JP4580979B2 - 大気圧プラズマ技術を用いる生体分子固定化 - Google Patents

Description

本発明はプラズマ蒸着層中への生体分子の混入を含むプラズマ技術に関する。

プラズマ技術を介して表面に官能基を付与することは業界で知られている。第二工程では、次いで生体分子を前記官能基に付着することができる。官能基は高分子の活性化によりまたは官能基を持つカバー層の付与により得られることができる。ほとんどの場合、既知の技術は少なくとも二工程法に関する。

ＤＥ １９８３５８６９は基体上の固定化酵素の安定化、特にバイオセンサまたはバイオリアクターを記載する。この文献は同時に酵素の表面上への付与及び高分子層の付与を述べる。使用される技術は気相蒸着であり、それは生体分子に対し苛酷な環境を作り、その望ましくない劣化に導く。

ＥＰ ０３５１９５０は高分子表面に蛋白質を固定化するためのプラズマの使用に関し、そこでは二工程法が用いられ、更に生体分子は低圧（減圧）プラズマに曝される。生体分子の付与は高分子前駆体の付与とは別個になされる。従って、記載された方法は高分子基体へのみ適用可能である。

ＥＰ １２３１４７０はプラズマ技術による物質の固定化方法を記載する。生体分子は少なくとも二工程法でプラズマと接触させられる：任意のプラズマ高分子層が表面に付与された後、前記表面上に生体分子を分散し、前記生体分子上へプラズマ高分子膜を減圧付与する。この方法により生体分子がそれらの活性を保持するかは疑わしい。というのもそれらは厚い高分子膜により覆われるからである。

ＷＯ ０３／０８６０３１は重合を起こすプラズマ中に液体前駆体を噴霧することを含む大気圧プラズマ法を記載する。生体分子については特別述べられていない。

本発明は生体分子を他の関心のある分子との特別な相互作用で使用することが可能であるように表面上に生体分子を固定化する方法を提供することを目的とする。従って、本発明の目的はどのような種類の表面にも大規模で適用可能である、蛋白質／酵素または他の生体分子の固定化のための全く新しい一工程法を開発することである。この新しい方法はより良好な再現性、高い柔軟性、広い応用性、簡単な加工工程及び従って高い処理量を含む、古典的な固定化技術を越える幾つかの利点を提供するであろう。新しい方式の加工工程は次いで現在の技術水準では実行可能でない全く新しい用途に導くことができる。

本発明は低温大気圧プラズマを発生して維持することにより試料表面上に生体分子を固定化する方法に関し、前記方法は次の工程：
− 第一と第二電極の間の空間内に試料を導入し、混合雰囲気を前記電極間に存在させる、
− 前記電極間の容積空間内にプラズマを発生して維持するために前記第一と第二電極に交流電圧を付与し、前記電圧を前記第一電極に対する正電圧と前記第二電極に対するゼロ電圧、及び前記第一電極に対するゼロ電圧と前記第二電極に対する負電圧の間で交番させる、及び
− 前記試料の表面上に被膜を蒸着する、
を含み、反応性前駆体と生体分子がこの蒸着工程時に蒸着されて固定化される。

