CN111289592B - 同时活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器及其制备与应用。活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器，包括：基底；参比/对电极，为表面覆盖铂的微孔阵列电极；工作电极，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面分别含有TaN‑CuN‑PDA、葡萄糖氧化酶、果糖脱氢酶、木糖脱氢酶，二茂铁甲酸及全氟磺酸。本发明提供的微阵列传感器可用于同时活体检测植物尤其是扁平形状的植物叶片中的葡萄糖、果糖和木糖。基于本发明微阵列传感器，可用于植物叶片中糖分变化的活体研究。

Description

同时活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器及其制备与 应用
技术领域
本发明涉及微电极生物传感技术领域，具体涉及一种同时活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器及其制备与应用。
背景技术
糖类是植物体内的重要能源物质，包括葡萄糖、果糖、木糖等多种，当外界环境变化时，这些糖类的含量也会发生相应的变化。因此，对植物中的糖类进行定量分析是非常重要的。传统的植物可溶性糖的测定方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、质谱法等等。然而，这些方法属于离体检测方法，对植物体本身会造成较大的损伤，而且经常会造成生物信息的丢失。因此，急需建立活体的研究方法来实时检测植物中的不同糖类。
电化学传感器目前被广泛应用于活体研究中，但是电化学传感器通常需要电解质支持电化学反应，因此需要一定量的水分。叶片是植物产生糖类的主要部位，因此研究叶片中各种糖类的含量变化非常重要。而植物叶片多为扁平状，大部分叶片较小，其中的水分含量普遍较少，因此开发针对叶片的活体应用的电化学传感器就更加困难。目前国内外还没有此类传感器研发出来，更没有可以同时检测叶片中不同糖类的传感器。
发明内容
本发明实施例提供一种微阵列传感器，可用于同时活体检测植物尤其是扁平形状的植物叶片中葡萄糖、果糖、木糖的检测。基于本发明微阵列传感器，可用于植物叶片中糖分变化的活体研究。
一种活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器，包括：
基底；
参比/对电极，为表面覆盖铂的微孔阵列电极；及
以下任一种、两种或三种工作电极：
工作电极一，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面含有钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)、葡萄糖氧化酶(GOX)、二茂铁甲酸(FcCOOH)及全氟磺酸(nafion)；用于检测葡萄糖；
工作电极二，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面含有钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)、果糖脱氢酶(FDH)、二茂铁甲酸(FcCOOH)及全氟磺酸(nafion)；用于检测果糖；
工作电极三，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面含有钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)、木糖脱氢酶(XDH)、二茂铁甲酸(FcCOOH)及全氟磺酸(nafion)；用于检测木糖；
其中，所述参比/对电极、工作电极均设置于所述基底上。
在本发明一些实施例中，所述基底的材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚(4-乙烯基吡啶)(P4V)、聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)(PDMA)等。
本发明中，所述参比/对电极是指该电极既可做参比又可做对极。
在本发明一些实施例中，所述微孔阵列通过刻蚀技术在所述基底上制备而成。其中，在一些实施例中，呈4个4×4微孔阵列。
在本发明一些实施例中，每个微孔阵列之间间隔1-5毫米，例如3毫米。微孔呈半圆形。微孔面积为1-15平方毫米，例如3平方毫米。深度为0.5-1.5毫米，例如0.98毫米，每个微孔之间的间隔为1-3毫米，例如2毫米。
在本发明一些实施例中，将其中的3个4×4微孔阵列通过溅射在微孔上喷50-100nm厚度的金膜，作为工作电极，分别用于葡萄糖、果糖及木糖的检测。
在本发明一些实施例中，对于上述工作电极，所述微孔阵列电极的表面覆盖的金膜的厚度为50-100nm。可通过溅射的方式在所述微孔阵列电极的表面喷涂该金膜。其优点在于即可保持金膜的稳定性，又较为节省材料。
