JP4360265B2 - 生化学測定チップおよび測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、光学薄膜を利用した生化学センサ、センサの部材およびこれを利用した測定装置に関する。

従来、抗原抗体反応などの生化学物質間の結合の測定は、一般的に、放射性物質や蛍光体などの標識を用いることで行われてきた。この標識には手間がかかり、特にタンパク質への標識は方法が煩雑な場合や標識によりタンパク質の性質が変化する場合があった。
そこで、生化学物質間の結合を簡便に標識を用いることなく直接的に測定する方法として、光学薄膜の干渉色変化を利用した生化学センサは知られている。この生化学センサは、Ｓａｎｄｓｔｒｏｍらの論文（例えば非特許文献１）に述べられている。その例を図１のモデルを用いて説明する。基板１上に光学薄膜２を設ける。空気の屈折率は１．００であり、光学薄膜２が屈折率１．５０の材料であり、基板の屈折率は２．２５のものを用いている。光学薄膜の厚さを、可視光の波長λ_０の４分の１またはその奇数倍（３／４λ_０、５／４λ_０など）の光学的長さとしておくと、光学薄膜は反射防止膜として働き、図２の反射スペクトルＡのように、波長λ_０で光学薄膜に垂直方向の反射光の強度が０となる。これにより、センサが干渉色を生じる。

この光学薄膜２の上に、第１の生化学物質３の単分子層を設ける。生化学物質をタンパク質とすると、屈折率は１．５程度、層の厚さは１０ｎｍ程度である。これにより、光にとっては光学薄膜が厚くなったことになり、反射スペクトルが図２の実線Ａから点線Ａ'のように変化し、干渉色が変化する。この第１の生化学物質３に第２の生化学物質４が生化学的に結合すると、更に膜厚が厚くなることになり、図２の点線Ａ'から破線Ａ''の変化が生じ、干渉色が変化する。これにより、第２の生化学物質の結合が検出される。一般的な検出の手順は、まず基板１上の光学薄膜２を第１の生化学物質の単分子層３で覆ったものを準備する。これを第２の生化学物質の溶液の中に入れる。その後、溶液から取りだし、乾燥した後、図２の点線Ａ'から破線Ａ''への干渉色の変化を調べる。

また基板１の材料として、光吸収性の材料、例えばシリコンを用いることで、基板の裏面で生じる光反射を抑制できることが述べられている。シリコン基板に対しては、光学薄膜として一酸化シリコンを蒸着し、また、最表層を一酸化シリコンの自然酸化により得られる厚さ２から３ｎｍの二酸化シリコンとすることで化学的に安定な膜としている。このように従来は、光吸収性の基板上に設けられた光学薄膜を利用した生化学センサにおいては、センサを空気中に取り出して乾燥した後、干渉色を測定するものであった。
また、特許文献１には、積層体を用いた化学物質の検出等が記載されている。ここでは、ケイ素からなる担体の表面にＳｉＯ_２層を存在させ、反射を減少させる被覆が設けることが記載されている。

T．Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，ＡＰＰＬ．ＯＰＴ．，２４，４７２，１９８５

特開昭58-195142号公報

しかしながら、上記論文に記載されたセンサで、検出するためには、一旦空気中に取り出して乾燥後に干渉色を測定するため、乾燥工程の時間がかかり、高スループット化が望めないという問題がある。
また、反応開始後所定の時間経過後に測定を行うため、所定の時間の設定の仕方によっては、反応が飽和する前に空気中に取り出してしまうことも有るため、必ずしも精度のよい測定が行えない。一方で、反応が十分に飽和した後に測定するべく、所定の時間を長時間に設定した場合には、反応が飽和した後もセンサが溶液中に浸されているため、時間的効率が悪い。

一方、センサの耐薬品性に関しては、センサに付着する有機物の除去にはアルカリ洗浄が有効な方法であり、さらに、第１の生化学物質のセンサ表面への固定化およびセンサ表面への非特異的な分子の吸着を防ぐための表面改質を行うときに、アルカリ溶液にセンサチップを浸ける場合もあり、アルカリに対する耐性が重要である。しかしながら、シリコン基板はアルカリ水溶液に対して耐性が悪く、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で気泡を発しながら溶ける。また、上記論文に記載の光学薄膜の最上層の二酸化シリコンもアルカリに対して耐性が十分ではない。
本発明の目的は、アルカリに対する耐性が良く、高スループットで生化学物質の結合を測定できる、光吸収性の基板上の光学薄膜からなる、光干渉効果を利用した簡便なセンサを提供することにある。

上記目的は、以下の構成により、達成される。即ち、
（１）光吸収性の基板上に形成されたアルカリに耐性のある光学薄膜と、その光学薄膜表面に形成されたプローブからなるセンサチップに、そのプローブと相互作用するサンプルを含む液を供給し、この液体が供給された状態で、相互作用の前後で変化する反射光の強度を検出する。ここで、光学薄膜としては、アルカリに対する耐性がある窒化シリコン、酸化タンタルのようなものを用いる。また、基板のセンサを有する面のセンサ以外の領域および裏面に、窒化シリコン、酸化タンタルなどのアルカリに対する耐性のある材料からなる保護膜を設ける。これにより、基板のセンサを有する面と、その裏面について、チップの耐アルカリ性を持たせることができる。更に、センサを有する面については、センサ部およびセンサ部などを示す印および文字と、それ以外の部分の間で、膜の光路長に差をつけて、異なる色を示すようにする。

