DE69738028T2

DE69738028T2 - Verfahren und geräte für massentransport-unterstützte optische tests

Info

Publication number: DE69738028T2
Application number: DE69738028T
Authority: DE
Inventors: Joel A. Woodbridge DREWES; Gregory R. Raritan BOGART; Jeffrey B. Boulder ETTER; Jeffrey W. Lafayette STEAFFENS; Rachel M. Westminster OSTROFF; Mark Boulder CROSBY
Original assignee: BIOSTAR Inc; Biostar Inc USA
Current assignee: Inverness Medical Biostar Inc
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-20
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2017-10-21
Also published as: ATE370245T1; WO1998018962A1; US6933112B1; ID21887A; CN1244219A; EP0935673A4; JP3900289B2; DE69738028D1; JP2004117345A; US7153651B1; JP3547454B2; MY118077A; HK1020073A1; JP2001503862A; EP0935673A1; AU732463B2; CA2270421A1; KR20000052896A; AU4912997A; EP0935673B1

Description

Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen, die für eine vorteilhafte Anwendung bei analytischen Prüfungen anwendbar sind. Solche Prüfungen umfassen, beschränken sich jedoch nicht auf medizinische Diagnosen und Umweltprüfungen.
Der folgende Text ist eine Erläuterung des Standes der Technik, wobei keine der Quellen als Stand der Technik in Bezug auf die vorliegende Erfindung anerkannt ist.
Eine Durchfluss- oder poröse Prüfvorrichtung ist im US-Patent Nr. 4,632,901 von Valkirs et al. beschrieben. Bei diesem Verfahren wird ein Immunoassay auf einer Membran oder einem Filter durchgeführt, die bzw. der mit einem Antikörper beschichtet ist und die Fähigkeit besitzt, einen Analyten von einer auf der Membran aufgebrachten Probe zu entfernen. Die Sichtbarmachung gründet sich auf die vom Analyten abhängige Erfassung eines sekundären Reagens, der auf einem Substrat wirkt und ein gefärbtes, teilchenförmiges Produkt, das unspezifisch nur dort auf der Membran anhaftet, wo das sekundäre Reagenz vorhanden ist, erzeugt. Viele Modifikationen sind eingeführt worden, einschließlich gefärbter und/oder metallischer Teilchen ( US-Patent Nr. 4,775,636 ), die zwecks Sichtbarmachung am sekundären Reagens angelagert sind, und der Einführung von Chromatographie an Stelle von Durchflusstechniken ( US-Patent Nr. 5,232,835 ).
Im US-Patent Nr. 5,200,312 ist eine Membran-Prüfvorrichtung beschrieben, bei der ein gefärbtes, unlösliches Produkt für den Nachweis eines Analyten verwendet wird. Dieses Produkt wird von einem Enzym gebildet, das mit einem Substrat interagiert, welches ein Reagens enthält, das bei Kontakt mit dem Enzym einen Chromophor bildet, der ein unlösliches Produkt enthält, das einen sichtbaren Farbwechsel hervorruft. Im US-Patent Nr. 5,395,754 sind Verfahren zur Erzeugung von Kontroll- oder Kalibrierzonen auf einer Membranoberfläche für Anwendung in einer biologischen Prüfvorrichtung beschrieben.
Die Erzeugung von porösen Antireflexionsfilmen ist beschrieben (66 J. Opt. Soc. Am. 515–519, 1976; 66 J. Am. Ceramic Soc. 302–307, 1983). Die Antireflexionsfilme haben steil verlaufende Brechungsindexgradienten zur Erzeugung breitbandiger Antireflexionsschichten. Die Filme sind äußerst porös, wobei die Poren ungeordnet und miteinander verbunden sind. Die Poren fangen Luft innerhalb des Antireflexionsmaterials auf, das gebildet wird, und tragen dazu bei, einen Brechungsindexgradienten zu bilden.
Massentransport oder Massentransfer ist ein bekanntes Phänomen. Er kann aus dem Vorhandensein eines Konzentrationsgradienten, Temperaturgradienten, eines elektrischen Felds, einer Schwerkraft usw. entstehen. Ein Massentransport in einer Lösung reagiert sehr empfindlich auf Bewegungen oder Fluss oder Konvektion der Lösung. Ein Massentransport kann auch durch den Diffusionskoeffizienten oder die Ladung von Materialien in der Lösung beeinflusst werden.
In einer statischen diffusionslimitierten Reaktion kann ein Konzentrationsgradient gebildet werden, wenn die Diffusionsschicht aufgebraucht und die Analytkonzentration an der Oberfläche reduziert ist. Analyt von einem Bereich mit höherer Konzentration muss zur Oberfläche hin diffundieren, damit ein Binden stattfindet. Nur Probe in der Nähe der Oberfläche wird gebunden werden. Ein Ergänzen von Analyt bei der Diffusionsschicht oder Sperrschicht beschränkt die Bindereaktionen. Die Auswirkungen von konvektivem Massentransport können dazu dienen, die Diffusionssperrschicht aufzubrechen oder zu modifizieren.
Lösungsfluss, Massentransport, in einer stark porösen oder zusammenhängenden Oberfläche ist turbulent und erzeugt Pfropfen- oder Konvektionsflusseigenschaften. In einer Kanäle aufweisenden Oberfläche verursacht der hydrodynamische Massentransport jedoch Laminarflusseigenschaften. Pfropfenfluss bewirkt ein Mischen der Lösung durch Konvektion und anschließenden Fortschritt entlang ihrem Weg. Dadurch ist sichergestellt, dass die Diffusionssperre minimiert wird, wenn der Probenfluss seitlich über das poröse Material verläuft. In einem Prüfsystem kann ein Pfropfenfluss die Wahrscheinlichkeit einer unspezifischen Adhäsion von Material, das nicht Analyt ist und demzufolge Reagenzien zur Sichtbarmachung sind, erhöhen. Jedoch neigt der konvektive Fluss dazu, den Kontakt von Analyt mit verfügbaren Bindestellen zu vergrößern, wenn dem Flussweg frische Lösung folgt, die mit den verfügbaren Bindestellen wiederholt in Kontakt kommt.
Lösungen, die durch oder über Kanäle aufweisendes Material fließen, sind im Wesentlichen statisch, wenn sie in Kontakt mit einer massiven, gleichförmigen Oberfläche kommen, bis sie auf einen Kanal treffen. Ein Fluss durch diesen Kanal erzeugt einen Laminarfluss. Somit wird, während eine Reaktion diffusionslimitiert ist, der Materialfluss so beeinflusst, dass die Diffusionssperre oder -schicht aufgebrochen wird. Die von den Kanälen bewirkte Konvektion zwingt neuen Analyten kontinuierlich zur Oberfläche, wobei die tote Schicht nahe der Pore eliminiert wird. Während gleichzeitig auch der Bildung einer Diffusionssperre, die dem statischen Zustand zwischen den Poren entspricht, vorgebeugt wird. Demzufolge bringt der Laminarfluss kontinuierlich neue Masse in die Diffusionsgrenzschicht. Der herkömmlichen Meinung nach ist das Pfropfenflusssystem effizienter bei der Überwindung der Diffusionslimitierung als das Laminarflusssystem. Der Anmelder hat überraschenderweise festgestellt, dass bei optischen Prüfvorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung der Laminarfluss effizienter ist als der Pfropfenfluss.
In einer statischen Lösung/festen Umsetzung beträgt die Diffusionssperre nach 20 Sekunden δ(t) = 2,8 × 10^–3 cm (δ(t) = 2(D_ot^)–1/2). Für herkömmliche biologische Reagenzien wird D_o mit 1 × 10^–7 cm²/s angenommen. Im Falle eines hydrodynamischen Massentransports ist die Diffusionssperre im Wesentlichen unabhängig von der Zeit, und δ(o) = 3,7 × 10^– ⁴ cm (δ(o) = 1,61 (D_o)^1/3 (ωv^1/6)^–1/2) Darin bezeichnet ω die Winkelfrequenz, die auf einer sich über einen angenommenen Festkörper mit einer Winkelgeschwindigkeit von ω bewegenden Lösung basiert, und v ist eine Funktion der (kinematischen) Viskosität der Lösungen. Der Wert von v, basierend auf einer sich mit einer Winkelgeschwindigkeit ω über einen angenommenen Festkörper bewegenden Lösung, wurde mit 0,01 cm² s^–1 (Wasser) angesetzt. Die Berechnungen sind vom Fickschen Gesetz abgeleitet.
In EP 0343826 sind Plasmonenresonanzvorrichtungen offenbart, die für den Nachweis von Veränderungen des Brechungsindex in der Oberfläche der Vorrichtung angewendet werden, wenn ein Antikörper an ein Antigen auf der Oberfläche der Vorrichtung bindet. Die Vorrichtung weist eine empfindliche Schicht auf, die Antikörper trägt. Über dieser Schicht liegend ist eine Schicht aus hydrophilem Kunststoffmaterial angeordnet, die mit Wellen und Nuten zur Aufnahme von Probe versehen ist. Adsorbierendes Material ist den Nuten zugeordnet. Wenn Probe einer Welle zugeführt wird, wird sie durch Kapillarwirkung, unterstützt durch die absorbierenden Flächen, zu der empfindlichen Schicht gezogen.
In US 4,931,384 ist ein Diffraktionsgitter offenbart, das intakt und ungebrochen ist. Das Gitter weist eine Antikörperschicht auf. Wenn Antigen an den Antikörper bindet, verursacht dies eine Veränderung der Lichttransmission.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt eine optische Prüfvorrichtung für den Nachweis eines Analyten von Interesse in einer Probe wie in Anspruch 1 beschrieben bereit.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens oder Menge eines Analyten in einer Probe wie in Anspruch 16 beschrieben bereit. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Ansprüchen 17 bis 21 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich durch die Einführung von Massentransport durch Laminarfluss einer potenziell einen Analyten enthaltenden Probe über und durch die Schichten einer optischen Prüfvorrichtung aus.
Solche Vorrichtungen (siehe 1) weisen einen (Kanäle aufweisenden oder porösen) Träger, eine optisch funktionale Schicht, eine Anlagerungsschicht auf, und können oder können nicht eine analytspezifische Aufnahmeschicht enthalten. Die optisch funktionale Schicht kann durch ein Dünnfilm-Beschichtungsverfahren auf dem Träger bereitgestellt werden. Diese Schicht enthält die für die Signalerzeugung im Anschluss an eine Analytbindung erforderlichen aktiven Bestandteile und wird auf Basis der gewünschten endgültigen Prüfvorrichtung und dem zur Auswertung der Prüfergebnisse angewendeten Verfahren ausgewählt. Diese Schicht weist eine optische Basisschicht mit oder ohne eine Antireflexionsschicht auf. Wenn die optisch funktionale Schicht ein Antireflexionsmaterial enthält, gestattet die endgültige Prüfvorrichtung eine visuelle Bestimmung des Prüfergebnisses. Die optisch funktionale Schicht ist mit einer Anlagerungsschicht überzogen. Die Anlagerungsschicht ist enthalten, um eine stabile Umgebung für die Retention eines analytspezifisch rezeptiven Materials oder ein Mittel, durch das der Analyt selbst zurückgehalten wird, bereitzustellen. Die Bindung des Analyten an das spezifische rezeptive Material auf der Anlagerungsschicht wird durch entweder physikalische oder chemische Adsorption aufgrund einer spezifischen Interaktion zwischen einem Analyten und der analytspezifischen Oberfläche erreicht. Alternativ, wenn der Analyt unspezifisch an der Anlagerungsschicht bindet, wird Analyt durch das anschließende spezifische Binden eines analytspezifischen Bindereagens nachgewiesen.
Ein solches Mittel zur Erzeugung eines Massentransports/Laminarflusses besteht in der Bereitstellung eines Kanäle aufweisenden massiven Trägers (siehe 2A). Der Kanäle aufweisende massive Träger kann die Kanäle von Grund auf aufweisen oder zur Einführung von Kanälen durch Entfernen separater, aber beschränkter Flächen von bis zu 15 Prozent des massiven Trägers modifiziert werden. Die optisch funktionale Schicht wird auf eine solche Weise auf den Kanäle aufweisenden Träger aufgebracht, dass die Kanäle erhalten bleiben. Zusammen fördern diese Schichten einen Laminarfluss der Probe.
Ein anderes Mittel zur Erzielung eines Laminarflusses einer Probe durch oder über die Schichten einer optischen Prüfvorrichtung besteht in der Bereitstellung einer Kanäle aufweisenden, optisch funktionalen Schicht und eines darunter liegenden porösen Trägers (siehe 2B). Der poröse Träger bietet, während er für Fluidfluss offen ist, nicht die gewünschten Kanalflusseigenschaften oder optischen Eigenschaften. Demzufolge werden die Kanäle in der optisch funktionalen Schicht durch chemische, mechanische, fotochemische, lithografische oder andere bekannte Mittel eingeführt. Eine Anforderung an diese Ausführungsart besteht darin, dass die optisch funktionale Schicht auf solche Weise aufgebracht wird, dass die optischen Eigenschaften (vorrangig der Brechungsindex) auf denen der optischen Basisschicht basiert sind und nicht auf einer Zusammensetzung von Basisschicht und porösem Träger.
Alternativ kann die optisch funktionale Schicht separate optisch funktionale Teilchen (Kugeln, Stäbe oder Fasern) aufwiesen (siehe 2C). Diese Teilchen in Verbindung mit einem darunter liegenden porösen Träger stellen Kanäle bereit, die ebenfalls zu einem Massentransport der Probe durch Laminarfluss durch oder über die Prüfvorrichtung führen. Eine sorgfältige Kontrolle der Größe und Packungsdichte der Teilchen ist notwendig, damit die gewünschten optischen und Flusseigenschaften erzielt werden. Die Lösung unterhalb der Feststoffe enthaltenden, optisch funktionalen Schicht kann Pfropfenfluss aufweisen, ohne dass dies einen Einfluss auf die Bindungs- und Nachweisereignisse hat.
