JPS584555B2 - アスコルビン酸の検出組成物、検出方法及び検出素子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は水性液体中におけるアスコルビン酸の同定方法
及び同定のための組成物に関する。

アスコルビン酸は、結締組織のフィブリル（原繊維）及
びコラーゲンを含む細胞間物質のコロイドの状態を正常
に保つために必須の物質である。

ビタミンＣ（即ほアスコルビン酸）の欠乏は組織の異常
、毛管の損傷をもたらし、最終的には壊血病をひきおこ
す。

従って体液中のアスコルビン酸を検定する必要がある。

アスコルビン酸を分析する方法及び技術については、Ｒ
ａｅ ， Ｊ ．Ｈ．、によるＭｅｌｈｏｄｓ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ，Ａｎａｌｙ．１、１１５ページ、１９６０
年： Ｈｅｎｒｙ ，Ｂ．Ｊ，、Ｃｏｎｎｏｒ ， Ｉ
）， Ｃ，、Ｗｉｎｋｌｅｍａｎ ， Ｊ ．Ｗ，、に
よるＣｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｅ，ｓ ，第．
２版、Ｈａｒｐｅｒ及びＲ ｏ ｗ ，１９６４年、１
３９４ページ、に詳しく述べられている。

もつとも一般的に採用されている早期の方法は、酸溶箪
中の例えば２・６−ジクロ口フェノールインドイエノー
ルなどの酸化−還元指示薬による滴定によるものである
。

アスコルビン酵同定のためのもつと最近の方法は、尿ア
スコノレビン酸による塩化第一水銀に対する水銀の還元
（ Ｋｕｍ −Ｔａｔｔ ， Ｌ．、Ｌｅｏｎｇ， Ｐ
．Ｃ．、Ｃｌｉｎ，Ｃｈｅｍ，１．０巻、５７５ページ
、１９６４年），尿アスコルビン酸の樹脂抽出及び２・
６−ジクロロインドフェノールによる測定（ Ｈｕｇｈ
ｅｓ， Ｒ．：Ｅ，、Ａｎａｌｙｓｔ， ８ ９巻、６
１８ページ、１９６４年）、第一鉄イオンに対する鉄イ
オンの還元及びバソフエナンソロリンによる光学的測定
（ Ｖａｎｎ， Ｌ， Ｓ，、ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ．，
１ １巻、９７９ページ、１９６５年）ジアゾ化４−ニ
トロアニリン−２・５−ジメトキシアニリンとの反応（
Ｍｉｃｈａｅ１ｓｓｏｎ ， Ｃ ，、Ｍ ｉ ｃｈ
ａｅｌｓｓｏｎ ， Ｍ．，Ｓｃａｎｅ， Ｊ，Ｃｌｉ
ｎ， Ｌａｂ， Ｉｎｖｅｓｔ．、２０巻、９７ページ
、１９６７年）、アスコルビン酸を２・６−ジクロロイ
ンドフェノールで酸化させヒドラゾンを生成させる方法
（ Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ、０．、Ｊ．Ｌａｂ， ＣＩｉ
ｎ，Ｍｅｄ，、７２巻、６７４ページ、１９６８年）、
１・２−ナフトキノンをアスコルビン酸で還元して螢光
ジヒドロ誘導体を生成する方法（ Ｈｕｂｍａｎｎ ，
Ｂ ．、Ｍｏｎｍｅｒ ， Ｄ，、Ｒｏｔｈ，Ｍ．Ｃ
ｌｉｎ ， Ｃｈｅｍ， Ａｃｔａ ．、２５巻、１６
１ページ、１９６９年）が挙げられる。

二種の自動化された方法も知られている。

その一つの方法はジクロロインドフェノール染料（ Ｇ
ａｒｒｙ， Ｐ．Ｊ．、Ｏｗｅｎ、Ｇ．Ｍ，Ｔｅｃｈｍ
ｉｃｏｎ Ｓｙｍｐ， １巻、５０７ページ、１９６
７年）であり、他方は４−メトキシ−２−ニトロアニリ
ン反応（ Ｗｉｌｓｏｎ、Ｓ．Ｓ．、Ｇｕｉｌｌａｎ，
Ｒ，Ａ．、ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ、１５巻、２８２ペー
ジ、１９６９年）である。

