DE19835869C2 - Biosensoren und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver­ fahren zur Herstellung von Biosensoren mit stabilen Enzymschichten und derart hergestellte Biosensoren. Derartige Biosensoren oder allgemein Sensoren auf der Basis von Biomolekülen (Enzymen) werden beispielswei­ se zur Detektion von chemischen Substanzen, bei­ spielsweise auf Basis optischer oder elektrochemi­ scher Signalwandlung benötigt.

Das Messprinzip derartiger Biosensoren beruht auf der spezifischen Wechselwirkung eines auf einem Trägerma­ terial immobilisierten Enzyms mit der zu bestimmenden Analytsubstanz. Der Stand der Technik ist bei Schel­ ler, F. und Schubert, F. in Biosensoren, Birkhäuser, Basel, Boston, Berlin 1989 beschrieben.

Biosensoren bzw. Bioreaktoren wiesen oft nur eine begrenzte Lebensdauer und oft eine ungenügende Signal­ stabilität auf und können daher zum Teil nur als Ein­ wegsensoren ausgeführt werden. Eine gezielte Anpas­ sung der Biosensoren an komplexe Probenmedien war bisher ebenfalls kaum möglich.

Die CA 104: 230534X in Pharmaceuticals, Band 104 (1986) Seite 367 beschreibt die Immobilisierung von biologisch aktiven Substanzen auf Substraten, bei­ spielsweise PTFE-Harzen oder Glas. Dabei wird das Substrat mit Glutaraldehydplasma polymerisiert und anschließend ein Enzym durch ein Tauchverfahren auf­ getragen.

Aus Biomaterials Band 17 (1996) Seite 1473 bis 1479 ist die Immobilisierung eines Enzyms auf einem Sub­ strat als technischer Biokatalysator bekannt.

Das Journal of Photopolymer Science and Technology, Band 8, Nr. 3 (1995) Seite 369 bis 376 zeigt einen Glukosesensor, bei dem Glukoseoxidase in einer porö­ sen Membran immobilisiert wird. Die immobilisierte Glukoseoxidase wird anschließend mit einem plasmapo­ lymerisierten Propargylalkohol beschichtet.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Biosenso­ ren sowie Biosensoren zur Verfügung zu stellen, die langzeitstabile, reproduzierbare und anpassbare sen­ sitive Eigenschaften besitzen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 sowie den Biosensor nach Anspruch 16 gelöst.

Dadurch, dass das Enzym auf dem Träger in eine durch ein Gasphasenabscheideverfahren erzeugte Polymerschicht eingebettet oder durch eine durch ein Gaspha­ senabscheideverfahren erzeugte Polymerschicht über­ deckt wird, wird eine sehr gute Immobilisierung des Enzyms erzielt, ohne die durch das Enzym realisierten spezifischen Wechselwirkungen mit den Analytsubstan­ zen zu verhindern. Weiterhin sind derartige Enzym- Träger-Verbunde durch eine hohe mechanische Stabili­ tät gekennzeichnet und besitzen als Biosensoren eine hohe Langzeitstabilität und Reproduzierbarkeit der durch sie erzeugten Messsignale. Dadurch wird das Einsatzgebiet derartiger enzymbasierter Biosensoren und Bioreaktoren ausgedehnt. Insbesondere kann durch Verwendung unterschiedlicher Polymerschichten das Verfahren an unterschiedliche, auch flexible Träger­ materialien angepasst werden.