Der Durchsatz des Massentransports/Laminarflusses durch und/oder über die Vorrichtung kann durch die Anwendung von absorbierendem Material, das um die Schichten herum oder unterhalb der Schichten der Prüfvorrichtung angeordnet wird, modifiziert werden. Absorbierendes Material gestattet eine Dochtwirkung, die bewirkt, dass Fluid durch oder über die Schichten der Vorrichtung gezogen wird. Außerdem kann die Probe, obwohl sie ohne äußere Unterstützung durch die Vorrichtung fließen wird, (durch negativen oder positiven Druck) durch die Kanäle gezogen bzw. gedrückt werden, und zwar entweder kontinuierlich (bei Inline-Probenentnahme) oder in einer separaten Menge.
Ein Massentransport/Laminarfluss von Probe durch die Vorrichtung ermöglicht einen verstärkten Kontakt der Massenprobe mit der Oberfläche der optischen Vorrichtung, wo das Binden von Analyt stattfindet. Er modifiziert außerdem die Diffusionssperre oder unterbricht den an der Diffusionssperre geschaffenen Konzentrationsgradienten. Diese Wirkung führt mit sich, dass die Menge an für Exposition auf der Aufnahmeschicht (oder Anlagerungsschicht) der Vorrichtung verfügbarem Analyten vergrößert werden kann. Der Laminarfluss von Lösung bringt während der gesamten Oberflächenkontaktperiode der Lösung mehr Analyt zur Aufnahmeschicht (oder Anlagerungsschicht). Bei einer einfachen diffusionslimitierten Umsetzung wird, sobald die Diffusionsschicht aufgebraucht ist, dem Aufnahmematerial der Oberfläche sehr wenig zusätzlicher Analyt verfügbar gemacht.
Die Schichten der vorliegenden Vorrichtung ermöglichen dem Analyten bei Kontakt mit Lösung oder Gas ein Bewegen zur Oberfläche durch Massentransport/Laminarfluss. Der Massentransport zur Oberfläche wird durch die Anzahl und Verteilung von Kanälen, Probenparametern und dem Laminarfluss, der sich auf den oder innerhalb der Schichten der Vorrichtung bildet, geregelt. Kanäle können durch die Anwendung von Perforation, Ätzen oder durch eine Zusammenballung und oder Immobilisierung von Teilchen auf oder in den Oberflächen geschaffen werden. Der Anmelder hat festgestellt, dass die Massentransportwirkung durch Laminarfluss die Diffusionslimitierung einer Prüfung mit massiver Oberfläche durch Reduzieren der Konzentrationsgradienten innerhalb des Probenfluids eliminiert hat, während die gewünschten optischen Eigenschaften beibehalten wurden.
Die in den Schichten der optischen Prüfvorrichtung vorhandenen Kanäle zur Erzeugung eines Massentransport-/Laminarflusseffekts haben nicht signifikant zu einer vergrößerten Bindefläche für den Analyten beigetragen. Der Bindevorgang ist beschränkt auf die Fläche der Vorrichtung, die eine analytspezifische Bindeschicht aufweist. Eine Elektronenmikroskopie deutet darauf hin, dass kein Material in der Nähe der Kanäle bindet. Ferner sind jegliche Bindeereignisse, die innerhalb der Kanäle auftreten könnten, für die eingesetzten optischen oder Massennachweisverfahren erkennbar. Jedes Verfahren, das eine Veränderung in Bezug auf Dicke, Masse, optische Masse oder irgendeine andere physikalische Eigenschaft der Dünnfilmvorrichtung nach dem Binden oder Umsetzen mit dem Analyten misst, ist ein geeignetes Mittel für den direkten physikalischen Nachweis. Solche Verfahren können automatisiert, instrumentiert oder eine einfache visuelle Farbbestimmung sein. Die Kanäle aufweisenden Oberflächen sind nicht für ein Zurückhalten von Analyt oder eines sekundären Reagens zum Nachweis von Analyt gestaltet, sondern sie sind ausschließlich für ein Vergrößern des Volumens der Probe gestaltet, das an der Oberfläche der Vorrichtung für die Analytbindeplätze verfügbar gemacht wird.
Unter „Probe" ist jedes Fluidmedium, Gas oder jede Flüssigkeit zu verstehen. Es können Proben verwendet werden, die einen hohen Anteil gelöster Feststoffe ohne weitere Verarbeitung enthalten, und Proben, die einen hohen Anteil (nicht gelöster) Feststoffe enthalten, können durch ein Filter eingeführt oder in Verbindung mit zusätzlichen manuellen Schritten verwendet werden. Proben können ein Gas, eine Flüssigkeit, eine Suspension, extrahierte oder gelöste Probe oder ein superkritisches Fluid sein. Einige Fließeigenschaften muss die Probe oder das Extrakt aufweisen, um einen Massentransport/Laminarfluss zu ermöglichen.
Analyten können Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Liganden, Chelaten, Proteine, Enzyme, Nukleinsäuren, DNA, RNA, Pestizide, Herbizide, anorganische oder organische Verbindungen oder jedes Material, für das ein spezifisches Bindereagens gefunden werden soll, sein. Die Oberflächen können mit mehreren Analyten benutzt werden, und die Zuordnung einer spezifischen Interaktion kann auf die Anwendung des Oberflächenmusters abgestimmt werden, um zu unterschiedlichen Analyten zu passen.
Unter „Kanäle aufweisender Träger" ist zu verstehen, dass der Träger Kanäle oder Löcher aufweist. Der Träger kann bereits vorhandene Kanäle aufweisen (die an sich den gewünschten Durchmesser und die gewünschte Dichte aufweisen), oder die Kanäle können durch ein Entfernen von Material vom Träger (durch jedes beliebige mechanische, fotochemische, elektrochemische oder chemische Verfahren, das durch Ätzen, Bohren, Durchlöchern oder auf andere Weise Kanäle oder Löcher im Träger erzeugt) geschaffen werden. Die Durchflussgeschwindigkeit der Lösung wird beeinflusst von einer Kombination von Kanalgröße und Kanaldichte, zusätzlich zu bestimmten Probeneigenschaften wie z. B. die Viskosität.
Unter „optisch funktionale Schicht" ist eine Schicht zu verstehen, die ein Signal erzeugen kann, wenn ein Analyt an eine Aufnahmeschicht bindet. Die Schicht kann eine oder mehrere Beschichtungen aufweisen, einschließlich der Basisschicht mit oder ohne eine Antireflexionsschicht, gestaltet, um die optischen Eigenschaften des Trägermaterials so zu modifizieren, dass der gewünschte Reflexionsgrad, die gewünschte Lichtdurchlässigkeit und/oder das gewünschte Absorptionsvermögen für die endgültige Konfiguration der Prüfung geeignet sind. Die optisch funktionale Schicht kann eine oder mehrere oder einen Bereich von Lichtwellenlängen dampfen, so dass ein Ergebnis visuell oder durch instrumentierte Analyse in der endgültigen Vorrichtung nach einem Binden von Analyt erkennbar ist. Die Dämpfung des Lichts kann eine Extinktion oder Verstärkung spezifischer Lichtwellenlängen umfassen, wie bei einer Prüfvorrichtung mit Antireflexionsbeschichtung für eine visuell erkennbare Farbänderung. Oder die Intensität einer spezifischen Lichtwellenlänge kann nach Reflexion oder Lichtdurchlässigkeit der endgültigen Prüfvorrichtung modifiziert werden. Die optisch funktionale Schicht kann auch die optischen Parameter der Vorrichtung verändern, um eine Veränderung des Zustands oder Grades der Polarisierung beim einfallenden Licht zu ermöglichen.
Unter „Laminarfluss" ist der Vorgang zu verstehen, durch den die Diffusionsschicht in der Nähe der Oberfläche der optischen Prüfvorrichtung reduziert und die Menge des Analyten, der verfügbar oder in Kontakt mit der Aufnahmeschicht (oder Anlagerungsschicht) ist, erhöht wird. Der Laminarfluss ist gleichmäßig und stabil und tritt auf, wenn separate Schichten (Laminae) des Fluids stabile und charakteristische Geschwindigkeiten mit einem Nettostrom in einer Richtung aufweisen,
Unter „durch Schichten der Vorrichtung" sind sowohl der Fluss der Probe durch die Schichten von der Oberfläche der Vorrichtung aus zum Träger hin als auch der Fluss über die Oberfläche jeder Schicht der Vorrichtung zu verstehen.
Unter „Anlagerungsschicht" ist jedes Material bzw. sind alle Materialien zu verstehen, durch das bzw. die das Binden von Aufnahmematerial an die optisch funktionale Schicht gefördert oder gesteigert wird. Außerdem sollte die Anlagerungsschicht das Aufnahmematerial mit ausreichender Avidität während der anschließenden Verarbeitung und Prüfvorgänge festhalten. Die Anlagerungsschicht darf die Stabilität des Aufnahmematerials nicht herabsetzen, sie darf diese Stabilität dagegen erhöhen. Wenn keine Anlagerungsschicht benutzt wird, bindet die Aufnahmeschicht den Analyten unspezifisch.
Unter „analytspezifische Aufnahmeschicht" ist Material bzw. sind Materialien zu verstehen, das bzw. die ausreichende Affinität zum Binden des Analyten aufweist bzw. aufweisen, um einen Analytennachweis zu gestatten, und das bzw. die spezifisch für den Analyten von Interesse ist bzw. sind.
Die Anlagerungsschicht (ohne eine Aufnahmeschicht) muss eine unspezifische Erfassung des Analyten ausführen können. Beispiele für Anlagerungsschichten umfassen Silane, Siloxane, verschiedene Polymere, Nickel und diamantartigen Kohlenstoff. Der Analyt wird durch Verwendung eines analytspezifischen Reagens nachgewiesen.
Unter „porösem Träger" ist ein Material zu verstehen, das eine Lösung, einen wirklichen „Tortuous-Path"-Fluss bereitstellt.
Unter „separate optisch funktionale Teilchen" ist jedes Teilchen, jede Kugel, jeder Stab zu verstehen, deren bzw. dessen Größe im Bereich von 10 μm bis 1 mm liegt und zur Bildung einer gleichförmigen, Brechungsindex-Schicht in einem lokalisierten Bereich des porösen Trägers gepackt werden kann.
Unter „eingebettet" ist zu verstehen, dass die Teilchen in der Matrix des porösen Trägers eingeschlossen sind.
Unter „optisch funktionale, Kanäle aufweisende Schicht" ist zu verstehen, dass die optisch funktionale Schicht Kanäle aufweist, bei denen Durchmesser und Dichte entsprechend festgelegt sind, um einen Laminarfluss der Probe durch Schichten der Vorrichtung zu gestatten. Kanäle können durch chemische, mechanische, fotochemische, lithografische oder andere, dem Fachmann bekannte Mittel eingeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die optisch funktionale Schicht eine Antireflexionsschicht; die Anlagerungsschicht ist Nickel; die Vorrichtung weist ferner ein absorbierendes Material auf, das die optisch funktionale Schicht umgibt oder unter dem Träger angeordnet ist; der Träger umfasst Polyester oder Polycarbonat, die optisch funktionale Schicht umfasst eine Schicht aus Siliziumnitrid, die auf einer Schicht aus amorphem Silizium angeordnet ist, und die Anlagerungsschicht umfasst Nickel, der Träger umfasst Polycarbonat oder Polyester, die optisch funktionale Schicht umfasst eine Schicht aus diamantartigem Kohlenstoff, die auf einer Schicht aus Germanium angeordnet ist; die optisch funktionale Schicht umfasst eine Schicht aus diamantartigem Kohlenstoff, die auf einer Schicht aus Germanium angeordnet ist, und die Anlagerungsschicht umfasst Nickel; die optisch funktionale Schicht umfasst eine Schicht aus Siliziumnitrid, die auf einer Schicht aus amorphem Silizium angeordnet ist; die Anlagerungsschicht umfasst diamantartigen Kohlenstoff; der Analyt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Rezeptoren, Liganden, Chelaten, Proteinen, Enzymen, Nukleinsäuren, DNA, RNA, Pestiziden, Herbiziden, anorganischen oder organischen Verbindungen ausgewählt.
Antireflexionsschichten sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für Antireflexionsschichten, die sich für eine Anwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, umfassen Aluminiumoxid, Antimonoxid, Bismutoxid, Indiumoxid, Indiumzinnoxid, Zinnoxid, Siliziummonoxid, Titandioxid, Zirkonoxid, Siliziumnitrid, Siliziumoxynitrid, Germaniumoxide, Cobaltoxide, Kohlenstoff, Tantaloxid ebenso wie die meisten anderen Metalloxide, -carbide, -nitride oder -oxynitride, Diamant und diamantartige Kohlenstoff.
Unter „absorbierendes Material" ist ein Material zu verstehen, das die Fähigkeit aufweist, Lösung von einer Oberfläche, mit der das Material in Kontakt ist, abzuziehen (Dochtwirkung) und zurückzuhalten. Das Material kann die optisch funktionale Schicht umgeben und/oder unter dem Träger angeordnet werden. Die Anwendung einer Kombination von Material, das das Absorptionsvermögen erhöht oder verringert, ermöglicht eine Steuerung der Bewegung der Probe.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform besteht in der Anwendung von Polycarbonat als Träger, Germanium als optische Basisschicht (> 300 Å) und diamantartigem Kohlenstoff, der sowohl als Antireflexionsschicht als auch als Anlagerungsschicht (300–800 Å je nach der gewählten oder erwünschten Farbänderung) funktioniert.
Unter „durch und über alle Schichten" ist zu verstehen, dass Probenlösung abhängig von der Konstruktion der Vorrichtung und Verteilung der Kanäle senkrecht und/oder waagrecht zu der oder durch die optische Vorrichtung fließt.
Unter „Massenveränderung" ist eine Veränderung der Dicke, optischen Dicke (Brechungsindex x Dicke) oder Materialanlagerung (Masse oder optische Masse) auf der optisch funktionalen Schicht zu verstehen. Massenveränderung kann eine Zunahme oder Abnahme bei einem oder mehreren der Oberflächenmaterialien sein.