全部でないとしてもこれら公知技術の殆んどは二つの観
点から望ましくない。

第一は、これら色色の方法による場合の選択性が疑わし
いことである。

これは使用される試剤の相対的な特殊性及び分析中に複
合液のうちの他成分が干渉する可能性のためである。

第二は、これら方法が次の難点のいくつか或いは全部を
要するからである：反応時間が長い、関与する技術者が
高度の技法を要すること、また分析中に液を過度に高温
加熱し、歪められた結果をもたらしうる５０〜６０℃の
オーダーになる、ことである。

Ｄｅｕｔｓｃｈ ， Ｍ．Ｊ ．ａｎｄ Ｗｅｅｋｓ
， Ｃ， Ｅ，、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ａ，０．Ａ， Ｃ， ４ ８巻６号、１９６５年、１
２４８ページには、ｏ−フエニレンジアミンとデヒドロ
アスコルビン酸との反応により螢光キノキサリンを生成
させる方法を用いて食物及びビタミンビル中のアスコル
ビン酸を測定することが記載されている。

このジヒドロアスコルビン酸は、アスコルビン酸をカバ
の木から得られる精製木炭で処理することにより得られ
る。

我々はここで、例えば血清などの水溶液中のアスコルビ
ン酸検定のための新規な方法であって、高度に選択性が
あり（酵素反応を基準にして）、迅速であり（５分間以
上）、比較的低温（約３７℃もしくはこれ以下）で実施
できる方法を開発した。

この方法は、緩衝水溶液中で分析すべき標本と新規な検
定用組成物を接触させることをふくみ、前記組成物はア
スコルビン酸からデヒドロアスコルビン酸への変換の触
媒作用をなしうるアスコルビン酸オキシターゼからなり
、前記デヒドロアスコルビン酸にカップリング物質との
反応により検出可能な物質を生じ、この検出可能物質を
検出するのである。

アスコルビン酸なる用語は、本明細書においては、カル
ボン酸として遊離状態として存在するアスコルビン酸、
及ヒアスコルビン酸エステルとしテ結合した状態で存在
するアスコルビン酸であって、分析の間液体中に存在す
る化合物を含む種々の水酸基と結合しているものを含む
。

本発明は、アスコルビン酸オキシターゼによるＬ−アス
コルビン酸かラテヒドロアスコルビン酸への酵素的変換
と、前記デヒドロアスコルビン酸とある種のカツ．プリ
ング物質との反応を組みあわせたものであらて、後者の
反応により検出可能な生成物が生じ、その量は好ましく
は、前記検定用組成物と接触させた液体標本中に含まれ
るアスコルビン酸の量に対応している。

アスコルビン酸オキシターゼ（Ｌ−アスコルビン酵：酸
素オキシドレドクターゼ、１．０１０．３．３）（以下
ＡＳＯと記す）は、当業者には公知である。

この酵素は次の反応触媒作用をする。

上記酵素（ＡＳＯ）が上述変換反応の触媒作用２０をし
、下記反応：デヒドロアスコルビン酸＋カップリング物
質→検出可能生成物によるデヒドロアスコルビン酸のカ
ップリング反応を阻害しない限り酵素は重大なものでは
ない。

第１表及び２表に記載した方法を用いて Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ ｍｅｄｕｌｌｏｓａ
から抽出された酵素は本明細書に記載される組成物及び
方法に特に有用である。

この酵素は約５．７乃至約８，７のｐＨ最適値を有し、
従って、アスコルビン酸の検出測定のための測定組成物
及び媒体は、このレベルで公知方法により緩衝化される
。

特に有用な緩衝溶液はトリ−ＨＣＩ，Ｎａ＋及びＫ＋り
ん酸塩、 トリーりん酸塩、トリ（１０−４Ｍ ＥＤＴ
Ａ）であって、すべてほぼ０．０５モルである。

もつとも好ましいものはりん酸ナトリウムを用いたもの
である。

検定が最適に行われるためには、組成物を実質的に中性
のｐＨ、即ち約６．８乃至７．２、より好ましくは６．
８乃至７．０の緩衝域にすることが好ましい。

以下に示すＡＳＯ抽出技術は、プロテイン１〜あたり約
３．０〜５．５Ｉ，Ｕ．の活性を示す抽出物を得るため
のものである。

酵素活性１ユニットは、３７℃でｐＨ６．８０±０．０
５において、０．０５モルのりん酸ナトリウム中で１分
間あたりアスコルビン酸１μモルを酸化する酵素プロテ
インの量である、と定義する。