好ましくは、反応性前駆体はエアロゾルの形の液体または気体である。

好ましくは、生体分子は蛋白質、ポリヌクレオチド、糖、脂質、成長因子、ホルモン及び生理活性物質からなる群から選ばれる。

反応性前駆体は炭化水素、フッ素化炭化水素及び有機金属化合物またはそれらの組合せからなる群から選ばれることができる。

混合雰囲気はヘリウム、アルゴン、窒素、空気、二酸化炭素、アンモニウムまたはそれらの組合せを含むことができる。

試料は金属、セラミックまたはプラスチック材料、織繊維または不織繊維、天然繊維または合成繊維または粉末を含むことができる。

もし必要なら、電極は０℃と１００℃の間の温度に冷却されることができる。

本発明の第一実施態様では、混合雰囲気は生体分子を含むエアロゾルと反応性前駆体とを含む。

本発明の代替実施態様では、前記方法は次の工程：
− 前記生体分子を含む溶液を試料表面上に付与する、
− 前記試料を第一と第二電極の間の空間にまたは二つの電極間に維持されているプラズマの残光内に導入し、混合雰囲気を前記電極間に存在させる、
− 前記電極間の容積空間内にプラズマを発生して維持するために前記第一と第二電極に交流電圧を付与し、前記電圧を前記第一電極に対する正電圧と前記第二電極に対するゼロ電圧、及び前記第一電極に対するゼロ電圧と前記第二電極に対する負電圧の間で交番させる、及び
− 前記試料の表面上に被膜を蒸着する、
を更に含み、前記混合雰囲気またはその残光は反応性前駆体を含み、それは蒸着工程時に試料表面上に蒸着される。

試料表面上へ生体分子を含む溶液を付与する工程は好ましくは溶液の分散及びそれに続く乾燥、吸着及びスペーサー分子を使用してのまたは使用せずの共有結合からなる群から選ばれる。

本発明の別の代替実施態様では、反応性前駆体は前記プラズマの残光に生体分子を含むエアロゾルと一緒に加えられ、それらの両者は蒸着工程時の同じ残光内に配置されている試料表面上に蒸着されて固定化される。

この生体工学材料は他の関心のある生体または非生体種と特に相互作用するように設計された生体認識部位を持つように考えられている。本発明は低温大気圧プラズマ処理により丈夫な生体工学表面を設計及び構成することを可能とし、それは全ての種類の生体分子の表面への結合を、生体分子の形及び活性を変えうるまたは高いコスト及び均質性に関する問題を導くかもしれない化学結合剤を使用することなく直接的な方法で可能とする。この技術は医学、化学、環境、食品、材料及び他の工業部門での将来の応用の新しい全領域への道を切り開くことができ、それらは特に限定されないが次のものを含む：
・ 例えば汚染物質（例えば水中及び空気中のダイオキシン、擬発情物質、抗生物質、マイクロ汚染物質等）の検出、医用診断、毒性試験等のような大規模及び小規模用途のためのバイオセンサ；
・ Ｌａｂｓ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ：表面の面内の移動度に対する低エネルギーバリヤが分子生物学の分野での利用を含む種々の蛋白質のクラスターを必要とする複合反応を容易とするために使用されることができる；
・ 例えばインプラントのためのバイオミメティックス材料（生体分子認識を模倣する）；
・ 固定化された感光性電荷移動蛋白質に基づく太陽電池；
・ 医用診断、熱交換及び食品加工器具のための焼付きしない表面；
・ （医用）織物、医用利用のためのプラスチック、食品包装のための抗菌被膜；
・ 制御された医薬放出を指向する表面；
・ 例えば生物学的信号のプロセッサーへの伝達を可能とする導電性プラズマ高分子被膜中に蛋白質を混入することによるインテリジェント材料／織物；
・ 機能性組織の生体外及び／または生体内成長のためのテンプレート；
・ バイオ誘導結晶モルフォロジー：表面上に配列された生体分子は無機化を誘導し、形成されたモルフォロジーは古典的なものとは異なる。かかる無機表面は材料開発及びマイクロエレクトロニクスで用途を見出すかもしれない。
・ 電導性蛋白質（例えばシトクロムＣ及びウシ血清アルブミン）に基づく電導性被膜；
・ バイオ触媒用途、例えば廃水中の非常に扱いにくい分子の生物分解及びマイクロ汚染物質の除去、高価な化学化合物（例えばキラル化合物）を製造するための非常に特別な生化学反応の触媒。

生体分子の安定溶液は低温大気圧プラズマに気体または液体のいずれかのプラズマ高分子前駆体と一緒に加えられる。蛋白質、酵素、核酸及び糖のような生体分子は水溶液または前駆体溶液であることができる。もし必要なら、混合物のエアロゾルまたは種々のエアロゾルの混合物がプラズマに、恐らくガス状前駆体と一緒に添加されることができる。これに代えて、生体分子の安定溶液を試料の表面上に配置した後、低温大気圧プラズマ処理によって液体またはガス状前駆体分子と共に薄い高分子層をこの表面へ付与する。生物学的活性または構造の少なくとも一部が保持されるような方法で生体分子を高分子被膜中に混入することが重要である。本発明は一工程法を構成する。更に、どのような形状または材料のどのような基体も本発明の方法を用いて生体分子で被覆されることができる。