Unter „analytspezifisches Bindungsreagens" ist ein Reagens zu verstehen, das spezifisch mit dem auf der Oberfläche erfassten Analyten reagiert.
Die optisch funktionale Schicht kann am Laminarfluss beteiligt sein, indem sie mit den Kanälen im darunter liegenden Träger übereinstimmt, oder indem sie Kanäle oder Löcher aufweist, die direkt in die optisch funktionale Schicht eingeführt sind, die die Probe direkt in einen porösen Träger leitet, oder indem sie Teilchen aufweist, die Kanäle oder Löcher erzeugen, durch die die Probe nach unten zu einem porösen Träger strömt.
Unter „der/die/das einen Laminarfluss der Probe fordert" ist ein Material oder eine Gestaltung zu verstehen, das bzw. die bewirkt, dass sich eine Lösung durch oder über die optische Prüfvorrichtung unter solchen Bedingungen bewegt, dass ein Massentransport/Laminarfluss einsetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Träger Polycarbonat auf, und die optisch funktionale Schicht weist eine Schicht aus amorphem Silizium auf; der Träger weist Polycarbonat auf, und die optisch funktionale Schicht weist eine Schicht aus Siliziumnitrid auf, die auf dem amorphen Silizium angeordnet ist; der Träger weist Polycarbonat auf, und die optisch funktionale Schicht weist Germanium auf; der Träger weist Polycarbonat auf, und die optisch funktionale Schicht weist eine Schicht auf diamantartigen Kohlenstoff, die auf einer Schicht aus Germanium angeordnet ist; der Träger weist Polyester auf, und die optisch funktionale Schicht weist amorphes Silizium auf; der Träger weist Polyester auf, und die optisch funktionale Schicht weist eine Schicht aus Siliziumnitrid auf, die auf einer Schicht aus amorphem Silizium angeordnet ist; der Träger weist Polyester auf, und die optisch funktionale Schicht weist Germanium auf; oder der Träger weist Polyester auf, und die optisch funktionale Schicht weist eine Schicht aus diamantartigem Kohlenstoff auf, die auf einer Schicht aus Germanium angeordnet ist.
Diamantartiger Kohlenstoff kann als Anlagerungsschicht verwendet werden.
Unter „Prüfvorrichtung" ist eine Vorrichtung zu verstehen, die für den Nachweis eines Analyten anwendbar ist.
Unter „Träger" ist jede Oberfläche zu verstehen, auf der eine Prüfung in Bezug auf einen Analyten durchgeführt werden kann, einschließlich, aber auf nicht beschränkt auf Mikrotiterplatte, Keramik, Metalle, Objektträger, Küvetten, Reagenzgläser, Diffraktionsgitter für Oberflächen-Plasmonresonanz, Membranen, Filterpapier, Silizium, Glas, piezoelektrischen Strukturen für Resonanz- oder Oszillationsstudien und aller kompatiblen Kombinationen von Oberflächen-/Nachweissystemen. Die Beschichtungen können gleichförmig über die Fläche des Trägers oder auf freigelegten Flächen des Trägers aufgebracht werden. Träger können in einer Auswahl von Formen und Konfigurationen sein.
Unter „Anlagerungsschicht" ist jedes Material bzw. sind alle Materialien zu verstehen, durch das bzw. die das Binden des Aufnahmematerials an entweder den Träger oder die optisch funktionale Schicht, wenn in der Vorrichtung vorhanden, gefördert oder gesteigert wird. Wenn keine Aufnahmeschicht benutzt wird, wird die Anlagerungsschicht den Analyten unspezifisch binden.
Unter „diamantartigem Kohlenstoff" ist eine Schicht zu verstehen, die zusammengesetzt ist aus einem gleichförmigen Film oder gepackten Teilchen, bestehend aus (synthetischem oder natürlichem) Diamant, monokristallinem Diamant, Resin-bond-Diamant, polykristallinem Diamant, diamantartigem Kohlenstoff, amorphem Kohlenstoff mit diamantähnlichen Eigenschaften (Härte und Oberflächenenergie), amorphen hydrierten Kohlenstoffschichten (DLC) oder -filmen, nichtkristallinen bis kristallinen Kohlenstofffilmen mit einer chemischen Zusammensetzung im Bereich von graphitartig bis Diamant.
Unter „optisch funktionaler Schicht" ist eine Schicht zu verstehen, die ein Signal beim Binden von Analyten an eine Aufnahmeschicht erzeugen kann, oder die ein Signal beim Binden von Analyt unspezifisch an eine Anlagerungsschicht zusammen mit einem Binden eines analytspezifischen Reagens erzeugen kann. Die Schicht kann eine oder mehrere Beschichtungen aufweisen, mit oder ohne eine Antireflexionsschicht, die so zur Modifikation der optischen Eigenschaften gestaltet wird, dass der gewünschte Reflexionsgrad, die gewünschte Lichtdurchlässigkeit und/oder das gewünschte Absorptionsvermögen für die endgültige Konfiguration der Prüfung geeignet sind. Die optisch funktionale Schicht kann eine oder mehrere oder einen Bereich von Lichtwellenlängen dampfen, so dass ein Ergebnis visuell oder durch instrumentierte Analyse in der endgültigen Vorrichtung nach einem Binden von Analyt erkennbar ist. Die Dämpfung des Lichts kann eine Extinktion oder Verstärkung spezifischer Lichtwellenlängen umfassen, wie bei einer Prüfvorrichtung mit Antireflexionsbeschichtung für eine visuell erkennbare Farbänderung. Oder die Intensität einer spezifischen Lichtwellenlänge kann nach Reflexion oder Lichtdurchlässigkeit der endgültigen Prüfvorrichtung modifiziert werden. Die optisch funktionale Schicht kann auch die optischen Parameter der Vorrichtung verändern, um eine Veränderung des Zustands oder Grades der Polarisierung beim einfallenden Licht zu ermöglichen.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine analytspezifische Aufnahmeschicht auf der Anlagerungsschicht angeordnet; die Anlagerungsschicht bindet Analyt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Rezeptoren, Nukleinsäuren, Polysacchariden, Lipopolysacchariden, Enzymen, Proteinen, Mikroorganismen, von Mikroorganismen abgeleiteten Fragmenten, Haptenen, Rauschgiften, Nahrungsmittelkontaminanten, Umweltwirkstoffen wie, aber nicht beschränkt auf Dioxan und Allergene, Liganden, Chelaten und analogen oder davon abgeleiteten Stoffen; die Aufnahmeschicht umfasst Biomoleküle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Rezeptoren, Nukleinsäuren, Polysacchariden, Lipopolysacchariden, Enzymen, Proteinen, Mikroorganismen, von Mikroorganismen abgeleiteten Fragmenten, Haptenen, Medikamenten, Nahrungsmittelkontaminanten, Umweltwirkstoffen wie, aber nicht beschränkt auf Dioxan und Allergene, Liganden, Chelaten und analogen oder davon abgeleiteten Stoffen; der diamantartige Kohlenstoff ist auf dem Träger mit einer Dicke von 50 Å aufgetragen; der diamantartige Kohlenstoff ist auf der optisch funktionalen Schicht mit einer Dicke von 50 Å aufgetragen; der diamantartige Kohlenstoff ist auf dem Träger mit einer Dicke von 50 bis 3000 Å aufgetragen; der diamantartige Kohlenstoff ist auf der optisch funktionalen Schicht mit einer Dicke von 50 bis 3000 Å aufgetragen; der diamantartige Kohlenstoff ist auf dem Träger aufgetragen durch ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schocksynthese-Technik, Sputtering, thermischer Radiofrequenz und mikrowellengestützten Plasmaverfahren, Heizdrahtverfahren, Gleichstromplasmaverfahren, Innenstrahl-Technik, chemischer Gasphasenabscheidung, Plasmaabscheidung und Ionenstrahlpistole; der diamantartige Kohlenstoff umfasst Industriediamanten.
Verfahren zur Beschichtung von diamantartigem Kohlenstoff sind beschrieben in Bachman et al., Chemical and Engineering News, S. 24, 15. Mai, 1989.
Unter „Biomolekül" ist Material zu verstehen, das ein Analyt von Interesse ist oder einen Analyten von Interesse spezifisch bindet (d. h. eine Anlagerungsschicht). Biomoleküle umfassen Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Enzyme, Proteine, Mikroorganismen, von Mikroorganismen abgeleitete Fragmente, Haptene, Rauschgifte, Nahrungsmittelkontaminanten, Umweltwirkstoffe wie, aber nicht beschränkt auf Dioxan und Allergene, Liganden, Chelaten und analoge oder davon abgeleitete Stoffe.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in einem empfindlicheren Ansprechen aufgrund eines Anstiegs des verfügbaren oder nutzbaren Probenvolumens, das durch die Wirkung des Massentransports/Laminarflusses mit dem analytspezifischen Aufnahmematerial in Kontakt gebracht wird. Dieses System kann eine Steigerung der analytischen Empfindlichkeit um mindestens das 40-fache bereitstellen.
Ein zweiter Vorteil besteht in der Reduzierung der Durchführungszeit für die Prüfung. Die Inkubationszeiten werden durch Bereitstellen von neuem Analyt zur Oberfläche durch Massentransport/Laminarfluss von Fluid, der bei einfacher Diffusion nicht auftritt, reduziert. Die Zeit je Schritt-Basis verringert sich aufgrund der effizienten Bereitstellung von Material zur Oberfläche durch Massentransport/Laminarfluss und Erhöhung des auf der Oberfläche aufgetragenen Probenvolumens von einem Minutenzeitfenster auf ein Sekundenzeitfenster. Die gesteigerte Empfindlichkeit und Geschwindigkeit sind von besonderem Nutzen für den Nachweis von solchen Analyten wie Antigenen oder DNA in Proben.
Ein dritter Vorteil besteht in der Möglichkeit zur Regelung der Inkubationszeit mithilfe der Dochtwirkungsrate, Druckdifferenz, Kanalgröße und Viskosität der Probe anstelle einer manuellen Zeitabstimmung jedes einzelnen Schritts. Alle nachfolgenden Oberflächen-Inkubationszeiten werden einen ähnlichen Zeitrahmen haben. Eine andere Möglichkeit besteht in der Anwendung von Schichten mit Dochtwirkungsmaterialien mit unterschiedlichen Kapillargeschwindigkeiten, Benetzbarkeitsraten oder Flusseigenschaften zur Regelung der Inkubationszeiten.
Ein vierter Vorteil besteht in der einfachen Herstellung. Die Materialien, die für die Schichten der Vorrichtungen nützlich sind, sind mit einer kontinuierlichen Online-Bahn-Verarbeitung kompatibel. Alle optische Verarbeitung kann in einem Schritt oder einem kontinuierlichen Vorgang erfolgen. Es besteht auch ein wirtschaftlicher Größenvorteil, da große Materialbogen verarbeitet werden können. Darüber hinaus wird die Ausbeute jedes einzelnen Schritts verbessert im Vergleich zu einer Herstellung separater Komponenten einer Vorrichtung. Ferner können Anlagerungsschichten (z, B, Ni, diamantartiger Kohlenstoff) während der Verarbeitung der optischen Schichten aufgetragen werden. Außerdem ermöglicht die Verwendung dieser Materialen eine flexible optische Gestaltung, denn die optischen Schichten können einfach ausgewechselt werden, und zusätzliche Schichten von Materialien (z. B. Antireflexionsschicht, Aufnahmeschicht) können einfach hinzugefügt werden.
Ein fünfter Vorteil bei Anwendung einer Vorrichtung, die die Eigenschaften des Massentransports/Laminarflusses in einem automatisierten System ausnutzt, besteht darin, dass die Proben durch die Oberfläche fließen können, wodurch der Bedarf an Vakuum- und Druckspülung entfällt, die Aerosole erzeugt und die Eingrenzung erschwert.
Die Verfahren und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind verschieden von den analytischen Verfahren der bekannten Technik, die alle auf der Adhäsion oder Erfassung eines analytspezifischen Reagens in den vielen Poren oder Fasern in der Membran oder dem Filtermaterial basieren. Bei diesen Verfahren wird eine solche Membran oder solches Filtermaterial benutzt, um das spezifische Bindereagens zu enthalten, das nicht umgesetzte Probenmaterial vom gebundenen Analyten abzutrennen und die für das Bindereagens verfügbare Fläche zu vergrößern. Das Bindereagens ist auf der Oberfläche und in den Poren zu finden, und der Nachweis kann, abhängig vom benutzten Verfahren zur Signalerzeugung, bis auf etwas Tiefe im porösen Material erfolgen. Diese Materialien weisen allgemein Porositäten von 60 Prozent auf. Die Porengrößen dieser Materialien liegen in der Größenordnung von 0,45 Mikrometer. Die Poren oder vernetzten Oberflächen sind äußerst komplex und miteinander verbunden. Dies führt ein System vom Pfropfenflusstyp ein. Im Unterschied zur vorliegenden Erfindung machen die Kanäle nicht mehr als 15 Prozent des Gesamtflächeninhalts irgendeiner der Schichten aus, und sie sind separat ohne gegenseitige Verbindungen, die einen Fluss mit laminaren Eigenschaften erzeugen. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass ein Binden von Analyt in den Poren oder Kanälen unerheblich ist und nicht zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals beiträgt.
Poren sind in einer Antireflexionsschicht eingeführt worden, um die optischen Eigenschaften dieser Schicht zu verändern und einen Gradienten beim Brechungsindex zu erzeugen. Dagegen sind bei der vorliegenden Erfindung Kanäle in der optisch funktionalen Schicht nur deshalb eingeführt worden, um den Laminarfluss von Probe durch eine Prüfvorrichtung zu ermöglichen. Außerdem sind sehr ungeordnete, stark poröse Filme, die für die Herstellung von Breitband-Antireflexionsfilmen verwendet werden, nicht kompatibel mit den erwünschten Vorrichtungen dieser Erfindung. In einem biologischen Assay neigen diese Typen von Antireflexionsfilmen dazu, bei Mehrzahl der Bindeereignisse deren Eintreffen in dem porösen Film und nicht auf der Oberfläche des Antireflexionsfilms zu begünstigen. Zudem erzeugen Breitband-Antireflexionsfilme sehr schwache und kleinere Farbänderungen mit einer entsprechenden Veränderung der Dicke oder Masse. Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung benutzen Schmalband-Antireflexionsschichten, die so gestaltet sind, dass sie sehr starke Farbänderungen von extremer Intensität erzeugen. Farbübergänge erscheinen über einen sehr kleinen Dickenbereich.
