ES2336804T5 - Inmovilización de biomoléculas usando tecnología de plasma a la presión atmosférica - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para inmovilizar una biomolécula en una superficie de muestra mediante la generación y mantenimiento de un plasma a presión atmosférica a una temperatura entre la temperatura ambiente y 60ºC, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:<br /><br /> - introducir una muestra en el espacio entre un primer y un segundo electrodo, estando presente una atmósfera mezclada entre dichos electrodos,<br /><br /> - aplicar una tensión alterna a dichos primer y segundo electrodos para generar y mantener un plasma en el espacio volumétrico entre dichos electrodos, alternando dicha tensión entre una tensión positiva para dicho primer electrodo y una tensión cero para dicho segundo electrodo, y una tensión cero para dicho primer electrodo y una tensión negativa para dicho segundo electrodo, y<br /><br /> - depositar un revestimiento sobre una superficie de dicha muestra,<br /><br /> en el que dicha atmósfera mixta comprende un precursor polimérico de plasma reactivo y un aerosol que comprende la biomolécula, y en el que dicho precursor polimérico de plasma reactivo se deposita y dicha biomolécula se inmoviliza durante la etapa de deposición.
Description
Inmovilización de biomoléculas usando tecnología de plasma a la presión atmosférica.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a técnicas de plasma, que implican la inclusión de moléculas biológicas en una capa depositada de plasma.
Estado de la técnica
En la técnica es conocido aplicar grupos funcionales a una superficie mediante tecnología de plasma. En una segunda etapa, es posible unir a continuación biomoléculas a dichos grupos funcionales. Los grupos funcionales pueden obtenerse mediante la activación de polímeros o por aplicación de una capa de cobertura con grupos funcionales. En la mayoría de los casos, la tecnología conocida se refiere a un proceso de por lo menos dos etapas.
El documento DE19835869 describe la estabilización de una enzima inmovilizada sobre un sustrato, especialmente un biosensor o bio-reactor. El documento menciona la aplicación simultánea de enzimas sobre una superficie y la aplicación de una capa de polímero. La tecnología utilizada es la deposición en fase gaseosa, que crea un entorno inestable para las biomoléculas y conduce a una degradación no deseada de las mismas.
La patente EP0351950 se refiere a la utilización de plasma para inmovilizar proteínas sobre superficies poliméricas, en la que se utiliza un proceso de dos etapas en el que las biomoléculas se exponen a un plasma a baja presión (vacío). La aplicación de biomoléculas se realiza separadamente de la aplicación de los precursores de polímeros. El proceso descrito es así únicamente aplicable a sustratos de polímeros.
La patente EP1231470 describe un método para la inmovilización de sustancias con tecnología de plasma. Las biomoléculas se ponen en contacto con el plasma en un proceso de por lo menos dos etapas: se aplica a una superficie una capa de plasma-polímero opcional, seguido por la extensión de las biomoléculas en dicha superficie y la aplicación en vacío de una película de plasma-polímero sobre dichas biomoléculas. Es dudoso que las biomoléculas retengan sus actividades con este procedimiento, dado que están cubiertas por una película gruesa de polímero
El documento WO 03/086031 describe un proceso de plasma atmosférico que comprende pulverizar precursores líquidos en un plasma que provocan la polimerización. No se hace ninguna mención específica a biomoléculas.
El documento "Antimicrobial coatings obtained in an atmospheric pressure dielectric barrier flow discharge", de Paulussen et al., actas del simposio de MRS, tomo 724, 1 de Abril de 2002, p. 246, se refiere al desarrollo de revestimientos de plasma-polímero que incluyen sustancias antimicrobianas, tales como sales de plata, mediante la adición de dichas sustancias a una solución precursora.
