DE102006020131A1

DE102006020131A1 - Nano- und mikrostrukturierter Biosensor und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE102006020131A1
Application number: DE200610020131
Authority: DE
Inventors: Jinping Liu
Original assignee: Liu Jinping Dr-Ing
Current assignee: Liu Jinping Dr-Ing
Priority date: 2006-05-02
Filing date: 2006-05-02
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2026-05-03
Also published as: DE102006020131B4

Abstract

Ein nano- und mikrostrukturierter Biosensor setzt sich aus einem Substrat mit einer Bürstenoberfläche, wobei die Bürstenstäbchen mindestens eine Stäbchenquerschnittsfläche im Bereich von 100 nm<SUP>2</SUP> bis 1000 µm<SUP>2</SUP>, eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 µm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 µm aufweisen, mindestens einer Metallelektrode mit einer Schichtdicke im Bereich von 30 bis 300 nm, einer durchlässigen Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm und zumindest einer Enzymmembran mit einem hydrophilen Metallnanopartikel und einem hydrophoben Siliziumnanopartikel zusammen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen nano- und mikrostrukturierten Biosensor, der insbesondere zum Integrieren in Mikrodetektionsvorrichtungen bzw. Lab-On-Chips geeignet ist, zur Bestimmung eines weiten Bereichs an chemikalien und biologischen Substanzen, die in Blut, Wasser oder anderen physiologischen Fluiden zu finden sind, und seine Herstellung.
Stand der Technik
Molekulare Biologie enthält eine große Anzahl von Techniken für die Analyse der Nukleinsäuren bzw. der Proteine und den Grundlagen der klinischen Diagnostik. Diese Techniken umfassen Nukleinsäurehybridationanalyse, Beschränkungsenzymtest, genetische Reihenfolgenanalyse, Trennung und Reinigung der Nukleinsäuren und der Proteine. Viele molekulare Biologietechniken brauchen eine zahlreiche Betriebe und viele Proben. Sie sind häufig kompliziert und zeitraubend, und erfordern im Allgemeinen eine hohe Genauigkeit. Vielmals wird eine solche Technik wegen einem Mangel an Empfindlichkeit, Besonderheit oder Reproduzierbarkeit in seiner Anwendung begrenzt. Beispielsweise haben Probleme mit Empfindlichkeit und Besonderheit die praktischen Anwendungen der Nukleinsäurehybridation begrenzt.
Nukleinsäurehybridationanalyse bezieht im Allgemeinen auf den Nachweis der Nukleinsäuren mit einer geringen Anzahl von spezifischen Komponenten in einer Probe (DNA oder RNS). Um hohe Besonderheit zu halten, wird Hybridation normalerweise unter den zwingendsten Bedingungen durchgeführt und durch verschiedene Kombinationen der Temperaturen, Salzen, Reinigungsmitteln, Lösungsmitteln, Dispergens und Denaturierungsmitteln erzielt.
In der modernen biologischen Analysentechnik, aber auch in der medizinischen Diagnostik, werden in zunehmendem Maße Biosensoren eingesetzt, bei denen ein biologisches Detektionssystem mit einem physikalischen Transducer verknüpft ist. Unter Detektionssystem versteht man biologische Detektionsmoleküle, wie Antikörper, Enzyme, und dergleichen, welche über eine sogenannte Immobilisierungsschicht an einem Träger gebunden sind. Als Transducer werden hauptsächlich kalcrimetrische, piezoelectrische, optische, und electrochemische Prinzipien verwendet.
Biosensoren werden zur Detektion der Anwesenheit und/oder der Menge einer ausgewählen Komponenten in einer Probe, beispielsweise Blut, eingesetzt. Bekanntlich umfassen Biosensoren ein kombiniertes Detektionssystem aus einer Bioschicht, beispielsweise aus Enzym, einem Transducer. Bestimmte Arten von Biosensoren verfügen über eine Membranstruktur, die eine oder mehrere Membranen aufweist und die das Detektionssystem von der analyseierten Probe trennt. Die Membranstruktur kann eine biologische Komponente enthalten, trennt jedoch gewöhnlich die biogische Komponente von der Probe. Im Falle eines Enzyms findet eine Reaction mit den interessierenden Spezies zur Herstellung eines Produktes statt, das dann mittels des Tranducers detektiert wird; dies stellt eine art von Einheit für die indirekte Bestimmung der interessierenden Spezies dar.
