DE10221435B4

DE10221435B4 - Enzymelektrodenanordnung, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie eine diese Enzymelektrodenanordnung umfassende Biosensoranordnung

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Publication number: DE10221435B4
Application number: DE10221435A
Authority: DE
Inventors: Isabella Dr. Moser; Gerald A. Prof. Dr. Urban; Anastasia Dr. Zacharopoulou; Panagiota S. Dr. Petrou
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-05-14
Filing date: 2002-05-14
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2022-05-15
Also published as: WO2003096003A1; EP1504254A1; AU2003227738A1; US7455874B2; US20050205422A1; DE10221435A1

Abstract

Enzymelektrodenanordnung, umfassend in der folgenden Reihenfolge
ein Substrat mit einer Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 20 nm bis 10 μm, eine Metallelektrode,
eine ultradünne semipermeable Membran mit einer Dicke im Bereich von 10 bis 100 nm und
mindestens eine Enzymmembran.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Enzymelektrodenanordnung, umfassend ein Substrat mit einer Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 20 nm bis 10 μm, eine Metallelektrode, eine ultradünne semipermeable Membran mit einer Dicke im Bereich von 10 bis 100 nm und mindestens eine Enzymmembran, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie eine diese Enzymelektrodenanordnung umfassende Biosensoranordnung.

Der Nachweis von Biomolekülen ist für viele Anwendungen in der forschenden Pharmaindustrie und in der klinischen Diagnostik von zentraler Bedeutung. In der Regel erfolgt dieser Nachweis über eine sogenannte Affinitätsreaktion, bei der komplementäre Analyten sich gegenseitig spezifisch binden. Grundsätzlich besteht das Problem, daß der nachzuweisende Analyt nur in geringsten Konzentrationen in einem Testansatz zur Verfügung steht. Meist ist die Sensitivität heutiger Meßsysteme zu gering, um diese niedrigen Kozentrationen eines Analyten direkt nachzuweisen. Man verwendet daher Amplifikationssysteme, die das biologische Signal derart indirekt verstärken, daß die untere Nachweisgrenze der Meßapparatur möglichst weit überschritten wird.

Affinitätssensoren sind spezielle Biosensoren, die jede Art biomolekularer Erkennung von hochspezifischen Affinitätspartnern nutzen, wie z.B. Antikörper-Antigen, Nukleinsäure-komplementäre Nukleinsäure oder Rezeptor-Ligand. Bio- und Affinitätssensoren setzen sich im allgemeinen aus zwei Komponenten zusammen: der biologischen Komponente zur spezifischen Erkennung eines Analyten und der Detektorkomponente, dem Transducer (d.h. Signal bzw. Meßwandler), der diese biomolekulare Erkennungsreaktion erfassen und in ein auswertbares Signal umsetzen soll. Die selektiven biologischen Komponenten (z.B. Nukleinsäuren, Enzyme, Antikörper, Antigene oder Mikroorganismen) sind in direkter räumlicher Nähe zum Transducer immobilisiert und lassen sich heute durch ein breites Spektrum an Meßprinzipien nachweisen. Die Wahl des Transducers richtet sich nach der Reaktion der biologischen Komponente und den daraus resultierenden Änderungen. Im Stand der Technik sind eine Reihe von Transducern beschrieben, die nach unterschiedlichen Prinzipien arbeiten. Gebräuchlich sind Transducer auf elektrochemischer, elektrischer oder optischer Basis.

Sensitivität und Spezifität der biomolekularen Erkennung kennzeichnen – neben anderen Parametern wie Reproduzierbarkeit, Herstellungskosten, Handhabbarkeit – die Qualität und Praxistauglichkeit der Sensoren. Die Spezifität des Biosensors wird dabei weitgehend durch die biologische Komponente vorgegeben. Jeweils ein spezifisches bioaktives Material dient dazu, die gesuchte Substanz unter einer Fülle anderer – auch ähnlicher – herauszufinden. Die dabei ablaufenden chemischen Reaktionen beeinflussen physikalische Parameter, beispielsweise das elektrische Potential. Die Grundwerte bzw. deren Änderungen werden von dem Transducer in ein elektrisches Ausgangssignal umgewandelt und dann elektronisch verstärkt. Somit bindet die biologische Komponente des Sensors, z.B. ein Enzym, ein Rezeptor oder ein Antikörper, die zu analysierende Substanz – und zwar im wesentlichen nur diese – und erzeugt ein Signal, dessen Intensität der Konzentration des gebundenen Stoffes entspricht. Zum Beispiel kann bei Enzymen ein elektrisches Signal durch die Bildung eines Reaktionsprodukts hervorgerufen und mit einer Elektrode aufgenommen werden. Im Falle eines Enzymsensors für Glucose ist die Elektrode üblicherweise mit einer dünnen Membran bespannt, die immobilisierte Glucoseoxidase (GOD) enthält. Die Enzymmoleküle werden beispielsweise in Gelatine oder Polyurethane eingeschlossen. Die Membran ist dabei nur für Moleküle bestimmter Größe durchlässig. Aus einem Gemisch von Aminosäuren, Proteinen, Fetten, Glucose und anderen Zuckern wandelt das Enzym GOD nur die Glucose unter Sauerstoffverbrauch um. Es bilden sich Gluconolacton und Wasserstoffperoxid. Das immobilisierte Enzym kann aus der Membran nicht herausgewaschen werden, vielmehr ist es bis zur natürlichen Alterung wiederverwendbar. Die kleineren Moleküle wie Glucose, Wasserstoffperoxid und Sauerstoff hingegen dringen leicht aus der zu analysierenden Lösung in die Enzymmembran ein bzw. aus ihr heraus. Das bei der Enzymreaktion sich bildende Wasserstoffperoxid gibt als elektrodenaktiver Stoff zwei Elektronen pro Molekül an die Elektrode ab. Die bei dieser Reaktion erzeugten Elektronen werden dann an die Elektrode des Biosensensors abgegeben. Dadurch wird ein Mikrostrom erzeugt. Zeitgleich zur Reaktion der Glucose mit dem Enzym GOD wird manchmal auf einem bioinaktiven Feld ein Hintergrundstrom gemessen, der durch Störsubstanzen in der Blutprobe entstehen kann. Bei den Störsubstanzen kann es sich z.B. um Medikamente, Vitamine oder Stoffwechselprodukte in hohen Konzentrationen handeln, die ebenfalls einen Mikrostrom verursachen können. Der auf diese Weise errechnete Nettostrom ist ein Maß für die Glucosemenge in z.B. einer Blutprobe und kann proportional in die Blutglucosekonzentration umgerechnet werden.