ここで、本発明では主に、生化学物質間の結合を溶液中で光学薄膜の干渉色変化を利用して検出する。ここで、この生化学物質とは、他の物質に生化学的に結合する物質のことを指し、タンパク質、核酸、脂質、糖などの生体内で生産される物質だけではなく、薬剤物質、内分泌錯乱化学物質などの生体内の分子と結合する外来物質も含む。

（２）水溶液中で明瞭な干渉色が得られるように、光学薄膜の屈折率を調節する。例えば、シリコン基板上の光学薄膜に対しては、光学薄膜の屈折率を２．２に調節する。または、光学薄膜を屈折率の異なる複数の層の組み合わせとする。例えば、シリコン基板上の光学薄膜に対しては、基板上に屈折率２．４の膜を形成し、その上に屈折率２．０の膜を形成する。または、光学薄膜をセンサ表面では屈折率２．０で、基板との界面ではこれより高い屈折率を持つ傾斜屈折率膜とする。このとき、光学薄膜の屈折率は膜厚方向に２．０から２．６の範囲で連続的に変化させる。例えば、シリコン基板上の光学薄膜に対しては、基板との界面では屈折率２．４とし、光学薄膜のセンサ表面では屈折率２．０になるように、連続的に屈折率を変化させる。ここで、屈折率２．０の膜とは、窒化シリコンでは最もアルカリに対して耐性のある膜であり、これを最上層とすることでより化学的に安定なセンサとなる。また、窒化シリコンはＣＶＤ法でガスの混合比を変化させることで屈折率を２．０から２．６まで変化させることができる。

（３）更に、複数種類のプローブ毎に、光を照射し、その反射光を検出する光ファイバと、反射光の強度変化を計測する測定器を設けた検出装置によって達成される。ここでは、プローブの種類毎に光ファイバを設けるため、複数種の反応をほぼ同時に検出できる。ここで、上記センサチップを保持するチップ保持部を設け、センサおよび光ファイバの配列をチップ保持部に対して回転方向に非対称とすることで、センサチップをチップ保持部に対して誤った方向に装着した場合に、検出装置により誤りを検知できるため、この誤りを防止できる。

チップの一の例は、シリコン基板と、シリコン基板の表面に設けられた第1の窒化シリコン膜と、シリコン基板の裏面に設けられた第2の窒化シリコン膜とを有し、第1の窒化シリコン膜は、生体物質と結合するプローブを表面に固定するための第1の領域を有することを特徴とする。ここで、第1の窒化シリコン膜の屈折率は2.0程度から2.6程度の範囲の値であってもよい。また、プローブはタンパク質であってもよい。また、第1の窒化シリコン膜は、シリコン基板の表面に設けられかつ屈折率が２．４程度の第3の窒化シリコン膜と、第3の窒化シリコン膜の表面に設けられかつ屈折率２．０程度の第4の窒化シリコン膜とからなってもよい。また、第1の窒化シリコン膜及び第2の窒化シリコン膜は、シリコン基板に接する表面及び他の表面の屈折率が各々2.4程度及び2.0程度であり、シリコン基板に接する表面から他の表面に向かって屈折率が連続的に変化するものであってもよい。また、第1の窒化シリコン膜及び第2の窒化シリコン膜は、表面からシリコン基板の表面に向かって屈折率が指数関数的に変化するものであってもよい。

アルカリ洗浄およびアルカリを用いた表面改質を施すことができるセンサチップを用いて、高スループットで生化学物質の結合を測定できる。

以下、アルカリに耐性のある生化学センサチップの製造方法を述べる。なお、以下において、屈折率の値に関して「程度」という語を用いる際には、その値の±０．５以内の範囲をさすものとする。図３にセンサの製造方法の一例を示す。図３（ａ）に示したように、実質的に平坦な表面を持つシリコン基板５の表面および裏面に、７０ｎｍ程度の厚さの窒化シリコン（ＳｉｘＮｙ、屈折率２．２）の光学薄膜６を化学気相蒸着（ＣＶＤ）法により形成する。

通常、窒化シリコン膜の組成はシリコン３に対し、窒素が４であり、このときの屈折率は２となる。我々は、窒化シリコン膜の成膜条件を調整することで屈折率を２．０から２．６の範囲で調整できることを見いだした。
図４に、ＣＶＤ法に用いる混合ガスのモノシラン、アンモニア、窒素に占めるモノシランの混合比に対する、製膜される窒化シリコン膜の屈折率を示した。具体的には原料混合ガスのモノシラン、アンモニア、窒素に占めるモノシランの混合比を０．０７程度から０．４５程度に調節することで、屈折率を窒化シリコン膜の屈折率を２．０程度から２．６程度の範囲で調整できた。しかしながら、原料混合ガス中に占めるモノシランの比率を高くすると窒化シリコン膜組成は「シリコン/窒素」の値が3/4より大きくなると推測される。