Gewöhnlich wird die Detektion von Biomolekülen mittels einer sogenannten Affinitätsreaktion durchgeführt, bei der komplementäre Analyten sich gegenseitig zusammen spezifisch binden. Affinitätssensoren sind spezielle Biosensoren, die irgendeine Art biomolekularer Erkennung von hohem Grade der spezifischen Affinitätspartnern verwenden, beispielsweise Antikörper, Antigen oder Nukleinsäure-komplementäre Nukleinnukleinsäure. In allgemeinem bestehen Bio- und Affinitätssensoren aus zwei Bestandteilen: der biologische Bestandteil für die spezifische Erkennung eines Analytes und der Detektorbestandteil, dem sogenannte Signalumformer/transducer, der diese biomolekulare Reaktion gefangennehmen und sie in ein analytisches Signal umwandeln sollte. Die vorgewählten biologischen Bestandteile/Komponenten wie z. B. Nukleinsäuren, Enzyme, Antikörper oder Mikroorganismen, werden in der Nähe zum Signalumformer/transducer immobilisiert und können mit einem optischen oder electronischen Detektionssystem detektiert werden. Die Signalumformer/transducer sind auf unterschiedlichen Grundregeln zu arbeiten. Allgemeine Signalumformer/transducer arbeiten auf den elektrochemischen, elektrischen oder optischen Grundregeln.
Grundlegend gibt es jedoch das Problem des Ermittelns der Analyten in kleinsten Konzentrationen, die in einem Testsatz vorhanden sind. Meistens sind heutige Maßsystemempfindlichkeit zu gering, diese Analyten in niedrigen Konzentrationen direkt zu detektieren. Hoche Empfindlichkeit und Besonderheit der biomolekularen Erkennung sind daher neben anderen Parametern: Reproduzierbarkeit, Herstellenkosten, Brauchbarkeit und Qualität des Sensors von großer Bedeutung.
Aus dem Dokument WO 94/02584 ist ein Biosensor zum Detektieren von biologischen Bestandteile/Komponenten in fluiden Proben bekannt. Dieser Biosensor umfaßt ein Elektrodensystem, eine selectivdurchlässige Membran, aufgebaut aus einer Mischung von Polyvinychlorid und Polyarylsulfonpolymeren und einer Enzymschicht zwischen der Membran und dem Electrodensystem. Die Polymerzusammensetzung für die Membranbarriere kann auch einen Weichmacher enthalten.
US 6485986 beschreibt ein Verfahren zum elektrochemischen Aufbringen organisccher Schichten auf einem Siliziumsubstrat, wodurch eine in der Biosensorik einsetzbare Schichtanordnung hergestellt wird.
Aus der JP 02089850 ist eine Immobilisierungsmethode eines Mediators in einem auf einem Elektrodenträger gebildenden Polymerschicht zusammen mit einem Enzym bekannt.
DE19835869 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Biosensoren mit stabilen Enzymschichten auf einem Trägermaterial, wobei das Enzym auf einem Trägermaterial immobilisiert wird derart, dass sie in elektronischem Kontakt mit einem Signaltransducer steht, und wobei während oder nach der Beschichtung des Trägermaterials mit dem Enzym auf dem Trägermaterial eine Polymerschicht abgeschieden wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschicht durch ein Gasphasen-Abscheideverfahren abgeschieden wird, wobei während der Gasphasenabscheidung der Polymerschicht, die während oder nach der Beschichtung des Trägermaterials mit dem Enzym erfolgt, Metallnanopartikel in die entstehende Polymerschicht eingelagert werden.
In der EP 0562389 B1 wird ein radikalisch vernetzbares Polyorganosiloxan, das zusätzlich Linkergruppen zur Ankopplung biologischer oder chemischer Funktionsträger enthält, beschrieben. Aus dem Dokument EP 0562372 B1 ist eine Herstellung enzymhaltiger Erkenningsschichten für Biosensoren auf Basis der vorgenannten funktionellen Polyorganosiloxan bekannt. Die Hydrophilie der damit erzeugten Immobilisierungsschichten wird in einem zusätzlich Prozessschritt durch Umsetzung eines Teils der in der Matrix vorhandenen Linkergruppen mit z. B. Einer Aminosäure nachträglich so weit erhöht, daß zum Beispiel Enzyme, wie Glucoseoxydase, unter Erhalt ihrer Funktionsfähigkeit in der Schicht immobilisiert werden können. Diese nachträgliche Verbesserung der Hydrophilie der Immobilisierungsschicht wegen längerer Reaktionszeit ist aufwendig und kommt somit insbesonders für die Massenherstellung von analytischen Biochips nicht in Frage.