在本发明一些实施例中，对于上述参比/对电极，所述微孔阵列电极的表面覆盖的铂的厚度为50-100nm。可通过溅射的方式在所述微孔阵列电极的表面喷涂铂。其优点在于即可保持金膜的稳定性，又较为节省材料。
在本发明一些实施例中，每个工作电极及参比/对电极之间保留一定间隔(2-8mm，例如5mm)便于绝缘。
在本发明一些实施例中，每g所述金膜的表面上涂覆的所述钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)的量为0.6-2.4mg，例如1.0mg。
在本发明一些实施例中，每g所述金膜的表面上涂覆的所述葡萄糖氧化酶(GOX)的量为0.6-2.4mg，例如1mg。
在本发明一些实施例中，每g所述金膜的表面上涂覆的所述果糖脱氢酶(FDH)的量为3-12mg，例如5mg。
在本发明一些实施例中，每g所述金膜的表面上涂覆的所述木糖脱氢酶(XDH)的量为5.5-24mg，例如10mg。
在本发明一些实施例中，每g所述金膜的表面上涂覆的所述二茂铁甲酸(FcCOOH)的量为0.02-0.05mg，例如0.03mg。
在本发明一些实施例中，每g所述金膜的表面上涂覆的所述全氟磺酸nafion的量为0.15-0.55mg，例如0.2mg。
在本发明一些实施例中，所述工作电极的表面还覆盖有半透膜(例如一层半透膜)，目的是防止酶分子的流失。
本发明还提供活体检测植物多种糖类的装置，包括：
反应池，其内设有孔槽；
上述活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器，设置在所述孔槽中；
流路，设于所述孔槽上，用于向所述孔槽中灌注液体；
电极连线，其一端与所述微阵列传感器的电极(参比/对电极、工作电极)相连，另一端延伸至所述孔槽外。
利用上述活体检测植物多种糖类的装置可对活体植物的葡萄糖、果糖、木糖进行检测，尤其是可实现同时检测。
在本发明一些实施例中，制备所述反应池的材料为聚乳酸(PLA)，可通过3D打印技术进行制备。
在本发明一些实施例中，所述同时活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器通过密封圈卡在所述孔槽内。
在本发明一些实施例中，所述孔槽的容积为600-1500ul，例如900ul。
在本发明一些实施例中，所述孔槽的高度为0.2-0.5厘米，例如0.3厘米。
在本发明一些实施例中，所述流路为孔道或管道。
在本发明一些实施例中，所述流路设于上述孔槽的上部，目的是在孔内溶液不足时，通过外面的注射器向孔内灌注液体，使孔槽内液体保持不变。
在本发明一些实施例中，所述电极连线的另一端延伸至所述孔槽外，并与电化学工作站连接，这样可以进行检测。
在本发明一些实施例中，所述装置还包括微型注射泵，用于通过所述流路向所述孔槽内补充等渗溶液(电解质溶液)，从而实现连续检测。
本发明一些实施例所提供的活体检测植物多种糖类的装置，通过3D打印技术制备聚乳酸(PLA)的反应池，中间含有孔槽，孔内容积为0.9ml，高度为0.3厘米。将微孔阵列电极表面覆盖一层半透膜，目的是防止酶分子的流失。用密封圈将半透膜固定后，进一步卡在孔槽内。反应池的一侧设置流路，流路位于孔槽的上部，目的是在孔内溶液不足时，通过外面的注射器向孔内灌注液体，使孔槽内液体保持不变。电极连线露于孔槽外，以便与电化学工作站连接。在流路前设置微型注射泵，根据水分蒸发器测算的水分蒸发的速度，通过流路向孔槽内补充电解质，从而保持较长的连续检测时间。
本发明还提供一种活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器的制备方法，包括：
提供基底；
制备参比/对电极；具体包括：在所述基底上通过刻蚀技术制备微孔阵列；在所述微孔阵列上喷涂铂；
制备工作电极；具体包括：
a.在所述基底上通过刻蚀技术制备微孔阵列；
b.在所述微孔阵列(的微孔)上喷涂金膜；及
c1.在所述金膜表面上涂覆钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)，葡萄糖氧化酶(GOX)、二茂铁甲酸(FcCOOH)及全氟磺酸(nafion)；制成用于检测葡萄糖的工作电极；和/或，
c2.在所述金膜表面上涂覆钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)，果糖脱氢酶(FDH)、二茂铁甲酸(FcCOOH)及全氟磺酸(nafion)；制成用于检测果糖的工作电极；和/或，
c3.在所述金膜表面上涂覆钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)，木糖脱氢酶(XDH)、二茂铁甲酸(FcCOOH)及全氟磺酸(nafion)；制成用于检测木糖的工作电极。
在一些实施例中，所述基底与上文相同；
在一些实施例中，通过现有常规方法在所述基底上通过刻蚀技术制备微孔阵列；