具体的には、屈折率２．０の膜の組成比は、シリコン３に対して窒素が４である。すなわち、シリコン約０．４３に対して窒素が約０．５７である。屈折率２．２の膜では、その組成比はシリコン約０．５１に対して、窒素が約０．４９である。屈折率２．３の膜では、その組成比はシリコン約０．５２に対して、窒素が約０．４８である。このように、屈折率が高いものほど、組成比のシリコンの比率が高い。次に、図３（ｂ）に示したように、レジストを塗布、ホトリソグラフィにより露光、現像し、センサ部およびセンサ部などを示す印および文字の部分にレジストパターン７を形成する。引き続き、図３（ｃ）に示したように、窒化シリコン膜を４０ｎｍエッチングし、窒化シリコン膜に段差をつける。その後に、図３（ｄ）に示したように、レジストを除去する。図５にセンサチップの上面図を示す。センサチップの上面には、センサ部８、センサチップの向きを示す印９、センサ部の名称を示す文字１０、保護層１１等が設けられる。センサ部８、センサチップの向きを示す印９、センサ部の名称を示す文字１０は、図３（ｂ）のレジストパターンに描くことで、同時に形成される。

センサ部８、センサチップの向きを示す印９、センサ部の名称を示す文字１０の部分の窒化シリコンの厚さは７０ｎｍ程度であり、その干渉色のため青色に、保護層１１の厚さは、図３（ｃ）のエッチングのために薄くなり、３０ｎｍ程度であるためにシリコンに近い色で若干褐色がかった色にそれぞれ見えるため、目視にて見分けることができる。すなわち、少なくともセンサ部８と保護層１１とは厚さが異なり、さらに目視上において色で識別することができる。これにより、各センサ部へ第一の生化学物質（プローブ）を固定化するために、各センサ部へ第一の生化学物質の溶液を滴下する時などに便利になる。

以上により、アルカリ耐性の優れたセンサチップが得られる。表１に窒化シリコンと二酸化シリコンのアルカリに対する耐性試験の結果をまとめた。表１には、シリコン基板上に窒化シリコン膜（屈折率２．０）、窒化シリコン膜（屈折率２．２）、窒化シリコン膜（屈折率２．３）、二酸化シリコン膜をそれぞれ形成したものを、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に６時間、２４時間、４８時間浸したときに、それぞれの膜厚が減少した量を示してある。各屈折率の窒化シリコン膜は、上記のＣＶＤ法によって得た。二酸化シリコン膜はシリコン基板表面を熱酸化することで成膜したものである。表１から、二酸化シリコンに比べて、窒化シリコンの方がアルカリに対して耐性が良いと分かる。二酸化シリコンの膜では、２４時間で１００オングストローム膜厚が減少、すなわち１０ナノメートル溶けてしまったのに対して、窒化シリコンでは数オングストローム以下しか膜厚が減少しない。

このように窒化シリコン膜はアルカリに対して耐性に優れていることが分かる。特に、屈折率２．０の窒化シリコン膜がもっともアルカリ耐性が優れている。屈折率を２．２や２．３に調整した窒化シリコン膜では、屈折率２．０のものよりアルカリ耐性は低くなる傾向にある。シリコン自体は水酸化ナトリウム水溶液のようなアルカリ液でエッチングされるので、シリコン比率が高いものほどアルカリ耐性が低くなると考える。屈折率２．３の窒化シリコン膜（ＳｉｘＮｙ）の組成はx／yがおおよそ１．１と予測される。今回の結果から、アルカリ耐性を考慮した場合には、シリコン比率の観点から、センサ部の表面の窒化シリコン膜（ＳｉｘＮｙ）のx／yを１．１以下とすることにしてもよい。窒化シリコン以外の材料でも、同様の屈折率と耐アルカリ性を示すものがある。その例として、スパッタ堆積による酸化タンタル膜（屈折率２．０６程度）の、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液への耐性を試験した。その結果、２４時間浸した時に約６オングストロームの膜厚の減少を確かめた。酸化タンタル膜を用いる場合には、化学気相成長法を用いるなどして膜質を調整することで、窒化シリコンと同等の性能を得ることができる。

このセンサは溶液中で明瞭な干渉色を示し、生化学物質の結合によりその干渉色が変化する。図６に計算機シミュレーションに用いたモデルを示す。センサ部はシリコン基板１２上の窒化シリコンからなる光学薄膜１３であって第一の生化学物質（プローブ）を固定するものである。また、光学薄膜１３の屈折率は２．２、厚さは７０ｎｍとした。ここでセンサ部は次の実施例以下で述べるように、屈折率を調節した窒化シリコンであってもよい。背景の屈折率ｎ_０は１．３３３０とした。第一の生化学物質（プローブ）を、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの層１４とした（図６（ａ））。この生化学センサに対し、第２の生化学物質を含むサンプルを供給することにより、第１の生化学物質と第２の生化学物質とを結合させる（図６（ｂ））。この第２の生化学物質を、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの層１５として示した。図７に反射スペクトルを示す。縦軸の吸光度は、−ｌｏｇ_１０Ｒとした。