Ein Biosensor und Verfahren zu seiner Herstellung sind in der DE 10064146 A1 beschrieben, worin der Biosensor aus einem Träger (Glasprisma), einer plasmonentragenden Schicht, bestehend aus einer Metallschicht mit freien Electronen, insbesondere Gold oder Silber oder einer Halbleiterschicht und einer Hydrogelschicht, bestehend aus einem Polymer, insbesondere Dextran mit der Möglichkeit zum Anbinden von Rezeptoren besteht und wist eine Schutzschicht, bestehend aus Siliziumoxid oder einem Metalloxid oder einer Schutzschicht, bestehend aus einem Polymer auf, die auf die Plasmonentragende Schicht physisorbiert ist.
DE 10334097 A1 beschreibt einen Biosensor mit einer Anordnung von mehreren Schichten. Die Anordnung umfaßt eine Halbleitersubstratschicht und eine benachbart zu der Halbleitersubstratschicht angeordnete Schicht mit einer biologisch aktiven Komponente. Es ist ein mit der Schicht mit der biologisch aktiven Komponente in Wirkverbindung stehender Wechselwirklungsabschnitt, in welchem eine Testsubstanz einer Testkomponente zum Wechselwirken mit der biologisch aktiven Komponente eingebracht werden kann. Darüber hinraus sind mindestens eine Anschlußeletrode, die mit dem Wechselwirklungsabschnitt elektrisch leitend verbunden ist, sowie eine weitere Anschlußeletrode, die mit der Halbleitersubstratschicht elektrisch leitend verbunden ist, vorgesehen, wobei mit Hilfe der mindestens einen Anschlußeletrode und der weiteren Anschlußeletrode Anschlußmittel zum Ankoppel an einen elektrischen Stromkreis gebildet sind, so daß zwischen der mindestens einen Anschlußeletrode und der weiteren Anschlußeletrode über die Anordnung der mehreren Schichten und den Wechselwirklungsabschnitt eine Leitfähigkeit, die sich infolge des Wechselwirkens der Testkomponente mit der biologisch aktiven Komponente gegebenenfalls ändert, abgegriffen werden kann.
In der US 6824866 sind einige Methoden zur Herstellung und Anwendung einiger Dünnfilme der porösen Silikonsubstrate zum Synthetisieren einer Polymer-Sensorenanordnung beschrieben. Die Methoden werden auch für das Prüfen solcher Polymer auf porösen Silikonsubstraten zur Verfügung gestellt. Die porösen Silikonsubstrate bieten eine Zunahme der Sensorenanordnungsdichte und eine Signalverbesserung an. Die Sensorenanordnung kann für eine Vielzahl der Hybridationversuchen angewendet werden.
Aus der DE 10025174 A1 ist ein Verfahren zum Herstellen einer mit Biomolekülern beschichteten Elektrode bekannt. Die Elektrode ist aus einem Komposit, dessen Oberfläche eine mit Lösungen hergestellte Mikrorauhigkeit aufweist, wobei an der Oberfläche Biomoleküle gebunden sind.
In der US 2003162214 wird eine selbstadressiertene, selbstzusammenbauende mikroelektronische Vorrichtung entworfen und fabriziert, um die Mehrstufen- und molekularen biologischen Multiplexreaktionen in den mikroskopischen Formaten aktiv durchzuführen und zu steuern. Diese Reaktionen umfassen Nukleinsäurehybridationen, Antikörper-/Antigenenreaktionen, Diagnose und Biopolymersynthese. Die Vorrichtung kann mit den mikrolithographischen Ätzen und Mikrobearbeitentechniken fabriziert werden. Sie kann den Transport und die spezifischen biologischen Bestandteile zu den spezifischen Mikro-Positionen elektronisch steuern. Die spezifischen Bestandteile schließen biologische Moleküle wie Nukleinsäuren und Polypeptide ein. Diese Vorrichtung umfaßt mehrere Schichten und ist in der Lage, Reaktionsmittel und nonspecifically gesprungene Moleküle zu entfernen.
Ein Nanosensor ist durch die selben Anmeldern in der WO 0248701 und US 2006054936 beschrieben. Die Erfindungsbeschreibungen beziehen im Allgemeinen auf Nanowires und Nanoscalevorrichtungen und besonders auf einer Nanoscalevorrichtung, die ein Nanowire oder functionalized Nanowires für das Ermitteln der Analyten in einer Probe hat, und Methode für das Verwenden. Diese Beschreibungen tieferen eine Reihe von Techniken und Vorrichtungen über einem Sensor, der ein Nanowire oder ein functionalized Nanowire enthält.
Entscheidende Fortschritte brachten in den letzten Jahren die Entwicklung von Biosensoren und deren Einsatz in der Mediezin, der Lebensmittel-Biotechnologie und der Abwasseranalytik. Die Entwicklung von empfindlichen und einfachen Detektionsmethoden und Vorrichtungen ist ein fortwährendes Ziel. Die obengennanten. Dokumenten weisen jedoch entweder ein Massenherstellungsproblem oder Ungenauigkeit der Messungen durch das Annehmen des Maßsignals bei Anwendung dieser angegebenen Techniken bzw. Biosensoren auf.