Objetivos de la invención
El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para inmovilizar biomoléculas sobre una superficie, con el fin de que sea posible utilizar dichas biomoléculas en interacción específica con otras moléculas de interés. El objetivo de la presente invención consiste por tanto en desarrollar un proceso de una etapa totalmente nuevo para la inmovilización de proteínas/enzimas u otras biomoléculas, que sea aplicable a gran escala a superficies de cualquier tipo. La nueva metodología debe ofrecer varias ventajas sobre las técnicas clásicas de inmovilización, incluida una mejor reproducibilidad, elevada flexibilidad, amplia aplicabilidad, tratamiento directo y, en consecuencia, unas tasas elevadas de rendimiento. El nuevo sistema de tratamiento podría a su vez llevar a aplicaciones totalmente nuevas que no son factibles con la tecnología del estado de la técnica actual.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un método para inmovilizar una biomolécula en una superficie de muestra mediante la generación y mantenimiento de un plasma frío a presión atmosférica, comprendiendo dicho procedimiento las etapas que consisten en:
# introducir una muestra en el espacio entre un primero y un segundo electrodos, encontrándose presente una atmósfera mixta entre dichos electrodos,
# aplicar una tensión alterna a dichos primer y segundo electrodos para generar y mantener un plasma en el espacio volumétrico entre dichos electrodos, alternando dicha tensión entre una tensión positiva para dicho primer electrodo y una tensión cero para dicho segundo electrodo, y una tensión cero para dicho primer electrodo y una tensión negativa para dicho segundo electrodo, y
# depositar un revestimiento sobre una superficie de dicha muestra
en el que, durante la etapa de deposición, se depositan e inmovilizan un precursor reactivo y una biomolécula.
Preferentemente, el precursor reactivo es un gas o un líquido en la forma de un aerosol.
La biomolécula se selecciona preferentemente de entre el grupo compuesto de una proteína, un polinucleótido, un azúcar, un lípido, un factor de crecimiento y una hormona.
El precursor reactivo se puede seleccionar del grupo que consiste en un hidrocarburo, un hidrocarburo fluorado y un compuesto organometálico o una de sus combinaciones.
La atmósfera mixta puede comprender helio, argón, nitrógeno, aire, dióxido de carbono, amonio o una de sus combinaciones.
La muestra puede comprender materiales metálicos, cerámicos o plásticos, fibras tejidas o no tejidas, fibras naturales o fibras sintéticas o polvos.
Si es necesario, los electrodos pueden ser enfriados a temperaturas entre 0ºC y 100ºC.
Según la invención, la atmósfera mixta comprende el precursor reactivo y un aerosol que comprende la biomolécula.
En otra realización alternativa de la presente invención, el precursor reactivo se administra a la post-luminiscencia de dicho plasma junto con un aerosol que comprende una biomolécula, depositándose e inmovilizándose ambos sobre una superficie de muestra que se coloca en la misma post-luminiscencia durante la etapa de deposición.
Descripción detallada de la invención
Está previsto que los materiales bio-ingenieriles de la presente invención tengan lugares de bio-reconocimiento diseñados para interactuar específicamente con otras especies de interés biológicas o no biológicas. La presente invención permite diseñar y construir superficies robustas obtenidas por bioingeniería mediante un tratamiento con plasma frío a la presión atmosférica, que permite la unión de todas las clases de biomoléculas a las superficies de un modo directo sin utilizar enlaces químicos que puedan cambiar la configuración y actividad de las biomoléculas o que puedan implicar costes elevados y problemas referentes a la homogeneidad. Dicha tecnología puede abrir el camino a un ámbito completamente nuevo de futuras aplicaciones en el entorno médico, químico, alimentario, de los materiales y muchos otros sectores industriales, incluyendo, aunque sin limitación:
- •
- Biosensores para aplicaciones a gran escala y pequeña escala como, por ejemplo, la detección de contaminantes (dioxinas, sustancias seudo-estrogénicas, antibióticos, microcontaminantes, etc., por ejemplo en el agua y en el aire), diagnósticos biomédicos, ensayos de toxicidad, etc.;
- •
- Laboratorios en un chip: la barrera de baja energía para la movilidad en el plano de la superficie puede utilizarse para facilitar reacciones complejas que requieren una agrupación de diferentes proteínas, incluidas las aplicaciones en el campo de la biología molecular;
- •
- Materiales bio-miméticos, por ejemplo para implantes (que imitan el reconocimiento bio-molecular);
- •
- Pilas solares basadas en proteínas de transferencia de carga fotosensibles e inmovilizadas;
- •
- Superficies no contaminantes para diagnósticos médicos, intercambiadores de calor, y equipo de tratamiento de alimentos;
- •
- Revestimientos antimicrobianos para materiales textiles (médicos), plásticos para aplicaciones médicas, envases de alimentos;
- •
- Superficies para controlar directamente la liberación de fármacos;
- •
- Materiales/textiles inteligentes, por ejemplo mediante la incorporación de proteínas en revestimientos de polímeros conductores de plasmas, que pueden permitir la transmisión de una señal biológica a un procesador;
- •
- Moldes para crecimiento extracorpóreos y/o in vivo de tejidos funcionales;
- •
- Morfologías cristalinas bio-inducidas: las biomoléculas ordenadas en una superficie pueden inducir a la mineralización y las morfologías obtenidas diferir de las clásicas. Dichas superficies minerales pueden encontrar aplicaciones en el desarrollo de materiales y en microelectrónica;
- •
- Revestimientos conductores basados en proteínas conductoras (por ejemplo, el citocromo C en la albúmina sérica bovina);
- •
- Aplicaciones de biocatálisis, por ejemplo, biodegradación de moléculas muy resistentes en aguas residuales y la eliminación de microcontaminantes, catálisis de reacciones bioquímicas muy específicas para producir compuestos químicos de gran valor (por ejemplo compuestos quirales).
Un aerosol que comprende una biomolécula se administra a un plasma frío a la presión atmosférica junto con un precursor de plasma-polímero, gaseoso o líquido. Si es necesario, al plasma se le pueden añadir aerosoles de mezclas o mezclas de diferentes aerosoles, posiblemente junto con los precursores gaseosos. Es importante incorporar las biomoléculas en un revestimiento de polímero de tal modo que retenga por lo menos parte de la actividad o estructura biológica. La presente invención constituye un proceso de una etapa. Además, cualquier sustrato, de cualquier forma o material, puede revestirse con biomoléculas utilizando el procedimiento de la presente invención.
Una ventaja principal de la presente invención es su capacidad para tratar los materiales de un modo rentable y a gran escala, lo cual no es posible con la tecnología del estado de la técnica actual.
El método de inmovilización según la presente invención comprende la incorporación de biomoléculas, y proteínas en particular, en revestimientos polimerizados finos de plasma. Con este fin, los aerosoles que contengan estas proteínas u otras biomoléculas se administrarán a un plasma frío a la presión atmosférica junto con precursores de polímeros líquidos o gaseosos. La configuración de plasma preferida que ha de utilizarse cuando se aplique la presente invención es la descarga de barrera dieléctrica (DBD), que consiste en una luminiscencia uniforme. La inmovilización de biomoléculas no es viable con la tecnología de plasma RF (13,56 MHz) en vacío o baja presión, bien estudiada, por una serie de razones, pero principalmente debido a la presencia de especies altamente energéticas en el plasma que provocan un daño importante a las proteínas o pueden incluso destruirlas. Además, el tratamiento de proteínas y soluciones de proteína es impracticable en condiciones de vacío.