Die Materialien und Verfahren, die in dieser Anmeldung beschrieben sind, können über einen breiten Bereich von analytischen Prüferfordernissen eingesetzt werden. Besonders anwendbar sind die mit diesen Verfahren hergestellten Vorrichtungen auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik. Die Vorrichtungen können über einen breit gefächerten Anwendungsbereich benutzt werden, wo eine Analyterfassung erforderlich ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Erkennung von Infektionskrankheiten, Krebsdiagnostik, Rauschgiftüberwachung, Umweltprüfungen, therapeutische Medikamentenüberwachung, DNA-Tests und kardiologische Untersuchungen. Die mit diesen Materialien und Verfahren hergestellten Vorrichtungen können auf derart unterschiedlichen Gebieten eingesetzt werden wie medizinische Diagnose und Umweltüberwachung oder Nahrungsmittel-Screening und Prüfanwendungen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Es folgt eine kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Zeichnungen
1 zeigt in schematischer Darstellung die Schichten einer Kanäle aufweisenden optischen Vorrichtung. Alle dargestellten Schichten müssen nicht in einer besonderen Ausführungsform einer solchen Vorrichtung enthalten sein. Die Platzierung von Kanälen ist nicht dargestellt.
2A–C zeigen schematisch mögliche Kombinationen von Träger und optisch funktionalen Schichten, die Laminarfluss von Probe durch die Vorrichtung ermöglichen. 2A zeigt eine Vorrichtung, bei der die bei der endgültigen Prüfvorrichtung erwünschten Flusseigenschaften durch das Trägermaterial, das Kanäle aufweist, eingeführt werden. 2B zeigt eine optisch funktionale Schicht mit Kanälen auf einem porösen Träger. 2C zeigt eine Kombination, bei der ein poröser Träger gewählt ist und die Kanäle durch Packen der separaten Teilchen erzeugt werden, welche Teilchen der endgültigen Vorrichtung auch die optische Funktionalität verleihen.
3 zeigt in Diagrammform einen Vergleich von diamantartigem Kohlenstoff (DLC) und T-Polymer für die Erfassung von chlamydienspezifischem Lipopolysaccharid (LPS) bei einer Verdünnung von 1:1000 LPS. Die Y-Achse bezeichnet das abgelesene Absorptionsvermögen für die TMB-Substrat-Umwandlung in Produkt, korrigiert für den Hintergrund (Fehlen von LPS). Die Menge DLC ist durch die X-Achse dargestellt. Vollfarbige Rechtecke bezeichnen T-Polymer. Schraffierte Rechtecke bezeichnen DLC.
4 zeigt in Diagrammform einen Vergleich von diamantartigem Kohlenstoff (DLC) und T-Polymer für die Erfassung von chlamydienspezifischem Lipopolysaccharid (LPS) bei einer Verdünnung von 1:5000 LPS. Die Y-Achse bezeichnet das abgelesene Absorptionsvermögen für die TMB-Substrat-Umwandlung in Produkt, korrigiert für den Hintergrund (Fehlen von LPS). Die Menge DLC ist durch die X-Achse dargestellt. Vollfarbige Rechtecke bezeichnen T-Polymer. Schraffierte Rechtecke bezeichnen DLC.
Träger
Eine Reihe von Materialien eignet sich für die Herstellung des Kanäle aufweisenden Trägers. Darin enthalten sind Celluloseacetat, PETE, Polyester, Polycarbonate, Glasteilchen, Silicateilchen, TiO₂-Teilchen, Metall- und Nichtmetall-Teilchen, Gewebe- und Vliesmaterialien, Polyamid, Filterpapier, Membranen, Polysulfone, poröses Glas, Polypropylene, Polyurethane oder beliebiges Polymer, Kunststoff und Metalle sowie Nichtmetalle. Der Träger sollte die sehr begrenzte Verteilung und Größe der Kanäle (in Bezug auf den Fluss durch oder über Oberflächenanordnungen) bereitstellen, die erforderlich ist, um Massentransport/Laminarfluss in der endgültigen Vorrichtung zu ermöglichen.
Die Kanäle müssen 0,01 bis 14 Mikrometer sein und dürfen nicht mehr als 15 Prozent des Gesamtflächeninhalts betragen. Die Kanalverteilung sollte relativ gleichmäßig über die Oberfläche sein. Der Kanal kann fester Bestandteil des ausgewählten Trägers sein oder in den Träger eingeführt werden. Der Träger kann chemisch, photochemisch, mechanisch oder elektromechanisch modifiziert werden. Zum Beispiel können zweidimensionale mikroporöse Siebe durch Beschuss von Polyester- oder Polycarbonatbahnenmaterial zwischen Fusionsplatten und anschließendes Ätzen in einem heißen Basenbad während der für ein Abätzen bis zum gewünschten Kanaldurchmesser erforderlichen Zeit erzeugt werden. Der Träger kann eine Dicke von zwischen 10 μm und 30 μm haben. Der Vorteil einer begrenzten Kanaldichte besteht in der Produktion von nicht gewundenen Pfaden, die ein geringes Ausgasen in den nachfolgenden Ablagerungsschritten ermöglichen, und einer Reduzierung von Material, das in der Kanalstruktur zurückgehalten wird. Die geschaffenen Kanäle sind separat, und es besteht keine Verbindung der Materialien untereinander.
Es bestehen keine Einschränkungen beim Träger, solange die optische Basisschicht gleichförmig auf allen Flächen aufgetragen werden kann (die optische Basisschicht muss für den optischen Nachweis von Analyt unverletzt sein) und sie keinen störenden Einfluss auf den Massentransport/Laminarfluss der Probenlösung hat, die auf die oberste Fläche der endgültigen optischen Vorrichtung aufgetragen wird.
Der Träger muss inhärent keine spezifischen optischen Eigenschaften aufweisen. Allerdings stellt bei dünneren optischen Basisschichten, die auf dem Träger angelagert sind, ein leichter, absorbierender Träger einen optischen Stapel bereit, der aufgrund der Absorption von Streulicht und dem Entfernen von Licht, das von der hinteren Fläche zur Front passiert, für das bloße Auge leichter sichtbar gemacht werden kann.
Der Träger sollte chemisch inert gegen die Lösemittel sein, die bei der Extraktion einbezogen sind, oder gegen Trägerlösemittel des Analyten von Interesse. Zum Beispiel enthalten bevorzugte kostengünstige Träger Polyester und Polycarbonat, die von den bei der Durchführung der aktuellen Anwendungen verwendeten Lösemitteln unbeeinflusst bleiben.
Die Kanäle des massiven Trägers können auf solche Weise gesteuert werden, dass die Anwendung von Dochtwirkung aufweisenden oder fasrigen, darunter liegenden Materialien nicht notwendig ist, um Fluss durch oder über die Vorrichtung zu ermöglichen. Allerdings kann ein genau geregelter Fluss erreicht werden durch Anpassung der Kanäle an den Träger und eine fasrige Unterschicht auf solche Weise, dass die durchschnittliche Verweilzeit des Probenvolumens innerhalb eines spezifischen Zeitfensters bleibt. Die Regelung des Flusses durch oder über die Vorrichtung dient nur zur Sicherstellung, dass die Umsetzungszeiten innerhalb eines vorgegebenen Zeitparametersatzes konstant bleiben. Ein absorbierender Block am einen Ende oder unterhalb des Trägers kann erforderlich sein als Lösungsbehälter und zur Sicherstellung, dass die vom Material mit Dochtwirkung vorgegebenen Durchflussmengen bei sättigenden Volumina der Lösung konstant bleiben. Wenn Druckdifferenzen die Durchflussmengen steuern, wird das Absorptionsmittel für Lösungsaufnahme und Behälterzwecke platziert.
Wenn als Träger ein äußerst poröses Material mit gewundenem Pfad dient, können die optische Basisschicht und Antireflexionsschichten zur Steuerung der kanalisierten Wirkung benutzt werden. Stark poröse Materialien sind eventuell nicht kompatibel mit den optischen Vorrichtungen dieser Erfindung. Diese Träger können eine Streuung oder andere unerwünschte Wirkungen einbringen. Die optische Basisschicht über diesem porösen Träger sollte dick genug sein, um zu bewirken, dass der Brechungsindex des Hauptteils des ersten Materials bei der Konstruktion der Vorrichtung vorherrscht.
Optisch funktionale Schicht
Die optisch funktionale Schicht besteht aus einer Basisschicht und kann außerdem aus einer Antireflexionsschicht bestehen.
Die optische Basisschicht dient dazu, die für die Erzeugung der entsprechenden Reflexions-, Antireflexions-, Adsorptions- oder Transmissionseigenschaften erforderlichen optischen Eigenschaften bereitzustellen. Sie muss ausreichend dicht sein, um eine Streulichtleckage oder eine Rückstreuung von der Rückseite des Trägers zu eliminieren. Das Material muss einen Brechungsindex von mehr als 3,0 aufweisen, so dass es den größten Teil der Reflexion regelt. Dies beeinflusst die Wahl der Antireflexionsschicht durch den Wert des Brechungsindex und die Eignung für die instrumentierten Formate durch Regelung der Reflexion oder Transmission usw. Wenn die Basisschicht zu dünn ist, kann der wirksame Brechungsindex auf die zusammengesetzten Indizes von optischer Basisschicht und Träger basiert werden. Wenn die vorstehenden Einschränkungen berücksichtigt bleiben, kann die Dicke innerhalb eines großen Bereichs gewählt werden.
Dickere Schichten beim optischen Basismaterial erhöhen die prozentuale Reflexion. Niedrigere Reflexionswerte sind wichtig für die Sichtbarmachung der Farbänderung für das bloße Auge. In einem automatisierten System sind jedoch höhere Reflexionswerte wichtig für die Sensibilisierung geringer Dickenänderungen für instrumentale Analyse.
Jedes optische Basismaterial kann für die Herstellung der neuen Vorrichtung verwendet werden. Verschiedene, auf der Kanäle aufweisenden, massiven Trägeroberfläche angelagerte Filme oder in den porösen Trägern eingebettete Kugeln, Stäbe oder Fasern, können – ohne die Auswahl einzuschränken – aus amorphem Silizium, Bleitellurid, Titan, Germanium, Kobalt, Gallium, Tellur, Eisenoxid oder Chrom bestehen. Es hat sich gezeigt, dass eine Veränderung der Dicke der optischen Basisschicht auf dem Träger zur Regelung der Gesamtreflexion der optischen Fläche dienen kann, was bei automatisierten Systemen und bei spezifischer Gestaltung der optischen Oberflächen für verschiedene Vorrichtungen zur Anwendung kommen kann, Dies hat allerdings keinen signifikanten Einfluss auf die Farbänderungsprüfverfahren.
Die optische Basisschicht kann mit den Kanälen im Träger konform sein, oder die Kanäle können direkt in der optischen Basisschicht eingeführt werden, oder es können Teilchen verwendet werden, die keinen unterhalb liegenden, Kanäle aufweisenden Träger erfordern.
Über dem optischen Basismaterial können eine oder mehrere Antireflexionsschichten aufgetragen werden. Diese Schichten können aus folgendem Material bestehen: Aluminiumoxid, Antimonoxid, Bismutoxid, Indiumoxid, Indiumzinnoxid, Zinnoxid, Siliziummonoxid, Titandioxid, Zirkonoxid, Siliziumnitrid, Siliziumoxynitrid, Germaniumoxiden, Cobaltoxiden, Kohlenstoff, Tantaloxid ebenso wie den meisten anderen Metalloxiden, -carbiden, -nitriden oder -oxynitriden, Diamant und diamantartigem Kohlenstoff. Alle Antireflexionsmaterialien können durch Verfahren aufgetragen werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Für ein visuelles Prüfgerät muss dieses eine optische Basisschicht mit einem höheren Index unterstützen als der der auf der Gegenseite der Basisschicht zu bildenden Antireflexionsschicht. Die bevorzugte Ausführungsform benutzt eine optische Basisschicht, die einen realen Brechungsindex aufweist, der in etwa dem Quadrat des realen Brechungsindex der Antireflexionsschicht entspricht. Der imaginäre Index der optischen Basisschicht muss keiner spezifischen Funktion passen.
Die Antireflexionsschicht muss einen realen Brechungsindex aufweisen, der in etwa der Quadratwurzel aus dem realen Index der optischen Basisschicht entspricht. Darüber hinaus sollte der imaginäre Index der Antireflexionsschicht angemessen niedrig sein, um die Absorption von Licht in dieser Schicht zu minimieren. Die Absorptionseigenschaften der Antireflexionsschicht können jedoch auch benutzt werden, um die Wellenlängenabhängigkeit bei Anwendung in automatisierten Nachweissystemen wie Reflexions- oder Streulichtmessungen oder Nachweis von Extinktionsparametern zu verstärken. Die Anzahl der Antireflexionsschichten kann von einer bis zu vier betragen, bevor eine Verschlechterung der optischen Eigenschaften einsetzt. Allerdings bietet eine geringere Anzahl von Schichten Vorteile in Bezug auf einfache Entwicklung und Herstellung.
Eine Kompatibilität der Schichten miteinander muss nur insoweit vorliegen, dass sie ausreichend aneinander anhaften, damit das Prüfungsergebnis sichtbar und, wenn möglich, dauerhaft gemacht werden kann. Kompatible Materialien mit höherem Brechungsindex durch den gesamten Stapel bieten den Vorteil höherkontrastiver Farbänderungen bei geringeren Dickenänderungen bei den analytspezifischen Schichten.
Die bevorzugte Farbänderung erfolgt von Gold oder Gelb in Blau nach Anlagern des spezifischen Analyten auf der Oberfläche. Die Dicke des Analytfilms, die erforderlich ist. um eine derartige Farbänderung zu begünstigen, und die Farbdichte der Farbentwicklung können über das Material im Stapel gesteuert werden.