Es wäre also wünschenswert, einen elektrochemischen Biosensor auf der Basis gegenwärtiger und zukünftiger Entwicklungen bereitzustellen, dass eine hohe Empfindlichkeit und Besonderheit der biomolekularen Erkennung besitzt und mit niedrigen Herstellungskosten produziert werden kann.
Aufgabenstellung
Die vorliegende Erfindung erreicht die obengenannten und weitere bedeutende Ziele und stellt einen verbesserten Biosensor bereit, der die biologischer Detektion und Analyse schnell und genau durchführen und insbesonders einfach und massenhaft hergestellt werden soll. Dies wird erreicht durch einen nano- und mikrostrukturierter Biosensor und ein Verfahren zu seiner Herstellung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen.
Insbesondere wird ein nano- und mikrostrukturierter Biosensor bereitgestellt, umfassend: Ein Substrat mit einer Bürstenoberfläche, wobei die Bürstenstäbchen mindestens eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 100 nm² bis 1000 µm², eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 µm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 µm aufweisen, zumindest eine Metalletektrode mit einer Schichtdicke im Bereich von 30 bis 300 nm, eine durchlässige Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm und zumindest eine Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel.
Der erfindungsgemäße nano- und mikrostrukturierte Biosensor ist insbesondere zum Integrieren in Mikrodetektionsvorrichtungen bzw. Lab-On-Chips geeignet.
Die hohe Empfindlichkeit der biomolekularen Erkennung des Biosensors und Haltbarkeit des Biosensors werden hauptsächlich durch eine Mitwirkung der Bürstenoberfläche des Sensorensubstrats, wodurch die Elektrodenoberfläche vergrößert wird, und die Enzymmembranen mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel, wodurch die elektronische Dicht bzw. die Stromantwortenempfindlichkeit der Elektrode erhöht wird, realisiert.
Die Produzierbarkeit, Massenherstellung und niedrigeren Herstellungskosten des Biosensors werden durch eine Formungstechnologie des Biosensorsubstrats mittels eines Werkzeugs, vorzugsweise Spritzgießen, realisiert.
Das Material des Substrats kann aus einer Keramik, einem Polymer und/oder einer an- und organischen Materialienmischung ausgewählt sein. Vorzugsweise ist das Substrat aus einem Polymer, das einen MFI größer als 1 aufweist, vorzugsweise aus Polystyrol, Polycarbonat, Polyester, Polyimid oder PMMA, geformt.
Das Material der Metallelektrode, welche auf der Bürstenoberfläche des Substrats aufgebracht wird, unterliegt keiner spezifischen Beschränkung, solange es elektrisch leitende ist, wie beispielsweise Platin, Palladium, Gold, Silber oder Kupfer. Die Metalllelektrode weist eine Schichtdicke weniger als 300 nm auf.
Anschaulich kann ein Aspekt der Erfindung darin gesehen werden, daß eine durchlässige Membran auf der Elektrode ausgebildet wird, welche zumindest die Elektrode bedeckt. Die Membran ist aus einem biokompatiblen Material wie zum Beispiel Polyurethan, Polyacrylamid oder Celluloseacelat gebildet, das eine Permeabilität hat, die den Zugang von Makromolekülen zu der darunterliegenden Schicht einschränkt. Die Membran, die eine ausreichende Porösität und auch vorgewählte Diffusionseigenschaften aufweist, ist eine hydrophobe, sauerstoffdurchlässige Schicht, die einen Elektrodenbewuchs infolge der hydrophilen elektroaktiven Moleküle in biologischen Fluiden verhindert. Ein weiterer Vorteil ist auch, daß mit einer solchen biokompatiblen Membran keine Schädigungen von Zellmaterial oder Biomolekülen auftreten können. Die durchlässige Membran weist eine Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm auf.
Die auf der durchlässigen Membran ausgebildeten Schicht ist eine Enzymmembran, die zumindest ein Enzym aus der Gruppe der Oxydasen oder Peroxydasen, insbesondere Traubenzuckeroxydase, Glutamatoxydase, L-Aminosäureoxydase, Meerettichperoxydase, Tyrosinase, Alkoholoxydase, Pyridoxol-4-oxydase, L-Sorboseoxydase, Lactatoxydase, Galactoseoxydase, Glycolatoxydase oder Sulfitooxydase, ein Metallnanopartikel mit Partikelgrößen weniger als 50 nm, aus Platin, Palladium, Gold oder Silber, und ein Siliziumnanopartikel mit Partikelgrößen weniger als 100 nm, vorzugsweise SiO₂, umfaßt.