ここで、Ｒはセンサの反射率である。図７は、波長が４００ｎｍから８３０ｎｍでの吸光度スペクトルである。それぞれ、図６（ａ）の第一の生化学物質層が施されたセンサの反射スペクトルを実線Ｂで、図６（ｂ）の第２の生化学物質が結合した後の反射スペクトルを点線Ｂ'で示した。図７の反射スペクトルから、波長６２０ｎｍ付近で光干渉により反射が小さくなっていることが分かる。また、生化学物質層が加わることで、スペクトル全体が長波長側に移動することが分かる。破線Ｂ''は点線Ｂ'から実線Ｂを引いた差スペクトルである。差スペクトルＢ''からわかるように、センサの反射スペクトル変化、すなわち反射光強度の変化から第１の生化学物質への第２の生化学物質の結合を計測することが可能である。

以下、センサ部への第一の生化学物質の固定化の一例として、タンパク質の固定化の方法を述べる。まず、センサチップを１Ｍの水酸化ナトリウムに２４時間浸しアルカリ洗浄する。続いて、センサチップに酸素または大気のプラズマを照射する。その後、３−アミノプロピルトリメトキシシランで表面処理を行い、光学薄膜の表面にアミノ基を導入する。そして、２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシイミドと１０ｍｇの水溶性カルボジイミドと１ｍｇのタンパク質を１ｍｌの脱イオン水に溶かしタンパク質のカルボキシル基を活性化し、この溶液をアミノ基を導入した箇所に滴下して、タンパク質をセンサ表面のアミノ基に共有結合により固定化する。この後、脱イオン水でセンサチップをすすぎ、窒素ガスを吹きかけて乾燥する。

この他の生化学物質の固定化の方法として、センサ表面への分子の非特異的吸着の少ない固定化方法として知られている、デキストランをリンカーとした固定化方法を述べる。まず、センサチップを１Ｍの水酸化ナトリウムに２４時間浸しアルカリ洗浄する。続いて、センサチップに酸素または大気のプラズマを照射する。その後、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランで表面処理を行い、光学薄膜の表面にエポキシ基を導入する。続いて、センサチップを０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に溶かした０．３ｇ／ｍｌのデキストラン溶液に２０時間浸ける。以上によりセンサ表面にデキストランが結合する。しかる後に、センサチップを２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に溶かした１Ｍのブロモ酢酸溶液に１６時間浸ける。これにより、デキストランにカルボキシル基が導入される。

ここで、図21に示した表１中の窒化シリコンの中で最もアルカリに対する耐性が良くない屈折率を２．３に調節した窒化シリコン膜を２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に２４時間浸した場合には９オングストローム以下の膜厚減少となることを確認しており、窒化シリコン膜は酸化シリコン膜に比べて２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液にも十分な耐性がある。Ｎ−ヒドロキシスクシイミドと水溶性カルボジイミドの水溶液を用いてこのカルボキシル基を活性化することにより、リンカーのデキストランに一級アミンを有する生化学物質、例えばタンパク質を結合させることができる。

図21に示した表１の異なる屈折率を持つ窒化シリコンのアルカリ耐性を比較すると、屈折率２．０の膜が最も耐性が良く、次に屈折率２．２の膜、次が屈折率２．３の膜の順に耐性が良い。窒化シリコン膜の組成比が、シリコン３に対して窒素４の最も化学的に安定な組成比に近いほど、耐性が良いと言える。ここでは、実施例１のシリコン基板上の屈折率２．２の光学薄膜の代わりに、シリコン基板上の屈折率２．０の光学薄膜、すなわちシリコン３に対して窒素４の組成比の窒化シリコン膜とすることで、より耐アルカリ性に優れた生化学センサチップとした例を示す。

この生化学センサチップは、実施例１の生化学センサチップの作製法で図３（ａ）の実質的に平坦な表面を持つシリコン基板５の表面および裏面に７０ｎｍ程度の厚さの窒化シリコン（ＳｉｘＮｙ、屈折率２．２）の光学薄膜６をＣＶＤ法により形成する代わりに、実質的に平坦な表面を持つシリコン基板５の表面および裏面に７５ｎｍ程度の厚さの屈折率２．０の窒化シリコンをＣＶＤ法により形成することで、他は実施例１のとおりで実現される。

実施例１と同様に計算機シミュレーションを行った。実施例１とのモデルの違いは、図６の光学薄膜１３の屈折率を２．０としたことと、その厚さを７５ｎｍとしたことのみである。図８に反射スペクトルを示す。図８は、波長が４００ｎｍから８３０ｎｍでの吸光度スペクトルである。それぞれ、図６（ａ）の第一の生化学物質層が施されたセンサの反射スペクトルを実線Ｃで、図６（ｂ）の第２の生化学物質が結合した後の反射スペクトルを点線Ｃ'で示した。破線Ｃ''は点線Ｃ'から実線Ｃを引いた差スペクトルである。実施例１の図７と比較して吸光度のピーク値および差スペクトルのピーク値は小さくなるものの、第２の生化学物質が結合することで反射スペクトルが変化するのでセンサとして用いることができる。以上のように、屈折率２．０の窒化シリコンの光学薄膜とすることで、よりアルカリに耐性のある生化学センサチップが得られる。