Schwierigkeiten stellt bis heute die reproduzierbare, einfach zu handhabende und stabile Immobilisierung der biologischen Komponenten dar. Zur Erzielung einer schnellen Ansprechzeit und eines verlässlichen Meßwertes ist beispielsweise eine dünne immobilisatschicht und zur Erzielung einer hohen Lager- und Funktionsstabilität eine hohe immobilisierte Enzymaktivität anzustreben. Durch Adsorption an entsprechende Trägeroberflächen einschließlich einer Metallelektrodenschicht werden jedoch relativ instabile Systeme erhalten. Die damit verbundenen Probleme treten bei planaren Systemen bzw. Trägern noch verstärkter auf, insofern dort ein im wesentlichen mechanischer Sandwichaufbau zur Sensorherstellung nicht mehr eingesetzt werden kann. Wenn sich in solchen Biosensoren mit Sandwichbauweise durch den Verlust des mechanischen Zusammenhaltes Risse in den einzelnen Membranschichten bilden, werden die erhaltenen Meßwerte beispielsweise durch oben erwähnte Störsubstanzen in einem Ausmaß verfälscht, daß selbst zuvor erwähnte Differenzmeßanordnungen mit einem bioinaktiven Feld diese nicht mehr kompensieren können.

DE 42 08 186 A1 beschreibt eine Sandwich-Membran für Biosensoren, wobei eine Biomaterialschicht vorgesehen wird, die zum Sensor mit einer gasselektiven Schicht abgegrenzt ist und die mit einer zur Meßlösung gewandten mikrostrukturierten Schicht abgedeckt ist, deren Permeabilität für verschiedene Substrate/Cosubstrate inhomogen ist, wobei sich zwischen der gasselektiven Schicht und der Biomaterialschicht bzw. auf der zur Meßlösung gewandten Seite der mikrostrukturierten Schicht gegebenenfalls Dialyseschichten befinden. JP 031 30 656 A beschreibt eine Elektrode auf Basis eines Laminatfilms. DE 41 28 569 C1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer semipermeablen Polymerschicht, die in situ auf einem elektrisch leitenden Substrat abgeschieden wird. Die durch elektrochemische Polymerisation gebildeten Polymerschichten sind aus Polyoxyphenylen oder Polyoxynaphthalinketten aufgebaut, die an den aromatischen Gruppen Ionen-austauschfähige und Ionen-leitfähige Gruppen tragen. Diese Polymerschichten eignen sich als semipermeable Membran in einer Elektroden/Membran-Einheit, als selektive Phase oder als Komponente einer selektiven Phase für potentiometrische oder amperometrische Sensoren. DE 689 13 144 T2 beschreibt inter alia einen Biosensor, der eine Elektrode mit darauf immobilisiertem Enzym umfaßt und in der angegebenen Reihenfolge auf der Elektrodenfläche eine aufgalvanisierte Metallschicht, die das Enzym und einen Vermittler für die Elektronenübertragung enthält, sowie eine Schicht einer elektropolymerisierten Substanz aufweist, welche das Enzym und den Vermittler für die Elektronenübertragung enthält. JP 020 87 056 A beschreibt einen Enzymsensor, wobei ein Film, der ein Enzym, wie beispielsweise Glukokinase, fixiert aufweist, auf einer Oberfläche eines leitfähigen Films laminiert ist. JP 020 99 850 A beschreibt das Immobilisieren eines Mediators in einem auf einem Elektrodensubstrat gebildeten hochleitenden Polymerfilm zusammen mit einem Enzym.