Die Metallnanopartikeln sind hydrophile und die Siliziumnanopartikeln hydrophobe. Durch diese Enzym-Metallnanopartikel-Siliziumnanopartikel-Verbunde kann eine sehr gute Immobilisierung des Enzyms auf der durchlässigen Membran auf der Biosensorenelektrode erzielt werden.
Eine hoche Detektionsempfindlichkeit, Langzeitstabilität und Reproduzierbarkeit des Biosensors werden weiterhin durch derartige Enzymmembran erzeugt. Dadurch wird auch das Einsatzgebiet derartiger enzymbasierter Biosensoren und Bioreaktoren ausgedehnt.
Die Enzym-Metallnanopartikel -Siliziumnanopartikel-Verbunde, die durch eine hohe mechanische Stabilität gekennzeichnet, erleichtert den Elektronenübergang zwischen dem amperometrischen oder einem anderen elektrochemischen Signaltransducer und dem immobilisierten Enzym, erhöht die Leitfähigkeit des Trägermaterials und verbessert so die elektrischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Biosensors.
Die vorliegenden Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines nano- und mikrostrukturierten Biosensors, umfassend die Schritte:

(I) Formen eines Substrats mit einer Bürstenoberfläche, wobei die Bürstenstäbchen mindestens eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 100 nm bis 1000 μm², eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 μm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 μm aufweisen, mittels eines Werkzeugs,
(II) Aufbringen einer Metallelektrodenschicht mit einer Dicke im Bereich von 30 bis 300 nm auf dem Substrat, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens,
(III) Aufbringen einer durchlässigen Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm auf der Metallelektrodenschicht, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens, und
(IV) Aufbringen von zumindest einer Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens.

Das Substrat mit einer Bürstenoberfläche wird durch ein Formungsverfahren mittels eines Werkzeugs, vorzugsweise Spritzgießen, hergestellt, wobei das Erzeugen der Bürstenoberfläche in dem Substrat, bei dem die Bürstenstäbchen mindestens eine Querschnittfläche im Bereich von 100 nm² bis 1000 µm², eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 µm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 µm aufweisen, durch ein Muster an einer Höhlenwand des Werkzeugs, das durch Laser-Furchen, Fotolithographisches Ätzen, Nano-/Mikrofräsen, und/oder mechanisches Mikroprägen hergestellt wird, erfolgt.
Die Gestaltung der Bürstenstäbchen umfaßt verschiedene einfachen geometrischen Gestaltungen, wie z. B. Konus, Zylinder Rechteck, Geviert, Orthogon oder Karo.
Das Formungsverfahren eigenet sich insbesondere für massenhafte Herstellung größerer Substrate zum Tragen mehrerer Mikroelektroden, deren Anzahl eine Million überschreiten kann. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Formungsverfahrens ist darin, eine gleichmäßige Wanddickenverteilung des Substrats und eine regelmäßige Bürstenoberfläche erzielen zu können. Dadurch ist auch die Reproduzierbarkeit des Biosensors erhöht.
Das Material des Substrats kann aus einer Keramik, einem Polymer und/oder einer an- und organischen Materialienmischung ausgewählt sein. Vorzugsweise ist das Substrat aus einem Polymer, das einen MFI größer als 1 aufweist, vorzugsweise aus Polystyrol, Polycarbonat, Polyester, Polyimid oder PMMA, geformt.
Erfindungsgemäß wird eine Metallelektrodenschicht mit einer Dicke im Bereich von 30 bis 300 nm auf dem Substrat durch ein Gasphasenabscheideverfahren, insbesondere ein Vakuumbeschichtungsverfahren, wie beispielsweise chemische Gasphasenabscheidung (CVD) oder physikalische Gasphasenabscheidung (PVD), PECVD, MOCVD, Metallverdampfung oder Metallsputtern abgeschieden. Das Material der Metallelektrode unterliegt keiner spezifischen Beschränkung, solange es elektrisch leitende ist, wie beispielsweise Platin, Palladium, Gold, Silber oder Kupfer, vorzugsweise Platin.
Eine durchlässigen Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500nm auf der Metallelektrodenschicht, wird erfindungsgemäß durch ein Gasphasenabscheideverfahren, insbesondere ein Vakuumbeschichtungsverfahren, wie beispielsweise CVD, PVD oder PECVD abgeschieden.