Erfindungsgemäß wird die Polymerschicht durch ein Gasphasenabscheideverfahren, insbesondere ein Vakuum­ beschichtungsverfahren, wie beispielsweise CVD (che­ mische Gasphasenabscheidung) oder PVD (physikalische Gasphasenabscheidung), abgeschieden. So ist es mög­ lich, sämtliche Herstellungsprozesse in einer Vakuum­ kammer, gegebenenfalls bei jeweils angepassten Vaku­ umdrücken durchzuführen. Dadurch wird die Herstellung der stabilen Enzymschichten mit den Herstellungspro­ zessen für Bauelemente in der Mikroelektronik kompa­ tibel, wodurch die Herstellung von Biosensoren stark vereinfacht wird. Diese Gasphasenabscheidung kann durch Plasmapolymerisation, Polymersputtern und/oder Polymerdampfung erfolgen. Die Plasmapolymerisation kann dabei unter Vakuum oder auch unter Normaldruck durchgeführt werden. Als Monomere zur Herstellung de­ rartiger Plasmapolymere eignen sich die folgenden Verbindungen: organische Verbindungen, siliciumorga­ nische Verbindungen, Vinylverbindungen oder Thiophen­ derivate, insbesondere Hexamethyldisilazan, Hexamethyldisiloxan, Vinylalkohol, Vinylacetat oder auch Acrylamid. Dabei entstehen Polymerschichten mit einem hohen Maß an Quervernetzungen.

Erfindungsgemäß wird weiterhin die Sensibilisierung des Enzyms verbessert, wenn während der Gasphasenab­ scheidung der Polymerschicht und/oder dem Auftrag des Enzyms Metallnanopartikel in die entstehende Polymer­ schicht eingelagert werden. Die Metallnanopartikel können durch Metallverdampfung oder Metallsputtern vor oder während der Plasmapolymerisation erzeugt werden. Hierzu eignen sich insbesondere die Metalle Platin, Palladium, Gold, Zinn, Kupfer und/oder Sil­ ber.

Weitere vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungs­ gemäßen Verfahrens sowie des erfindungsgemäßen Bio­ sensors werden in den jeweiligen abhängigen Ansprü­ chen gegeben.

Werden die Schichten bei relativ hohen Leistungsdich­ ten hergestellt, so haben sie eine amorphe Struktur und können auch als amorphe Kohlenwasserstoffschich­ ten (a-CH) bzw. als amorphe siliciumhaltige Kohlen­ wasserstoffschichten (a-C, Si, H) bezeichnet werden.

Wird vor der Beschichtung des Trägermaterials mit dem Enzym eine Polymerschicht aufgetragen, so wird die Haftung des Enzyms und damit seine Immobilisierung verbessert. Gleichermaßen kann unmittelbar auf den Träger vor der Beschichtung mit dem Enzym eine Me­ talldünnschicht beispielsweise durch thermische Ver­ dampfung oder Plasmazerstäubung (Sputtern) aufge­ bracht werden. Diese Metalldünnschicht, die vorteil­ hafterweise Gold, Silber, Platin oder Kupfer, Palla­ dium, Zinn enthält, erleichtert den Elektronenübergang zwischen dem amperometrischen oder einem anderen elektrochemischen Signaltransducer und dem immobili­ sierten Enzym, erhöht die Leitfähigkeit des Trägerma­ terials und verbessert so die elektrischen Eigen­ schaften der erfindungsgemäßen Biosensoren.

Eine weitere Möglichkeit zum Auftrag des Enzyms auf das Trägermaterial besteht darin, dass das Enzym auf das Trägermaterial aufpipettiert wird. Dies kann bei­ spielsweise auch während der Plasmapolymerisation un­ ter Normaldruck durchgeführt werden. Wird das Enzym unter Vakuum aufpipettiert, so wird es gefrierge­ trocknet oder lyophilisiert. Hierbei kann ein Kry­ oprotektant, beispielsweise ein Polyelektrolyt oder eine Polyhydroxyverbindung Schäden an dem Enzym ver­ hindern.

Für die erfindungsgemäßen Biosensoren eignen sich als Enzym u. a. insbesondere Oxidasen oder Peroxidasen, beispielsweise Glukoseoxidasen, Glutamatoxidase, L-Aminosäureoxidase, Meerettichperoxidase, Tyrosina­ se, Alkoholoxidase oder Sulfitooxidase. Als Trägerma­ terial können poröse Kunststoff-Folien, beispielswei­ se aus Teflon oder Polypropylen, poröses Silicium, poröse Keramiken oder poröse Metalle Verwendung fin­ den.