実施例２で述べたように、窒化シリコン膜の中でも、屈折率を２．０に調節したものが最もアルカリに対する耐性が優れている。従って、センサ表面には、屈折率２．０に調節した窒化シリコン膜が最もふさわしい。しかしながら、実施例２のシリコン基板上の屈折率２．０の膜とした場合では、屈折率２．０の膜と水溶液の界面での光の反射に比べて、シリコン基板との界面の光の反射が強くなるため、水溶液中での光干渉が弱い。そこで、シリコン基板上に屈折率２．４程度の窒化シリコンの膜を４０ｎｍ程度堆積し、さらにその上に屈折率２．０程度の窒化シリコンの膜を４０ｎｍ程度堆積することで、実施例１の図７と同様の反射スペクトルを持ち、より耐アルカリ性に優れた生化学センサチップを得ることができる。

この生化学センサチップは、実施例１の生化学センサチップの作製法で図３（ａ）の実質的に平坦な表面を持つシリコン基板５の表面および裏面に７０ｎｍ程度の厚さの窒化シリコン（ＳｉｘＮｙ、屈折率２．２）の光学薄膜６をＣＶＤ法により形成する代わりに、実質的に平坦な表面を持つシリコン基板５の表面および裏面に４０ｎｍ程度の厚さの屈折率２．４程度の窒化シリコンをＣＶＤ法により形成し、その上に４０ｎｍ程度の厚さの屈折率２．０程度の窒化シリコンをＣＶＤ法により形成することで、他は実施例１のとおりで実現される。

このセンサも実施例１と同様に溶液中で明瞭な干渉色を示し、生化学物質の結合によりその干渉色が変化する。図９に計算機シミュレーションに用いたモデルを示す。背景の屈折率ｎ_０は１．３３３０とした。基板はシリコンとし、光学薄膜はシリコン基板上の厚さ４０ｎｍの屈折率２．４の膜１６と厚さ４０ｎｍの屈折率２．０の膜１７の二層膜とした。実施例１と同じく、第一の生化学物質（プローブ）を、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの層１４とした（図９（ａ））。この生化学センサに対し、第２の生化学物質を含むサンプルを供給することにより、第１の生化学物質と第２の生化学物質とを結合させる（図９（ｂ））。この第２の生化学物質を、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの層１５として示した。図１０に反射スペクトルを示す。図１０は、波長が４００ｎｍから８３０ｎｍでの吸光度スペクトルである。それぞれ、図９（ａ）の第一の生化学物質層が施されたセンサの反射スペクトルを実線Ｄで、図９（ｂ）の第２の生化学物質が結合した後の反射スペクトルを点線Ｄ'で示した。破線Ｄ''は点線Ｄ'から実線Ｄを引いた差スペクトルである。実施例１の図７と比較して、ほぼ同じ反射スペクトルと差スペクトルとなることが分かる。以上のように、屈折率２．０の窒化シリコンの膜をセンサ部の最上層とした二層膜とすることで、実施例１とセンサとしての性能は同程度で、よりアルカリに耐性のある生化学センサチップが得られる。

本実施例においては、生化学センサチップを実施例１の作製法の図３（ａ）の光学薄膜６を屈折率２．０程度の窒化シリコンと屈折率２．４程度の窒化シリコンを４０ｎｍ程度の積層膜として堆積し、図３（ｃ）に示すように部分的に加工することで段差を形成しているが、実質的に平坦なシリコン基板の表面及び裏面に厚さ４０ｎｍ程度の屈折率２．４程度の窒化シリコン膜を堆積した後、ホトリソグラフィで実施例１と同様なレジストパターンを形成し、それをマスクとしてシリコン基板の表面の厚さ４０ｎｍ程度の屈折率２．４程度の窒化シリコン膜をエッチングしてから、基板表面及び裏面に厚さ４０ｎｍ程度の屈折率２．０程度の窒化シリコン膜を堆積することでも実現される。この場合は、センサ部だけでなくセンサチップ表面が全て薬品耐性の高い屈折率２．０程度の窒化シリコンで覆われることになるので、薬品耐性をより高くできる。

実施例３では光学薄膜を屈折率の異なる２つの膜からなる二層膜とすることで、最上層を屈折率２．０の窒化シリコンとしたが、傾斜屈折率膜を用いることでも実施例３と同様の効果を得ることができる。図１１に傾斜屈折率膜の例を示す。図１１(a)のように、厚さ７５ｎｍ程度の光学薄膜１８中で屈折率を連続的に変化させる。センサ表面では屈折率を２．０程度とし、ｚ 軸をセンサ表面を０として光学薄膜１８に対して垂直方向にとり、シリコン基板１９上、すなわちｚ＝７５ｎｍで屈折率を２．４程度とする。ここではその間の屈折率変化は指数関数とし、図１１（ｂ）のように、屈折率ｎ（ｚ）をｎ（ｚ）＝ｅｘｐ（Ｗ×ｚ）とする。ここでＷは定数である。この傾斜屈折率膜は、表面の屈折率が一定であれば、その内部での屈折率変化は図１１（ｂ）に示したような指数関数的変化でも、それ以外の連続的な変化であってもよい。このときに表面の屈折率を２程度とすることにより、薬品耐性を高めることができ、またシリコン基板上に複数の薄膜を形成することなく、測定に適した光学薄膜を形成することができる。