在一些实施例中，通过溅射的方法在所述微孔阵列的表面上喷涂金膜；
在本发明一些实施例中，上述制备方法中所述同时活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器与上文相同。
在本发明一些实施例中，制备用于检测葡萄糖的工作电极的方法包括：在微孔阵列电极的微孔中滴加钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)；干燥(室温)后，再滴加葡萄糖氧化酶(GOX)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物；干燥(室温)后，再在每个微孔阵列电极的微孔中滴加全氟磺酸(nafion)，干燥(室温)。
在本发明一些实施例中，制备用于检测果糖的工作电极的方法包括：在微孔阵列电极的微孔中滴加钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)；干燥(室温)后，再滴加果糖脱氢酶(FDH)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物；干燥(室温)后，再在每个微孔阵列电极的微孔中滴加全氟磺酸(nafion)，干燥(室温)。
在本发明一些实施例中，制备用于检测木糖的工作电极的方法包括：在微孔阵列电极的微孔中滴加钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)；干燥(室温)后，再滴加木糖脱氢酶(XDH)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物；干燥(室温)后，再在每个微孔阵列电极的微孔中滴加全氟磺酸(nafion)，干燥(室温)。
通常，将所述微孔阵列电极事先清洁后再进行上述操作。
在一些实施例中，每个微孔阵列电极的微孔滴加的TaN-CuN-PDA复合物为0.8-3.0mg左右，或使每g所述金膜的表面上涂覆的所述钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)的量为0.6-2.4mg，例如1.0mg。
在一些实施例中，每个微孔阵列电极的微孔中滴加的葡萄糖氧化酶(GOX)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物为0.8-3.0mg左右，或使每g所述金膜的表面上涂覆的所述葡萄糖氧化酶(GOX)的量为0.6-2.4mg，例如1mg。
在一些实施例中，每个微孔阵列电极的微孔中滴加的果糖脱氢酶(FDH)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物为4-16mg左右，或使每g所述金膜的表面上涂覆的所述果糖脱氢酶(FDH)的量为3-12mg，例如5mg。
在一些实施例中，每个微孔阵列电极的微孔中滴加的木糖脱氢酶(XDH)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物为6.3-28mg左右，或使在本发明一些实施例中，每g所述金膜的表面上涂覆的所述木糖脱氢酶(XDH)的量为5.5-24mg，例如10mg。
在一些实施例中，每个微孔阵列电极的微孔中滴加的全氟磺酸(nafion)为1.8-7.5mg左右，或使每g所述金膜的表面上涂覆的所述全氟磺酸(nafion)的量为0.15-0.55mg，例如0.2mg。
在一些实施例中，在每个微孔阵列电极的微孔中滴加2ul 0.5-2％的nafion溶液，室温干燥。
在一些实施例中，所述钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)的制备方法包括：将钽立方体纳米材料(TaN)、铜立方体纳米材料(CuN)与聚多巴胺(PDA)混合，超声处理，得到钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)。具体地，钽立方体纳米材料、铜立方体纳米材料与聚多巴胺的重量比为(2:1:2)-(4:4:21)，例如4:3:16。超声处理时间例如3-6h。
在一些实施例中，所述钽立方体纳米材料(TaN)的制备方法包括：
将0.2-0.8mmol TaCl5溶解于10ml 0.1-0.5％壳聚糖溶液中，制成溶液A；
将0.2-0.5mmol K3Co(CN)6分散于10ml 0.4-1％聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)中，制成溶液B；
在震荡条件下将溶液B逐步加入到溶液A中，并继续震荡3-12h；将得到的白色胶体在6000rpm下离心并用双蒸水冲洗，然后分散于双蒸水中，制得钽立方体纳米材料(TaN)。
在一些实施例中，所述铜立方体纳米材料(CuN)的制备方法包括：
将0.2-0.8mmol CuCl2溶解于10ml 0.1-0.5％壳聚糖溶液中，制成溶液C；