Im Folgenden wird ein Beispiel für das erfindungsge­ mäße Verfahren beschrieben werden. Es zeigen:

Fig. 1a, 1c, 1d Biosensoren

Fig. 1b ein Beispiel für einen erfin­ dungsgemäßen Biosensor

Fig. 2 den Verlauf der Signalintensität bei verschiedenen Biosensoren.

Die Fig. 1a, 1c, 1d und 2 zeigen keine erfindungs­ gemäßen Biosensoren, sind jedoch für das Verständnis einzelner Aspekte der vorliegenden Erfindung hilf­ reich.

Wesentlich für die Erfindung ist die Erzeugung einer Plasmapolymerschicht zur Enzymstabilisierung oder Im­ mobilisierung während oder nach dem Auftragen des En­ zyms auf das Trägermaterial. Dabei werden Metallnano­ partikel in die Polymerschicht zur Sensibilisierung des Enzyms eingebracht. Weiterhin können folgende drei Verfahrensschritte zusätzlich durchgeführt wer­ den, die jeweils zu einer weiteren Verbesserung der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Enzym-Träger- Verbunde führen:

• 1. Abscheidung von Metalldünnschichten vor Auftrag des Enzyms zur Verbesserung der Leitfähigkeit des Trägermaterials;
• 2. Herstellung einer Polymerschicht unmittelbar auf dem Trägermaterial zur Verbesserung der Haftung und/oder zur Immobilisierung des anschließend aufgetragenen Enzyms; und/oder
• 3. Einbau zusätzlicher Redoxmediatoren in die Poly­ merschichten.

Sämtliche dieser Prozessschritte können in derselben Vakuumkammer bei verschiedenen Vakuumdruckbereichen durchgeführt werden. Als Druckbereiche haben sich die folgenden Werte als günstig erwiesen:
ca. 10^-6 Torr für die Metallverdampfung bzw. das Metallsputtern zur Abscheidung von Metalldünn­ schichten;
ca. 10^-1 Torr für die Plasmapolymerisation und die Metallverdampfung zur Erzeugung von Metall­ nanopartikeln;
ca. 1 Torr für die Plasmapolymerisation bei gleichzeitigem Vakuumpipettieren des Enzyms.

Für die Beschichtung des Trägermaterials mit einer Plasmapolymerschicht ist eine Plasmaentladung notwen­ dig, die durch eine hohe Gleichspannung, durch eine Wechselspannung (z. B. 50 Hz), durch eine Hochfrequenz (z. B. 13,56 MHz) oder durch eine Mikrowelle (z. B. 2,45 GHz) erzeugt werden kann.

Fig. 1a zeigt eine Enzymimmobilisierung durch eine ein Enzym 2 überdeckende Plasmapolymerschicht 3. Auf eine mikroporöse Polymerfolie 1 aus Nylon oder Teflon wird als Enzym 2 eine fungale Peroxidase durch Auf­ tropfen aufgebracht und absorbtiv oder kovalent immo­ bilisiert. Anschließend wird die betropfte Membran 1 in einen Vakuumrezipienten überführt und mit einer Plasmapolymerschicht 3 aus einem Hexamethyldisilazan- oder Vinylalkohol-Monomer bei einem Druck zwischen 0,1 und 10 Torr beschichtet. Die Schichtdicke der Plasmapolymerschicht 3 in Fig. 1a liegt im Nanometer­ bereich. In einem Beispiel, das einen Schichtaufbau wie in Fig. 1a beschrieben ergibt, wird als Enzym 2 eine fungale Peroxidase auf einem mikroporösen Me­ tallschwamm 1 aus Gold durch Auftropfen aufgebracht und kovalent immobilisiert. Anschließend wird dieser Enzym-Träger-Verbund als Biosensor wie im vorigen Beispiel mit einer Plasmapolymerschicht 3 beschichtet. Beide vorgenannten Beispiele sind keine Ausfüh­ rungsformen der Erfindung.