DE 100 25 174 A1 beschreibt eine Elektrode aus einem Komposit, dessen Oberfläche eine Mikrorauhigkeit aufweist, wobei an der Oberfläche Biomoleküle gebunden sind.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine stabile Enzymelektrodenanordnung bzw. einen Biosensor in Sandwichbauweise bereitzustellen, welcher) Messungen schnell und in hoher Präzision ohne das Auftreten von Interferenzeffekten bei anhaltendem Einsatz ermöglichen soll und somit eine verlässliche Signalamplifikation von biologischen Bindungsreaktionen erzeugen soll. Dies sollte ohne kovalente Kopplung der üblicherweise in einer Membran immobilisierten biologischen Komponenten realisiert werden.

Diese Aufgabe wird durch die in den unabhängigen Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Insbesondere wird eine Enzymelektrodenanordnung bereitgestellt, umfassend in der folgenden Reihenfolge mindestens ein Substrat mit einer Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 20 nm bis 10 μm, gemessen durch AFM-Messung,
eine Metallelektrode,
eine ultradünne semipermeable Membran mit einer Dicke im Bereich von 10 bis 100 nm, und
mindestens eine Enzymmembran.

Die Figuren zeigen:
1 zeigt eine schematische Aufsicht (1a) auf einen Ausschnitt einer beispielhaften Biosensoranordnung gemäß der vorliegenden Erfindung sowie eine Querschnittsansicht entlang der Linie A-B (1b).
2 zeigt eine schematische Querschnitt (2a) einer beispielhaften Biosensoranordnung gemäß der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit einer Durchflusszelle sowie eine entsprechende Aufsicht darauf (2b).
3 zeigt schematisch eine Querschnittsansicht des Schichtaufbaus einer erfindungsgemäßen Enzymelektrodenanordnung sowie darunter einen vergrößerten Ausschnitt daraus.
Das Material des Substrats unterliegt keiner spezifischen Beschränkung, solange es befähigt ist, eine Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 20 nm bis 10 μm auszubilden und im allgemeinen als Trägermaterial eines Biosensors geeignet ist. Vorzugsweise ist das Substrat aus einem organischen Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyacrylat-, Polyimid-, Polyester- und Polycarbonat- Homo- und Copolymeren davon, aufgebaut. Alternativ können Substrate auf Basis anorganischer Materialien wie z.B. poröses Silizium oder geätztes Glas eingesetzt werden. Vorzugsweise weisen die verwendeten Substrate Dicken im Bereich von 0,01 bis 5 mm auf.
Die Metallelektrode kann aus jeder der im Rahmen von Biosensoren üblicherweise eingesetzten Materialien aufgebaut sein, wie beispielsweise Platin oder Gold. Die Schichtdicke der Metallelektrode ist dabei so dünn ausgelegt, daß sie befähigt ist, sich an die Oberflächenrauhigkeitsstruktur des mikrorauhen Substrats anzupassen. Insbesondere ist die Metallelektrodenschicht dünn genug ausgelegt, mindestens einen Teil der Oberflächenrauhigkeit des erfindungsgemäß eingesetzten Substrats an dessen Oberfläche zu erhalten bzw. zu übernehmen. Üblicherweise weist die Metallelektrode im Rahmen der erfindungsgemäßen Enzymelektrodenanordnung eine Schichtdicke im Bereich von 50 bis 250 nm auf.
Gemäß der Sandwichbauweise der erfindungsgemäßen Enzymelektrodenanordnung ist auf der Metallektrode eine ultradünne semipermeable Membran bzw. eine Anti-Interferenzmembran angeordnet. Darunter wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Membran verstanden, die eine ausreichende Porösität aufweist, daß Moleküle wie H₂O₂ oder O₂ bzw. solche in ähnlicher Größenordnung durchdiffundieren und die Metallelektrodenoberfläche kontaktieren können. Der Zutritt von Stoffen wie beispielsweise Ascorbinsäure, Harnsäure, Pracetamol und Gentisinsäure als Metabolit der Acetylsalicylsäure, die jeweils ein Molekulargewicht von größer als 100 Dalton aufweisen und, falls sie die Metallelektrode erreichen könnten, oxidiert werden würden, was ein „falsches" Signal hervorrufen würde, wird jedoch durch die ultradünne semipermeable Membran verhindert. Diese semipermeable Membran ist vorzugsweise aus einem organischen Polymermaterial aufgebaut, das durch Elektropolymerisation von organischen Monomeren, ausgewählt aus (i) diamino-, (ii) dihydroxy- oder (iii) sowohl amino- als auch hydroxysubstituierten aromatischen Kohlenwasserstoffen und Gemischen davon, gebildet worden ist. Die organischen Monomere sind dabei vorzugsweise aus 1,2-Diaminobenzol, 1,3-Diaminobenzol, 2,3-Diaminonaphthalin, 1,5-Diaminonaphthalin, 1,8-Diaminonaphthalin, 5-Amino-1-naphthol oder Resorcin ausgewählt.
Auf der semipermeablen Membran ist eine übliche Enzymmembran angeordnet. Vorzugsweise ist in dieser Membran mindestens ein Enzym aus der Gruppe der Oxidasen immobilisiert. Die Oxidasen können dabei aus der Gruppe, bestehend aus Lactatoxidase, Galactoseoxidase, L-2-Hydroxysäureoxidase, Glucoseoxidase, Glycolatoxidase, Hexoseoxidase, L-Gulonolactonoxidase, L-Sorboseoxidase, Pyridoxol-4-oxidase und Alkoholoxidase, ausgewählt sein.
Durch die ausgehend von dem mikrorauhen Substrat über die Metallelektrode und die semipermeable Membran auf die untere Oberflächenseite der Enzymmembran übertragene Rauhigkeitsstruktur wird innerhalb des Sandwichverbunds der erfindungsgemäßen Enzymelektrodenanordnung in einfacher Weise ein mechanischer Selbstzusammenhalt hervorgerufen, so daß die erfindungsgemäße Enzymelektrodenanordnung Messungen von entsprechenden Analyten schnell und in hoher Präzision ohne das Auftreten von Interferenzeffekten bei anhaltendem Einsatz ermöglicht, wobei dies in besonders vorteilhafter Weise ohne kovalente Kopplung der üblicherweise in einer Membran immobilisierten biologischen Komponenten erreicht wird. Damit wird in vorteilhafter Weise der zeitlichen Abnahme der Anti-Interferenzwirkung, wie es im Fall der Verwendung von glatten Substraten erfolgt, entgegengewirkt.
Zusätzlich kann auf der Enzymmembran weiter zur Verbesserung der Meßgenauigkeit eine diffusionshemmende Membran, beispielsweise eine pHEMA-Membran, und/oder eine Katalase-Membran zum Verhindern oder zur Verringerung von Störeinflüssen angeordnet werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Enzymelektrodenanordnung, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen eines Substrats mit einer Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 20 nm bis 10 μm,
(b) Aufbringen einer Metallelektrodenschicht auf dem Substrat in einer Schichtdicke, die ausreichend dünn ausgelegt ist, sich an die Oberflächenrauhigkeitsstruktur des Substrats anzupassen,
(c) Aufbringen einer semipermeablen Membran in einer Dicke im Bereich von 10 bis 100 nm und
(d) Aufbringen von mindestens einer Enzymmembran.