将0.2-0.5mmol K3Co(CN)6分散于10ml 0.4-1％PDDA中，制成溶液D；
在震荡条件下将溶液D逐步加入溶液C中并继续震荡3-12h，将得到的白色胶体在9000rpm下离心并用双蒸水冲洗，然后分散于双蒸水中，得到铜立方体纳米材料(CuN)。
在一些实施例中，分别取上述方法制备钽立方体纳米材料的79-316mg、铜立方体纳米材料55.6-222mg与160-320mg聚多巴胺(PDA)混合，超声3-6h，得到钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)。
在一些实施例中，分别取118.7mg上述钽立方体纳米材料、83.4mg上述铜立方体纳米材料与180mg聚多巴胺(PDA)混合，超声3h，得到钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)。
在一些实施例中，将二茂铁甲酸(FcCOOH)分别与葡萄糖氧化酶(GOX)、果糖脱氢酶(FDH)和木糖脱氢酶(XDH)混合，制得葡萄糖氧化酶(GOX)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物、果糖脱氢酶(FDH)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物、木糖脱氢酶(XDH)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物。具体地，葡萄糖氧化酶(GOX)、果糖脱氢酶(FDH)和木糖脱氢酶(XDH)的浓度可均为20-80mM，二茂铁甲酸的浓度为5-10mM。
本发明还包括上述方法制备的同时活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器。
本发明还包括上述同时活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器在同时活体检测植物葡萄糖、果糖、木糖中的应用。其中，所述植物包括作物、花卉、蔬菜或林木。尤其包括植物叶片，例如扁平形状的植物叶片。
本发明还提供一种活体检测植物多种糖类的方法，包括：
1)将上述微阵列传感器连接至电化学工作站，分别与不同浓度的葡萄糖、果糖、木糖标准溶液反应，在工作电压下通过计时电流法进行连续检测，由浓度与电流关系(电流时间曲线(I-T))获得稳定的检测葡萄糖、果糖、木糖的工作曲线；
2)将上述微阵列传感器浸没于与待测植物的待测部位等渗的溶液中，并将所述微阵列传感器连接至电化学工作站；
使待测植物的待测部位内的液体流至所述等渗溶液中；所述待测部位内的液体中的葡萄糖、果糖、木糖分别与葡萄糖氧化酶(GOX)、果糖脱氢酶(FDH)、木糖脱氢酶(XDH)进行反应；
在工作电压下通过计时电流法进行连续检测，获得电流；
根据所述工作曲线和所述电流得到所述待测植物的待测部位的葡萄糖、果糖、木糖的浓度。
在本发明一些实施例中，将上述微阵列传感器连接至多通道电化学工作站。
在本发明一些实施例中，所述待测植物的待测部位为植物的叶片。
在本发明一些实施例中，可将所述待测植物的待测部位打洞或撕破，以使其中的液体流至所用等渗溶液中。
由于待测植物的待测部位(例如叶片)内外渗透压不同会造成其中内部的糖类分子(葡萄糖、果糖、木糖)的主动向外运输。为了避免发生这种情况，可以配制含多种离子及糖类的电解质溶液作为等渗溶液，使之与待测部位(例如叶片)内部渗透压一致。在本发明一些实施例中，通过在双蒸水中加入适量浓度的氯化钾(例如0.05-0.5mM，优选0.2mM)、氯化钠(例如0.1-1mM，优选0.7mM)、硫酸钠(例如0.1-1mM，优选0.2mM)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液(例如0.1-1mM，优选0.3mM)及甘露醇(例如0.05-5％，优选0.2％)，通过渗透压仪配成与待测部位(例如叶片)内渗透压相等的等渗溶液。在本发明一些实施例中，所述等渗溶液的pH值为5-7。在本发明一些实施例中，以此等渗溶液作为检测葡萄糖、果糖、木糖的电解质。在本发明一些实施例中，以该等渗溶液配制葡萄糖、果糖、木糖标准溶液。
在本发明一些实施例中，可在上述装置中实施同时活体检测植物叶片内多种糖类。例如，进行植物叶片的活体检测时，使用电化学多通道工作站，将工作电极的三根连线(分别检测葡萄糖、果糖、木糖)及参比/对极分别与工作站相连。先在孔槽内灌注900ul等渗溶液(pH值为5-7)，将叶片平铺于孔槽上方，在叶片上通过打孔器打一小洞，使叶片内液体流至孔槽的溶液内，叶片内的葡萄糖、果糖、木糖分别与GOX、FDH和XDH进行反应。通过标准曲线可以分别确定这几种糖类的浓度。
本发明具有以下优点：
(1)本发明可以实现活体同时检测扁平形状植物叶片中的葡萄糖、果糖、木糖。