Erfindungsgemäß kann das Aufbringen von zumindest einer Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran, folgende Schritte umfaßt:

(a) Erzeugen einer Mischung, die mindestens eine hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung, eine hydrophoben Siliziumnanopartikel-Sol-Lös-ung und einer Hydrolösung der Oxydasen oder Peroxydasen, enthält,
(b) Addieren der Mischung in eine Polymer-Hydrogel-Lösung aus Polyglykol, Polyurethan, Harnstoff-Polymer, Vinyl-Alkohol-Copolymer, Äthansäurenzellulose-Polymer, Polyvinylalkohol oder Polyvinylazetal, Homogenmischen der Lösungen, und
(c) Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homogenischen Gemisches mit einem Vernetzungsmittel, vorzugsweise einem mit Aldehyd-Funktionsgruppe und anschließend Vakuumabscheiden.

Das Erzeugen einer hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung kann mittels herkömmlicher Techniken, wie zum Beispiel Sol-Gel-Methode erfolgen. Die Metallnanopartikel-Sol-Lösung besteht aus einer Chlorsäure vorzugsweise einer Platinchlorsäure, einem Redoxmittel und einer Schutzsmittelslösung.
Die hydrophoben Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung wird aus einer Lösung mit einem nichtpolaren organischen Auflösungsmittel mit einem Oberflächenaktivsmittel, einem Ammoniakwasser und einem Silicon, vorzugsweise Si(OC₂H₅)₄ mittels herkömmlichr Techniken, vorzugsweise Antimizell-Methode erzeugt.
Die Polymer-Hydrogel-Lösung wird durch Auflösen der Polymer in einem organischen Auflösungsmittel oder dem Wasser erzeugt.
Die vorliegenden Erfindung betrifft weiterhin ein anderes Verfahren zum Herstellen und Aufbringen der Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran, das folgendes umfaßt:

(a) Erzeugen einer Mischung, die mindestens eine hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung, eine hydrophoben Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung und einer Hydrolösung der Oxydasen oder Peroxydasen, enthält,
(b) Addieren der Mischung in eine Polymer-Hydrogel-Lösung aus Polyglykol, Polyurethan, Harnstoff-Polymer, Vinyl-Alkohol-Copolymer, Äthansäurenzellulose-Polymer, Polyvinylalkohol oder Polyvinylazetal, Homogenmischen der Lösungen,
(c) Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homogenischen Gemisches mit einem Photoinitiator, anschließend Vakuumabscheiden, und
(e) Vernetzen der Enzymmembran auf der durchlässigen Membran durch Aussetzung einer UV-Lichtbestrahlung unter Sauemstofffreier Atmosphäre.

Ein weiter Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren besteht darin, daß sämtliche Beschichtungen in derselben Vakuumkammer bei jeweils geeigneten Vakuumdruckbereichen vorgenommen werden können.
Ausführungsbeispiel
Im Folgenden wird ein Beispiel für den erfindungsgemäße Biosensor und das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben werden.
Es zeigen:
1 eine schmatische Ansicht eines Substrats mit einer Bürstenoberfläche eines beispielhaften Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 eine schmatische Querschnittsansicht des Schichtaufbaus eines erfindungsgemäßen Biosensors.
Bezugnahmend auf die Zeichnungen werden Ausführungsbeispiele der Erfindung näher erläutert, in welchen gleiche oder änliche Komponenten in unterschiedlichen Zeichnungen mit gleichen oder ähnlichen Bezugsziffern versehen sind.
1 zeigt eine schmatische Ansicht eines Substrats mit einer Bürstenoberfläche eines beispielhaften Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung, in welcher ein Substrat (1) mehrere Bürstenstäbchen (2) in der Bürstenoberfläche aufweist. Das Substrat (1) und die Bürstenstäbchen (2) in dem beispielhaften Biosensors (6) werden als ein Teil durch ein Formungsverfahren mittels eines Werkzeugs zusammen hergestellt. Die Bürstenoberfläche in dem Substrat (1) wird durch ein Muster an einer Höhlenwand des Wertzeugs, das durch Laser-Furchen, Fotolithographisches Ätzen, Nano-/Mikrofräsen, und/oder mechanisches Mikroprägen hergestellt wird, erfolgt. Die Gestaltung der Bürstenstäbchen (2) umfaßt verschiedene einfachen geometrischen Gestaltungen, wie z. B. Konus, Zylinder, Rechteck, Geviert, Orthogon oder Karo.
2 zeigt eine schmatische Querschnittsansicht des Schichtaufbaus eines erfindungsgemäßen Biosensors. Der erfindungsgemäßen Biosensor (6) umfaßt ein Substrat (1) mit einer Bürstenoberfläche, auf der eine Metallelektrodenschicht (3), eine durchlässige Membran (4) und zumindest eine Enzymmembran (5) mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel aufeinander im Vakuum aufgebracht werden.