Das Erzeugen der Oberflächenrauhigkeit in dem Substrat kann insbesondere durch Bereitstellen eines vorbehandelten metallischen oder keramischen Masters und anschließendes Replikatformen durch Aufbringen eines entsprechenden flüssigen oder thermisch erweichbaren Polymervorläufers bzw. Polymers auf den Master und anschließendes Härten bzw. Abkühlen oder auch durch thermisches Einprägen in den Polymervorläufer bzw. das Polymer unter Bereitstellen des Substrats mit einer Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 20 nm bis 10 μm erfolgen. Der Master kann dabei zur Bereitstellung einer entsprechenden mikrorauhen Oberfläche, die im Rahmen des Replikatformens als Negativform fungiert, durch beispielsweise Mikrofräsen, fotolithographisches Ätzen, Sandstrahlen, mechanisches Prägen oder galvanisches Aufrauhen vorbehandelt werden. Ist solcherart das Substrat in den Master eingeprägt worden, wird das Substrat anschließend vom Master getrennt, indem sie entweder mechanisch getrennt werden oder der Master beispielsweise durch ein Ätzverfahren aufgelöst wird.
Eine weitere Ausführungsform hinsichtlich des Erzeugens der Oberflächenrauhigkeit des Substrats besteht darin, das Substrat anzuätzen. So können beispielsweise Glasoberflächen in bekannter Weise Flußsäuredämpfen ausgesetzt werden. Ferner kann beispielsweise Polyimid mit im Stand der Technik hierfür üblicherweise eingesetzten Säuregemischen angeätzt werden.
Das Aufbringen der Metallelektrodenschicht in Schritt (b), insbesondere eine Platin- oder Goldelektrode, kann beispielsweise mittels Vakuumabscheidungsverfahren, beispielsweise PVD- oder CVD-Verfahren, durchgeführt werden. Die Metallelektrode wird dabei in einer solchen Schichtdicke aufgebracht, die angepasst ist, die Oberflächenrauhigkeitsstruktur des mikrorauhen Substrats zu übernehmen. Die Schichtdicke der Metallelektrodenschicht wird so gewählt, daß mindestens ein Teil der Oberflächenrauhigkeit des erfindungsgemäß eingesetzten Substrats erhalten bleibt bzw. übernommen wird. Üblicherweise weist die Metallelektrode im Rahmen der erfindungsgemäßen Enzymelektrodenanordnung eine Schichtdicke im Bereich von 50 bis 250 nm auf.
Vorzugsweise wird in Schritt (c) die semipermeable Membran durch Elektropolymerisation von organischen Monomeren, ausgewählt aus diamino- oder dihydroxy-substituierten Benzolen oder Naphthalinen und Gemischen davon, in üblicher Weise aufgebracht. Das Aufbringen kann beispielsweise durch Elektropolymerisation mittels zyklischer Variation des Potentials in einer Lösung aus beispielsweise neutralem Phosphatpuffer erfolgen.
Das Aufbringen der Membranlösungen zur Bildung der Enzymmembran und gegebenenfalls ein oder mehrerer weiterer Membrane, wie beispielsweise einer diffusionshemmenden Membran oder einer Katalase-Membran, kann mittels herkömmlicher Techniken, wie z.B. Dispensieren oder spin/dip-coating, erfolgen. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird üblicherweise zunächst eine photoreaktive Membran-Precursor-Lösung aufgebracht, welche zur Vernetzung anschließend einer UV-Licht-Bestrahlung unter Sauerstoff-freier Atmosphäre, z.B. Argon-Atmosphäre, ausgesetzt wird. Die Enzymmembran-Lösungen enthalten dabei vorzugsweise mindestens ein Enzym aus der Gruppe der Oxidasen. Die Oxidasen können dabei aus der Gruppe, bestehend aus Lactatoxidase, Galactoseoxidase, L-2-Hydroxysäureoxidase, Glucoseoxidase, Glycolatoxidase, Hexoseoxidase, L-Gulonolactonoxidase, L-Sorboseoxidase, Pyridoxol-4-oxidase und Alkoholoxidase, ausgewählt werden. Eine typische Membran-Precursor-Lösung enthält pHEMA als polymeres Bindemittel, HEMA (Hydroxyethylacrylat) als reaktives Monomer, TEGDMA (Tetraethylenglykoldimethacrylat) als Vernetzungsmittel, Polyethylenglykol als Plastifiziermittel und einen Photoinitiator wie z.B. ω,ω'-Dimethoxy-ω-phenylacetophenon sowie Wasser. Nach Lösen der vorstehenden Bestandteile und Filtration werden die gewünschten Enzyme zu der Precursor-Lösung gegeben.