(2)本发明中，所用工作电极为微孔形状的阵列式电极，在微孔的不同区域内注入不同的反应酶类，并通过半透膜使酶稳定在微孔内。通过钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)的应用提高电极的催化性能。进一步采用二茂铁甲酸(FcCOOH)作为电子媒介体，并利用三种酶类(GOX、FDH、XDH)，实现葡萄糖、果糖、木糖的同时检测。
(3)扁平形状的植物叶片，叶片中水分相对较少，而且多是扁平形状，用普通的圆柱状电极难以实现检测。本发明中，采用平面的微孔阵列电极，在其上安装反应池，将叶片贴于反应池的孔槽上进行检测，在框架结构一侧设置流路，通过流路向里面灌注液体，保持一定的水分含量，从而可以进行长时间检测。
为了保持叶片内外渗透压一致，本发明还配制了含多种离子及糖类的电解质溶液，使之与叶片内部渗透压一致，以此等渗溶液作为检测葡萄糖的电解质。
(4)本发明中，检测目标材料可以是具有扁平叶片的不同植物的不同生长时期和不同外界环境。
本发明可以实现对植物的扁平状叶片中葡萄糖、果糖、木糖的同时、活体、连续检测，突破了因叶片中水分不足或蒸发过快造成的无法检测或信号不稳定。并且通过微阵列方式可大大增强传感器的灵敏度。
附图说明
图1表示本发明一个实施例微阵列传感器的制备过程(以检测果糖为例)；
图2表示本发明一个实施例所用的活体检测植物多种糖类的装置示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下实施例及对比例分别对经以下处理的一年期胡杨叶片中的葡萄糖、果糖和木糖进行检测：
处理一:每天浇一次水,每次每桶1L，连续处理两天；
处理二:与处理一的区别在于，所浇的水中加入200mM氯化钠(NaCl)。连续处理2天。
以下实施例制备微阵列传感器的过程(以检测果糖为例)可参见图1。其中，FcCOOH表示二茂铁甲酸；Fructose表示果糖；keto-Fructose表示果糖酮。
以下实施例所用的活体检测植物多种糖类的装置可参见图2。
实施例1
如图1、图2所示，本实施例提供一种活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器，包括：基底；参比/对电极，为表面覆盖铂的微孔阵列电极；工作电极一，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面含有钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)、葡萄糖氧化酶(GOX)、二茂铁甲酸(FcCOOH)及全氟磺酸(nafion)；用于检测葡萄糖；工作电极二，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面含有钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)、果糖脱氢酶(FDH)、二茂铁甲酸(FcCOOH)及全氟磺酸(nafion)；用于检测果糖；工作电极三，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面含有钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)、木糖脱氢酶(XDH)、二茂铁甲酸(FcCOOH)及全氟磺酸(nafion)；用于检测木糖；其中，所述参比/对电极、工作电极均设置于所述基底上。
本实施例提供的活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器，制备方法如下：
1)微孔阵列电极以多聚物(聚二甲基硅氧烷，PDMS)作为基底材料，通过刻蚀技术制备4个4×4微孔阵列，每个微孔阵列之间间隔3mm，微孔呈半圆形。每个微孔面积为3平方毫米，深度为0.98mm，每个微孔之间的间隔为1毫米。将其中的3个4×4微孔阵列通过溅射在微孔上喷80nm厚度的金膜，作为工作电极，分别用于葡萄糖、果糖及木糖的检测。将其余一个4×4微孔阵列(例如图2中右侧下方的一排)的微孔电极喷80nm厚度的铂，作为参比/对电极。
2)微孔阵列电极清洁后，分别在每个工作电极的微孔中滴加2ul钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)，室温干燥。
在其中一个工作电极的每个微孔中滴加2ul葡萄糖氧化酶(GOX)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物，室温干燥后，再在每个微孔阵列电极的微孔中滴加2ul 1％的全氟磺酸(nafion)，室温干燥，制成用于检测葡萄糖的工作电极。
在其中一个工作电极的每个微孔中滴加2ul果糖脱氢酶(FDH)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物，室温干燥后，再在每个微孔阵列电极的微孔中滴加2ul 1％的全氟磺酸(nafion)，室温干燥，制成用于检测果糖的工作电极。