この生化学センサチップは、実施例１の生化学センサチップの作製法で図３（ａ）の実質的に平坦な表面を持つシリコン基板５の表面および裏面に７０ｎｍ程度の厚さの窒化シリコン（ＳｉｘＮｙ、屈折率２．２）の光学薄膜６をＣＶＤ法により形成する代わりに、実質的に平坦な表面を持つシリコン基板５の表面および裏面に、図１１に示したように、７５ｎｍ程度の厚さで屈折率が２．４から２．０へ変化するように、モノシランの混合比を調節しながら窒化シリコンをＣＶＤ法により形成することで、他は実施例１のとおりで実現される。

このセンサも実施例１と実施例３と同様に溶液中で明瞭な干渉色を示し、生化学物質の結合によりその干渉色が変化する。図１２に計算機シミュレーションに用いたモデルを示す。背景の屈折率ｎ_０は１．３３３０とした。基板はシリコンとし、光学薄膜は図１１に示した屈折率が２．４から２．０へ変化する傾斜屈折率膜１８とした。実施例１と同じく、第一の生化学物質（プローブ）を、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの層１４とした（図１２（ａ））。この生化学センサに対し、第２の生化学物質を含むサンプルを供給することにより、第１の生化学物質と第２の生化学物質とを結合させる（図１２（ｂ））。この第２の生化学物質を、屈折率１．５、厚さ１０ｎｍの層１５として示した。図１３に反射スペクトルを示す。図１３は、波長が４００ｎｍから８３０ｎｍでの吸光度スペクトルである。それぞれ、図１２（ａ）の第一の生化学物質層が施されたセンサの反射スペクトルを実線Ｅで、図１２（ｂ）の第２の生化学物質が結合した後の反射スペクトルを点線Ｅ'で示した。破線Ｅ''は点線Ｅ'から実線Ｅを引いた差スペクトルである。実施例１の図７と比較して、ほぼ同じ反射スペクトルと差スペクトルとなることが分かる。以上のように、センサ表面を屈折率２．０の窒化シリコンとした屈折率傾斜膜とすることで、実施例１とセンサとしての性能は同程度で、よりアルカリに耐性のある生化学センサチップが得られる。

本実施例においても、センサ表面に加えて、チップ表面全体の薬品耐性を向上するために、上記傾斜屈折率膜を加工した表面に、屈折率２．０程度の窒化シリコン膜を0.5ｎｍ程度から１０ｎｍ程度堆積してもよい。この場合は、傾斜屈折率膜と後から堆積する屈折率２．０程度の窒化シリコン膜の両方を考慮した膜厚、屈折率傾斜とする。

以下、本発明の光学薄膜センサの干渉色変化を溶液中でリアルタイムに検出する装置を、図面を用いて説明する。図１４は、本発明の一実施例を示すブロック図、図１５は本発明の検出装置の計算機の表示画面の一実施例を示す図、図１６は本発明の検出装置で検出する量を示す図、図１７は本発明の検出装置の光学系の一実施例を示す斜視図、図１８は本発明の検出装置の反応槽の一実施例を示す斜視図、図１９は図１８のＧ−Ｇ’での断面図、図２０は図１８のＨ−Ｈ’での断面図である。

本発明の検出装置は、図１４のように、タングステンランプなどの白色光源２０からの光が光ファイバからなる照射光学系２１を経て、反応槽２２に入ったセンサチップ２３上の実施例１〜実施例４で述べた複数の光学薄膜センサ部２４に照射され、その光学薄膜センサ部２４からの反射光が光ファイバからなる集光光学系２５を経て、複数の分光器２６と複数のＣＣＤやフォトダイオードアレイなどの多チャンネル受光機２７でリアルタイムに反射スペクトルとして測定され、計算機２８に反射スペクトルのデータが取りこまれる。計算機２８により、実施例１〜４で述べた、各光学薄膜センサ部２４の反射スペクトルの、吸光度のピーク位置の変化または単一波長での吸光度の変化をリアルタイムに計算し、その経時変化を図１５のグラフ３０のようにリアルタイムにプロットし、記録する。

図１６に実施例１の図７の実線Ｂ、点線Ｂ'、破線Ｂ''のグラフを用いて、吸光度のピーク位置および単一波長での吸光度の変化の波長位置を矢印Ｆ、Ｆ'、Ｆ''で示した。吸光度のピーク位置の変化量とは、矢印Ｆの位置から矢印Ｆ'の位置へのピーク位置の変化量を指す。単一波長での吸光度の変化の波長位置は矢印Ｆ''のように差スペクトルの値が大きい波長位置が望ましい。グラフ３０の時間微分をグラフ３１に表示し記録する。これにより、結合の開始と、飽和が分かり易くなる。このように、試料溶液中でリアルタイムに計測を行うことで、センサチップを空気中に取り出して測定を行う場合に比べて、反応を迅速かつ正確に調べることができる。