Vorzugsweise werden derartige Enzyme auf der erfindungsgemäßen Enzymelektrodenanordnung in einer vernetzten pHEMA-Membran immobilisiert.
Bei der Immobilisierung von Proteinen, wie z.B. Enzymen, in Polymeren mittels deren Polymerisation bzw. Vernetzung, die durch freie Radikale ausgelöst wird, welche insbesondere durch Photolyse mit UV-Licht erzeugt werden, stellt sich bei Proteinen, welche Sulfhydryl(-SH)-Gruppen an deren Oberfläche aufweisen, wie z.B. Glucoseoxidase, das Problem, daß derartige -SH Gruppen zu einem solchen Ausmaß freie Radikale verbrauchen, daß die Polymerisation bzw. Vernetzung wesentlich gehemmt wird. Dies läßt sich jedoch erfindungsgemäß dadurch vermei den, daß der Zusammensetzung zur Herstellung einer Enzymmembran ein molekulares chinoides Agens beigemischt wird, welches befähigt ist, unter UV-Licht-Bestrahlung ein Wasserstoffatom von den -SH Gruppen zu abstrahieren. Dadurch wird nicht nur der Verbrauch von anderen Radikalen durch -SH Gruppen verhindert, sondern auch durch das intermediär gebildete Schwefelradikal die zur Bereitstellung der Enzymmembran durchzuführende Polymerisation bzw. Vernetzung unterstützt. Als solche molekularen chinoiden Agentien können unsubstituierte oder substituierte Benzochinone, Anthrachinone oder Naphthochinone sowie deren Derivate oder ein Gemisch von einem oder mehreren davon eingesetzt werden. Als Derivate können beispielsweise deren Imin-, Oxim-, Cyanimin- und/oder Dicyanmethidverbindungen, wie z.B. 1,4-Benzochinondioxim, 1,4-Benzochinondiimin, Tetracyano-p-chinodimethan und N,N'-Dicyanochinondiimin, eingesetzt werden. Vorzugsweise wird in der erfindungsgemäßen Elektrodenformulierung ein unsubstituiertes oder substituiertes, ortho- oder para-Benzochinon als chinoides Agens verwendet. Neben geradkettigen oder verzweigtkettigen (C₁-C₆)-Alkyl-, (C₃-C₇)-Cycloalkyl-, (C₁-C₆)-Alkoxy- und (C₁-C₆)-Thioetherresten können die Substituenten auch ein oder mehrere, gleiche oder unterschiedliche, elektronenziehende Gruppen sein, vorzugsweise ausgewählt aus Fluor, Chlor, Brom, Nitro, Cyan und Sulfonat. Als derartige chinoide Agentien können beispielhaft Chloranil, Durochinon und p-Benzochinon angeführt werden.
Vorzugsweise erfolgt das Aufbringen der Membranlösungen dabei mittels Dispensiertechnik, wobei eine Kanüle, aus welcher dispensiert wird, gegebenenfalls mit einem hydrophoben Überzug versehen sein kann, wodurch sowohl die Stabilität des Dispensiervorganges als auch dessen Reproduzierbarkeit gesteigert wird. Das Aufbringen der aktiven Membranen mittels Dispensiertechnik ist inbesondere dann günstig, wenn anstelle einer einzelnen, entsprechend großen Elektrode eine Vielzahl kleinerer Elektroden gemäß der vorliegenden Erfindung zur Realisierung der gewünschten Signalstärke vorgesehen werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymelektrodenanordnung in einer Biosensoranordnung. Eine solche Biosensoranordnung kann neben der erfindungsgemäßen Enzymelektrodenanordnung, in der die Metallelektrode als Arbeitselektrode wirkt, bei spielsweise weiter eine Ag/AgCl-Elektrode als Referenzelektrode und/oder eine Differenzmeßelektrode bzw. „Dummy-Elektrode" zur Eliminierung von Nebeneffekten über Differenzmessung umfassen. Vorzugsweise ist die Referenzelektrode und/oder Differenzmeßelektrode auf dem gleichen mikrorauhen Substratmaterial angeordnet, wie für die erfindungsgemäße Enzymelektrodenanordnung vorgesehen, d.h. die Referenzelektrode und/oder die Differenzmeßelektrode sind in räumlich vorbestimmter Nachbarschaft zur erfindungsgemäßen, die Enzymmembran aufweisenden Enzymelektrodenanordnung angeordnet.
