DE10025174A1 - Verfahren zur Herstellung einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode - Google Patents

Verfahren zur Herstellung einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode mit folgenden Schritten: DOLLAR A a) Bereitstellen eines Komposits, das aus einem mit Kunststoff gebundenen elektrischen leitfähigen Stoff hergestellt ist, DOLLAR A b) Behandeln des Komposits mit einer sauren oder basischen ersten Lösung und DOLLAR A c) Behandeln des Komposits mit einer das Biomolekül enthaltenden zweiten Lösung, wobei das Biomolekül an die Oberfläche des Kunststoffs gebunden wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode sowie eine nach die­ sem Verfahren hergestellte Elektrode und deren Verwendung.
Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der elektrochemi­ schen Anreicherung von Biomolekülen auf elektrisch leitfähi­ gen Oberflächen. Dazu ist es bekannt auf den Oberflächen zu den anzureichernden Biomoleküle affine Biomoleküle zu immobi­ lisieren.
Aus der WO 95/12808 ist eine Mehrzahl separat adressierbarer Elektroden bekannt, welche in Reaktionslokalitäten angeordnet sind. Indem unterschiedliche Spannungen an die Elektroden an­ gelegt werden, können bestimmte vorgegebene Reaktionen an den Elektroden stattfinden. Die Elektroden weisen funktionelle Gruppen zum Binden von Biomolekülen auf. Die funktionellen Gruppen sind hier in einer Zwischenschicht angeordnet. - Die Herstellung der Vorrichtung ist aufwendig. Insbesondere ist das Vorsehen einer Zwischenschicht auf den Elektroden um­ ständlich.
In der WO 96/01836 ist ein Chip zum Nachweis von Polynukleo­ tidsequenzen beschrieben. Der Chip kann z. B. aus einem Sili­ ziumsubstrat hergestellt sein. Auf dem Chip ist eine Vielzahl von Reaktionsfeldern vorgesehen, an die jeweils eine vorgege­ bene Polynukleotidsequenz gebunden ist. Sofern der Chip in eine die nachzuweisende Polynukleotidsequenz enthaltende Lö­ sung getaucht wird, kommt es zur Hybridisierung mit der am Chip immobilisierten komplementären Nukleotidsequenz. Die Hy­ bridisierung wird durch Fluoreszenz nachgewiesen. - Die Her­ stellung solcher Chips ist aufwendig. Das damit durchführbare Nachweisverfahren ist zeit- und kostenaufwendig.
Aus der US 5,871,918 ist eine Elektrode bekannt, auf deren Oberfläche ein elektrisch leitender Polymerfilm aufgebracht ist. An dem Polymerfilm sind Polynukleotide gebunden. Eine Hybridisierung mit dazu komplementären in einer Nachweislö­ sung enthaltenen Polynukleotiden wird elektrochemisch mit in­ terkalierenden Makermolekülen nachgewiesen. - Das Verfahren ist zeitaufwendig, da die Hybridisierung langsam vor sich geht.
Aus der WO 98/02399 ist eine aus Kunststoff hergestellte Elektrode bekannt, auf der unmittelbar Biomoleküle immobili­ siert sind. - Die Elektrode hat den Nachteil, daß die Bele­ gungsdichte der Biomoleküle an der Oberfläche der Elektrode relativ gering und nicht variierbar ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer Elektrode sowie eine Elektrode angegeben werden, die einfach und billig herstell­ bar ist und überdies mit einer hohen Belegungsdichte an Bio­ molekülen versehen werden kann. Weiteres Ziel der Erfindung ist es, den elektrischen Widerstand einer solchen Elektrode an der Oberfläche zu erniedrigen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 11 und 21 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 10, 12 bis 20 und 22.
Nach Maßgabe der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung mit einer mit Biomolekülen beschichteten Elektrode mit fol­ genden Schritten vorgeschlagen:
  • a) Bereitstellen eines Komposits, daß aus einem mit Kunst­ stoff gebundenen elektrisch leitfähigen Stoff hergestellt ist,
  • b) Behandeln des Komposits mit einer sauren oder basischen ersten Lösung und
  • c) Behandeln des Komposits mit einer das Biomolekül enthal­ tenden zweiten Lösung, wobei das Biomolekül an die Oberfläche des Kunststoffs gebunden wird.