Beispiel
Bei einem ersten Prozess zum Herstellen des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung wurd ein Substrat mit einer Größe von 15 mm × 10 mm × 2 mm geformt, wobei eine Mikrospritzgießenmaschine mit einer Schließenkraft von 50 Tonnen angewendet wurd. An einer Höhlenwand des Werkzeugs zum Formen des Substrats wurd ein Muster zum Erzeugen einer Bürstenoberfläche des Substrats durch Mikrofräsen hergestellt, die eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 1000 nm² bis 100 µm², eine Höhe von 100 µm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 500 nm bis 10 µm aufweist. Das genischen Gemisches mit einem Vernetzungs Substrat wurd aus Polystyrol mittels herkömmlicher Spritzgißentechnologie geformt.
Bei einem zweiten Prozess zum Erzeugen des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung wurd eine 150 nm dicke Platinschicht mit einer Größe weniger als 2 mm² auf der Bürstenoberfläche des Substrats im Vakuum durch thermische Verdampfung aufgebracht.
Anschließend wurd eine durchlässige Membran mit einer Dicke von 100 nm aus Polyurethan-Monomer auf der Oberfläche der Metallelektrodenschicht im Vakuum aufgedampft.
Dann erfolgt das Auftragen einer Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf die durchlässigen Membran, mit folgendem Prozess:

(1) Erzeugen einer hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung (Lösung 1) mittels der Sol-Gel-Methode: Mischen einer Platinchlorsäure-Wasserlösung (1 Vol.-Teil) mit einer Oxyzellulose-Wasserlösung (0.1 Vol.-Teil) bei einer Temperatur 70 °C, Mischen des Gemisches (1 Vol.-Teil) mit einer Hydrazin-Wasserlösung (15 Vol.-Teil) in einem Reaktor, für 0.4 Stunde unter Abrühen, und Erzielen einer hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung (Lösung 1) mit Partikelgröße von 10 nm.
(2) Erzeugen einer hydrophoben Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung (Lösung 2) mittels der Antimizell-Methode: Mischen eines Oberflächenaktivsmittels (TritonX-45), (1 Vol.-Teil) mit einem Ammoniakwasser (12 Vol.-Teil), Mischen des Gemisches (10 Vol.-Teil) mit Si(OC₂H₅)₄ (1 Vol.-Teil) in einem Reaktor, für 16 Stunde unter Abrühen bei einer Temperatur 40 °C, und Erzielen einer hydrophoben Siliziumnanopartikel (SiO₂)-Sol-Lösung (Lösung 2) mit Partikelgröße von 20 nm.
(3) Erzeugen einer Polymer-Hydrogel-Lösung (Lösung 3): Auflösen von Äthansäurenzellulose-Polymer in einem Azeton, Ziel der sämtlichen Lösungskonzentration 1 Gew.-%.
(4) Erzeugen einer Enzymmembran-Lösung mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel: Mischen von Lösung 1 (1 Vol.-Teil), Lösung 2 (1 Vol.-Teil) und einer Hydrolösung der Glutamatoxydase (0.1 Vol.-Teil), Mischen des Gemisches mit Lösung 3 (Lösungskonzentration 1 Gew.-%) (10 Vol.-Teil), Homogenabrühen, und Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homo mittel mit Aldehyd-Gruppe (Lösungskonzentration 1 Gew.-%).
(5) Aufbringen der Enzymmembran-Lösung mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran im Vakuum durch thermische Verdampfung bei einer Temperatur zwischen –195 °C und 85 °C, und Erzeugen einer Enzymmembran anschließend darauf.

1: Substrat
2: Bürstenstäbchen
3: Metallelektrodenschicht
4: durchlässige Membran
5: Enzymmembran
6: Biosensor

Claims

Nano- und mikrostrukturierter Biosensor, wobei der Biosensor folgendes umfaßt: Ein Substrat mit einer Bürstenoberfläche, wobei die Bürstenstäbchen mindestens eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 100 nm² bis 1000 µm², eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 µm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 µm aufweisen, zumindest eine Metallelektrode mit einer Schichtdicke im Bereich von 30 bis 300 nm, eine durchlässige Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm und zumindest eine Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel.
Nano- und mikrostrukturierter Biosensor nach Anspruch 1, bei dem das Substrat aus einer Keramik, einem Polymer und/oder einer Mischung von an- und organischen Materialien mittels eines Werkzeugs geformt wird.
Nano- und mikrostrukturierter Biosensor nach Anspruch 1, bei dem die Metallelektrode eine Platinelektrode, Palladiumelektrode, Goldelektrode, Silberelektrode oder Kupferelektrode ist.
Nano- und mikrostrukturierter Biosensor nach Anspruch 1, bei dem die durchlässige Membran aus einem hydrophoben Polymer einschließlich Polyurethan oder seinem organischen Monomer ist.
