JP2004117345A - マス輸送補助光学アッセイのための方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 興味の対象である分析対象物のアッセイを行うことができる表面を含む支持体であって、支持体表面上にダイヤモンド様炭素を含む付着層を含み、付着層は、アッセイにおいて分析対象物をダイヤモンド様炭素に直接結合させることにより検出するために、興味の対象である分析対象物の捕捉に適合されていることを特徴とする支持体が開示される。
【選択図】 なし
Description
一定の範囲の材料が、溝含有支持体の製造に適している。それらには、酢酸セルロース、PETE、ポリエステル、ポリカーボネート、ガラス粒子、シリカ粒子、TiO2粒子、金属及び非金属粒子、織られたか又は織られていない材料、ナイロン、濾紙、メンブラン、ポリスルホン、多孔質ガラス、ポリプロピレン、ポリウレタン又はあらゆるポリマー、プラスチック、及び金属又は非金属が含まれる。支持体は、最終装置中のマス輸送/層流を可能にするために要求される非常に限定された分布と大きさの溝を(表面配置を横切るか又はその上を越える流れの中に)提供しなければならない。
光学的機能層は基本層からなり、AR層からなることもできる。
多数の光学的機能層の化学的修飾を、シラン、シロキサン及び各種ポリマーによって行うことができる。これらは、蒸気相中で堆積させても、噴霧しても、浸漬させてもよい。溶液化学を用いて追加材料を表面に導入してもよい。これら材料は、光学的機能層への分析対象物特異的結合試薬の接着又は付着を促進し且つ増強するか、又は分析対象物の非特異的捕捉のための表面を提供するのに用いられる。非特異的捕捉の場合、分析対象物の特異的識別は、捕捉される分析対象物を結合する分析対象物特異的試薬で達成される。表面修飾剤ラテックスを用いて分析対象物特異的結合層を結合するときは、それらは、光学的表面全体に僅かしか寄与しないが、装置全体の設計には関係すると考えられる。したがって、添加された材料を補償するために、一つの層、好ましくは、AR層を調整する。
分析対象物特異的結合試薬は、キレート化剤、抗体、抗原、レセプター、リガンド、タンパク質、核酸、DNA、RNA、酵素、具体的分析対象物と結合できる何等かの生体分子、又はそれらの類似体若しくは誘導体、及び/又はポリマー層であることができる。
具体的な溝含有支持体には、0.01〜14マイクロメートルの大きさのランダム溝を有するポリエステル又はポリカーボネート材料が含まれるであろう。表面の溝密度は約1〜15%であるが、最適性能のために15%未満で保持されるべきである。これは、溝の存在のためにARフィルムの有効な屈折率の低下を妨げる。溝付き支持体は、非晶質ケイ素で300Å〜5000Åの厚さ範囲でコートされるであろう。基本光学層の厚さ及び充填密度は、その基本層からの反射能をコントロールするために調節することができる。これは、引続き全反射能を制御し、そしてそれを個々の用途に最適にさせるであろう。光学コーティング材料は、溝付き支持体に一致していてもよい。これは、非晶質ケイ素を用いる場合にはあまり必要でない。溝付き支持体は、比較的均一でなければならない。溝密度は、ランダムではあるが、表面積あたりほぼ同じ百分位数のままでなければならない。
0.6μm、1μm及び5μmの溝付きポリカーボネート支持体の流れ特性は、セルロースアセテート又は他の繊維状若しくは多孔質吸上材料で裏打ちされた場合に所望の流れ特性を示す。目的の流れ特性は、表面を貫き及び/又は横切る流量、光学的表面での流体の保持、及び表面全体にわたるサンプル溶液の均一流動である。流量は、160〜1000μlのサンプルを用いると仮定して、充分な反応時間を許すように選択されるべきである。表面の最適流動及び乾燥は、親水性溝付き支持体が、表面乾燥時にサンプルの逆流を防止するように別の親水性吸収材料で裏打ちされている極めて薄い疎水性メンブランで裏打ちされている場合に得られる。乾燥工程は、光学シグナルの可視化において必要な工程ではないが、流動マトリックス(そのマトリックスが気体でなければであるが)と比較して低指数の空気によって一層容易に評価されるシグナルを生じる。これは、全アッセイ時間をかなり減少させる。