図１７に光ファイバを用いた照射光学系２１、集光光学系２５の一実施例を示す。図１７のように、直径１．５ｍｍの金属のパイプ３２に直径２００ミクロンのガラス製の光ファイバが７本詰まった光ファイバ束を用意する。光ファイバ束の中心に配置した光ファイバ３３の反対側の端は、分光器２６のスリットの前に置かれる。中心に配置した光ファイバ３３を囲む残りの６本の光ファイバ３４の反対側の端は、白色光源２０の前に置かれる。

図１８，１９，２０に、図１７に示した光ファイバ束３５を用いた検出装置の一実施例を示す。図１８，１９，２０のように、光ファイバ束３５を、反応槽２２とセンサチップを所定の位置に置くためのセンサチップホルダ３６と冷却水または温水３７を循環させることで温調を行う冷却・加熱機３８を固定した台３９に取りつけられた可動台４０に固定し、光学薄膜センサ部２４の真上に置く。このようにして、それぞれの光ファイバ束３５から、実質的に透明な光学窓４１を通して、それぞれの真下の光学薄膜センサ部２４に光が照射されるようにする。センサチップ２３をセンサチップホルダ３６に装着する際に、センサチップの向きを示す印２９により適切な方向に装着できる。さらに、センサの配列を回転対称性を持たないもの、つまりセンサチップの回転方向に関して非対称とすることで、センサチップを誤った方向に装着した場合に、反射強度の違いから検出器によって装着方向の誤りを判定できる。なお、これに対応して、光ファイバ束３５はセンサチップと対面する端部の配置が回転対称性を持たない、つまり回転方向に関して非対称とする。これにより、センサチップに対して適切な測定を行うことができる。

可動台４０は、光ファイバ束３５を保持する光ファイバ保持部でもあり、光ファイバ束３５の光学薄膜センサ部２４に対する位置が再現されるように、可動台の位置を規定する位置決め機構４２が取り付けられる。一般に、光学薄膜の干渉色は測定に用いる光の入射・反射角度に依存する。位置決め機構４２を利用して光ファイバ束３５の位置を再現することで、照射光学系２１用の光ファイバ３４から照射される光と光学薄膜センサ部２４で反射され集光光学系２５用の光ファイバ３３で集光される光の角度が再現される。ここで、使用する光ファイバの開口数から決まる光照射角、集光角の範囲内でこの角度を決めて使用するのが望ましい。また、位置決め機構４２を用いることで、光ファイバ束３５の光学窓４１への衝突による破損を避けることができる。

ここで、光ファイバ束３５と光学窓４１を十分に近づけることで、光学窓４１での光の反射の反射スペクトル測定への影響を低減することができる。一度により多くの種類の生化学物質の結合を調べるには、光学薄膜センサ部２４と光ファイバ束３５の数を増やすことで対応できる。光ファイバ束３５の先端と光学窓４１の間に液体を入れるための空間４３を設ける。これにより、光ファイバ束３５の先端および光学窓４１での界面の光の反射を低減でき、反射スペクトル測定への影響をより少なくできる。また、冷却時に反応槽２２の周りに水滴や霜が付着することがあるが、この空間４３に液体を入れることで水滴や霜の付着による反射スペクトル測定への影響を防ぐことができる。溶液の入り口４４から溶液の出口４５へ送液ポンプとサンプルインジェクターなどを用いて生化学物質を含む試料溶液４６を互いに独立した二つの反応槽２２へ送液し、ある時間の間だけ生化学物質を含む試料溶液４６が光学窓４１と各光学薄膜センサ部２４の間の隙間を通過する状態を作ることで、生化学物質の結合および解離のリアルタイム検出を行うことができる。

独立した二つの反応槽２２には、それぞれ異なる試料溶液４６を注入することができる。反応槽の上方に、溶液の入り口４４および溶液の出口４５を配置し、気泡が反応槽２２に進入した場合や発生した場合に、その排出を促進することができる。一般に生化学物質間の結合には、環境の温度依存性がある。冷却・加熱機３８により反応槽２２の温度を調節し、対象生化学物質の結合の温度依存性を調べることができる。ここで、センサチップ２３への熱伝導を良くするために、センサチップホルダ３６および冷却・加熱機３８の一部または全体を金属製とする。冷却・加熱機３８はペルティエ素子などでもよい。

以下、送液および測定の手順の一例である。始状態では試料を含まない緩衝液を送液している。次に、一定時間試料溶液を送液し、第２の生化学物質の第１の生化学物質への結合を調べる。続いて、試料を含まない緩衝液を一定時間送液する。この時に、第２の生化学物質の第１の生化学物質からの解離を調べる。次に、２０ｍＭの塩酸を３分間送液し、第１の生化学物質に結合している第２の生化学物質を解離させる。その後試料を含まない緩衝液を送液し、始状態に戻る。
この実施例では、複数の検体をほぼ同時に、リアルタイムで反応が検出できるので、より高スループットで生化学物質間の結合を測定できる。