本発明の主な利点は現在の技術水準では実行できない費用効果的な方法で大規模に材料を処理するその能力である。

本発明による固定化方法は薄いプラズマ重合被膜内の生体分子、特に蛋白質の混入を含む。この目的のため、これらの蛋白質または他の生体分子を含む溶液は低温大気圧プラズマに液体またはガス状高分子前駆体のいずれかと一緒に加えられるであろう。これに代えて、これらの蛋白質を含む溶液を基体の表面上に配置した後、低温大気圧プラズマに液体またはガス状高分子前駆体のいずれかと一緒に試料を加えることができる。この発明を実行するのに使用される好適なプラズマ形状は誘電体バリヤ放電（ＤＢＤ）であり、それは均一残光からなる。生体分子の固定化は多数の理由のため、しかし主として蛋白質に著しい損傷を起こすかまたはそれらを破壊することすらありうるプラズマ中の高エネルギー種の存在のために、十分に確立された減圧または低圧ＲＦ（１３．５６ＭＨｚ）プラズマ技術では実行できない。加えて、蛋白質及び蛋白質溶液の加工は減圧条件下では実行不可能である。

大気圧でのプラズマ加工は比較的新しい技術−１９９０年の第一報告日−であり、それはインラインで作業する能力、著しく低い工程費用及び事実上いずれの形式の基体材料とも適合性があることを含む、減圧プラズマ技術を越える多くの利点を提供する。しかし、この文脈での大気圧プラズマの最も重要な特徴はプラズマ中の高エネルギー種の不存在である。複合前駆体分子は減圧プラズマに曝されたとき分裂するけれども、それらは大気圧プラズマでは高度にそれらの構造を保持する。この後者の現象は高い量の気体分子の存在のため活性種の減少した平均自由工程長を原因とする。従って、この新しい技術はまた、ほんの小さな変更により生体分子の被膜中への混入を可能とする。生体分子／蛋白質を含む溶液は、水性または添加された溶剤と共に、液体またはガス状炭化水素または混成有機／無機分子高分子前駆体と一緒にエアロゾルとしてプラズマに加えられることができる。従って、液滴で存在する生体分子は薄いプラズマ高分子被膜中に混入されることができ、そこではそれらは表面に露出され、それらの活性を示す。これに代えて、生体分子／蛋白質を含む溶液はそれらを低温大気圧プラズマに加えるに先立ち試料の表面上に付与され、そこで数ナノメートルの厚さを持つ薄い層が生体分子の上に蒸着される。生体分子の混入は反応条件及び使用される前駆体の種類に依存して、物理的に（埋め込みにより）または共有結合により達成されることができる。この工程時に、蛋白質は表面に結合するためにそれらの形態を変えるように強制されないであろう。なぜならば、この被膜、好ましくは高水分含量を持つ被膜は蛋白質の周りに形成され、従ってそれらを安定化しかつ保護するからである。しかし、表面近くの蛋白質の配向はそれらをそれらの生物学的に活性な部位を露出させることまたはプラズマ高分子の架橋密度がマッチング基体の完全に埋め込まれた蛋白質への拡散を可能とするために十分低いことは重要なままである。アミン及びカルボキシルのような官能基を含む前駆体は生体分子に化学的に結合するであろうが、これはアルカンのような前駆体ではほとんど起こらない。後者の場合、蛋白質の被膜内への埋め込みが起こるかもしれない。前駆体は有機分子（例えばアクリル化合物、アルカン、アルケン等）及び有機／無機混成分子（例えばＨＭＤＳＯ及びＴＥＯＳ）を含む。