A群連鎖球菌に特異的な多糖類抗原に反応性の試験表面を、溝不含支持体(ケイ素)及び溝付き支持体(ポリカーボネート)上に製造した。ケイ素試験装置は、商業的に入手可能な装置である。溝付き支持体は、非晶質ケイ素の後に窒化ケイ素でコートされた後、実施例3におけるようにDCDMSでシリル化された1μm溝寸法のポリカーボネートであった。シリル化したら、その表面を抗Strep A 抗体でコーティングし、そして修飾STREP A OIARアッセイを実施した。抗原は、1分間抽出工程で抽出した。その抽出を、固体フィルム形成性酵素産物の沈澱のためにHRPとの結合抗Strep A抗体も含有する試薬で中和した。全抽出量250μl(しかし、300μlを越えることがありうる)を、溝付き装置の表面に与えた。固体溝不含装置のサンプルサイズは、約35μlに制限される。サンプルは、溝装置の表面を通って約30秒で流れた後、各10秒間の2回の洗浄を施された。固体溝不含装置は、2分間のインキュベーション工程の後、約20秒間の洗浄を1回必要とする。次に、酵素基質を溝含有光学支持体に少なくとも1分間、潜在的には30秒程度もの短時間で(特に、より高い抗原濃度において)与えた。次に、可視化の前に装置を洗浄して乾燥させた。固体装置は、洗浄、乾燥及び解釈の前に、酵素基質と一緒に2分間のインキュベーションを必要とした。固体支持体に対する溝付き支持体での全アッセイ時間減少は1.5分間又は全アッセイ時間の約半分である。マス輸送/サンプルの層流を伴う溝含有装置で、同様の性能レベルが得られたが、標準的な固体光学支持体装置と比較して速度を増加させた。
1μm溝を含むポリカーボネートの支持体を、非晶質ケイ素の基本光学層で2000Åの厚さまでコーティングした。AR層は、420Åの厚さまでコーティングされた窒化ケイ素であったが、屈折率は2.0である。光学層は、工業用標準パラメータを用いるイオンビーム堆積によって適用された。付着層は、触媒を用いることなく室温で10分間の堆積法を用いて本質的に支持体上にコーティングされた1,1,1−トリクロロエタン中2%DCDMSであった。抗Strep A抗体は、装置をコーティングする溶液によって、0.1M HEPES、pH8.0、6μg/mlの抗体を含有する溶液中において45℃で2時間加えられた。装置を脱イオン水で洗い、そして直ちに用いた。この装置のアッセイは、360μlの予め抽出された抗原標準及び40μlの結合体を用いた。その混合物を光学装置に加え、そして差圧(真空)を各抗原標準に2分間加えた後、それぞれ約100μlの水で2回洗浄を行った。次に、基体(substrate)を4分間加えた後、上記洗浄手順を行った。乾燥は差圧によって行われ、その可視変化を記録した。この特異的抗原標品で評価された場合の溝含有装置は、400μlサンプルで1:96000の分画レベルを示した。固体(溝不含)支持体装置の使用は、この抗原標品に関して1:2400の分画レベルを与えた。したがって、約40倍の感度の増加が溝含有支持体の使用によって得られる。差圧は、STREP A OIAR アッセイで時間を合わせるように流れを制御することにのみ用いられた(溝不含支持体)。この装置は、本来的にサンプルのマス輸送/層流を可能にするので、差圧の使用を必要としない。
シリコンウェファーを、米国特許第5,468,606号で記載のように、窒化ケイ素でコーティングした後、T−ポリマーシロキサンでもコーティングした。DLCを50Åキャップとして加えた。多数の異なったDLCコーティングをT−ポリマー表面と比較した。この実施例で評価された各種DLC表面ロットは、イオンビーム蒸着によって製造した。蒸着処理パラメーターは、僅かに異なったDLCコーティングを製造するように変更した。変更できるパラメーターには、温度、コーティング時間、炭素含有ガスの種類及び量、存在する非炭素ガスの存在、不存在又は量、及び全室圧が含まれる。当業者は、これら及び他のパラメーターを変更してDLC表面の特性を変化させる方法を知っている。この実施例において、DLCは、メタン及びアルゴン混合物をDC中で用いる直接イオンビーム蒸着によって製造し、そして誘導的にRfイオンガンを結合させた。メタンはプラズマ中で分解され、水素化非晶質ダイヤモンドフィルムとして表面上に蒸着する。フィルムは約25℃で製造された。コーティングされている基体の温度は、作成されたDLCの硬度及び疎水性に強く影響を与えることもありうる。
シリコンウェファーを、約450Å窒化ケイ素及び2.0の目標の屈折率を有する50ÅのDLCでコーティングした。複合フィルム厚さの測定値は、ウェファーが493.8±5.8Åの厚さまで、2.058±0.003の屈折率でコーティングされたことを示す。