Fig. 1b zeigt ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Enzymimmobilisierung durch eine Plasmapolymerschicht 3, wobei das Enzym 2 durch eingelagerte Metallnano­ partikel 4 sensibilisiert wird. Wie bei den vorigen Beispielen wird auf eine mikroporöse Polymerfolie 1 aus Nylon oder Teflon eine fungale Peroxidase als En­ zym 2 aufgetropft. Anschließend wird der Träger 1 durch eine Plasmapolymerisation im Vakuum mit einer Plasmapolymerschicht 3 aus einem Hexamethyldisilazan- oder Vinylalkohol-Monomer beschichtet. Vor, während oder nach der Plasmapolymerisation im Vakuum erfolgt zusätzlich eine Verdampfung von Silber, Platin, Gold oder Palladium, die zur Einlagerung von Silber-, Pla­ tin-, Gold- bzw. Palladiumpartikeln 4 mit Größen im Nanometerbereich in die Plasmapolymerschicht führt.

Fig. 1c zeigt ein weiteres Beispiel einer nicht er­ findungsgemäßen Enzymimmobilisierung. Eine mikroporö­ se Nylonfolie 1 ist hier zur Verbesserung ihrer e­ lektrischen Leitfähigkeit zusätzlich mit einer Me­ tallschicht 5 aus Gold bzw. Silber bedampft. Sämtli­ che für die Bedampfung zugänglichen Oberflächen der Nylonfolie sowie ihrer für den Metalldampf zugängli­ chen Poren sind folglich mit Gold bzw. Silber be­ schichtet. Anschließend wird als Enzym 2 eine Tyrosi­ nase wie im ersten Beispiel aufgetropft und mit einer Plasmapolymerschicht 3 überschichtet.

Fig. 1d zeigt ein weiteres Beispiel einer nicht er­ findungsgemäßen Enzymstabilisierung und - immobilisierung. Eine mikroporöse Nylon- oder Teflon­ folie 1 wurde in einem Vakuumrezipienten mit einer Plasmapolymerschicht versehen. Anschließend wurde im Vakuumrezipienten mit einer vakuumtauglichen Mikropi­ pette als Enzym 2 eine Meerettichperoxidase auf die beschichtete mikroporöse Nylon- bzw. Teflonfolie auf­ gebracht. Während oder im Anschluss an das Aufbringen des Enzyms wurde eine Plasmapolymerschicht aus einem Vinylalkoholmonomer bzw. einem Monomergemisch aus Allylalkohol und Allylamin aufgebracht. Bei diesem Beispiel wurde während des Aufbringens beider Plasma­ beschichtungen Toluidenblau als Redoxmediator 6 dem Monomer hinzugefügt. Wie in Fig. 1d zu sehen ist, wurde der Redoxmediator in die Polymerschichten ein­ gelagert. Dieser Redoxmediator führt zu einer zusätz­ lichen Sensibilisierung und Stabilisierung des Enzyms 2 und damit zu einer Verbesserung der Eigenschaften des in diesem Beispiel vorgestellten Enzym-Träger- Verbundes.

In Fig. 2 ist das Ergebnis aus einem Versuch mit ver­ schiedenen nicht erfindungsgemäßen Plasmapolymerbe­ schichtungen dargestellt. Hierzu wurde fungale Pero­ xidase aus Arthromyces ramosus (ARP) auf eine poröse Nylonfolie immobilisiert und anschließend mit Plasma­ polymerschichten aus Hexamethyldisilazan (CH₃)₃Si-NH-Si(CH₃)₃) bzw. aus Vinylalkohol beschich­ tet. Anschließend wurde durch Flow Injection Analysis (FIA) eine fortlaufende Chemilumineszenzdetektion von 0,1 mM Wasserstoffperoxid in Gegenwart des immobili­ sierten ARP und von Luminol durchgeführt. Es zeigt sich, dass gegenüber den unbeschichteten Sensoren die Anfangsempfindlichkeit der durch die genannten Plas­ mapolymerschichten beschichteten Sensoren merklich verringert ist. Es ist jedoch deutlich zu erkennen, dass das Messsignal gegenüber dem unbeschichteten Sensor über längere Zeit deutlich stabilisiert ist.