Beim Anlagern der Antireflexionsschichten auf einem Kanäle aufweisenden Material sollte das Antireflexionsmaterial die Kanäle nicht so voll mit Material füllen, dass sie verstopft werden. Die Dicken können geregelt werden, um ein signifikantes Verstopfen zu vermeiden. Ein anderer Grund für die Anwendung eines Kanäle aufweisenden Trägers wie Polyester oder Polycarbonat besteht darin, dass die nicht gewundenen Pfade nicht zum Verstopfen neigen wie dies bei Materialien mit gewundenen Pfaden der Fall wäre.
Im Fall einer Anwendung eines Instruments, das für die Messung von Reflexion konstruiert ist, kann die Antireflexionsschicht so eingestellt werden, dass die schärfste Veränderung der Reflexion bei einer spezifischen Wellenlänge von Interesse nach Interaktion der analytspezifischen Fläche mit dem gewählten Analyten eintritt.
Im Fall der visuellen Prüfung kann die Dicke der Schichten derart eingestellt werden, dass eine Dickenänderung eine empfindliche Farbentwicklung bereitstellt. Die verwendeten Antireflexionsschichten sind auf solche Weise angelagert, dass ein Farbwechsel von Gold in Blau als empfindlicher Farbwechsel definiert wird, da er (für das menschliche Auge) den Farbwechsel mit dem höchsten Kontrast unter Antireflexionsbedingungen darstellt. Andere Farbkombinationen können eine einfachere Auswertung bereitstellen oder dem Prüfformat Flexibilität verleihen. Alle lassen sich einfach durch Verändern der Materialkombinationen und/oder Dicken erhalten.
Eine Laminarflusswirkung kann auch erzielt werden durch die Ablagerung kleiner, mit einer Antireflexionsschicht überzogener Teilchen und einer biologischen Bindeschicht (Aufnahmematerial), wonach diese in einen porösen Träger implantiert werden. Die mit der Antireflexionsschicht überzogenen Teilchen können auch im chromatographischen Format benutzt werden, lassen sich einfach in Muster anordnen und lassen den Träger die Durchlässigkeit beibehalten. Die mit der Antireflexionsschicht überzogenen Kügelchen müssen in die Membran gepackt werden. damit eine ausreichende Dichte und Gleichförmigkeit beim Brechungsindex erzielt werden, so dass ein Signalverlust aufgrund von Streulicht oder Absorption von einfallendem Licht verhindert werden. Die Teilchen sollten den Größenbereich von 1 μm bis 3 μm aufweisen und sich gut packen lassen, um eine dichte, gleichförmige optische Oberfläche bereitzustellen.
Die Teilchen tragen dazu bei, den Massentransport/Laminarfluss von Fluidmedien zur Oberfläche der optischen Vorrichtung zu fördern, indem sie einen Fluss um die Teilchen herum in den porösen oder adsorptiven Träger ermöglichen. Darüber hinaus bietet die Anwendung von Teilchen die Flexibilität eines chromatographischen Formats, wobei die Teilchen vom Analyten gebunden und vom Fluid über einen gewundenen oder nicht gewundenen Pfad in einen Immobilisierungs- oder Konzentrationsbereich für den Nachweis bewegt werden.
Anlagerungsschicht
Eine Vielfalt chemischer Modifizierungen der optisch funktionalen Schicht lässt sich mithilfe von Silanen und Siloxanen sowie verschiedenen Polymeren vornehmen. Diese können durch Abscheiden in der Gasphase, Aufsprühen oder Eintauchen aufgebracht werden. Lösungschemikalien können zur Einführung zusätzlicher Materialien auf der Oberfläche verwendet werden. Diese Materialien werden verwendet, um die Anhaftung oder Anlagerung des analytspezifischen Bindereagens an der optisch funktionalen Schicht zu fordern oder erhöhen oder, um eine Oberfläche für eine unspezifische Erfassung eines Analyten bereitzustellen. Im Fall einer unspezifischen Erfassung wird eine spezifische Identifikation des Analyten erzielt durch ein analytspezifisches Reagens, das den erfassten Analyten bindet. Wenn die Oberfläche modifizierende Latizes für das Binden der analytspezifischen Bindeschicht verwendet werden, liefern sie einen geringeren Beitrag zur gesamten optischen Oberfläche, werden aber als relevant bei der Gestaltung der gesamten Vorrichtung berücksichtigt. Demzufolge wird eine Schicht, vorzugsweise die Antireflexionsschicht, zur Kompensation von hinzugefügtem Material eingestellt.
Die Dicke der Anlagerungsschicht wird für jedes spezifische Erfassungsmolekül oder jeden spezifischen Analyten optimiert. Die Anlagerungsschicht wird keinen nennenswerten Einfluss auf die Kanäle haben. Die Dicke der Anlagerungsschicht wird weniger als das zehnfache der Antireflexionsschicht betragen. Die Metalle können auch dazu beitragen, schwach an die Antireflexionsschicht gebundene Moleküle zu stabilisieren.
Allerdings hat die Anlagerungsschicht selbst keine signifikante Bedeutung für die optischen Eigenschaften des Stapels. Auch die Anlagerungsschicht kann verändert werden, um einem visuellen oder instrumentierten Format zu entsprechen. Bei instrumentiertem Format kann die Morphologie der Anlagerungsschicht geregelt werden, um die Feinabstimmung der Reflexionseigenschaften zu erzielen, die für die beste Sensitivität und Selektivität erforderlich sind. Durch Verändern der Morphologie können die Absorptionseigenschaften des dünnen Films gesteuert werden.
Die Anlagerungsschicht muss Protein binden oder selbst eine gewisse Dickenänderung nach der Analyterfassung erfahren. Die Anlagerungsschicht muss keine besonderen physikalischen Eigenschaften aufweisen, da die Dicke und die Beschaffenheit dieser Schicht hohe Flexibilität bei der Gestaltung des Stapels bieten. Eine Reihe von Materialien eignet sich bestens für die Anlagerungsschichten. Darunter befinden sich die chemischen Modifikatoren wie Silane, Siloxane und Polymere. Darüber hinaus kann diamantartiger Kohlenstoff als eine hydrophobe Anlagerungsschicht dienen.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass eine anorganische Anlagerungsschicht für das analytspezifische Reagens bei diesen optischen Prüfvorrichtungen ausgezeichnet funktioniert. Materialien mit guter Funktion für diese Aufgabe umfassen Platin, Nickel, Gold, NiChrom (80 % Nickel, 20 % Chrom) und Bismutoxid mit einem Goldüberzug, wobei das Bismutoxid enthalten ist, um das Anhaften der Goldschicht zu unterstützen. Diese Materialien können durch Aufdampfen im Vakuum, Metallaufdampfung, Photoreduktion oder elektrochemische Reduktion eines Metalls auf der Oberfläche, wenn Halbleiter- oder Leitermaterialien als Antireflexionsschicht verwendet werden, angelagert werden. Beispiele für Halbleitermaterialien umfassen Titandioxid und Siliziumnitrid. Allerdings sind Indiumzinnoxid (ITO) und Zinnoxid repräsentative Materialien. Die bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung der Vakuumaufdampftechnik zum Auftragen der Metallschicht. Der Vorteil der Aufdampfung im Vakuum besteht darin, dass sie eine genauere Regelung der aufgetragenen Schichtdicke und eine schnelle Verarbeitung von Bahnmaterialien gestattet. Der Dickenbereich kann von Subnanometern bis zu 5 Nanometer betragen, ohne dass dies die Antireflexionsschicht oder Reflexionen nennenswert beeinflusst. Über 5 nm kann die Beschichtung mit Nickel, NiChrom und Platin erfolgen, wenn die darunter liegende Antireflexionsschicht am dünneren Ende ihres optimalen Dickenbereichs liegt, ohne dass dies den Antireflexionszustand nennenswert beeinflusst. Die dickeren Metallschichten verringern jedoch die reflektierte Intensität aufgrund von Absorption, und deshalb sollten sie so dünn wie möglich gehalten werden, während eine erhöhte Anhaftung von Biomolekülen unterstützt wird. Die Schicht sollte zwischen 10 und 100 Å dick sein. Darüber hinaus können Tempern und andere Behandlungen angewendet werden, um die Morphologie der anorganischen Anlagerungsschichten zu verändern.
Ein bevorzugtes Anlagern von spezifischen Erfassungsmolekülen gründet sich auf eine Interaktion der Moleküle mit einer Nickelschicht auf der Oberfläche der Antireflexionsbeschichtung. Die Nickelschicht weist eine Dicke von zwischen 1 und 10 nm auf. Das Anlagern der Nickelschicht wird bevorzugt durch Aufdampfen im Vakuum ausgeführt. Das Aufdampfen im Vakuum ermöglicht eine sehr genaue Steuerung der Dicke und ausgezeichnete Wiederholbarkeit von Lot zu Lot.
Filme, die aus Diamant oder diamantartigem Kohlenstoff (DLC) bestehen, eine Beschichtung, die viele Eigenschaften von Diamant und einige von Graphit aufweist, sind dem Fachmann bekannt. DLC wird benutzt, um eine Schicht zu beschreiben, die sich zusammensetzt aus einem gleichförmigen Film oder gepackten Teilchen, die aus (synthetischem oder natürlichem) Diamant, monokristallinem Diamant, Resin-bond-Diamant, polykristallinem Diamant, diamantartigem Kohlenstoff, amorphem Kohlenstoff mit diamantähnlichen Eigenschaften (Harte und Oberflächenenergie), amorphen hydrierten Kohlenstoffschichten (DLC) oder -filmen, nichtkristallinen bis kristallinen Kohlenstofffilmen mit diamantähnlichen Eigenschaften oder diamantartigem Material mit einer chemischen Zusammensetzung im Bereich von graphitartig bis Diamant bestehen. DLC ist extrem hart, chemisch beständig (inert), optisch transparent und besitzt die thermischen und reibungsarmen Eigenschaften von reinen Diamantbeschichtungen. DLC-Filme können in Bezug auf Härte und Zusammensetzung im Bereich von amorphem Kohlenstoff bis halbkristallinem diamantartigem Kohlenstoff bis Einzelkristalldiamant liegen. DLC-Film kann auf Trägern durch Verfahren wie chemische Gasabscheidung, Sputtering und Ionenstrahlauftragsverfahren, Plasmaverfahren, Ionenstrahlpistole, thermische Radiofrequenz und mikrowellengestützte Plasmaverfahren, Heizdrahtverfahren, Gleichstromplasmaverfahren, und Schocksynthese-Technik erzeugt werden.
Graphit besteht aus Ringstrukturen, die aus sp²-hybridisierten Kohlenstoffatomen gebildet werden. Diamant besteht aus kovalentgebundenen aliphatischen sp³-hybridisierten Kohlenstoffatomen. DLC weisen, abhängig vom Auftragsverfahren, variierende Mengen von sp²- und sp³-Eigenschaften auf. Einige DCL-Bindungen können in Wasserstoff terminiert sein. Die relative Menge der sp²- und sp³-Charaktere ist ausschlaggebend für die Gesamteigenschaften des Films. Die Eigenschaftsbestimmung des Films kann durch Kontaktwinkelmessungen (Messung der Hydrophobizität), Elektronenenergieverlust-Spektroskopie (EELS), Reflection High Energy Electron Diffraction (RHEED) und Fourier-Transformations-IR-Spektroskopie (FTIR) erfolgen. Kohlenstoff mit sp³-Hybridisierung hat einen Raman-Peak bei 1332 cm^–1, während Kohlenstoff mit sp²-Hybridisierung Peaks bei 1345 cm^–1 und 1540 cm^–1 hat. Ein Material, das eine Mischung der beiden Formen von Kohlenstoff ist, kann eine Kombination dieser Raman-Peaks aufweisen. Die Menge der sp²- und sp³-Charaktere ist auch ausschlaggebend für die Härte des Films. Ein Variieren der Menge Wasserstoff im Gas kann Einfluss haben auf die Elektronendichte, Härte und andere Eigenschaften des Films, einschließlich der Hydrophobizität des Films.
Der Fachmann versteht, dass die DLC-Beschichtung auf einer Vielfalt von Trägermaterialien aufgetragen werden kann, wie auf Silizium, mit Silizium beschichteten Trägern, Kunststoff, Kunststoff-Siliziumverbundwerkstoffen, Keramik, Metallen oder Verbundwerkstoffen, die aus einer Kombination dieser Materialien hergestellt sind. DLC können unter Niedrigtemperatur-(100 °C oder darunter) oder Hochtemperaturverhältnissen hergestellt werden. Die DLC-Beschichtung kann aus Methan, Olefingasen, Kohlenmonoxid, bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Wasserstoff hergestellt werden. Das Auftragverfahren bei kohlenstoffhaltigen Gasen kann, abhängig von Verfahrenstyp, Temperatur, Gaszusammensetzung, Menge kohlenstofffreiem Material und anderen Umsetzungsbedingungen, eine Vielfalt von DLC-Filmen ergeben.
Es ist festgestellt worden, dass DLC-Filme auf Silizium- oder Polycarbonat- oder anderer Fläche biologische Moleküle (Biomoleküle) wie Antikörper, Antigene, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Nukleinsäuren und andere Materialien stark festhalten können. Obwohl DLC-Beschichtungen durch eine Reihe von Verfahren (die alle für die vorliegende Erfindung geeignet sind) hergestellt worden sind, ist die Direktaufbringung durch die Anwendung von Ionenstrahltechniken das bevorzugte Verfahren für ein Bereitstellen von hydrierten DLC-Filmen für Anwendung als biologische Anlagerungsbeschichtungen. Die Filme können bei oder im Bereich von Raumtemperatur produziert werden, was, wie vorstehend bereits beschrieben, die Anwendung einer Vielfalt von Substratmaterialien ermöglicht.