Key Industrial Diamond Corporationからの0.2ミクロン工業用銘柄ダイヤモンド上にレセプターを固定した。そのレセプターを1mg/ml原液からダイヤモンド上にコーティングし、100μL容量のレセプターを10μLのダイヤモンドと混合した。レセプターを室温で一晩インキュベートした。この材料からのサンプル2μLを表面に加え、そして15分間インキュベートした。固体支持体を水で洗浄し、そして窒素流下で乾燥させた。これは、DLC/レセプターコーテッド表面を生じた。
ビオチニル化された14マーを、脱イオン水で1μモル/mLまで希釈した。その原液から、14マーを10pモル/mLまで更に希釈した。各希釈のアリコート1μLを、DLCコーテッド窒化ケイ素/ポリエステル表面に与え、そして30分間乾燥させた。非結合14マーは全て、水で表面から洗浄し、その表面を乾燥させた。各DNAスポットを、100μLの抗ビオチン−HRP結合体でコートし、そして室温で10分間インキュベートした後、洗浄/乾燥工程を行った。次に、DNA/結合体スポットを約100μLの沈澱性TMB基でコートし、そして5分間インキュベートした。再度、洗浄/乾燥工程を行った。DLC表面上へのDNAの捕捉の正指標は、加えられたDNAスポットの光学的バックグラウンドに相対的な変色によって可視化される。この実験は、10fモルのDNAがDLC表面上に固定され、そして沈澱酵素反応によって可視化されたことを示した(データは示されていない)。
前の実施例の場合と同様、DLC/窒化ケイ素/ポリエステル支持体を用いた。ビオチニル化された14マーの10nモルアリコートと混合した。プローブを、20mM Tris、pH7.5、15mM MgCl2及び50mM NaCl(最終容量22μL)中において室温で15分間アニーリングさせた。次に、ハイブリダイゼーション溶液4μLを取出し、そして1μLのS1ヌクレアーゼ、22μLの水及び3μlのS1緩衝液と混合した。一本鎖DNAの消化を、室温で15分間進行させた。次に、ハイブリッドのサンプル1μlをDLC表面に与え、乾燥させた。その表面を洗浄し乾燥させた。抗ビオチン抗体/HRP結合体のサンプルを加え、10分間インキュベートした後、洗浄及び乾燥工程を行った。次に、HRP沈澱基質のサンプルを表面に5分間与えた。その表面を洗浄し、乾燥させ、そして可視化した。この技法で、60pモルのビオチニル化プローブを検出した(データは示されていない)。補体又は両プローブの不存在下においてシグナルは生じなかった。シグナルは、S1ヌクレアーゼの不存在下におけるビオチニル化プローブ又はハイブリッドの捕捉によって生じうると考えられる。
DLCフィルムの疎水性をもっと増加させるために、sp3特性をフィルム中に導入することができるし又はDLCフィルム中の水素化炭素の量を増加させることができる。この実施例では、DLCフィルム中の水素化炭素の量を増加させた。イオンビーム蒸着は、用いることができる多数のコーティング法の一つである。水素化非晶質DLCを25Å/分で蒸着する中間コーティングプロトコルは、次の設定を包含する。
Claims (32)
- 興味の対象である分析対象物のアッセイを行うことができる表面を含む支持体であって、
支持体表面上にダイヤモンド様炭素を含む付着層を含み、付着層は、アッセイにおいて分析対象物をダイヤモンド様炭素に直接結合させることにより検出するために、興味の対象である分析対象物の捕捉に適合されていることを特徴とする支持体。 - 付着層が約50Å−約3000Åの厚さのダイヤモンド様炭素の層を含む、請求項1記載の支持体。
- 付着層の疎水性の度合いが、ダイヤモンド様炭素のあらかじめ選択されたsp2およびsp3特性から生ずる、請求項1記載の支持体。
- ダイヤモンド様炭素が、抗反射層として機能するような形状とされている、請求項1記載の支持体。
- 支持体が、支持体表面と付着層との間に挟まれた光学的機能層をさらに含む、請求項1記載の支持体。
- 支持体が、1又はそれ以上の光の波長を減衰させることができる分析対象物が結合すると光学的厚みの変化を与える、請求項1記載の支持体。
- 支持体が、支持体を通るかこれを横切る層流を与える、請求項1記載の支持体。