重要注記：これら二種の調製物は購入されたＺ ｕｃｃ
ｈｉｎｉ ｓｑｕａｓｈ３．２ｋｇから出発している
。

透析物質の親液化処理後の、それぞれの調製物の実際の
乾燥重量はＬｏｗｒｙの手順により決定されるダラム重
量のほぼ２〜３倍である。

かくして調製物（Ａ）は乾燥重量が〜０．６９グラムで
あり（Ｂ）は１．７グラムである。

この研究に引用されるのは、この乾燥重量である。

検定用組成物の第二の重要な成分はカップリンク物質で
あって、これはデヒドロアスコルビン酸に作用して検出
可能な化合物を生成する。

前記化合物は好ましくは着色或いは螢光性物質であって
、分析する標本に含有されるアスコルビン酸の量に対応
している。

従って、ＡＳＯによりアスコルビン酸の分析を可能にす
るほどに媒体中で不活性であるカップリング物質は、本
発明の効果的な実施のために有用であると考えられる。

このようなカップリング物質としては例えば、デヒドロ
アスコルビン酸と相互作用して分光光度計により或いは
ケイ光分析により監視することのできる青いケイ光団を
生成する置換もしくは非置換ｏ−、ｍ−及びｐ−フエニ
レンジアミンが挙げられる。

ｏ−フエニレンジアミンはこのカップリング物質の群の
中では特に好ましい。

これらのカップリング物質のうちの或種のものは、溶解
度を増加させると思われる例えばメタノールなどの有機
溶媒が少量存在する場合には、より満足のゆく結果を生
む。

有用なカップリング物質の他の例としては次の物質が挙
げられよう。

Ｎ−Ｎ−ジメチルｐ−フエニレンジアミンジヒドロクロ
リド、 Ｎ−Ｎ−ジメチルｐ−フエニレンジアミンモノヒドロク
ロリド、 ２・３・５・６−テトラメチルｐ−フエニレンジアミン
ジヒドロクロリドロキノン、 ２・４−ジアミノフェノールジヒドロクロリド、４−ア
ミノーＮ一エチル−Ｎ−（β−メチルスルホンアミドエ
チル）−ｍ−トルイジンセスキスルフエートモノヒドレ
ート、 ｐ−アミンフェノールモノヒドロクロリド、Ｎ−エチル
ーＮ−（β−ヒドロキシエチル）一ｐ − フェニレン
ジアミンスルフエート、Ｐ−フエニレンジアミンジヒド
ロクロリド。

有用な組成物は、従ってアスコルビン酸オキシターゼ、
緩衝剤及びカップリング物質を含む。

このような組成物は、親液酵素及び粉末緩衝剤、及び水
により容易に再生しうるカップリング物質、との乾燥混
合物もしくは水溶液の形で提供される。

更に本明細書に記載される検定用組成物は、当業者には
周知であるような種々の試験用要素と組みあわせること
ができる。

このような素子としては一般的に吸収用母体が挙げられ
、これは例えば試薬で含浸した紙などがある。

本明細書で記載される組成物を用いることのできるアス
コルビン酸の検定に使用できる代表的な材料及び素子は
、例えば次の米国特許第３０９２４６５号、 ３４１８０９９号、３４１８０８３号、 ２８９３８４３号、２８９３８４４号、 ２９１２３０９号、３００８８７９号、 ３８０２８４２号、３７９８０６４号、 ３２９８７３９号、３９１５６４７号、 ３９１ ７４５３号、３９３３５９４号、３９３６３５
７号等に記載されている。

このような組成物はまた、１９７４年１月２日に公告さ
れたベルギー特許第８０１７４２号、及び１９７６年１
１月１６日に発行された米国特許第３９９２１５８号に
記載されるタイプの多層分析用素子に組みあわせること
もできる。

以下に有用なこのような素子の詳しい説明をする。

この試薬組成物は製造時にはどのような物哩的状態であ
ろうと、使用時には約１０μｇ／ｍｌのＡＳＯ、約５×
１０−３乃至１０−２モルのカップシリング物質及び、
ｐＨ値を約５．７乃至８．７、好ましくは６．８乃至７
．２、もつとも好ましくは約６．８乃至７．０の間に保
持しうるに十分な量の緩衝剤を含む水溶液を生成しうる
ものでなければならない。