DLC-Beschichtungen können hergestellt werden, indem man Methan durch eine induktiv geschaltete Radiofrequenz-Ionenpistole strömen lässt, wobei das Methan abgebaut wird, um einen hydrierten amorphen Diamantfilm zu bilden. Die Parameter und Materialien des Verfahrens werden die Oberflächeneigenschaften der beschichteten Fläche bestimmen.
Zusätzlich zu einem Verändern des Wasserstoffgehalts von DLC (hydriertem DLC) kann die Hydrophobizität von DLC durch Verändern der sp²/sp³-Eigenschaften verändert werden.
Die Härte der für die Zwecke einer Biomolekül-Anlagerung verwendeten DLC-Filme liegt typischerweise im Bereich von 15–50 GPA bei Messung mit einem Nanoindenter. Der Brechungsindex dieser Filme liegt typischerweise im Bereich von 1,5 bis 2,2 bei Messung mit einem Gaertner-Ellipsometer. Die Biomolekül-Anlagerung scheint gleichwertig über diesen Bereich von Materialhärte und Brechungsindex zu sein. Dennoch und ohne an eine Theorie gebunden zu sein wird allgemein angenommen, dass die amorphen, hydrierten, niedrigere Härte aufweisenden Kohlenstofffilme eine stärkere hydrophobe Eigenschaft aufweisen, während die höhere Härte aufweisenden Filme mehr elektronenreiche Plätze aufweisen, was auf das Vorliegen von mehr sp²-Charakter (C=C) auf der Oberfläche zurückzuführen ist.
Es wird angenommen, dass die hydrophobe Eigenschaft der primäre Mechanismus für die Anlagerung von Biomolekülen ist. Allerdings können die elektronenreichen Flächen gleichermaßen elektrostatische Interaktionen fördern. Es besteht die Möglichkeit, die Hydrophobizität und Elektronendichte der DLC-Oberfläche entsprechend dem Typ des zu immobilisierenden Biomoleküls maßzuschneidern. Dies kann auf Basis einer Analyse der sp²/sp³-Eigenschafen der Oberfläche und der charakteristischen Eigenschaften des Biomoleküls erfolgen. Je höher zum Beispiel der sp³-Charakter der DLC-Oberfläche ist, desto größer ist die Hydrophobizität, und je höher der sp²-Charakter ist, desto größer ist die Elektronendichte (elektrostatische Oberfläche). Dem Fachmann sind die Techniken zur Bestimmung der Hydrophobizität und Elektronendichte von Biomolekülen bekannt.
Alternativ kann die Oberfläche/das Biomolekül für optimale Retention des Biomoleküls empirisch angepasst werden. Für ein empirisches Anpassen einer DLC-Oberfläche und eines Biomoleküls wird eine Auswahl von DLC-Oberflächen erzeugt. Wenn das Molekül hydrophob ist, wird der DLC beschichtet, um Oberflächen von unterschiedlichem Hydrophobizitätsgrad zu liefern. Dem Fachmann sind Techniken für das Variieren von Parameter bekannt, wie Anlagerungsverfahren, Temperatur, Beschichtungszeit, Typ und Menge von kohlenstoffhaltigem Gas, Vorhandensein, Fehlen oder Menge von kohlenstofffreiem Gas und Gesamtkammerdruck, so dass DLC-Oberflächen erzeugt werden können, die hinsichtlich ihrer hydrophoben Eigenschaft variieren. Das Biomolekül wird für die verschiedenen Test-DLC-Oberflächen beschichtet mit einer Beschichtungslösung, die in Bezug auf gleiche Zusammensetzung, Ionenstärke, pH-Wert und Menge Biomoleküle die gleichen Werte aufweist. Die Beschichtung aller Oberflächen wird bei der gleichen Temperatur und während der gleichen Zeitdauer fortschreiten gelassen. Danach werden die Oberflächen gewaschen und getrocknet. Die Menge Biomoleküle, die auf den verschiedenen Oberflächenzusammensetzungen zurückgehalten wird, wird bestimmt. Falls ein Anti-Biomolekül verfügbar ist, kann dies zwecks Auswertung der Oberflächen mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert werden. Ein spezifisches Volumen einer Lösung des Anti-Biomolekül-Antikörperkonjugats wird auf jeder Test-DLC-Oberfläche für eine Zeitdauer aufgetragen und darauf folgen ein Wasch- und Trocknungsschritt. Danach wird eine Lösung mit löslichem TMB-Substrat auf den Test-DLC-Oberflächen aufgetragen, und für eine Zeitdauer inkubiert. Ein spezifisches Volumen der Lösung wird entnommen und in Mikrotiterplatten-Wells eingegeben, die eine voreingestellte Menge Stoplösung enthalten, wonach das Absorptionsvermögen gemessen wird. Das gemessene Absorptionsvermögen korreliert mit der Fähigkeit der DLC-Oberfläche, das Biomolekül zurückzuhalten.
Alternativ kann das Binden der Biomoleküle durch Messen des Kontaktwinkels der Oberfläche überwacht werden. Auf diese Weise kann die Veränderung beim Kontaktwinkel (vor und nach der Beschichtung mit Biomolekül) zur Erfassung der Menge zurückgehaltener Biomoleküle dienen. Andere Oberflächen-Analyse-Techniken wie FELS, FTIR und RHEED können auch dazu dienen, das Zurückalten des Biomoleküls auf der DLC-Oberfläche zu erfassen.
Eine ähnliche Herangehensweise wird angewendet, um DLC-Oberflächen variierender Elektronendichte für die elektrostatische Zurückhaltung von Biomolekülen zu erfassen. Dem Fachmann sind Techniken für das Variieren von Parameter bekannt, wie Anlagerungsverfahren, Temperatur, Beschichtungszeit, Typ und Menge von kohlenstoffhaltigem Gas, Vorhandensein, Fehlen oder Menge von kohlenstofffreiem Gas und Gesamtkammerdruck, so dass DLC-Oberflächen erzeugt werden können, die hinsichtlich ihrer Elektronendichte variieren.
Bei einigen Anwendungen kann es erwünscht sein, das Biomolekül auf der Oberfläche zu immobilisieren als Capture-Reagens, das in einer einschränkenden Menge vorhanden ist. Wiederum kann die Chemie der DLC-Filmoberfläche eingestellt werden, um die Menge des immobilisierten Capture-Reagens zu begrenzen.
Die Mindestdicke von DLC bei Beschichtung einer Oberfläche zur Verstärkung der Biomolekül-Anlagerung liegt erwiesenermaßen im Bereich 50–500 Å. Dies stellt jedoch nicht die obere Grenze dar. Eine sehr dünne Schicht von ungefähr 50 Å ist angemessen für die Bereitstellung einer Deckschicht mit DLC-Film, der Biomoleküle anheften wird. Dies ist besonders anwendbar, wenn der DLC mit einer Antireflexionsschicht in einer visuellen Prüfvorrichtung kombiniert ist. Indessen kann die obere Grenze noch viel höher sein, im Mikron-Bereich, bei Verfahren, die von einem Tracer für die Signalerzeugung abhängig sind. Die Oberflächen, die beschichtet werden können, umfassen einen breit gefächerten Bereich von Konfigurationen, was die Anhaftung von Biomolekülen auf diesen Oberflächen durch DLC ermöglicht. Somit kann DLC zur Immobilisierung von Biomolekülen in einer Vielfalt von Sensor-, Elektroden-, ELISA-, RIA- und anderen Bioassayformaten eingesetzt werden.
Wenn der DLC für sowohl eine Antireflexionsschicht als auch eine Anlagerungsschicht für eine optische Immunoassay-Vorrichtung verwendet werden soll, müssen die folgenden Kriterien erfüllt sein. Material, das für ein Interference-Assay anwendbar sein soll, muss einen Brechungsindex von annähernd 2,0 aufweisen. DLC hat einen Brechungsindex von 2 bis 3 im sichtbaren Lichtspektrum mit einer geringeren Komponente des komplexen Brechungsindex. Dies resultiert in einem besseren Lichtausgang und damit besserer Farberzeugung. Wenn der komplexe Index geringer ist, liegt eine geringere Absorption des einfallenden Lichts vor. Der DLC muss für einige Anwendungen optisch transparent sein. Eine Kombination einer DLC-Deckschicht mit einer eingestellten Schicht aus einem Antireflexionsfilm ist auch geeignet für die Erzeugung einer sichtbaren Störungswirkung. Eine mögliche Kombination wäre ein Film mit 450 Å, n_f = 2,2 aus Siliziumnitrid mit einer DLC-Deckschicht mit 50 Å und einem n_f = 1,7. Der Fachmann besitzt die Fähigkeit, andere geeignete Kombinationen von DLC-Deckschichten herzustellen.
Aufnahmeschicht
Beim analytspezifischen Bindereagens kann es sich um einen Chelaten, einen Antikörper, ein Antigen, einen Rezeptor, einen Liganden, ein Protein, eine Nukleinsäure, DNA, RNA, Enzyme, jedes biologische Molekül mit der Fähigkeit zur Bindung eines spezifischen Analyten oder analoge oder davon abgeleitete Stoffe und/oder eine Polymerschicht handeln.
Das Beschichten der Bindereagenzien erfolgt entweder durch Eintauchen des Substrats in einen Tank oder durch Aufsprühen des Reagens und Abspülen des Substrats. Punktbeschichtung, Inkjetbeschichtung, Airbrush oder andere Techniken können ebenfalls angewendet werden. Einmal beschichtete Reagenzien können, müssen aber nicht mit einer Stabilisierungsschicht für Lagerungszwecke überzogen werden.
Es ist möglich, einen unspezifischen Erfassungsmechanismus für den Nachweis von Analyt zu verwenden. In diesem Prüfformat kann der Analyt durch eine Anzahl von chemischen Interaktionen an der Oberfläche anhaften. Wenn der Analyt die optische Vorrichtung bindet, wird ein spezifisches Agens benutzt, um das Vorhandensein von Analyt (z. B. eines Antikörpers, der spezifisch für den Analyten ist, an dem ein zusätzliches Massen verstärkendes Material angelagert sein kann) nachzuweisen.
Polyester oder Polycarbonat, amorphes Silizium. Siliziumnitrid und Nickel
Ein spezifischer, Kanäle aufweisender Träger umfasst Polyester- oder Polycarbonatmaterial mit einer beliebigen Anzahl von Kanälen von einer Größe im Bereich 0,01 bis 14 Mikrometer. Die Kanaldichte der Oberfläche beträgt ungefähr 1 bis 15 % und sollte für optimale Leistung unter 15 % betragen. Dies verhindert eine Reduzierung des wirksamen Brechungsindex des Antireflexionsfilms aufgrund des Vorhandenseins von Kanälen. Der Kanäle aufweisende Träger wird mit amorphem Silizium im Dickenbereich von 300 Å bis 5000 Å beschichtet. Die Dicke und die Packungsdichte der optischen Basisschicht können zwecks einer Regelung der Reflexion von der Basisschicht eingestellt werden. Dies wiederum regelt die Gesamtreflexion und gestattet deren Optimierung für die individuelle Anwendung. Materialien für optische Beschichtung können konform mit dem Kanäle aufweisenden Träger sein. Dies ist weniger notwendig bei der Verwendung von amorphem Silizium. Der Kanäle aufweisende Träger muss relativ gleichförmig sein. Die Kanaldichte, auch wenn beliebig gewählt, muss bezogen auf den Flächeninhalt prozentual ungefähr gleich verbleiben.
Die Siliziumnitridschicht wird reaktiv auf der amorphen Siliziumschicht angelagert und kann eine Dicke im Bereich 30 bis 70 nm haben, die für optimalen Kontrast für eine spezifische Anwendung eingestellt werden kann. Ein Vorteil besteht bei der Anwendung der Gasphasenabscheidung der gegenwärtigen optischen Schichten darin, dass durch die Regelung von Reflexionsvermögen und Kontrast ebenso wie bei der Farbentwicklung jede Oberfläche für eine spezifische Anwendung maßgeschneidert werden kann. Die größten Unterschiede in der Oberflächenstruktur sind feststellbar bei einem Vergleich des Nachweisschemas von automatisierten und visuellen Versionen.
Viele Vorteile sind mit der Verwendung von amorphem Silizium für die Basisschicht in der Vorrichtung verbunden. Erstens hat amorphes Silizium einen höheren Brechungsindex als polykristallines Silizium. Zweitens lassen sich Filme aus amorphem Silizium aufgrund der höheren Adsorption in den sichtbaren Wellenlängen dünner herstellen. Drittens kann amorphes Silizium auf Trägern angelagert werden, die niedrige Temperatur aufweisen, wie solche aus Papier und Kunststoff, denn es ist keine Erhitzung der Oberfläche erforderlich, um amorphes Silizium zu formen. Außerdem besitzt amorphes Silizium ausgezeichnete Bindung und mechanische Stabilität im Vergleich zu anderen Materialien mit hohem Brechungsindex, Eine dünne Schicht aus Nickel ist für die Anlagerungsschicht zu bevorzugen, und zwar aus mehreren Gründen. Erstens haftet Nickel sehr gut auf den vorstehend umrissenen Antireflexionsschichten und besonders auf Siliziumnitrid. Darüber hinaus weist Nickel einen Brechungsindex von 1,78 auf, und obwohl der Extinktionskoeffizient 7,4 × 10⁵ beträgt, haben dünne Filme des Metalls keine deutliche Auswirkung auf das Reflexionsvermögen der Antireflexionsschicht. Die Verwendung von Nickel scheint die Gesamtdeckung von biologischen Molekülen über natives Siliziumnitrid hinaus zu erhöhen. Dies kann auf spezifischen Interaktionen wie Wasserstoffbindung, II-Rückbindung und die Bildung von Sulfidbindungen an das Metall beruhen.