- 付着層が、合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、工業ダイヤモンド、単結晶ダイヤモンド、樹脂型ダイヤモンド、多結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様の硬度および表面エネルギー特性を有する非晶質炭素、非晶質水素化ダイヤモンド様炭素、およびダイヤモンド様の硬度および表面エネルギー特性を有する非結晶ないし結晶炭素フィルムからなる群より選択される形のダイヤモンド様炭素を含む、請求項1記載の支持体。
- ダイヤモンド様炭素が非炭素材料を含む、請求項1記載の支持体。
- 非炭素材料が、水素、ケイ素、および窒素からなる群より選択される、請求項9記載の支持体。
- 支持体が高温に適合性ではない材料を含む、請求項1記載の支持体。
- 前記高温が100℃より高い、請求項11記載の支持体。
- 高温に適合性ではない材料が、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート(PETE)、ポリエステル、ポリカーボネート、ナイロン、濾紙、ポリスルホン、ポリプロピレン、およびポリウレタンからなる群より選択される、請求項11記載の支持体。
- ダイヤモンド様炭素が約15−約50Gpaの硬度を有する、請求項11記載の支持体。
- 付着層が、約1.5−約2.2の反射率を有する、請求項11記載の支持体。
- 前記支持体がバイオセンサーである、請求項1記載の支持体。
- 興味の対象である分析対象物のアッセイを行うことができる表面を含む支持体であって、
支持体表面上に約50Å−約500Åの厚さのダイヤモンド様炭素の層を含む付着層を含み、前記付着層は、前記分析対象物を捕捉分子に結合させることにより前記分析対象物を特異的に捕捉するための、前記ダイヤモンド様炭素に結合した捕捉分子を含むことを特徴とする支持体。 - 前記捕捉分子が、抗原、抗体、レセプター、核酸、RNA、DNA、多糖類、リポ多糖類、酵素、タンパク質、微生物、ハプテン、薬物、リガンド、およびキレート化剤からなる群より選択される、請求項17記載の支持体。
- 付着層の疎水性の度合いが、ダイヤモンド様炭素のあらかじめ選択されたsp2およびsp3特性から生ずる、請求項17記載の支持体。
- 前記ダイヤモンド様炭素が抗反射層である、請求項17記載の支持体。
- 前記支持体が、前記表面と前記付着層との間に挟まれた光学的機能層をさらに含む、請求項17記載の支持体。
- 前記支持体が、1又はそれ以上の光の波長を減衰させることができる分析対象物が結合すると光学的厚みの変化を与える、請求項17記載の支持体。
- 前記支持体が、前記支持体を通るかこれを横切る層流を与える、請求項17記載の支持体。
- 前記付着層が、合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、工業ダイヤモンド、単結晶ダイヤモンド、樹脂型ダイヤモンド、多結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様の硬度および表面エネルギー特性を有する非晶質炭素、非晶質水素化ダイヤモンド様炭素、およびダイヤモンド様の硬度および表面エネルギー特性を有する非結晶ないし結晶炭素フィルムからなる群より選択される形のダイヤモンド様炭素を含む、請求項17記載の支持体。
- ダイヤモンド様炭素が非炭素材料を含む、請求項17記載の支持体。
- 非炭素材料が、水素、ケイ素、および窒素からなる群より選択される、請求項25記載の支持体。
- 支持体が高温に適合しない材料を含む、請求項17記載の支持体。
- 前記高温が100℃より高い、請求項27記載の支持体。
- 高温に適合しない材料が、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート(PETE)、ポリエステル、ポリカーボネート、ナイロン、濾紙、ポリスルホン、ポリプロピレン、およびポリウレタンからなる群より選択される、請求項27記載の支持体。
- ダイヤモンド様炭素が、約15−約50Gpaの硬度を有する、請求項27記載の支持体。
- 付着層が約1.5−約2.2の屈折率を有する、請求項27記載の支持体。
- 前記支持体がバイオセンサーである、請求項17記載の支持体。
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