El tratamiento de plasma a presión atmosférica es una tecnología relativamente nueva - los primeros informes son del año 1990 - y ofrece muchas ventajas sobre la tecnología de plasma en vacío, incluyendo la capacidad de trabajo en línea, los costes de proceso notablemente menores y la compatibilidad con prácticamente cualquier tipo de material sustrato. La característica más importante de los plasmas a presión atmosférica en este contexto es no obstante la ausencia de especies altamente energéticas en el plasma. Aunque las moléculas complejas precursoras se fracturan cuando se exponen al plasma en vacío, mantienen su estructura en gran medida en los plasmas a presión atmosférica. Dicho fenómeno se atribuye a la longitud reducida media de la trayectoria libre de las especies activas debido a la presencia de altas cantidades de moléculas de gas. En consecuencia, dicha nueva tecnología permite también la incorporación de biomoléculas en revestimientos con solo modificaciones menores. Las soluciones que contienen biomoléculas/proteínas, acuosas o con disolventes añadidos, pueden administrarse al plasma como un aerosol junto con un hidrocarburo líquido o gaseoso o un precursor de polímero de molécula híbrida orgánica/inorgánica. En consecuencia, las biomoléculas presentes en las gotitas pueden incorporarse en revestimientos finos de plasma-polímero cuando están expuestas a la superficie y muestran su actividad. La incorporación de biomoléculas puede realizarse físicamente (mediante su empotramiento) o mediante enlaces covalentes, dependiendo de las condiciones de reacción y el tipo de precursor utilizado. Durante este proceso, las proteínas no estarán forzadas a cambiar su conformación para unirse a una superficie porque el revestimiento, preferentemente un revestimiento con un alto contenido de agua, se formará alrededor de las proteínas, estabilizándolas y protegiéndolas de ese modo. No obstante, sigue siendo importante que la orientación de las proteínas en la proximidad de la superficie permita que expongan sus sitios biológicamente activos o que la densidad de reticulaciones de plasma polímero sea lo suficientemente baja para permitir la difusión de los sustratos apareables en las proteínas completamente empotradas. Los precursores que contienen grupos funcionales como aminas y carboxilos se unirán químicamente a las biomoléculas aunque esto es menos probable que ocurra con precursores como los alcanos. En el último caso, sí podría tener lugar el empotramiento de proteínas en un revestimiento. Los precursores incluyen moléculas orgánicas (como compuestos acrílicos, alcanos, alquenos, etc.) y moléculas hibridas orgánicas/inorgánicas (como HMDSO y TEOS).
Además, aparte de la presencia de radicales de baja energía, las condiciones de la reacción en plasmas fríos y no equilibrados son muy suaves: baja temperatura (temperatura ambiente hasta 60ºC) y presión ambiente. Hasta este momento no se ha publicado literatura ni ninguna patente sobre la producción de revestimientos bio-funcionales similares mediante la tecnología de plasma a presión atmosférica.
Ejemplo 1
Se obtiene una descarga de plasma a presión atmosférica entre dos electrodos paralelos colocados horizontalmente con un tamaño de 45 × 45 mm, ambos cubiertos con una capa de alúmina (Al2O3) de un espesor de 2 mm. La distancia entre los electrodos cubiertos es 2 mm. El electrodo superior está conectado a tierra. El electrodo inferior está conectado a una fuente de energía de CA de frecuencia variable (ENI, modelo RPG - 50). La frecuencia de la fuente de energía de CA se fija en 2 kHz. Con el fin de desarrollar ensayos en un entorno controlado, la configuración de electrodos está montada en una cámara cerrada que está a vacío y se llena posteriormente con el gas vehículo antes de que se empiece la deposición.
Como gas vehículo se utiliza helio. El caudal del gas vehículo se controla mediante un controlador de caudal másico y se fija en 20 litros/minuto. Se usa hexametildisiloxano (HDMSO) como precursor reactivo. Se añade al gas portador inerte en la forma de un aerosol. Al plasma se añade simultáneamente otro aerosol, que contiene una solución acuosa de estreptavidina. El tiempo de deposición se fija en 1 min. Se observa la deposición del revestimiento de la superficie de ambos electrodos y en los sustratos unidos a estos electrodos. El espesor de los revestimientos es igual a 175 nm. Se evaluó la presencia de estreptavidina en el revestimiento de plasma-polímero obtenido y la capacidad de la estreptavidina de un irse a la biotina marcada fluorescentemente después de la inmovilización utilizando microscopía de fluorescencia. Después de utilizar el ensayo de unión de la biotina marcada fluorescentemente, pudo observarse una señal, lo que indica que la estreptavidina se inmovilizó en el revestimiento, reteniendo al mismo tiempo por lo menos parte de su actividad de unión.