カップリング物質の濃度がこの範囲以下の場合には、試
験の動的な範囲をかなりせばめる。

しかしながら、カップリング物質がこの範囲以下の場合
にはアスコルビン酸の定量分析に有用である場合もある
。

測定は約１６乃至４０℃の温度範囲で行うことができる
けれども、最良の結果は２０℃±２℃で得られる。

所定の測定に必要な時間はもちろん使用される試薬の種
類、濃度及び同定の温度により変動する。

好ましい材料及び条件を採用した場合には、最良の結果
は約５分間以内で得られる。

先述したように、ここに記載する組成物は当業界に知ら
れている広い範囲の単層もしくは複層の分析用素子と組
みあわせることができる。

しかしこの組成物は、好ましくは、１９７１４年１月２
日に公告されたベルギー特許第８０１７４２号に記載さ
れる分析用素子中に組み込むことが望ましい。

極めて好ましい実施態様の場合、アスコルビン酸の同定
のための素子は下記物質を含んでなる：標本中に含まれ
るアスコルビン酸が均一な濃度をもつように分散させる
ための展着層； 先述した検定用組成物の少くとも一部を含み、使用状態
においては前記展着層と流体接触をしている反応剤層。

更にこの素子は、任意に、デヒドロアスコルビン酸と相
互作用に検出可能生成物を生成するカップリング物質を
含む指示薬層を含んでもよい。

分析用素子中の両層の間の前記流体接触なる用語は、液
体であれ気体であれ、流体が素子中の展着層、反応剤層
もしくは他の層の重複した域を流体接触状に通過する能
力を指す。

別のいいかだをすると、流体接触とは両層間を流体接触
状態にて、流体成分を移動させる能力を指す。

流体接触におけるこれら両層は接触して配置させること
ができるが、また、以下に述べるような中間層により分
離させることもできる。

しかしながら、相互に流体接触する両層を物理的に分離
する層は、流体接触する両層間の流体の流通を妨げるよ
うであってはならない。

展着層：展着層なる用語は、等方性多孔質或いはいずれ
にせよ液体試料を受けいれることのできる層であって、
液体試料をこの展着層に直接に適用するか、或いはこの
層に流体接触する層を通じて供給する。

この場合展着層には、試料の溶媒もしくは分散液と少く
とも一種の溶解するか分解した成分がその全面に均一な
見かけ濃度で拡がるようになす。

濃度が均一であることについては、以上に述べた技術に
より測定される、観察された均一性であることが埋解さ
れるべきである。

本発明において、展着される試料成分は、勿論、アスコ
ルビン酸もしくは適用される試料中に存在するアルコル
ビン酸エステルを含む。

このような見かけ濃度は、展着層の厚さ全面にわたって
濃度勾配を生じさせることによって達成しうろことが埋
解されるべきである。

このような勾配は、結果の測定中に検出可能でないとし
ても定量分析結果を得るためには困難をもたらすもので
なく、或いは既知の検度技術をもちいて調整することが
可能である。

展着層は等方性多孔質層であってよい。

等方性多孔質とは、展着層中で全方向に実質的に孔が存
在するものをいう。

このような多孔の程度については、その孔径、ボイド（
間隙容積）比率その他に関し、必要に応じ変化させる。

本明細書において使用される等方性多孔質なる用語は、
フィルタ膜に関連して使用される等孔性或いはイオン移
動性などの用語と混同すべきでない。

これら後者の場合には、膜の両側面の間に連続している
孔を有する膜を指すのである。

同様に、等方性多孔質なる用語は、異方性の反意語とし
て使用される等方性なる用語と混同すべきではない。

この場合には、少くとも一片面に沿う薄い“皮”を有す
るフィルター膜を指すのである。

これらの点については，例えばＭｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｅｌｏｇｙ（膜科学
及び技術）、Ｊａｍｅｓ Ｆｌｉｕｎ Ｅｄ，Ｐ ｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （ １ ９
７ ０ ）を参照されたい。