在其中一个工作电极的每个微孔中滴加2ul木糖脱氢酶(XDH)与二茂铁甲酸(FcCOOH)的混合物，室温干燥后，再在每个微孔阵列电极的微孔中滴加2ul 1％的全氟磺酸(nafion)，室温干燥，制成用于检测木糖的工作电极。
本实施例中，钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)的制备方法如下：
合成钽立方体纳米材料(TaN)；
溶液A：0.3mmol TaCl5溶解于10ml0.15％壳聚糖溶液中。溶液B:0.2mmolK3Co(CN)6分散于10ml0.4％PDDA中。在震荡条件下将溶液B逐步加入溶液A中并继续震荡3h。得到的白色胶体在6000rpm下离心并用双蒸水冲洗，然后分散于双蒸水中。
合成铜立方体纳米材料(CuN)；
溶液C：0.3mmol CuCl2溶解于10ml0.15％壳聚糖溶液中。D:0.2mmolK3Co(CN)6分散于10ml0.4％PDDA中。在震荡条件下将溶液D逐步加入溶液C中并继续震荡3h。得到的白色胶体在9000rpm下离心并用双蒸水冲洗，然后分散于双蒸水中。
取118.7mg上述钽立方体纳米材料、83.4mg上述铜立方体纳米材料与180mg聚多巴胺(PDA)混合，超声3h，得到钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)。
本实施例中，是将二茂铁甲酸(FcCOOH)与葡萄糖氧化酶(GOX)、果糖脱氢酶(FDH)和木糖脱氢酶(XDH)分别混合，其中，三种酶类的浓度均为50mM，FcCOOH的浓度为5mM。
如图2所示，本实施例还提供一种活体检测植物多种糖类的装置，包括：反应池1，其设有孔槽2；微阵列传感器(同上文)3，设于所述孔槽2内；流路4；注射泵5；连接线6。在一些实施例中，所述微阵列传感器3的表面还覆盖一层半透膜，目的是防止酶分子的流失。具体如下：通过3D打印技术制备聚乳酸(PLA)的反应池1，中间含有孔槽2，孔内容积为0.9ml，高度为0.3厘米。将微阵列传感器(同上文)的电极表面覆盖一层半透膜，目的是防止酶分子的流失。用密封圈将半透膜固定后，进一步卡在孔槽内。反应池1的一侧设置流路4，流路4位于孔槽2的上部，目的是在孔内溶液不足时，通过外面的注射器向孔内灌注液体，使孔槽内液体保持不变。电极连接线6露于孔槽外，以便与电化学工作站连接，进行检测。在模具的流路前设置微型注射泵，根据水分蒸发器测算的水分蒸发的速度，通过流路向孔槽内补充电解质，从而保持较长的连续检测时间。
本实施例还提供一种活体检测植物多种糖类的方法，采用本实施例制备的微阵列传感器，在一些实施例中还采用本实施例所述装置，具体如下：
在双蒸水中加入0.2mM浓度的氯化钾、0.7mM氯化钠、0.2mM硫酸钾，0.3mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶液及0.2％甘露醇，通过渗透压仪配成与叶片内渗透压等渗的溶液。以此等渗溶液作为检测葡萄糖、果糖、木糖的电解质。
标准溶液测试：用修饰的微孔阵列电极做工作电极，铂阵列电极做参比/对电极，连接电化学工作站，通过电流时间曲线(I-T)分别测试由等渗的电解质配制的葡萄糖、果糖、木糖三种糖类的标准溶液，制备三种糖类检测的标准曲线。其中，葡萄糖标准溶液的浓度分别为5mM,10mM,20mM,50mM,100mM,150mM,200mM,获得的标准曲线为y＝0.625x-6.329(R2＝0.9972)；果糖标准溶液的浓度分别为5mM,10mM,30mM,60mM,90mM,120mM,150mM,180mM,获得的标准曲线为y＝0.521x+0.013(R2＝0.9812)；木糖标准溶液的浓度分别为5mM,10mM,20mM,40mM,60mM,80mM,100mM,获得的标准曲线为y＝0.575x-0.617(R2＝0.9877)。
进行植物叶片活体检测时：使用电化学多通道工作站，将工作电极的三根连线(分别检测葡萄糖、果糖、木糖)及参比/对极分别与工作站相连。先在孔槽内灌注900ul上述等渗溶液(pH值为6.5)，将不同处理组的胡杨叶片平铺于模具上方，在叶片上通过打孔器打一小洞，使叶片内液体流至孔槽的溶液内，叶片内的葡萄糖、果糖、木糖分别与GOX、FDH和XDH进行反应。通过I-T曲线实时测试胡杨叶片中葡萄糖、果糖、木糖的电流响应，连续测量24h。通过标准曲线分别确定这几种糖类的浓度。
实验结果对比：
在上述检测过程中，每隔8小时取同一株植物上的、与检测叶片相近位置的不同叶片，研磨处理后，利用高压液相色谱(HPLC-MS)进行以上三种糖类含量的测试，进行对比分析。其中，所用的HPLC-MS方法参考文献RSC Adv.,2017,7,54416-54421。
结果如表1所示。结果表明该微电极传感检测结果的变化趋势与HPLC-MS的趋势一致，但结果更为准确，并且反应了植物活体内即时的糖类浓度变化，结果更加可靠。
表1传感器活体检测的胡杨叶片葡萄糖、果糖、木糖含量与HPLC-MS离体检测结果的对比