Ejemplo 2
Se obtiene una descarga de plasma frío a presión atmosférica entre dos electrodos paralelos colocados horizontalmente con un tamaño de 8 × 15 cm, ambos cubiertos con una placa de vidrio flotante de un espesor de 3 mm. La distancia entre los electrodos es 2 mm. El electrodo inferior está conectado a tierra y a un elemento Peltier que puede proporcionar refrigeración a temperatura ambiente, si es necesario. El elemento Peltier está a su vez conectado a una aleta de enfriamiento que está refrigerada por un ventilador. El electrodo superior está conectado a una fuente de energía de CA de frecuencia variable. A los electrodos se aplica un campo de CA de 8 kHz y de 20 kV.
El helio se utiliza como gas vehículo. El caudal del gas vehículo se controla mediante un controlador de caudal másico y se fija en 6 litros/min. Se usa acetileno como precursor reactivo. Se mezcla con el gas inerte vehículo y se administra al plasma a una caudal de 0,3 litros/min. Al plasma se añade simultáneamente un aerosol, que contiene una solución acuosa de avidina. El tiempo de deposición se fija en 30 segundos. En la superficie de ambos electrodos y en los sustratos de vidrio y silicona unidos a los electrodos se deposita un revestimiento. El espesor del revestimiento es igual a 25 nm tal como determina el análisis por microscopía electrónica de exploración (SEM) de los sustratos de silicona revestidos. Se evaluó la presencia de avidina en el revestimiento de plasma-polímero obtenido y la capacidad de la avidina para unirse a la biotina marcada fluorescentemente después de la inmovilización utilizando microscopía de fluorescencia. Después de utilizar el ensayo de unión de la biotina marcada fluorescentemente, pudo observarse una señal, lo que indica que la avidina se inmovilizó en el revestimiento, reteniendo al mismo tiempo por lo menos parte de su actividad de unión. Se efectuó el análisis por difracción de rayos X con ángulo pequeño e incidencia rasante (GISAX) a fin de obtener información sobre la estructura y tamaño de la avidina inmovilizada. Aparentemente por lo menos parte de la avidina inmovilizada retuvo su estructura y forma original y, en consecuencia, su actividad.
Ejemplo 3
Se repitió el procedimiento descrito en el ejemplo 2 utilizándose un precursor líquido, siendo pirrol este precursor, en lugar de acetileno. El pirrol se administró a la zona de plasma en forma de aerosol. De nuevo, se observó la deposición del revestimiento sobre la superficie de ambos electrodos y sobre los sustratos de vidrio y silicona unidos a su superficie. El espesor del revestimiento fue igual a 35 nm después de 30 segundos de deposición.
Ejemplo 4
La puesta a punto del reactor descrita en el ejemplo 2 se utilizó para la inmovilización de seroalbúmina bovina (BSA). Se administró helio a la zona de plasma a un caudal de 6 litros/min. Se utilizó pirrol como precursor reactivo. Se añadió al gas vehículo inerte en forma de aerosol. Al plasma se añadió simultáneamente otro aerosol, que contenía una solución acuosa de BSA. A los electrodos se les aplicó un campo de CA de 2 kHz y 20 kV. El tiempo de deposición se fijó en 30 segundos. En la superficie de ambos electrodos y sobre los sustratos de vidrio y silicona unidos a los electrodos se depositó un revestimiento. El espesor del revestimiento fue igual a 35 nm tal como se determinó por el análisis de microscopía electrónica de exploración (SEM) de los sustratos de silicona revestidos. Se efectuó un análisis de difracción de rayos X con ángulo pequeño e incidencia rasante (GISAX) con el fin de obtener información sobre la estructura y tamaño de la BSA inmovilizada. Aparentemente, una parte sustancial de la BSA inmovilizada retuvo su estructura y forma original y, en consecuencia, su actividad.