更に、低エネルギーラジカルの存在は別として、低温非平衡プラズマの反応条件は非常に穏やかである：低温（６０℃迄の室温）及び周囲圧力。これまで、大気圧プラズマ技術による同様な生体官能被膜の製造についての文献または特許は刊行されていない。

実施例１
大気圧でのプラズマ放電は４５×４５ｍｍの寸法を持つ二つの水平に置かれた平行電極間で得られる。これらの両者は２ｍｍ厚のアルミナ（Ａｌ_２Ｏ_３）板で覆われている。被覆電極間の距離は２ｍｍである。上部電極は接地される。下部電極は可変周波数ＡＣ電源（ＥＮＩ，ＲＰＧ−５０型）に接続される。ＡＣ電源の周波数は２ｋＨｚに設定される。制御された環境で試験を実施するために、電極配列は、蒸着が開始される前に排気され続いてキャリヤーガスで満たされた閉鎖室内に取り付けられる。

キャリヤーガスとしてヘリウムが用いられる。キャリヤーガスの流速は質量流量制御器により制御され、２０ｌ／分に設定される。ヘキサメチルジシロキサン（ＨＭＤＳＯ）が反応性前駆体として用いられる。それはエアロゾルの形で不活性キャリヤーガスに添加される。ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）の水溶液を含む別のエアロゾルが同時にプラズマに添加される。蒸着時間は１分に設定される。被膜蒸着が両電極の表面で及びこれらの電極に付着された基体上に観察される。被膜の厚さは１７５ｎｍに等しい。得られたプラズマ高分子被膜中のストレプトアビジンの存在及び固定化後の蛍光的に標識されたビオチンに結合するストレプトアビジンの能力が蛍光顕微鏡を用いて評価された。蛍光的に標識されたビオチン結合アッセイを用いた後、信号を観察することができ、それはストレプトアビジンが被膜中に固定化されたことを、一方でその結合活性の少なくとも一部を保持していることを示す。

実施例２
低温大気圧プラズマ放電は８×１５ｃｍの寸法を持つ二つの水平に置かれた平行電極間で得られる。これらの両者は３ｍｍ厚のフロートガラス板で覆われている。電極間の距離は２ｍｍである。下部電極が接地され、もし必要なら室温への冷却を提供することができるペルチェ素子に連結される。ペルチェ素子は次いでファンにより冷却される冷却フィンに連結される。上部電極は可変周波数ＡＣ電源に接続される。８ｋＨｚと２０ｋＶのＡＣ電界が電極に付与される。

キャリヤーガスとしてヘリウムが用いられる。キャリヤーガスの流速は質量流量制御器により制御され、６ｌ／分に設定される。反応性前駆体としてアセチレンが用いられる。それは不活性キャリヤーガスと混合され、０．３ｌ／分の流速でプラズマに加えられる。アビジンの水溶液を含むエアロゾルが同時にプラズマに添加される。蒸着時間は３０秒に設定される。被膜が両電極の表面上に及びこれらの電極に付着されたガラス及びケイ素基体上に蒸着される。被膜の厚さは被覆されたケイ素基体の断面の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析により決定される２５ｎｍに等しい。得られたプラズマ高分子被膜中のアビジンの存在及び固定化後の蛍光的に標識されたビオチンに結合するアビジンの能力が蛍光顕微鏡を用いて評価された。蛍光的に標識されたビオチン結合アッセイを用いた後、信号を観察することができ、それはアビジンが被膜中に固定化されたことを、一方でその結合活性の少なくとも一部を保持していることを示す。斜入射形小角Ｘ線散乱分析（ＧＩＳＡＸ）が固定化されたアビジンの構造及び寸法についての情報を得るために実施された。明らかに、固定化されたアビジンの少なくとも一部がその当初の構造及び形状、従ってその活性を保持していた。

実施例３
実施例２に記載の方法がアセチレンの代わりにピロールである液体前駆体を用いて繰り返された。ピロールはエアロゾルとしてプラズマ領域に加えられた。再度、被膜蒸着が両電極の表面上に及びそれらの表面に付着されたガラス及びケイ素基体上に観察された。被膜厚は３０秒の蒸着後に３５ｎｍに等しかった。