埋解されるように、展着の範囲はある程度展着すべき液
体量に依存する。

しかしながら、展着による均一な見掛け濃度は、液体標
本の量に実質的に依存しておらず、展着範囲と無関係に
生ずる。

その結果、これら素子は、一般的に精密な標本適用技術
を要することはない。

しかしながら、ある一定の液体標本量が好薫しい。

これば、好ましい展着回数等の理由のためである。

本発明の素子が、展着素子の都合のよい大きさ（例えば
１平方センチ）に完全に適用することができるようなご
く少量の標本量を用いて定量分析を行うことができるた
め、液体標本の塗布後素子から余分の水分を除去する必
要はない。

更に、展着が展着層中で起りまた展着成分が、見かゆの
側方群水圧ながけることなく流体接触反応剤層に適用さ
れる結果、溶解性反応剤を使用した場合公知分析素手に
しばしばみられた“洗浄”の問題が生ずることはない。

展着層は、流体接触している反応剤層に面する側の単位
面積に展着成分を均一な見かけ濃度に生成するだけでよ
く、免詠した米国特許第 ３９９２１５８号に記載され
るごく簡単な試験により展着目的に適当である層である
か否かを決定するのに極めて便利である。

等方性多孔質層は種々の成分を使用しで調製することが
できる。

例えば細分材料がこのような層を生成するために使用さ
れ、等方性多孔は材料粒子相互の間の連通空間によって
確保される。

種々の細分材料であって、試料成分に対して分析中化学
的に不活性であるものは有用である。

例えば二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛
等の顔料は望ましい。

他の望ましい粒子はケイソウ土、及び天然もしくは合成
ポリマーから得られる微結晶コロイド材料が挙げられる
。

このような微結晶材料は、″Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｍａ
ｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｏｒＰｈｅｎｏｍｅｎａ， Ｐａ
ｒｔ ＩＩ、Ｎ ｏｖｅ ＩＭｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌ
ｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ （コロイド状巨大分
子現象、第２部、ポリマーの新規な微結晶）”；０，
Ａ， Ｂａｔｔｉｓｔａ他著、Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆＡｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ａｃｉｅｕｃｅ，
Ｖｏｌ．ｎ、４８１−４９８ページ、１９６７年、に
記載されている。

商標名Ａｖｉｃｅｌの名でＦＭＣ社から得られる微結晶
セルローズは、本発明に利用するのに適当な、このよう
なコロイド材料の例である。

樹脂製もしくはガラスのビーズなどの、均一な大きさを
有する球状粒子は、例えば選択ろ過をするため均一な孔
が特に望ましい場合には使用することが特に望ましい。

ガラスビーズ等のように選択された細分材料に接着性が
ない場合、接触点で相互に接着することのできる粒子を
得るための処理を施すことができ、それにより等方性多
孔質層の形成を容易にすることができる。

このための処理の例としては、非接着性粒子を例えば親
水性コロイド状ゼラチン或いはポリビニルアルコールの
溶液で被覆し、相互の接触を行いうるようにすることが
できる。

コロイド（即ち結合剤）被覆物が乾燥すると、層の一体
性が保持され、その成分粒子相互の間に中空部分による
多孔質が形成される。

このような細分材料に代えて、或いはこれに加えて、等
方性多孔質の連続したポリマーを使用して展着層を調製
することができる。

このようなポリマーは“ブラッシュ（カブリ）”ポリマ
ーの生成に有効な技術を用いて調製することができる。

ブラッシュポリマ一層は基体上において、ポリマーな二
種の液の混合物中で溶解させることにより生成すること
ができる。

この二種の液の一方は、ポリマーの良好な溶媒であって
低沸点の液であり、他方は高沸点であって、ポリマーに
対して非溶媒であるが少くとも溶解度の小さい液である
。

このようなポリマー溶液は次に基体上に被覆処理され、
調整された条件下で乾燥処理される。

この低沸点溶媒はより容易に蒸発し、被覆体はそれによ
り前記非溶媒もしくは溶解度の小さい液の割合が大きく
なる。

適当な条件下で蒸発が進行すると、生成されたポリマー
は等方性多孔質層となる。

本発明に使用する等方性多孔質プラッシュポリマーの展
着層として様々のポリマーが単体又は組み合わせた状態
で使用することができるが、代表的な例としては、ポリ
カーボネート、ポリアミド、ポリウレタン及び酢酸セル
ロースなどのセルロースエステルが挙げられる。