Nano- und mikrostrukturierter Biosensor nach Anspruch 1, bei dem die Enzymmembran zumindest ein Enzym aus der Gruppe der Oxidasen oder Peroxidasen, insbesondere Traubenzucker, Glutamatoxidase, L-Aminosäureoxidase, Meerettichperoxidase, Tyrosinase, Alkoholoxidase, Pyridoxol-4-oxydase, L-Sorboseoxydase, Lactatoxydase, Galactoseoxydase, Glycolatoxydase oder Sulfitooxidase, ein Metallnanopartikel mit Partikelgrößen weniger als 50 nm, aus Platin, Palladium, Gold oder Silber, und ein Siliziumnanopartikel mit Partikelgrößen weniger als 100 nm, vorzugsweise SiO₂, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines nano- und mikrostrukturierten Biosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die Schritte: (I) Formen eines Substrats mit einer Bürstenoberfläche, wobei die Bürstenstäbchen mindestens eine Stäbchenquerschnittfläche im Bereich von 100 nm² bis 1000 µm², eine Höhe im Bereich von 100 nm bis 1000 µm und eine Stäbchenlücke im Bereich von 10 nm bis 500 µm aufweisen, mittels eines Werkzeugs, (II) Aufbringen einer Metallelektrodenschicht mit einer Dicke im Bereich von 30 bis 300 nm auf dem Substrat, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens, (III) Aufbringen einer durchlässigen Membran mit einer Dicke im Bereich von 5 bis 500 nm auf der Metallelektrodenschicht, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens, (IV) Aufbringen von zumindest einer Enzymmembran mit einer hydrophilen Metallnanopartikel und einer hydrophoben Siliziumnanopartikel auf der durchlässigen Membran, mittels eines Vakuumabscheidungsverfahrens.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Erzeugen der Bürstenoberfläche in dem Substrat durch ein Muster an einer Höhlenwand des Werkzeugs, das durch Laser-Furchen, Fotolithographisches Ätzen, Nano-/Mikrofräsen, und/oder mechanisches Mikroprägen hergestellt wird, erfolgt.
Verfahren zur Herstellung eines nano- und mikrostrukturierten Biosensors nach Anspruch 6, bei dem in Schritt (IV) folgendes umfaßt: (a) Erzeugen einer Mischung, die mindestens eine hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung, eine hydrophoben Siliziumnanopartikel-Sol-Lös-ung und einer Hydrolösung der Oxydasen oder Peroxydasen, enthält, (b) Addieren der Mischung in eine Polymer-Hydrogel-Lösung aus Polyglykol, Polyurethan, Harnstoff-Polymer, Vinyl-Alkohol-Copolymer, Äthansäurenzellulose-Polymer, Polyvinylalkohol oder Polyvinylazetal, Homogenmischen der Lösungen, und (c) Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homogenischen Gemisches mit einem Vernetzungsmittel, vorzugsweise einem mit Aldehyd-Funktionsgruppe und anschließend Vakuumabscheiden.
Verfahren zur Herstellung eines nano- und mikrostrukturierten Biosensors nach Anspruch 6, bei dem in Schritt (IV) folgendes umfaßt: (a) Erzeugen einer Mischung, die mindestens eine hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung, eine hydrophoben Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung und einer Hydrolösung der Oxydasen oder Peroxydasen, enthält, (b) Addieren der Mischung in eine Polymer-Hydrogel-Lösung aus Polyglykol, Polyurethan, Harnstoff Polymer, Vinyl-Alkohol-Copolymer, Äthansäurenzellulose-Polymer, Polyvinylalkohol oder Polyvinylazetal, Homogenmischen der Lösungen, (c) Vernetzungsvorbehandeln des sämtlichen homogenischen Gemisches mit einem Photoinitiator, anschließend Vakuumabscheiden, und (e) Vernetzen der Enzymmembran auf der durchlässigen Membran durch Aussetzung einer UV-Lichtbestrahlung unter Sauemstofffreier Atmosphäre.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die hydrophilen Metallnanopartikel-Sol-Lösung aus einer Chlorsäure vorzugsweise einer Platinchlorsäure, einem Redoxmittel und einer Schutzsmittelslösung erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die hydrophoben Siliziumnanopartikel-Sol-Lösung aus einer Lösung mit einem nichtpolaren organischen Auflösungsmittel mit einem Oberflächenaktivsmittel, einem Ammoniakwasser und einem Silicon, vorzugsweise Si(OC₂H₅)₄ erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die Polymer-Hydrogel-Lösung durch Auflösen der Polymer in einem organischen Auflösungsmittel oder dem Wasser erzeugt wird.