) aufgeben
    08:30 02:00 800 Waschpuffertransport und Chromatographie
    10:30 0 Messen
    1) 100 mM Hepes, pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,095 % Natriumazid.
  • Die Messdaten sind in Figur 10 wiedergegeben. Dabei sind die jeweiligen Messsignale (in counts) gegen die Konzentration an rekombinantem Troponin T (c (TnT)) in [ng/ml]) aufgetragen. Die tatsächliche Troponin T-Konzentration in den Vollblutproben wurde mit der Referenzmethode "Roche Diagnostics Elecsys Troponin T Test" bestimmt.
  • Im Vergleich zu herkömmlichen immunochromatographischen Troponin T-Teststreifen, wie z. B. Cardiac Troponin T von Roche Diagnostics, ist die Nachweisgrenze für den quantitativ auswertbaren Messbereich mit dem erfindungsgemäßen Testelement nach unten verschoben (Cardiac Troponin T: 0,1 ng/ml; Erfindung: 0,02 ng/ml) und der dynamische Messbereich nach oben hin erweitert (Cardiac Troponin T: 2,0 ng/ml; Erfindung: 20 ng/ml). Zugleich zeigen die erfindungsgemäßen Testelemente eine verbesserte Präzision.

Claims (13)

  1. Testelement (1) zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, das im Wesentlichen scheibenförmig ist und um eine Achse, die senkrecht zur scheibenförmigen Testelementebene liegt, rotierbar ist, enthaltend
    - eine Probenaufgabeöffnung (4) zur Aufgabe einer flüssigen Probe,
    - eine kapillaraktive Zone (12), welche eine poröse, saugfähige Matrix (12) ist, wobei die kapillaraktive Zone (12) eine oder mehrere Zonen mit immobilisierten Reagenzien enthält, wobei die immobilisierten Reagenzien spezifische Bindereagenzien sind, welche dazu geeignet sind, aus der durch die kapillaraktive Zone (12) fließenden Probe gezielt den Analyten oder vom Analyten abgeleitete und mit diesem in Beziehung stehende Spezies abzufangen und welche in Form von Linien, Punkten, Mustern in oder auf dem Material der kapillaraktiven Zone (12) immobilisiert vorliegen, mit einem achsenfernen ersten Ende und einem achsennahen zweiten Ende, und
    - einen Probenkanal (9), der von der Probenaufgabeöffnung (4) über einen achsennahen Bereich zum achsenfernen ersten Ende der kapillaraktiven Zone (12) reicht, gekennzeichnet dadurch, dass
    das achsenferne erste Ende der kapillaraktiven Zone (12) mit dem Probenkanal (9) in Kontakt steht und
    die Probenaufgabeöffnung (4) achsennah ist und der Probenkanal (9) von der achsennahen Probenaufgabeöffnung (4) zum achsenfernen ersten Ende der kapillaraktiven Zone (12) reicht und
    der Probenkanal einen Zufluss für weitere Flüssigkeiten außer der Probenflüssigkeit aufweist.
  2. Testelement (1) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die poröse, saugfähige Matrix (12) ein Papier, eine Membran oder ein Vlies ist.
  3. Testelement (1) gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die kapillaraktive Zone (12) mit dem achsennahen zweiten Ende in Kontakt steht mit einem weiteren saugfähigen Material (13) oder einer saugfähigen Struktur, das bzw. die Flüssigkeit aus der kapillaraktiven Zone (12) aufnehmen kann.
  4. Testelement (1) gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenkanal (9) Zonen unterschiedlicher Dimensionen und/oder für unterschiedliche Funktionen enthält, insbesondere eine Zone mit löslichen Reagenzien und/oder eine Probendosierzone (5) und/oder eine Zone zum Abtrennen partikulärer Bestandteile aus der flüssigen Probe enthält.
  5. Testelement (1) gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenkanal (9) geometrische Ventile oder Hydrophobsperren (6, 8, 14, 19) enthält.
  6. Testelement (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenaufgabeöffnung (4) mit einer Probendosierzone (5) und einer Zone (7) für Probenüberschuss in Kontakt steht, wobei zwischen der Probendosierzone (5) und der Zone (7) für Probenüberschuss ein Kapillarstopp (6) vorhanden ist.
  7. Testelement (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, in den Probenkanal ein zweiter Kanal mündet, der vorzugsweise mit einer Wasch- oder Reagenzflüssigkeit befüllbar ist.
  8. Testelement (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine separate Zugabeöffnung (16) für weitere Flüssigkeiten, vorzugsweise Waschpuffer, und ein dazugehöriger Kanal (15) vorhanden sind, der den Puffer zur kapillaraktiven Zone (12) transportieren kann.
  9. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei
    - die Probe in die Probenaufgabeöffnung (4) des Testelements (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 aufgegeben wird,
    - das Testelement (1) rotiert wird, so dass die Probe zum achsenfernen Ende der kapillaraktiven Zone (12) transportiert wird,
    - die Rotation des Testelements (1) soweit verlangsamt wird bzw. gestoppt wird, so dass die Probe oder ein beim Durchströmen des Testelements (1) aus der Probe gewonnenes Material vom achsenfernen zum achsennahen Ende der kapillaraktiven Zone (12) gesaugt wird, und
    - der Analyt in der kapillaraktiven Zone (12) oder einer ihr nachgelagerten Zone visuell oder optisch nachgewiesen wird.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Rotation des Testelements (1) eine weitere Flüssigkeit auf das Testelement (1) aufgegeben wird, die nach der Probe vom achsenfernen zum achsennahen Ende der kapillaraktiven Zone (12) gesaugt wird.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Wanderung der flüssigen Probe und/oder der weiteren Flüssigkeit durch die kapillaraktive Zone (12) durch die Rotation des Testelements (1) gezielt verlangsamt oder gestoppt wird.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Wanderungsrichtung der flüssigen Probe und/oder der weiteren Flüssigkeit durch die kapillaraktive Zone (12) durch die Rotation des Testelements (1) umgekehrt wird.
  13. System zur Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe enthaltend ein Testelement (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und ein Messgerät, wobei das Messgerät
    - zumindest einen Antrieb für die Rotation des Testelements (1) und
    - eine Auswerteoptik zum Auswerten des visuellen oder optischen Signals des Testelements (1) aufweist.
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