多くの種類の材料が展着層として有用である。

しかしながら、通常、分析すべき液に対し耐性のある、
即ちこれと接触することによって膨満しない材料が好ま
しい。

層の乾燥時厚さに対して約１０−４０％の膨張範囲であ
れば正常である。

更に、等方性多孔質等を有する有用な展着層を得ること
は可能であるけれども、展着層材料は繊維分を含まない
ようにすることが好ましい。

これは、繊維分が分光分析の背景となっている場合にみ
られるまだらなあるいはでこぼこに起因する不均一な分
布の悪影響を避けることができるからである。

反応剤層：本発明素子における反応剤層は好ましくは、
展着剤層に展着可能な成分が好ましくは均一に透過する
ことができ、必要に応じ多孔質であってもよい。

本明細書において透過性なる用語は、多孔質であること
に起因する透過性、膨満しうる能力その他の特徴を含む
ものとする。

このような反応剤層は基体を有し、これに酵素及び他の
反応物質であってアスコルビン酸もしくはアスコルビン
酸の分解生成物と相互作用する物質を分布させる。

即ち溶解もしくは分散させる。前記相互作用物質は以下
に説明する。

検出可能物質を受けるためだけの層は本明細書において
記録層として説明する。

相互活性材料（即ち酵素と他の反応材料）の分布は、こ
れらを前記基体材料に溶解もしくは分散させることによ
って得られる。

相互活性材料が均一に分布することは好ましいことであ
るけれども必らずしも必要ではない。

これはアスコルビン酸オキシターゼがどのような反応に
よっても消費されず、連続的に再使用することのできる
触媒としてのみ役立つもので１あるからである。

反応剤層に対して展着する成分は好ましくは均一に透過
可能であるべきである。

層の均一な透過性とは、均質な流体が層の表面に均一に
供給された場合、層中におけるこのような流体濃度を測
定した時に、同一の装置を用い同一の条件下において、
層表面の別々の域で実質的に等しい結果を生ずることを
意味する。

均一な透過性をもたせたことにより、反応剤層中に例え
ば好ましくない濃度勾配が生ずることが防止される。

反応剤層もしくは記録層における基体を選ぶについては
、勿論素子の使用目的により、またこれに組み込まれる
相互作用材料により変ってくる。

好ましい基体材料としては、親水性セルロース誘導体、
多糖類、例えばデキストラン、アラビアゴム、アガロー
ゼ等、合成物質例えば水溶性ポリビニル化合物であって
、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン
）、アクリルアミドポリマー等が挙げられる。

例えばセルロースエステル等の有機親水性材料も使用す
ることができ、いずれの場合でも基体材料の選択にあた
っては、それぞれの素子の使用係数が反映されなければ
ならない。

反応剤層の透過性を高めるためには、多孔質でないにし
ろ、分析すべき液の溶媒もしくは分散媒中に適度に膨満
しうる基体材料を使用することが好ましい。

反応剤層は透過性を有するほか、本発明の同一体素子を
使用した分析結果の検知に際して、一様でないか他の難
点を生せしめるような特性のないものでなければならな
い。

例えば、紙などの繊維性材料を透過性媒体として使用し
た場合に起るような、色或いは組織が均一でない場合に
は、反応剤層において検出すべき変化に均一性を阻害し
たりノイズを生ずるような特性を有するものであっては
ならない。

更にフィルター等の紙類は全体的に極めて透過性がある
けれども、紙の各部分により透過性に大きなバラつきを
生じやすい。

これはせんいの寸法や間隔などの構成的なバラつきによ
る。

その結果これらの材料は均一な透過性を有さないと考え
られ、本発明の展着層或いは反応剤層としては不適当と
考えられる。

展着層及び反応剤層は、非繊維材料を使用して調製され
るべきである。

繊維成分の使用は、これを非繊維材料と適当な割合に組
みあわせた場合には好ましい場合もある。

本発明素子のアスコイレビン酸オキシターゼの一般的に
有用な濃度範囲は約０．１０乃至０．６０ｇ／ｍ２であ
る。

ｏ−フエニレンジアミンなどのカップリング物質は通常
０．０１乃至１．０ｇ／ｍ２のレベルで含まれている。

支持体これら一体的な分析用素子は自己支持性であるか
、或いは展着層、反応剤層その他の層が支持体上に被覆
された形で保持される。

有用な支持体材料ハ使用されるとすれば、紙及びポリオ
レフィンを被覆した紙、種々のポリマニ材料、例えば酢
酸セルロース、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ
カーボネート及びポリビニル化合物例えばポリスチレン
がある。