本センサ、及び本測定装置は、物質間、特に生化学物質間の結合を測定することに用いる。具体的には、創薬における薬剤物質の探索、医療・検査機関における病原の探索、及び理化学機器として用いる際の分子間の相互作用の解析に利用することができる。

従来の生化学センサの構成を示す図。 従来の生化学センサの干渉色変化を示す図。 本発明の生化学センサの製造工程図。 本発明の生化学センサの光学薄膜の屈折率を示す図。 本発明の生化学センサの上面図。 本発明の生化学センサの構成を示す図。 蛋白結合前と結合後の反射スペクトル変化を示す図。 蛋白結合前と結合後の反射スペクトル変化を示す図。 本発明の生化学センサの構成を示す図。 蛋白結合前と結合後の反射スペクトル変化を示す図。 本発明の生化学センサの構成を示す図。 本発明の生化学センサの構成を示す図。 蛋白結合前と結合後の反射スペクトル変化を示す図。 本発明の装置を示すブロック図。 本発明の検出装置の計算機の表示画面を示す図。 蛋白結合前と結合後の反射スペクトル変化を示す図。 本発明の検出装置の光学系を示す斜視図。 本発明の検出装置の反応槽を示す斜視図。 図１８のG−G’での断面図。 図１８のH−H’での断面図。 耐アルカリ性試験の結果に関する表１。

符号の説明

１：基板、２：光学薄膜、３：第１の生化学物質、４：第２の生化学物質、５：シリコン基板、６：光学薄膜、７：レジストパターン、８：センサ部、９：センサチップの向きを示す印、１０：センサ部の名称を示す文字、１１：保護層、１２：シリコン基板、１３：光学薄膜、１４：第１の生化学物質の層、１５：第２の生化学物質の層、１６：屈折率２．４の膜、１７：屈折率２．０の膜、１８：傾斜屈折率膜、１９：シリコン基板、２０：白色光源、２１：照射光学系、２２：反応槽、２３：センサチップ、２４：光学薄膜センサ部、２５：集光光学系、２６：分光器、２７：多チャンネル受光機、２８：計算機、２９：センサチップの向きを示す印、３０：グラフ、３１：グラフ、３２：金属のパイプ、３３：集光光学系用の光ファイバ、３４：照射光学系用の光ファイバ、３５：光ファイバ束、３６：センサチップホルダ、３７：冷却水または温水、３８：冷却・過熱機、３９：台、４０：可動台、４１：光学窓、４２：位置決め機構、４３：空間、４４：溶液の入り口、４５：溶液の出口、４６：試料溶液。

Claims (8)

1. シリコン基板と、
   前記シリコン基板の表面に設けられた第1の窒化シリコン膜と、
   前記シリコン基板の裏面に設けられた第2の窒化シリコン膜とを有し、
   前記第1の窒化シリコン膜は、生体物質と結合するプローブを表面に固定するための第1の領域を有することを特徴とするチップ。
2. 前記第1の領域は、前記第1の窒化シリコン膜の他の領域よりも膜厚が厚いことを特徴とする請求項１に記載のチップ。
3. 前記第1の窒化シリコン膜の窒素とシリコンの組成比は、シリコン量をｘ、窒素量をｙとしたときにｘ／ｙが１．１以下であることを特徴とする請求項1に記載のチップ。
4. 前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のチップ。
5. シリコン基板と、前記シリコン基板の表面に設けられた第1の窒化シリコン膜と、前記 シリコン基板の裏面に設けられた第2の窒化シリコン膜とを有し、前記第1の窒化シリコン膜は、生体物質と結合するプローブを表面に固定するための領域を有するチップと、
   前記チップに試料溶液を供給する試料溶液供給部と、
   前記領域に対して光を照射する光源と、
   前記領域で反射した光を測定する受光部と、
   前記受光部の測定結果の処理を行う計算部とを有することを特徴とする測定装置。
6. シリコン基板と、前記シリコン基板の表面に設けられた第1の窒化シリコン膜と、前記シリコン基板の裏面に設けられた第2の窒化シリコン膜とを有し、前記第1の窒化シリコン膜は、生体物質と結合するプローブを表面に固定するための複数のプローブ固定領域を有するチップと、
   前記チップを設置するための台と、
   前記チップに試料溶液を供給する試料溶液供給部と、
   光源と、
   前記チップの表面に設けられた前記複数のプローブ固定領域の各々に対応して、前記光源からの光を照射するための複数の第1光ファイバと、
   前記チップの表面に設けられた前記複数のプローブ固定領域の各々に対応して、前記プローブ固定領域で反射した光を検出する複数の第2光ファイバと、
   前記反射した光を測定する受光部と、
   前記受光部の測定結果について処理を行う計算部とを有することを特徴とする測定装置。
7. 前記第1光ファイバと前記第2光ファイバとは、前記チップと対面する端部の配置が前記チップに対して回転方向に関して非対称であることを特徴とする請求項６記載の測定装置。
8. 前記第1光ファイバと前記第2光ファイバを保持しかつ可動である光ファイバ保持部と、前記光ファイバ保持部の位置を定める位置決め機構とを有することを特徴とする請求項６に記載の測定装置。

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