Figure BDA0002395680160000131
注：表1中，Sensor表示微阵列传感器。
对比例
本对比例提供一种微阵列传感器，其制备方法与实施例的区别仅在于不包括滴加钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物(TaN-CuN-PDA)的步骤。
本对比例还提供一种活体检测植物多种糖类的装置，与实施例的区别仅在于采用本对比例制备的微阵列传感器。
本对比例还提供一种活体检测植物多种糖类的方法，采用本对比例制备的微阵列传感器及本对比例所述装置，具体如下：
所用等渗溶液同实施例。
标准溶液测试：用修饰的微孔阵列电极做工作电极，铂阵列电极做参比/对电极，将微孔阵列电极置于聚乳酸的反应池中。连接电化学工作站，通过电流时间曲线(I-T)分别测试由上述等渗溶液配置的葡萄糖、果糖、木糖三种糖类的标准溶液，制备三种糖类检测的标准曲线。其中，葡萄糖标准溶液的浓度分别为5mM,10mM,20mM,50mM,100mM,150mM,200mM,获得的标准曲线为y＝0.433x-8.712(R2＝0.9766)；果糖标准溶液的浓度分别为5mM,10mM,30mM,60mM,90mM,120mM,150mM,180mM,获得的标准曲线为y＝0.321x+0.872(R2＝0.9734)；木糖标准溶液的浓度分别为5mM,10mM,20mM,40mM,60mM,80mM,100mM,获得的标准曲线为y＝0.379x-0.512(R2＝0.9776)。
进行植物叶片的活体检测：方法基本参照上文实施例。
实验结果对比：
在上述检测过程中，每隔8小时取同一株植物上的、与检测叶片相近位置的不同叶片，研磨处理后，利用高压液相色谱(HPLC-MS，方法与实施例相同)进行这几种糖类含量的测试，进行对比分析。结果如表2所示。结果表明该微电极传感器的灵敏度降低，有些时间段的结果检测不到。取某一时间点的即时浓度与同一时间点的HPLC-MS的检测结果相比，偏差变大。
表2传感器活体检测的胡杨叶片葡萄糖、果糖、木糖含量与HPLC-MS离体检测结果的对比
Figure BDA0002395680160000141
注：表2中，Sensor表示本对比例微阵列传感器。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (14)

1.一种活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器，包括：
基底；
参比/对电极，为表面覆盖铂的微孔阵列电极；及
以下任一种、两种或三种工作电极：
工作电极一，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面含有钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物、葡萄糖氧化酶、二茂铁甲酸及全氟磺酸；用于检测葡萄糖；
工作电极二，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面含有钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物、果糖脱氢酶、二茂铁甲酸及全氟磺酸；用于检测果糖；
工作电极三，为表面覆盖金膜的微孔阵列电极；所述金膜的表面含有钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物、木糖脱氢酶、二茂铁甲酸及全氟磺酸；用于检测木糖；
其中，所述参比/对电极、工作电极均设置于所述基底上。
2.根据权利要求1所述的微阵列传感器，其中，所述微孔阵列电极的表面覆盖的金膜的厚度为50-100nm；和/或，所述微孔阵列电极的表面覆盖的铂的厚度为50-100nm；和/或，所述工作电极的表面还覆盖有半透膜。
3.根据权利要求1或2所述的微阵列传感器，其中，每g所述金膜的表面上涂覆的所述钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物的量为0.6-2.4mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述葡萄糖氧化酶的量为0.6-2.4mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述果糖脱氢酶的量为3-12mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述木糖脱氢酶的量为5.5-24mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述二茂铁甲酸的量为0.02-0.05mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述全氟磺酸nafion的量为0.15-0.55mg。