Mit dem vorgeschlagenen Verfahren ist es auf überraschend einfache Weise möglich, die Belegungsdichte der auf der Ober­ fläche des Kunststoffs gebundenen Biomoleküle drastisch zu erhöhen. Die Belegungsdichte kann überdies durch eine Varia­ tion der Parameter der ersten Lösung, wie z. B. pH-Wert, Tem­ peratur, Behandlungsdauer und dgl., variiert werden. Das Ver­ fahren liefert Elektroden mit einer wesentlich verbesserten Leitfähigkeit. Es ist einfach durchzuführen. Die hergestell­ ten Elektroden sind kostengünstig.
Nach einem Ausgestaltungsmerkmal ist der Kunststoff ein Poly­ ester, vorzugsweise ein Polykarbonat. Der elektrisch leitfä­ hige Stoff kann Kohlefaser oder Ruß sein. Um stets eine gute elektrische Leitfähigkeit innerhalb des Komposits zu gewähr­ leisten, ist es erforderlich, daß die elektrisch leitfähigen Partikel untereinander im Punkt- oder Flächenkontakt sich be­ finden.
Untersuchungen haben gezeigt, daß durch die Behandlung des Kunststoffs mit einer sauren oder basischen Lösung u. a. Poly­ esterbindungen aufgebrochen werden. Die Bindung des Biomole­ küls an den Kunststoff ist zweckmäßigerweise ein kovalente Bindung. Bei der ersten Lösung kann es sich um eine wäßrige NaOH- oder KOH-Lösung handeln. Die Lösung kann auf eine Tem­ peratur von bis zu 90°C erwärmt werden. Es hat sich weiter als zweckmäßig erwiesen, das Komposit bis zu vier Stunden mit der ersten Lösung zu behandeln. Eine solche Behandlung führt zu einer Elektrode mit einer besonders guten elektrischen Leitfähigkeit.
Der zweiten Lösung kann als Biomolekül ein Oligonukleotid zu­ gegeben werden, dessen 5'-Ende eine NH2-Gruppe aufweist. Der zweiten Lösung kann ferner mindestens einer der folgenden Stoffe zugesetzt sein: 1-Ethyl-3-(3-Dimethylamino­ propyl)carbodiimid-hydrochlorid, Hydroxysulfosuccinimid- Natriumsalz, (2-[N-Morpholino]ethan-sulfonsäure Monohydrat, Magnesiumchlorid, EDTA.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung wird eine Elektrode vor­ geschlagen, hergestellt aus einem mit Kunststoff gebundenen elektrisch leitfähigen Stoff gebildeten Komposit, dessen Oberfläche durch Behandlung mit einer saueren oder einer ba­ sischen ersten Lösung erzeugte Mikrorauhigkeit aufweist und wobei an die Oberfläche Biomoleküle gebunden sind. - Die durch die Behandlung mit einer sauren oder eine basischen er­ sten Lösung erzeugte Mikrorauhigkeit führt überraschenderwei­ se zu einer drastischen Erhöhung der Belegungsdichte mit Bio­ molekülen sowie zu einer verbesserten Leitfähigkeit der Elek­ trode. Sie kann einfach und billig hergestellt werden.
Wegen der weiteren Ausgestaltungen der Elektrode wird auf die vorangegangenen das Verfahren betreffende Ausführungen ver­ wiesen.
Beansprucht wird schließlich die Verwendung der erfindungsge­ mäßen Elektrode zum Anreichern von weiteren Biomolekülen aus einer Probenlösung, wobei die weiteren Biomoleküle eine Affi­ nität zu den gebundenen Biomolekülen aufweisen. Unter Affini­ tät wird jegliche Wechselwirkung zwischen Biomolekülen ver­ standen, die zu einer Bindung oder Anlagerung führt. Eine Af­ finität besteht insbesondere zwischen komplementären DNA- oder RNA- oder ähnlichen Molekülen, die hybridisieren können.
Nach einer Ausgestaltung der Verwendung ist vorgesehen, daß die weiteren Biomoleküle durch zyklische Umpolung auf der Oberfläche angereichert werden. Dadurch kann die Effektivität der erfindungsgemäßen Elektrode nochmals erheblich verbessert werden.
Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines unbehandelten Komposits,
Fig. 2 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines behandelten Komposits,
Fig. 3 die Abhängigkeit der Belegungsdichte von der Tempe­ ratur und der Behandlungsdauer,
Fig. 4 die Anreicherung weiteren Biomoleküle an der Ober­ fläche der erfindungsgemäßen Elektrode.
Fig. 1 zeigt ein Komposit, das aus mit Polykarbonat gebunde­ nen Kohlefasern gebildet ist. Die Kohlefasern sind unterein­ ander im Punkt- oder Flächenkontakt, so daß eine elektrische Leitfähigkeit durch das Komposit gewährleistet ist. Die Ober­ fläche ist im wesentlichen mit Polykarbonat überzogen.