Ejemplo 5 de referencia
Una solución de seroalbúmina bovina (BSA) se extendió sobre un sustrato de vidrio. Después de secar la muestra durante 12 horas a temperatura ambiente, se colocó sobre el electrodo inferior de la configuración descrita en el ejemplo 2, y se administró helio y acetileno a la zona entre los electrodos a un caudal de 6 y 0,3 litros/minuto, respectivamente. Después de 10 segundos de deposición, se obtuvo una capa con un espesor de 3 a 5 nm. Se analizó la muestra por medio del análisis de difracción de rayos X con ángulo pequeño e incidencia rasante (GISAX) y, aparentemente, la BSA retuvo su estructura y tamaño original en gran medida después de este tipo de tratamiento.
Claims (7)
- REIVINDICACIONES1. Un método para inmovilizar una biomolécula en una superficie de una muestra mediante la generación y mantenimiento de un plasma a presión atmosférica a una temperatura entre la temperatura ambiente y 60ºC, comprendiendo dicho método las etapas de:
- •
- introducir una muestra en el espacio entre un primer y un segundo electrodo, estando presente una atmósfera mixta entre dichos electrodos,
- •
- aplicar una tensión alterna a dichos primer y segundo electrodos para generar y mantener un plasma en el espacio volumétrico entre dichos electrodos, alternando dicha tensión entre una tensión positiva para dicho primer electrodo y una tensión cero para dicho segundo electrodo, y una tensión cero para dicho primer electrodo y una tensión negativa para dicho segundo electrodo, y depositar un revestimiento sobre una superficie de dicha muestra, y
- •
- depositar un revestimiento sobre una superficie de dicha muestra
en el que dicha biomolécula se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un polinucleótido, un azúcar, un lípido, un factor de crecimiento y una hormona, y dicha atmósfera mixta comprende un precursor de plasmapolímero y un aerosol que comprende la biomolécula, y en el que se deposita dicho precursor de plasmapolímero reactivo y dicha biomolécula se inmoviliza durante la etapa de deposición. -
- 2.
- El método según la reivindicación 1, en el que el precursor de plasma-polímero reactivo es un gas o un líquido en la forma de un aerosol.
-
- 3.
- Un método para inmovilizar una biomolécula en una superficie de una muestra por generación y mantenimiento de un plasma a presión atmosférica a una temperatura entre la temperatura ambiente y 60ºC, comprendiendo dicho método las etapas de:
- •
- introducir una muestra en el espacio entre un primer y un segundo electrodo, estando presente una atmósfera mixta entre dichos electrodos,
- •
- aplicar una tensión alterna a dichos primer y segundo electrodos para generar y mantener un plasma en el espacio volumétrico entre dichos electrodos, alternando dicha tensión entre una tensión positiva para dicho primer electrodo y una tensión cero para dicho segundo electrodo, y una tensión cero para dicho primer electrodo y una tensión negativa para dicho segundo electrodo, y
- •
- depositar un revestimiento sobre una superficie de dicha muestra,
en el que dicha biomolécula se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un polinucleótido, un azúcar, un lípido, un factor de crecimiento y una hormona; se deposita un precursor de plasma-polímero reactivo durante la etapa de deposición y se inmoviliza una biomolécula durante la etapa de deposición, y en el que el precursor de plasma-polímero reactivo se administra a la post-luminiscencia de dicho plasma junto con un aerosol que comprende una biomolécula, depositándose e inmovilizándose ambos sobre una superficie de la muestra que está dispuesta en la misma post-luminiscencia durante la etapa de deposición. - 4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el precursor de plasma-polímero reactivo se selecciona del grupo que consiste en un hidrocarburo, un hidrocarburo fluorado, y un compuesto organometálicoo una de sus combinaciones.
-
- 5.
- Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la atmósfera mixta comprende helio, argón, nitrógeno, aire, dióxido de carbono, amonio o una de sus combinaciones.
-
- 6.
- Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra comprende materiales metálicos, cerámicos o plásticos, fibras tejidas o no tejidas, fibras naturales o fibras sintéticas o polvos.
-
- 7.
- Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los electrodos se enfrían a temperaturas entre 0ºC y 100ºC.
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