実施例４
実施例２に記載された反応器構成がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の固定化のために使用された。ヘリウムがプラズマ領域に６ｌ／分の流速で加えられた。ピロールが反応性前駆体として用いられる。それは不活性キャリヤーガスにエアロゾルとして添加される。ＢＳＡの水溶液を含む別のエアロゾルが同時にプラズマに添加される。２ｋＨｚと２０ｋＶのＡＣ電界が電極に付与される。蒸着時間は３０秒に設定される。被膜が両電極の表面上に及びそれらの電極に付着されたガラス及びケイ素基体上に蒸着される。被膜の厚さは被覆ケイ素基体の断面の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析により決定される３５ｎｍに等しい。斜入射形小角Ｘ線散乱分析（ＧＩＳＡＸ）が固定化されたＢＳＡの構造及び寸法についての情報を得るために実施された。明らかに、固定化されたＢＳＡの実質的部分がその当初の構造及び形状、従ってその活性を保持していた。

実施例５
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液がガラス基体の上に分散される。試料を１２時間室温で乾燥後、それは実施例２に記載の構成の下部電極上に置かれる。ヘリウムとアセチレンが電極間の領域にそれぞれ６及び０．３ｌ／分の流速で加えられる。１０秒の蒸着後、３〜５ｎｍの厚さを持つ層が得られた。試料は斜入射形小角Ｘ線散乱分析（ＧＩＳＡＸ）により分析され、明らかに、この形式の処理後にＢＳＡはその当初の構造及び寸法を高度に保持していた。

Claims (8)

1. ６０℃迄の室温で大気圧プラズマを発生して維持することにより試料表面上に生体分子を固定化する方法であって、前記方法が次の工程：
   − 試料を第一と第二電極の間の空間に導入し、混合雰囲気を前記電極間に存在させる、
   − 前記電極間の容積空間内にプラズマを発生して維持するために前記第一と第二電極に交流電圧を付与し、前記電圧を前記第一電極に対する正電圧と前記第二電極に対するゼロ電圧、及び前記第一電極に対するゼロ電圧と前記第二電極に対する負電圧の間で交番させる、及び
   − 前記試料の表面上に被膜を蒸着する、
   を含み、前記混合雰囲気が生体分子を含むエアロゾル及び反応性前駆体を含み、更に前記反応性前駆体が蒸着されかつ前記生体分子が蒸着工程時に固定化されることを特徴とする方法。
2. 反応性前駆体がエアロゾルの形の液体または気体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ６０℃迄の室温で大気圧プラズマを発生して維持することにより試料表面上に生体分子を固定化する方法であって、前記方法が次の工程：
   − 試料を第一と第二電極間の空間に導入し、混合雰囲気を前記電極間に存在させる、
   − 前記電極間の容積空間内にプラズマを発生して維持するために前記第一と第二電極に交流電圧を付与し、前記電圧を前記第一電極に対する正電圧と前記第二電極に対するゼロ電圧、及び前記第一電極に対するゼロ電圧と前記第二電極に対する負電圧の間で交番させる、及び
   − 前記試料の表面上に被膜を蒸着する、
   を含み、反応性前駆体が蒸着されかつ生体分子が蒸着工程時に固定化され、かつ更に反応性前駆体が前記プラズマの残光に生体分子を含むエアロゾルと一緒に加えられ、それらの両者が蒸着工程時の同じ残光内に配置されている試料表面上に蒸着されかつ固定化されることを特徴とする方法。
4. 生体分子が蛋白質、ポリヌクレオチド、糖、脂質、成長因子、ホルモンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 反応性前駆体が炭化水素、フッ素化炭化水素及び有機金属化合物またはそれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 混合雰囲気がヘリウム、アルゴン、窒素、空気、二酸化炭素、アンモニウムまたはそれらの組合せを含むことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 試料が金属、セラミックまたはプラスチック材料、織繊維または不織繊維、天然繊維または合成繊維または粉末を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 電極が０℃と１００℃の間の温度に冷却されることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の方法。