Beispiele
Beispiel 1: Verwendung von absorbierendem Material zur Auswertung von Fließeigenschaften
Die Fließeigenschaften der 0,6, 1 und 5 μm dicken, Kanäle aufweisenden Polycarbonatträger zeigen die erwünschten Fließeigenschaften bei einer Unterschicht aus Celluloseacetat oder anderem fasrigem oder porösem, Dochtwirkung aufweisendem Material. Fließeigenschaften von Interesse sind der Volumenstrom durch und/oder über die Oberfläche, die Zurückhaltung von Fluid an der optischen Oberfläche und der gleichmäßige Fluss von Probenlösung über die gesamte Oberfläche. Der Volumenstrom sollte so gewählt werden, dass er bei einer Vorgabemenge von 160 bis 1000 μl Probe eine ausreichende Reaktionszeit ermöglicht. Optimales Fließen und Trocknen der Oberflächen liegen vor, wenn die hydrophilen, Kanäle aufweisenden Träger auf einer sehr dünnen hydrophoben Membran angeordnet werden, auf deren Rückseite ein weiteres, hydrophiles absorbierendes Material angeordnet ist, um einen Rückfluss von Probe beim Trocknen der Oberfläche zu verhindern. Der Trocknungsschritt, obwohl dieser Schritt nicht bei der Visualisierung des optischen Signals erforderlich ist, erzeugt ein Signal, das aufgrund des geringeren Brechungsindex von Luft gegenüber der Fluidmatrix (sofern die Matrix nicht ein Gas ist) leichter zu erfassen ist. Dies ergibt eine erhebliche Reduzierung der Gesamtprüfzeit.
Beispiel 2: Prüfzeitreduzierung im Vergleich mit Träger ohne Kanäle
Testoberflächen mit Reaktion auf das für Streptococcus Gruppe A spezifische Polysaccharid-Antigen wurden auf einem kanalfreien Träger (Silizium) und einem Kanäle aufweisenden Träger (Polycarbonat) eingerichtet. Die Siliziumprüfvorrichtung ist eine handelsübliche Vorrichtung. Der Kanäle aufweisende Träger hatte eine Kanalgröße von 1 μm, war aus Polycarbonat mit einer Beschichtung aus amorphem Silizium, worauf Siliziumnitrid folgte, und wurde danach mit DCDMS wie in Beispiel 3 silyliert. Nach der Silylierung wurde die Oberfläche mit Antikörper Anti-Strep A beschichtet, und es wurden Strep-A-OIA^®-Assays durchgeführt. Das Antigen wurde in einem 1-Minuten-Extraktionsschritt extrahiert. Das Extrakt wurde mit einem Reagens neutralisiert, das auch den konjugierten Anti-Strep-A-Antikörper mit HRP enthält, um eine Ausfällung eines einen massiven Film bildenden Enzymprodukts zu erhalten. Die gesamte Extraktionsmenge von 250 μl (es können auch mehr als 300 μl sein) wurde auf die Oberfläche der Kanäle aufweisenden Vorrichtung aufgebracht. Die Probengröße für die massive, kanalfreie Vorrichtung ist auf ungefähr 35 μl begrenzt. Die Probe floss durch die Oberfläche der Kanäle aufweisenden Vorrichtung in ungefähr 30 Sekunden, worauf 2 Waschungen während jeweils 10 Sekunden folgten. Die massive, kanalfreie Vorrichtung erfordert einen Inkubationsschritt von 2 Minuten, worauf ein einziger Waschvorgang während ungefähr 20 Sekunden folgt. Danach wurde das Enzymsubstrat für mindestens 1 Minute auf dem Kanäle aufweisenden optischen Träger aufgebracht, möglicherweise für so kurze Zeit wie 30 Sekunden (besonders bei höheren Antigenkonzentrationen). Die Vorrichtung wurde danach gewaschen und getrocknet, bevor die Visualisierung erfolgte. Die massive Vorrichtung erforderte eine Inkubation während 2 Minuten mit dem Enzymsubstrat vor dem Waschen, Trocknen und Auswerten. Die Gesamtreduktion der Prüfzeit mit dem Kanäle aufweisenden Träger im Vergleich mit dem massiven Träger beträgt 1,5 Minuten oder annähernd die Hälfte der Gesamtprüfzeit. Die Kanäle aufweisende Vorrichtung mit ihrem Massentransport/Laminarfluss der Probe ergab das gleiche Leistungsniveau, aber höhere Geschwindigkeit im Vergleich zu einer standardmäßigen Vorrichtung mit massivem optischem Träger.
Beispiel 3: Strep-A-OIA^®-Assay Vergleich
Ein Träger aus Polycarbonat mit 1 μm-Kanälen wurde mit einer optischen Basisschicht aus amorphem Silizium bis zu einer Dicke von 2000 Å überzogen. Als Antireflexionsschicht wurde Siliziumnitrid in einer Dicke von 420 Å aufgebracht, der Brechungsindex beträgt 2,0. Die optischen Schichten wurden im Ionenstrahl-Auftragverfahren bei Anwendung von Industrie-Standardparametern aufgebracht. Die Anlagerungsschicht bestand aus DCDMS, 2 % in 1,1,1-Trichlorethan, die auf dem wesentlichen Träger im Gasabscheidungsverfahren ohne Katalysator und während 10 Minuten bei Raumtemperatur aufgebracht wurde. Anti-Strep-A-Antikörper wurde durch Lösemittelbeschichtung auf der Vorrichtung aufgebracht für 10 Minuten bei 45 °C in einer 0,1 M HEPES, pH-Wert 8, 6 μg/l Antikörper enthaltenden Lösung. Die Vorrichtung wurde mit entionisiertem Wasser abgespült und sofort benutzt. Für die Prüfung mit dieser Vorrichtung wurden 360 μl vorextrahiertes Antigen Standard + 40 μl Konjugat verwendet. Die Mischung wurde auf der optischen Vorrichtung aufgebracht und für jedes Antigen Standard während 2 Minuten mit Differenzdruck (Vakuum) beaufschlagt, wonach 2 Wäschen mit jeweils ungefähr 100 μl Wasser durchgeführt wurden. Danach wurde Substrat für 4 Minuten aufgebracht, gefolgt vom vorstehend beschriebenen Waschvorgang. Das Trocknen bewirkte der Differenzdruck, und die sichtbaren Veränderungen wurden aufgezeichnet. Die Kanäle aufweisende Vorrichtung wies bei Auswertung mit dieser spezifischen Antigenzubereitung einen Cut-off-Level von 1:96000 mit einer 400-μl-Probe auf. Bei Anwendung einer massiven (kanalfreien) Trägervorrichtung wurde ein Cut-off-Level von 1:2400 für diese Antigenzubereitung erhalten. Somit wurde durch die Anwendung des Kanäle aufweisenden Trägers eine etwa 40-fache Steigerung der Sensitivität erhalten. Die Druckdifferenz diente lediglich zur Regelung des Flusses, um eine Anpassung der Zeiten im Strep-A-OIA^®-Assay (kanalfreier Träger) zu erhalten. Die Anwendung der Druckdifferenz ist nicht erforderlich, wenn die Vorrichtung inhärent einen Massentransport/Laminarfluss der Probe ermöglicht.
Bei einem anderen Versuch wurde eine 300-μl-Probe eines 1:2400 Antigen Standard mit Konjugat gemischt und auf einem Muster des Kanäle aufweisenden optischen Trägers aufgebracht und die gesamte Menge während 30 Sekunden unter Anwendung eines Druckdifferenzsystems durchgezogen. Drei aufeinander folgende Waschungen mit je 100 μl während jeweils 5 Sekunden wurden durchgeführt. Nach dem Abspülen wurde das Substrat während 1 Minute und 30 Sekunden aufgebracht. Eine Farbentwicklung konnte innerhalb einer Inkubationszeit von 30 Sekunden festgestellt werden. Eine abschließende Spülung von 200 μl wurde für 10 Sekunden durch den Kanäle aufweisenden optischen Träger passieren gelassen. Die Gesamtprüfzeit für den Kanäle aufweisenden Träger betrug 2 Minuten 25 Sekunden, was zu vergleichen ist mit 8 Minuten für den massiven Träger (bei einem Cut-off-Level von 1:2400). Gestützt auf diese Werte ermöglicht die Anwendung eines Kanäle aufweisenden Trägers eine Reduzierung der Prüfzeit auf 2 Minuten 25 Sekunden bei Beibehalten der vergleichbaren Sensitivität des massiven Trägersystems (Cut-Off-Level 1:2400), das nachweislich ausgezeichnete klinische Leistung erbringt.
Beispiel 4: Vergleich von DLC-beschichteten dünnen Filmen mit T-Polymer-Siloxan-beschichteten Dünnfilmen (nicht Bestandteil dieser Erfindung)
Silizium-Wafer wurden mit Siliziumnitrid und danach im einen Fall mit T-Polymer-Siloxan, wie in US-Patent Nr. 5468606 beschrieben, beschichtet. Der DLC wurde als 50-Å-Deckschicht aufgebracht. Eine Anzahl unterschiedlicher DLC-Beschichtungen wurde mit der T-Polymer-Oberfläche verglichen. Die verschiedenen DLC-Oberflächen-Lots, die bei diesem Beispiel ausgewertet worden sind, waren durch Ionenstrahlauftragsverfahren hergestellt worden. Die Auftragsverfahrensparameter wurden variiert, um geringfügig unterschiedliche DLC-Beschichtungen zu ergeben. Die Parameter, die variiert werden können, umfassen Temperatur, Auftragsdauer, Typ und Menge von kohlenstoffhaltigem Gas, Vorhandensein, Fehlen oder Menge von kohlenstofffreiem Gas und Gesamtkammerdruck. Dem Fachmann ist bekannt, wie diese und andere Parameter zum Verändern der Eigenschaften der DLC-Oberfläche variiert werden können. In diesem Beispiel wurde der DLC durch Direktionenstrahlauftrag unter Verwendung von Methan- und Argonmischungen mit Gleichstrom und induktiv gekoppelten Radiofrequenz-Ionenpistolen erzeugt. Das Methan wird im Plasma abgebaut und auf einer Oberfläche als hydrierter Diamantfilm angelagert. Die Filme wurden bei ungefähr 25 °C erzeugt. Die Temperatur des zu beschichtenden Trägers kann großen Einfluss auf die Härte und Hydrophobizität des erzeugten DLC haben.
Die Oberflächenenergie hydrierter amorpher Kohlenstofffilme kann mit der Hydrophobizität dieser Filme korreliert werden. Einn Kohlenstofffilm, der eine sehr hydrophile Oberfläche hat, weist einen Wasserkontaktwinkel von 60° und eine Oberflächenenergie von 49 erg/cm² auf, wogegen bei einer hydrophoben Oberfläche der Wasserkontaktwinkel 110° und die Oberflächenenergie 23–24 erg/cm² betragen.
Die in diesem und anderen Beispielen hergestellten Filme haben einen Wasserkontaktwinkel von 71° und eine Oberflächenenergie von 45 erg/cm². Bei den amorphen hydrierten Kohlenstofffilmen in diesem und den nachfolgenden Beispielen beträgt der einen Wasserstoffgehalt im Bereich 12–23 %.
Das Prüfverfahren umfasste Inkubation der Oberfläche mit einem Volumen von Probe, das entweder eine 1:1000, eine 1:500 oder ein negatives LPS-Antigen, abgeleitet von Chlamydia-Grundstoffen, enthielt. Sobald das LPS unspezifisch an der DLC- oder T-Polymer-Oberfläche anhaftete, wurde ein Anti-LPS-Antikörper-HRP-Konjugat auf der Oberfläche inkubieren gelassen und für 10 Minuten inkubiert. Danach wurden 100 μl des löslichen TMB-Substrats entfernt und in einen 100-μl-Mikrotiter-Well gegeben und das Absorptionsvermögen bei 450 nm aufgezeichnet. Dies ergibt einen semiquantitativen Vergleich der LPS-Erfassung zwischen der DLC-Beschichtung und der T-Polymer-Oberfläche. In 3 und 4 wird die Performance verschiedener DLC-Beschichtungen mit T-Polymer-Oberflächen verglichen; der abgesetzte Wert bezeichnet das Signalrauschen (negatives Probenergebnis). Bei LPS-Verdünnung 1:1000 ist das auf der DLC-Oberfläche erzeugte Signal vergleichbar mit oder in einigen Fällen höher als der entsprechende T-Polymer-Wert (siehe 3). Dies deutet darauf hin, dass die DLC-Oberfläche erfolgreich modifiziert werden kann, um die LPS-Bindung auf ein gewünschtes Niveau zu dampfen. Die Ergebnisse bei der LPS-Verdünnung 1:5000 sind ähnlich denen, die bei LPS-Verdünnung 1:1000 festgestellt worden waren, aber in einigen Fällen wurde das Niveau der Bindung an DLC markant verbessert (siehe 4). In anderen Fällen zeigte der DLC markant geringere Fähigkeit, LPS zu erfassen. Dies bestätigt erneut, dass sich der DLC für den gewünschten Grad von Biomolekülretention maßschneidern lässt.
Beispiel 5: Nachweis von Influenza-Virus A oder B auf DLC-Oberflächen (nicht Bestandteil dieser Erfindung)
Ein Silikon-Wafer wurde mit ungefähr 450 Å Siliziumnitrid und 50 Å DLC beschichtet, wobei ein Brechungsindex von 2,0 angestrebt war. Messungen der zusammengesetzten Filmdicke zeigen, dass der Wafer bis zu einer Dicke von 493,8 ± 8 Å beschichtet war und einen Brechungsindex von 2,058 ± 0,003 aufwies.