Fig. 2 zeigt das Komposit gemäß Fig. 1 nach einer 2-stündigen Behandlung mit 70°C heißer wäßriger 5 M NaOH. Im Vergleich zu Fig. 1 liegen an der Oberfläche Kohlefasern frei oder ragen darüber hinaus.
Herstellung einer Elektrode
Es wird ein Komposit hergenommen, welches aus mit Polykarbo­ nat gebundenen Kohlefasern besteht. Die Läge des Komposits beträgt etwa 130 mm, sein Durchmesser etwa 2 mm. Das Komposit wird drei Stunden bei 70°C in wäßriger 5 M NaOH-Lösung behan­ delt und anschließend drei mal mit destilliertem Wasser ge­ spült. An das so vorbehandelte Komposit werden in einem zwei­ ten Schritt unmittelbar Oligonukleotide gebunden. Dazu kann beispielsweise ein Oligonukleotid hergenommen werden, wie es im anhängenden Sequenzprotokoll Nr. 2 wiedergegeben ist. Das Oligonukleotid ist an seinem 5'-Ende mit einer NH2-Gruppe versehen. Um ein solches 5'-NH2-derivatisiertes Oligonukleo­ tid an die Oberfläche des Komposits zu binden, wird eine Lö­ sung hergestellt, die 0,26 M1-Ethyl-3-(3-Dimethylamino­ propyl)carbodiimid-hydrochlorid, 1,4 mM N-Hydroxysulfosuccin­ imid-Natriumsalz, 14 mM (2-[N-Morpholino]ethan-sulfonsäure) Monohydrat, 10 mM MgCl2, 50 µl 50 mM EDTA (ph 5,5) und 10 nM des vorgenannten Oligonukleotids enthält. Das Komposit wird bei einer Temperatur von 37°C zwei Stunden in 10 ml der vorgenann­ ten Reaktionslösung behandelt. Anschließend wird das Komposit fünf mal mit 1 × PBS gewaschen.
Zur Bestimmung der erzielten Belegungsdichte mit dem Oligonu­ kleotid kann an dessen 5'-Ende eine Fluorescin-Dithio-Gruppe gekoppelt werden. Das Oligonukleotid wird in diesem Fall an seinem 3'-Ende mit einer NH2-Gruppe versehen und darüber mit dem Polykarbonat des Komposits gebunden. Zur Messung der Men­ ge des auf der Oberfläche gebundenen Oligonukleotids kann nach Waschen der Oberfläche die Fluoresccin-Dithio-Gruppe mit Dithiothreitol abgespalten und anschließend die Fluoreszenz des freigewordenen Fluorescins in der Lösung gemessen werden. Zweckmäßigerweise wird dazu ein ph von 8,3 bis 8,5 einge­ stellt und mit 100 mM Dithiothreitol behandelt. Die dabei er­ zielten Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Darin ist die Be­ legungsdichte vom Oligonukleotid an der Oberfläche eines be­ handelten Komposits gemäß Fig. 2 gezeigt. Die Belegungsdichte nimmt mit der Konzentration der wäßrigen NaOH-Lösung, mit der Behandlungsdauer sowie mit der Temperatur der wäßrigen NaOH- Lösung zu. Die Behandlungsdauer der bei 60°C gezeigten Ergeb­ nisse hat eine Stunde betragen. Die Konzentration der bei 70 und 80°C gezeigten Ergebnisse hat jeweils 5 M betragen.