Zur Isolierung der Biosensoranordnung und gleichzeitigen Erzeugung von Vertiefungen zur Aufnahme der Enzymmembran bzw. der Referenzelektrode und/oder der Differenzmeßelektrode kann auf der erfindungsgemäßen Biosensoranordnung eine 25 bis 200 μm dicke Lage eines photostrukturierbaren Materials, z.B. Vacrel 8120, vertrieben von DuPont, vorgesehen werden. Das Anordnen einer solchen Schicht auch auf der Rückseite des Substrats als Träger der erfindungsgemäßen Biosensensoranordnung kann das Auftreten von mechanischen Spannungen kompensieren, welche sonst zu Verbiegungen führen könnten, und erlaubt im Rahmen der vorliegenden Erfindung zudem den Einsatz auch sehr dünner Substratmaterialien.
Zur Bereitstellung einer den gewünschten Meßraum außen umschliessenden Dichtung bzw. eines Abstandshalters kann ebenfalls die Verwendung eines 25 bis 200 μm dicken photostrukturierbaren Materials vorgesehen werden. Ferner kann eine beidseitig klebende strukturierte Folie zur Verbindung von Sensor und einem Oberteil vorgesehen werden, wobei eine solche Klebefolie gleichzeitig als Abstandshalter und Dichtung zur Ausformung einer Messkammer mit den Sensorelektroden dient. Als Oberteil solcher Messkammern kann dabei eine strukturierten Edelstahlfolie vorgesehen werden, wobei eine solche Edelstahlfolie sowohl zum Verschließen der Messkammer als auch zum Ableiten des Stromes der Sensoren dient.
In 1 ist eine schematische Aufsicht auf eine derartige beispielhafte Biosensoranordnung gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt, in welcher eine erfindungsgemäße Enzymelektrode (1), eine Dummy-Elektrode (2) und eine Ag/AgCl- Referenzelektrode (3) räumlich voneinander beabstandet auf einer Chipfläche (6), wie z.B. einer Polyimidfolie, angeordnet sind. Die Bezugszeichen (4) bzw. (5) stehen dabei für entsprechende Kontaktflächen (Kontaktpads) bzw. Metallflächen wie die Metallelektrodenschicht. An den Kontaktpads sind elektrische Verdrahtungen angeordnet (nicht gezeigt), die üblicherweise zu einem oder mehreren herkömmlichen Meßgeräten führen. 1b zeigt schematisch eine Querschnittsansicht entlang der Linie A-B. Auf dem Substrat (7) sind neben einer Enzymelektrode, die aus der Metallelektrodenschicht (5), der semipermeablen Membran (15), der Enzymmembran (11), einer diffusionshemmenden Membran (12) und einer Katalase-Membran (13) aufgebaut ist, eine Dummy-Elektrode mit einer Dummy-Membran bzw. Differenzsensormembran (10) anstelle der Enzymmembran und eine Ag/AgCl-Elektrode (Bezugszeichen (8) bzw. (9) stehen für Ag bzw. AgCl) angeordnet. Die Elektroden (1), (2) und (3) sowie die Kontaktflächen sind dabei in Öffnungen der auf dem Substrat (7) angeordneten Isolationsschicht (14), die üblicherweise ein photostrukturierter Trockenresistfilm ist, angeordnet bzw. eingelassen.
2 zeigt eine schematische Querschnitt (2a) einer beispielhaften Biosensoranordnung gemäß der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit einer Durchflusszelle sowie eine entsprechende Aufsicht darauf (2b). Die Durchflußzelle wird nach außen hin durch eine zweite Lage von Trockenresist (16) abgeschlossen. Alternativ kann hierfür auch eine beidseitig klebende strukturierte Folie vorgesehen werden. Als Oberteil der Durchflußzelle ist eine strukturierte Edelstahlfolie (17) angeordnet. Die Bezugszeichen (18) und (19) stehen für einen Flüssigkeitseinlaß bzw. Flüssigkeitsauslaß.
In 3 ist schematisch in einer Querschnittsansicht der Schicht- bzw. Sandwichaufbau einer erfindungsgemäßen Enzymelektrodenanordnung sowie ein vergrößerter Ausschnitt daraus dargestellt. Auf einem erfindungsgemäßen mikrorauhen Substrat (7) ist eine Metallelektrode (5) in einer solchen Schichtdicke angeordnet, die derart dünn ausgelegt ist, daß sich die Metallelektrode an die Oberflächenrauhigkeitsstruktur des Substrats anpasst. Auf der Metallelektrodenschicht ist eine ultradünne semipermeable Membran (15) angeordnet, auf welcher eine Enzymmembran (11) aufgebracht ist.