4.根据权利要求1或2所述的微阵列传感器，其中，每g所述金膜的表面上涂覆的所述钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物的量为1.0mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述葡萄糖氧化酶的量为1mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述果糖脱氢酶的量为5mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述木糖脱氢酶的量为10mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述二茂铁甲酸的量为0.03mg；和/或，
每g所述金膜的表面上涂覆的所述全氟磺酸nafion的量为0.2mg。
5.一种活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器的制备方法，包括：
提供基底；
制备参比/对电极；具体包括：在所述基底上通过刻蚀技术制备微孔阵列；在所述微孔阵列上喷涂铂；
制备工作电极；具体包括：
a.在所述基底上通过刻蚀技术制备微孔阵列；
b.在所述微孔阵列上喷涂金膜；及
c1.在所述金膜表面上涂覆钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物，葡萄糖氧化酶、二茂铁甲酸及全氟磺酸；制成用于检测葡萄糖的工作电极；和/或，
c2.在所述金膜表面上涂覆钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物，果糖脱氢酶、二茂铁甲酸及全氟磺酸；制成用于检测果糖的工作电极；和/或，
c3.在所述金膜表面上涂覆钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物，木糖脱氢酶、二茂铁甲酸及全氟磺酸；制成用于检测木糖的工作电极。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，还包括将钽立方体纳米材料、铜立方体纳米材料与聚多巴胺混合，超声处理，得到钽立方体-铜立方体-聚多巴胺复合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，钽立方体纳米材料、铜立方体纳米材料与聚多巴胺的重量比为(2∶1∶2)-(4∶4∶21)。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其中，钽立方体纳米材料、铜立方体纳米材料与聚多巴胺的重量比为4∶3∶16。
9.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其中，还包括将二茂铁甲酸分别与葡萄糖氧化酶、果糖脱氢酶和木糖脱氢酶混合，制得葡萄糖氧化酶与二茂铁甲酸的混合物、果糖脱氢酶与二茂铁甲酸的混合物、木糖脱氢酶与二茂铁甲酸的混合物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，葡萄糖氧化酶、果糖脱氢酶和木糖脱氢酶的浓度均为20-80mM，FcCOOH的浓度为5-10mM。
11.权利要求5-10任一项所述方法制备的活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器。
12.一种活体检测植物葡萄糖的装置，包括：
反应池，其内设有孔槽；
权利要求1-4、11任一项所述活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器，设置在所述孔槽中；
流路，设于所述孔槽上，用于向所述孔槽中灌注液体；
电极连线，其一端与所述微阵列传感器的电极相连，另一端延伸至所述孔槽外。
13.权利要求1-4、11任一项所述活体检测植物体内多种糖类的微阵列传感器在活体检测植物葡萄糖、果糖、木糖中的应用。
14.一种活体检测植物多种糖类的方法，包括：
1)将权利要求1-4、11任一项所述微阵列传感器连接至电化学工作站，分别与不同浓度的葡萄糖、果糖、木糖标准溶液反应，在工作电压下通过计时电流法进行连续检测，由浓度与电流关系获得稳定的检测葡萄糖、果糖、木糖的工作曲线；
2)将权利要求1-4、11任一项所述微阵列传感器浸没于与待测植物的待测部位等渗的溶液中，并将所述微阵列传感器连接至电化学工作站；
使待测植物的待测部位内的液体流至等渗溶液中；所述待测部位内的液体中的葡萄糖、果糖、木糖分别与葡萄糖氧化酶、果糖脱氢酶、木糖脱氢酶进行反应；
在工作电压下通过计时电流法进行连续检测，获得电流；
根据所述工作曲线和所述电流得到所述待测植物的待测部位的葡萄糖、果糖、木糖的浓度。
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