Anreicherung von Oligonukleotiden an der Elektrode
Zum Nachweis der Anreicherung wird eine nach dem vorgenannten Verfahren hergestellte Elektrode in eine Lösung getaucht, welche ein zum an die Oberfläche der Elektrode gebundenes komplementäres nachzuweisendes Oligonukleotid enthält. Ein solches Oligonukleotid ist im anhängenden Sequenzprotokoll Nr. 1 gezeigt. Das nachzuweisende Oligonukleotid weist eine Länge von 100 bp auf. Anschließend wird ein Stück der Elektro­ de in eine PCR-Lösung gebracht; die aus der Lösung gebundenen nachzuweisenden Oligonukleotide werden thermisch bei 95°C abgespalten. Es wird eine PCR durchgeführt und Amplifikationsprodukte durch Gelelektrophorese nachgewiesen. Die Ergeb­ nisse sind in Fig. 4 gezeigt. Die Spur A in Fig. 4 zeigt ei­ nen Standard. Bei der Spur B ist ein Potential von 1 V gegen eine Ag/AgCl-Elektrode für 60 Sekunden angelegt worden. Es ist eine starke Bande bei 100 bp erkennbar. In der Spur C ist ein Ergebnis gezeigt, bei dem nach dem Anlegen des Potentials ein entgegengesetztes Potential von minus 0,5 V für 30 Sekun­ den eingestellt worden ist, um unspezifisch angereicherte Mo­ leküle mit negativer Ladung abzustoßen. Hier zeigt sich eine besonders starke Bande bei 100 bp. In den Spuren D und E sind Ergebnisse gezeigt, bei denen kein Potential an die Elektrode angelegt worden ist. Es ist keine Bande bei 100 bp erkennbar. Eine Anreicherung des nachzuweisenden Oligonukleotids aus der Lösung hat hier also nicht stattgefunden. In den Spuren F bis I sind Ergebnisse von Versuchen aufgetragen, bei denen Oligo­ nukleotide mit einer Länge von 100 bp enthaltende Vergleichs­ lösungen in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Elektrode einer PCR unterzogen worden sind. Bei dem Ergebnis gemäß der Spur J ist die PCR ohne Anwesenheit der Elektrode durchgeführt wor­ den. Es zeigt sich, daß die erfindungsgemäße Elektrode die PCR offenbar hemmt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (22)

1. Verfahren zur Herstellung einer mit Biomolekülen be­ schichteten Elektrode mit folgenden Schritten:
  • a) Bereitstellen eines Komposits, das aus einem mit Kunst­ stoff gebundenen elektrisch leitfähigen Stoff hergestellt ist,
  • b) Behandeln des Komposits mit einer sauren oder basischen ersten Lösung und
  • c) Behandeln des Komposits mit einer das Biomolekül enthal­ tenden zweiten Lösung, wobei das Biomolekül an die Oberfläche des Kunststoffs gebunden wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kunststoff ein Po­ lyester ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Polyester ein Poly­ karbonat ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der elektrisch leitfähige Stoff Kohlefaser oder Ruß ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindung des Biomoleküls an den Kunststoff eine kovalente Bindung ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Lösung eine wäßrige NaOH- oder KOH-Lösung ist.
7. Verfahren Anspruch 6, wobei die erste Lösung auf eine Temperatur von bis zu 90°C erwärmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Komposit bis zu vier Stunden mit der ersten Lösung behandelt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der zweiten Lösung als Biomolekül ein Oligonukleotid zugege­ ben wird, dessen 5-Ende eine NH2-Gruppe aufweist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der zweiten Lösung mindestens einer der folgenden Stoffe zu­ gesetzt ist: 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid­ hydrochlorid, Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz, (2-[N- Morpholino]ethan-sulfonsäure Monohydrat, Magnesiumchlorid, EDTA.
11. Elektrode hergestellt aus einem mit Kunststoff gebunde­ nen elektrisch leitfähigen Stoff gebildeten Komposit, dessen Oberfläche eine durch Behandlung mit einer sauren oder einer basischen ersten Lösung erzeugte Mikorauhigkeit aufweist und wobei an die Oberfläche Biomoleküle gebunden sind.
12. Elektrode nach Anspruch 11, wobei der Kunststoff ein Polyester ist.
13. Elektrode nach Anspruch 12, wobei der Polyester ein Po­ lykarbonat ist.
14. Elektrode nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei der leitfähige Zusatz Kohlefaser oder Ruß ist.
15. Elektrode nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Biomolekül kovalent an die Oberfläche gebunden ist.
16. Elektrode nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die erste Lösung eine wäßrige NaOH- oder KOH-Lösung ist.
17. Elektrode nach Anspruch 16, wobei die erste Lösung auf eine Temperatur von bis zu 90°C erwärmt ist.
18. Elektrode nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Komposit bis zu vier Stunden mit der ersten Lösung behandelt ist.
19. Elektrode nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Biomolekül ein Oligonukleotid ist, das über eine am 5'-Ende befindliche NH2-Gruppe an den Kunststoff gebunden ist.
20. Elektrode nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei das Oligonukleotid mittels einer zweiten Lösung an die Oberfläche bindbar ist, der mindestens einer der folgenden Stoffe zuge­ setzt ist: 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid­ hydrochlorid, Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz, (2-[N- Morpholino]ethan-sulfonsäure Monohydrat, Magnesiumchlorid, EDTA.
21. Verwendung der Elektrode nach einem der Ansprüche 11 bis 21 zum Anreichern von weiteren Biomolekülen aus einer Proben­ lösung, wobei die weiteren Biomoleküle eine Affinität zu den gebundenen Biomolekülen aufweisen.
22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei die weiteren Biomole­ küle durch zyklische Umpolung auf der Oberfläche angereichert werden.
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