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert.
Beispiel
Zur Herstellung einer Biosensoranordnung gemäß der vorliegenden Erfindung wird zunächst von einer im Handel erhältlichen Polyimidfolie (Pyralux AP, DuPont) die entsprechende Kupferschicht durch Ätzen mit 20 Gew.-% Na₂S₂O₈ entfernt, wodurch ein Polyimidsubstrat mit mikrorauher Oberfläche erhalten wurde. Anschließend wurde auf das derart erzeugte mikrorauhe Substrat eine im Handel erhältliche Fotoresistlage (Tenmaster TM 100, DuPont) aufgebracht und unter Ausbildung vorbestimmter Zonen bzw. Kontaktflächen, z.B. zum Auftrag des Analyten, entsprechend photolithographisch strukturiert.
Anschließend wurde zur Bildung einer Metallelektrodenschicht eine 100 nm dicke Platinschicht im Vakuum aufgedampft. Zur Vermeidung einer Oberflächenverschmutzung der so gebildeten Pt-Metallelektrodenschicht in den sich daran anschließenden Verfahrenschritten kann auf die Pt-Schicht gegebenenfalls eine 100 nm dicke Titanschicht abgeschieden werden. Nach Ablösen der zuvor aufgebrachten Resistlage verbleibt eine strukturierte Metallage auf dem Polyimidsubstrat.
Zur Kompensation von Schrumpfung und aus Isolationszwecken wurden auf die Ober- und Unterseite des derart strukturierten Polyimidsubstrat Trockenresistlagen (Vacrel 8120, DuPont) angeordnet und wiederum entsprechend photolithographisch strukturiert.
Nach dem Entfernen der Titanschicht durch herkömmliches Ätzen wurde auf dem Substrat eine Ag/AgCl-Referenzelektrode durch galvanisches Aufbringen einer Silberschicht und anschließendes galvanisches Umwandeln eines Teils davon in Silberchlorid mittels 0,1 M KCl angeordnet.
Daran schloß sich das Aufbringen einer semi-permeablen Membran durch Elektropolymerisation einer Lösung von 3 mM 1,3 Diaminobenzol in neutralem Phos phatpuffer mittels zyklischer Variation des Potentials über 18h an.
Anschließend wurde darauf eine Glukoseoxidase-haltige Membran auf Basis folfolgender Zusammensetzung aufgebracht:
1 Vol.-Teil einer Lösung C + 1 Vol.-Teil einer Lösung B + 6 Vol-Teile einer Lösung A, wobei die Lösungen A, B und C folgende Zusammensetzungen aufwiesen:
Lösung A: 24 Gew.-% pHEMA, 12 Gew.-% HEMA, 3 Gew.-% TEGDMA, 1 Gew.-% ω,ω'-Dimethoxy-ω-phenylacetophenon, 36 Gew.-% PEG400 und 24 Gew.-% H₂O;
Lösung B: 0,2 Gew.-% Benzochinon und 1 Gew.-% N-Methyldiethanolamin in PEG 400;
Lösung C: 25 Gew.-% Glukoseoxidase-Lyophilisat in Wasser
Anschließend wurde eine Membran auf eine Dummy"-Elektrode aufgebracht, die auf dem Substrat zusätzlich angeordnet worden war, wobei diese „Dummy"-Membran auf folgender Zusammensetzung basierte (1 Vol.-Teil Wasser + 1 Vol.-Teil Lösung B + 6 Vol.-Teile der vorstehenden Lösung A).
Um den Stoffzutritt durch Diffusion zu verlangsamen, wurde auf die vorstehend gebildete Enzymmembran zusätzlich eine diffusionshemmende Membran auf Basis folgender Zusammensetzung aufgebracht:
18 Gew.-% pHEMA, 18 Gew.-% HEMA, 3 Gew.-% TEGDMA, 1 Gew.-% ω,ω'-Dimethoxy-ω-phenylacetophenon, 36 Gew.-% PEG400 und 24 Gew.-% H₂O
Abschließend erfolgte das Aufbringen einer Katalase-Membran, um ein Queransprechen des Sensors zu verhindern und die Abhängigkeit der Sensorempfindlichkeit von der Geschwindigkeit der Bewegung der Lösung zu minimieren. Die Katalase-Membran basierte dabei auf folgender Zusammensetzung:
1 Vol.-Teil einer Lösung D + 1 Vol.-Teil Glycerin + 6 Vol-Teile einer Lösung A, wobei die Lösung A die vorstehende Zusammensetzung aufwies und die Lösung D wie folgt zusammengesetzt war:

1: Enzymelektrode
2: Dummy-Elektrode
3: Ag/AgCl-Referenzelektrode
4: Kontaktflächen
5: Metallflächen
6: Chipfläche
7: Mikrorauhes Substrat
8: Silber
9: Silberchlorid
10: Differenzsensormembran („Dummymembran")
11: Enzymmembran
12: Diffusionshemmende Membran, z.B. pHEMA-Membran
13: Katalase-Membran
14: Isolationsschicht
15: semipermeable Membran
16: weitere Trockenresistlage oder beidseitig klebende strukturierte Folie
17: strukturierte Edelstahlfolie
18: Flüssigkeitseinlaß
19: Flüssigkeitsauslaß

Claims

Enzymelektrodenanordnung, umfassend in der folgenden Reihenfolge ein Substrat mit einer Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 20 nm bis 10 μm, eine Metallelektrode, eine ultradünne semipermeable Membran mit einer Dicke im Bereich von 10 bis 100 nm und mindestens eine Enzymmembran.
Enzymelektrodenanordnung nach Anspruch 1, wobei das Substrat aus einem organischen Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyacrylat-, Polyimid-, Polyester- und Polycarbonat-Homo- und Copolymeren davon, aufgebaut ist.
Enzymelektrodenanordnung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Metallelektrode eine Schichtdicke im Bereich von 50 bis 250 nm aufweist.
Enzymelektrodenanordnung nach Anspruch 3, wobei die . Metallelektrode eine Platinelektrode oder Goldelektrode ist.
Enzymelektrodenanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die semipermeable Membran aus einem organischen Polymermaterial aufgebaut ist, das durch Elektropolymerisation von organischen Monomeren, ausgewählt aus (i) diamino-, (ii) dihydroxy- oder (iii) sowohl amino- als auch hydroxy-substituierten aromatischen Kohlenwasserstoffen und Gemischen davon, gebildet worden ist.
Enzymelektrodenanordnung nach Anspruch 5, wobei die organischen Monomere aus 1,2-Diaminobenzol, 1,3-Diaminobenzol, 2,3-Diaminonaphthalin, 1,5-Diaminonaphthalin, 1,8-Diaminonaphthalin, 5-Amino-1-naphthol und Resorcin
Enzymelektrodenanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Enzymmembran mindestens ein Enzym aus der Gruppe der Oxidasen umfaßt.
Enzymelektrodenanordnung nach Anspruch 7, wobei die Oxidasen aus der Gruppe, bestehend aus Lactatoxidase, Galactoseoxidase, L-2-Hydroxysäureoxidase, Glucoseoxidase, Glycolatoxidase, Hexoseoxidase, L-Gulonolactonoxidase, L-Sorboseoxidase, Pyridoxol-4-oxidase und Alkoholoxidase, ausgewählt sind.
Enzymelektrodenanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei auf der Enzymmembran weiter eine diffusionshemmende Membran, vorzugsweise eine pHEMA-Membran, und/oder eine Katalase-Membran zur Verringerung von Störeinflüssen angeordnet ist bzw. sind.
Verfahren zur Herstellung einer Enzymelektrodenanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Substrats mit einer Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 10 nm bis 10 μm, (b) Aufbringen einer Metallelektrodenschicht auf dem Substrat, (c) Aufbringen einer semipermeablen Membran in einer Dicke im Bereich von 10 bis 100 nm, und (d) Aufbringen von mindestens einer Enzymmembran.
Verfahren nach Anspruch 10, worin vor Schritt (a) das Erzeugen der Oberflächenrauhigkeit in dem Substrat durch Bereitstellen eines vorbehandelten metallischen oder keramischen Masters und anschließendes Replikatformen durch Aufbringen eines flüssigen Polymervorläufers auf den Master und Härten des Polymervorläufers unter Bereitstellen des Substrats mit einer Oberflächenrauhigkeit im Bereich von 20 nm bis 10 μm erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der Master durch Mikrofräsen, fotolithographisches Ätzen, Sandstrahlen, mechanisches Prägen oder galvanisches Aufrauhen vorbehandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, worin vor Schritt (a) das Erzeugen der Oberflächenrauhigkeit in dem Substrat durch Entfernen der Metallschicht in einer Metall-Polymer-Laminatfolie mittels Ätzen erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin das Aufbringen der Metallelektrodenschicht in Schritt (b) mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin in Schritt (c) die semipermeable Membran durch Elektropolymerisation von organischen Monomeren, ausgewählt aus (i) diamino-, (ii) dihydroxy- oder (iii) sowohl amino- als auch hydroxy-substituierten aromatischen Kohlenwasserstoffen und Gemischen davon, aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, worin in Schritt (d) das Aufbringen von mindestens einer Enzymmembran mittels Dispensiertechnik erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 16, worin zunächst eine photoreaktive Membran-Precursor-Lösung aufgebracht wird, welche zur Vernetzung anschließend einer UV-Lichtbestahlung unter Sauerstoff-freier Atmosphäre ausgesetzt wird.
Verwendung der Enzymelektrodenanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einer Biosensoranordnung.
Biosensoranordnung, umfassend eine Enzymelektrodenanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Biosensoranordnung nach Anspruch 19, weiter umfassend eine Ag/AgCl-Elektrode als Referenzelektrode und/oder eine Differenzmeßelektrode zur Eliminierung von Nebeneffekten über Differenzmessung.
Verwendung eines molekularen chinoiden Agens zur Herstellung einer Enzymmembran, worin mindestens ein Enzym immobilisiert wird.