Claims (17)

1. Verfahren zur Herstellung von Biosensoren mit stabilen Enzymschichten auf einem Trägermateri­ al, wobei das Enzym auf einem Trägermaterial im­ mobilisiert wird derart, daß sie in elektroni­ schem Kontakt mit einem Signaltransducer steht, und wobei während oder nach der Beschichtung des Trägermaterials mit dem Enzym auf dem Trägerma­ terial eine Polymerschicht abgeschieden wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerschicht durch ein Gasphasen- Abscheideverfahren abgeschieden wird, wobei wäh­ rend der Gasphasenabscheidung der Polymer­ schicht, die während oder nach der Beschichtung des Trägermaterials mit dem Enzym erfolgt, Me­ tallnanopartikel in die entstehende Polymer­ schicht eingelagert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gasphasenab­ scheidung durch Plasmapolymerisation, Polymer­ sputtern und/oder Polymerbedampfung erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Plasmapolymere siliciumorganische Verbindungen, Vinylverbindungen, Thiophenderivate, insbesonde­ re Hexamethyldisilazan (CH₃)₃Si-NH-Si-(CH₃)₃, Hexamethyldisiloxan (CH₃)₃Si-O-Si(CH₃)₃, Vinylal­ kohol (CH₂=CH-OH), Vinylacetat (CH₃CO₂CH=CH₂), Acrylamid (CH₃-CO₂-CH=CH₂) eingesetzt werden.

4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Beschichtung des Trägermaterials organische monomere Verbin­ dungen, insbesondere mit dem Enzym eine Metall­ dünnschicht und/oder eine Polymerschicht auf das Trägermaterial, vorzugsweise durch Gasphasenab­ scheidung, aufgebracht wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallschicht durch thermische Verdampfung oder durch Plasma­ zerstäubung (Sputtern) aufgebracht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallschicht eine Schicht aufgebracht wird, die Gold, Silber, Platin, Palladium oder Kupfer enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallnanoparti­ kel durch Metallverdampfung oder Metallsputtern vor oder während der Gasphasenabscheidung der Polymerschicht erzeugt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallnanoparti­ kel Partikel verwendet werden, die Platin, Pal­ ladium, Gold, Kupfer, Zinn, Indium und/oder Sil­ ber enthalten.

9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in die vor, während und/oder nach der Beschichtung des Trägermateri­ als mit dem Enzym abgeschiedenen Plasmapolymer­ schichten Redoxmediatoren eingelagert werden.

10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sämtliche Beschich­ tungen in derselben Vakuumkammer bei jeweils ge­ eigneten Vakuumdruckbereichen vorgenommen wer­ den.

11. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym durch Pi­ pettieren auf das Trägermaterial aufgebracht wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym unter Va­ kuum, gegebenenfalls in Gegenwart eines Kryopro­ tektantes, insbesondere eines Polyelektrolyten oder einer Polyhydroxyverbindung, aufpipettiert wird.

13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Auftrag des En­ zyms bei einer Temperatur zwischen -195°C und 90°C erfolgt.

14. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterial poröse Kunststoff-Folien, insbesondere aus Te­ flon, Polypropylen, poröses Silicium, poröse Ke­ ramiken oder poröse Metalle verwendet werden.

15. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym Oxidasen oder Peroxidasen, insbesondere Glukoseoxidase, Glutamatoxidase, L-Aminosäureoxidase, Meeret­ tichperoxidase, Tyrosinase, Alkoholoxidase oder Sulfitooxidase, verwendet werden.

16. Biosensor mit einem Signaltransducer und einer auf einem Trägermaterial aufgebrachten, mit dem Signaltransducer in elektronischem Kontakt ste­ hender Enzymschicht, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym in eine durch ein Gasphasen-Abscheideverfahren erzeugte Polymerschicht bedeckt ist und daß Metallnano­ partikel in der Polymerschicht eingelagert sind.

17. Biosensor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß er durch ein Verfah­ ren nach mindestens einem der vorhergehenden An­ sprüche erzeugt ist.