Monoklonale Antikörper zu sowohl Influenza A als auch Influenza B wurden als ein Spot von 5 μl verschiedener Antikörperkonzentrationen (jeder Spot enthielt gleiche Mengen jedes Antikörpers bei angegebener Konzentration) auf der DLC-Oberfläche aufgebracht, während 10 Minuten inkubiert, gewaschen und trocken geklopft. Danach wurden 15 μl des Konjugats (Anti-Influenza A oder B konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)) mit 75 μl verdünntem Virus A oder B von unterschiedlicher Konzentration (auf Basis des Verdünnungsvielfachen in Tab. 1) gemischt. Bei dem verwendeten Influenza-A-Stamm handelte es sich um Hongkong A (HK A) und bei dem verwendeten Influenza-B-Stamm um Panama B. Eine 10-μl-Probe dieser Mischung wurde auf der Oberfläche aufgebracht und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde von der Oberfläche abgespült und trocken geklopft. Danach wurde ein Tropfen HRP-Substrat für 5 Minuten aufgebracht, um die Bildung einer Ausfällung zu ermöglichen. Das Substrat wurde gewaschen und trocken geklopft. Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 1 hervor. Die Tabelle zeigt einen Vergleich der Menge auf der Oberfläche aufgetragenen Antikörpers mit einer negativen Steuerung von PBS und der Erfassung von HONGKONG (Influenza-A-Stamm) und PANAM (Influenza-B-Stamm) bei unterschiedlichen Verdünnungen der beiden Viren. Eine gute Erfassung bei beiden Influenza-Stämmen wurde mit einem Oberflächen-Antikörper-Spot von 5 μg (0,005 ml × 1 mg/l × 1000 μg/mg) erzielt. Tabelle 1

(Ab) Spot (mg/ml)	PBS	1/10 HK A Virus	1/10 PN B Virus	1/100 HK A Virus	1/100 PN B Virus	1/250 HK A Virus	1/250 PN B Virus	1/500 HK A Virus	1/500 PN B Virus
1	-	4+	4+	2+	2+	1+	1+	-	-
0,5	-	4+	4+	2+	2+	1+	1+	-	-
0,05	-	4+	4+	2+	2+	1+	1+	-	-
0,01	-	2+	2+	-	-	-	-	-	-
0,005	-	2+	2+	-	-	-	-	-	-

Beispiel 6: Nachweis eines Liganden auf einem Rezeptor mit Industriediamant-Beschichtung (nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung)
Ein Rezeptor wurde auf einer 0,2 Mikrometer dicken Schicht von Industriediamanten von Key Industrial Diamond Corporation immobilisiert. Der Rezeptor aus einer 1-mg/ml-Stammlösung auf den Diamanten aufgebracht: 100 μl Rezeptor wurden mit 10 μl Diamanten gemischt. Der Rezeptor konnte über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Eine 2-μl-Probe dieses Materials wurde auf der Oberfläche aufgebracht und 15 Minuten lang inkubiert. Der massive Träger wurde mit Wasser gewaschen und unter einem Stickstoffstrahl getrocknet. Dies ergab eine DLC/Rezeptor-beschichtete Oberfläche.
Zur Prüfung der Funktionalität der DLC/Rezeptor-beschichteten Oberfläche wurde eine 15-μl-Probe eines Liganden, der mit dem Rezeptor reagiert, aufgebracht und während 5 Minuten inkubiert. Der ungebundene Ligand wurde von der Oberfläche, die unter einem Stickstoffstrahl getrocknet worden war, abgespült. Danach wurde Anti-Ligand/HRP-Konjugat für 5 Minuten aufgebracht, worauf ein Spül-/Trocknungsschritt folgte. Die Ergebnisse wurden visuell abgelesen. Alle positiven Proben wurden nachgewiesen (Daten nicht angezeigt). Obwohl nicht optimiert, zeigt dieser Versuch, dass Industriediamanten für die Immobilisierung von Biomolekülen verwendet werden können, und dann kann eine Filmbeschichtung des immobilisierten Biomoleküls erzeugt werden.
Beispiel 7: Erfassen von DNA auf einer DLC-Oberfläche (nicht Bestandteil der Erfindung)
Ein biotinyliertes 14-mer wurde in entionisiertem Wasser auf 1 μmol/ml verdünnt. Ausgehend von dieser Konzentration wurde das 14-mer herunter auf 10 pmol/ml verdünnt. Eine 1-μl-Teilmenge von jeder Konzentration wurde auf der mit DLC beschichteten Siliziumnitrid/Polyesteroberfläche aufgebracht und während 30 Minuten trocknen gelassen. Jegliches ungebundenes 14-mer wurde mit Wasser von der Oberfläche abgewaschen, und die Oberfläche wurde getrocknet. Jeder DNA-Spot wurde mit 100 μl Anti-Biotin-HRP-Konjugat überdeckt und während 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach ein Abspül/Trocknungsschritt folgte. Der DNA-/Konjugat-Spot wurde danach mit ungefähr 100 μl eines fallenden TMB-Substrats überzogen und während 5 Minuten inkubiert. Danach wurde wiederum ein Abspül-/Trocknungsschritt durchgeführt. Eine positive Indikation der Erfassung von DNA auf der DLC-Oberfläche ist durch eine Farbveränderung im angewendeten DNA-Spot im Verhältnis zum optischen Hintergrund sichtbar gemacht. Dieser Versuch zeigte, dass 10 fmol DNA auf der DLC-Oberfläche immobilisiert und durch die fallende Enzymreaktion (Daten nicht angezeigt) sichtbar gemacht worden waren.
Beispiel 8: Nachweis von DNA/DNA-Hybrid auf DLC-Oberfläche (nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung)
Wie in früheren Beispielen wurde ein DLC/Siliziumnitrid/Polyester-Träger angewendet. Eine Teilmenge von 10 nmol biotyliniertem 14-mer wurde mit einer Teilmenge von 10 nmol eines komplementären 14-mers gemischt. Die Proben durften während 15 Minuten bei Raumtemperatur in 20 nM Tris, pH-Wert 7,5, 15 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl (endgültiges Volumen 22 μl) härten. Danach wurden 4 μl der Hybridisierungslösung entfernt und mit 1 μl S1-Nuklease, 22 μl Wasser und 3 μl S1-Puffer gemischt. Der Verdau von einzelsträngigen DNA konnte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stattfinden. Danach wurde 1 μl Probe des Hybrids auf der DLC-Oberfläche aufgebracht und trocknen gelassen. Die Oberfläche wurde gewaschen und getrocknet. Eine Probe des Anti-Biotin-Antikörper/HRP-Konjugats wurde aufgebracht und konnte während 10 Minuten inkubieren, worauf ein Wasch- und Trocknungsschritt folgte. Anschließend wurde eine Probe von HRP-Fällsubstrat auf der Oberfläche für 5 Minuten. aufgebracht. Diese Oberfläche wurde gewaschen, getrocknet und sichtbar gemacht. Mit diesem Verfahren wurden 60 pmol der biotinylierten Probe nachgewiesen (Daten nicht angezeigt). Kein Signal wurde beim Fehlen von Komplement- oder beider Proben erzeugt. Ein Signal hätte durch das Erfassen der biotinylierten Probe oder des Hybrids bei Fehlen von S1-Nuklease erzeugt werden können.
Beispiel 9: Kontrolle der DLC-Film-Hydrophobizität Oberfläche (nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung)

Zur Erhöhung der Hydrophobizität eines DLC-Films kann mehr sp³-Charakter in den Film eingebracht werden, oder die Menge hydrierten Kohlenstoffs im DLC-Film kann erhöht werden. In diesem Beispiel wurde die Menge hydrierten Kohlenstoffs im DLC-Film erhöht. Ionenstrahlbeschichtung ist eines von vielen Beschichtungsverfahren, das eingesetzt werden kann. Ein Mittelpunkt-Beschichtungsprotokoll. das hydrierten, amorphen DLC mit 25 Å/min anlagert, enthält folgende Einstellungen:

PARAMETER	EINSTELLUNG
R_f Durchlassleistung	300 W
R_f Sperrleistung	0 W
Strahlenspannung	100 mA
Beschleunigerspannung	200 V
Strom	8,2 mA, konstant
Gittertemperatur	170 °C
Plattentemperatur	85–90 °C
Durchflussmenge (CH₄)	40 sccm*
Quelle	8 cm – off

* Standardkubikzentimeter/min

Variationen der Hydrophobizität des DLC-Films lassen sich durch Variieren von Rf Durchlassleistung in 50-W-Schritten und Variieren der CH₄-Durchflussmenge, so dass eine Rf Sperrleistung von Null beibehalten wird, vornehmen. Alle anderen Parameter werden konstant innerhalb der normalen Einschränkungen in der Beschichtungskammer gehalten. Zur Erzeugung eines stärker graphitähnlichen DLC kann das Gas auf eine Mischung von CH₄ und CH₂CH₂ oder auf reines CH₂CH₂ umgestellt werden. Eine Änderung des Verhältnisses zwischen den beiden Gasen unter Anwendung der vorstehend aufgelisteten Parametereinstellungen würde eine Auswahl von DLC-Filmen ergeben, die in Bezug auf die Hydrophobizität variieren. Für ein reines CH₂CH₂-Gas können die oben angegebenen Parameter ebenfalls benutzt werden. Der Fachmann versteht, dass die anderen Beschichtungsverfahren so modifiziert werden können, dass eine Auswahl von DLC erzeugt werden kann und, auf Basis der vorstehenden Diskussion der Ionenstrahlbeschichtung, solche Modifikationen bei anderen Beschichtungsverfahren, wie chemische Gasphasenabscheidung, Plasmaabscheidung usw., vorgenommen werden können.

Claims

Optische Prüfvorrichtung zum Nachweis eines Analyten von Interesse in einer Probe, wobei die Prüfvorrichtung Folgendes umfasst: einen Träger, der Kanäle enthält, oder einen porösen Träger, eine optisch funktionale Schicht, die Kanäle enthält und auf dem Träger angeordnet ist, wobei die optisch funktionale Schicht eine optische Eigenschaft aufweist, die bei einer Veränderung der Masse auf der optisch funktionalen Schicht, die mit der Analytbindung zusammenhängt, nachweisbar modifiziert wird, wobei die Kanäle in der optisch funktionalen Schicht derart angeordnet sind, dass sie einen Fluidfluss von der optisch funktionalen Schicht zu dem Träger entweder durch die Kanäle in dem Träger, der Kanäle enthält, oder über Poren in dem porösen Träger ermöglichen, und wobei die Vorrichtung einen Laminarfluss einer Probe durch Schichten der Vorrichtung bereitstellt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin eine Anlagerungsschicht umfasst, die Kanäle enthält und auf der optisch funktionalen Schicht angeordnet ist, wobei Kanäle in der Anlagerungsschicht und der optisch funktionalen Schicht derart angeordnet sind, dass sie einen Fluidfluss von der Anlagerungsschicht zu dem Träger entweder durch die Kanäle in dem Träger, der Kanäle enthält, oder über Poren in dem porösen Träger ermöglichen.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei die Anlagerungsschicht eine unspezifische Erfassung des Analyten bereitstellt.
Vorrichtung nach Anspruch 2, die weiterhin eine analytspezifische Aufnahmeschicht umfasst, die Kanäle enthält und auf der Anlagerungsschicht angeordnet ist, wobei Kanäle in der analytspezifischen Aufnahmeschicht derart angeordnet sind, dass sie einen Fluidfluss von der analytspezifischen Aufnahmeschicht, der Anlagerungsschicht und der optisch funktionalen Schicht zu dem Träger entweder durch die Kanäle in dem Träger, der Kanäle enthält, oder über Poren in dem porösen Träger ermöglichen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger ein poröser Träger ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger ein poröser Träger ist und "wobei die optisch funktionale Schicht, die Kanäle enthält, separate, optisch funktionale Teilchen umfasst, die in dem porösen Träger eingebettet sind und derart eingerichtet und angeordnet sind, dass sie Kanäle durch die optisch funktionale Schicht zu dem porösen Träger bereitstellen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die optisch funktionale Schicht weiterhin eine Antireflexionsschicht umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Anlagerungsschicht Nickel ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Vorrichtung weiterhin ein absorbierendes Material umfasst, das die optisch funktionale Schicht umgibt oder unter dem Träger angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Träger Polyester oder Polycarbonat umfasst, die optisch funktionale Schicht eine Schicht aus Siliziumnitrid umfasst, die auf einer Schicht aus amorphem Silizium angeordnet ist, und die Anlagerungsschicht Nickel umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Träger Polyester oder Polycarbonat umfasst und die optisch funktionale Schicht eine Schicht aus Germanium umfasst, auf der einer Schicht aus diamantartigem Kohlenstoff angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die optisch funktionale Schicht eine Schicht aus Germanium umfasst, auf der einer Schicht aus diamantartigem Kohlenstoff angeordnet ist, und die Anlagerungsschicht Nickel umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die optisch funktionale Schicht eine Schicht aus Siliziumnitrid umfasst, die auf einer Schicht aus amorphem Silizium angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 13, wobei die Anlagerungsschicht diamantartigen Kohlenstoff umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Rezeptoren, Liganden, Chelaten, Proteinen, Enzymen, Nukleinsäuren, DNA, RNA, Pestiziden, Herbiziden, anorganischen oder organischen Verbindungen ausgewählt ist.
Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens oder der Menge eines Analyten in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, (b) Aufbringen einer Probe auf die Oberfläche der Vorrichtung, so dass die Probe durch Laminarfluss durch oder über die Schichten der Vorrichtung gezogen wird, und wobei der Analyt an die Oberfläche der Vorrichtung bindet, wodurch eine Massenveränderung auf der Oberfläche der Vorrichtung bewirkt wird, wobei die optisch funktionale Schicht eine optische Eigenschaft aufweist, die bei einer Veränderung der Masse, die mit der Analytbindung an der Oberfläche zusammenhängt, nachweisbar modifiziert wird, wodurch das Vorliegen oder die Menge des Analyten in der Probe angezeigt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Vorrichtung nach Anspruch 3 bereitgestellt wird und wobei der Analyt an die Anlagerungsschicht bindet und wobei die Massenveränderung weiterhin durch Bereitstellen eines analytspezifischen Bindungsreagens, das den Analyten bindet, der an die Anlagerungsschicht gebunden ist, bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Vorrichtung nach Anspruch 4 bereitgestellt wird und wobei der Analyt an die analytspezifische Aufnahmeschicht bindet, wodurch die Massenveränderung bewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei der Träger Kanäle enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei der Träger porös ist und die optisch funktionale Schicht Kanäle enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei der Träger porös ist und die Kanäle der optisch funktionalen Schicht separate, optisch funktionale Teilchen umfasst, die in dem Träger eingebettet sind, so dass die optisch funktionale Schicht und der Träger Laminarfluss der Probe durch Schichten der Vorrichtung ermöglichen.