支持体は不透明であるかあるいは検出の態様に応じ光そ
の他のエネルギーを伝導するものであってよい。

支持体の選択は、検知態様に応じてしなければならない
。

好ましい支持体は透明材料からなり、約２００ｎｍ乃至
９００ｎｍの波長の電磁光を伝達しうるものである。

透明な支持体はもちろん２００−９００ｎｍ域の全域に
わたり伝達する必要なく、そのうちの限定域のみ伝達す
ればよい。

本発明素子が支持体を有する場合、反応剤層は支持体と
展着層との間に位置させる。

好ましい伝達範囲については、種々のカップリング物質
との関係から定めなければならない。

約０．０２５乃至０．２５ｍｍの厚さを有する支持体が
良好であるが、厚さは、検出光の強度及び検出装置の感
度等の要素に依存して異なる． 他の層好ましい実施態様の場合、分光学的分析に適当で
ある分析素子が採用される。

このような素子は、分光分析その他の検知反応に必要な
背景となるための反射層を含む。

支持体が使用される場合には、検定な支持体を通じ行わ
れる。

反射層はアルコルビン酸及び／もしくはアルコルビン酸
の分解生成物を反応剤層もしくは指示層（反応剤層の下
に位置する層であって、反応剤層はアスコルビン酸の分
解の触媒となるアスコルビン酸オキシターゼを含有し、
これに対し指示層はデヒドロアスコルビン酸と相互作用
して検出可酷な生成物を生成するカップリング物質を含
有するのみである）にまで通過させ、反射分光分析のた
めの効果的な背景となる。

この目的のためには通常白い背景が好ましい。

反応剤層もしくは指示層に生成される検出可能生成物の
背景としての機能を考慮すると、どのような反射層も展
着、反応剤もしくは記録層の間に介在するであろう。

このような層は、しかしながら、反応剤層及び指示層の
間に、このような構造が適当である場合介在するのが好
ましい。

反射は例えば展着層としての作用をする層によっても行
われ、或いは素子中の補足的な機能をもたない補足層に
よっても行われる。

顔料、例えば二酸化チタン及び硫酸ゲリウムなどは反射
作用があり、反射層に使用することが有利である。

ブラツシュポリマーは適当な反射材料となりうる。

当業者にはよくわかるように顔料の展着層はブラツシュ
ポリマ一層がこの目的のために有用である。

またブラツシュポリマ一層に顔料を組みあわせて展着及
び／もしくは反射能を高めることもできる。

プラツシュポリマーと共に層に含有される顔料の量は変
動自在であるが、ブラッシュポリマー１重量部に対して
顔料を約１乃至１０重量部、より好ましくは３乃至６重
量部使用する。

ライルタ一層も素子中に使用してよい。

このような層の組成及び調製は当業者にはよく知られて
おり、検出反応に干渉するか或いは同定を阻害する状態
を試料成分から除く役割をなす。

かくして、血液中のアルコルビン酸の分析のため、多層
型分析素子の使用においては、別々のフィルタ一層が血
清をその下の層に送る間に赤い血液細胞を除去する役割
をする。

血清或いは他の流体の分析中、フィルタ一層は、一次的
な検知反応を阻害或いは混乱させる必要でない成分を除
去する役割をなす。

上記ブラッシュポリマ一層も、ある条件下ではフィルタ
一層としての役割をなす。

素子が血液全体の分析に使用される場合、フィルタ一層
は約０．５乃至５ミクロンの径の孔を有することが望ま
しい。

素子の調製：このような一体的な分析用素子を調製する
場合、各層をあらかじめ別々に生成し、次いで積層させ
て全体的な素子を形成する。

このような方法で調製される層にはその表面に溶液もし
くは分散液を被覆し、これから、乾燥された層を物理的
に引き剥がす。

しかしながら、何回もの引がはなし及び積層工程の必要
性を避けることのできる好適な方法は、引きはなし面も
しくは支持体主の最初の層上に被覆し、その後順次する
層をそれ以前に被覆した層上に順次被覆することである
。

たのような被覆工程は手で、刃被覆装置もしくは機械を
用いて、例えばディップコーティング或いはビードコー
ティング技術によって行う。

機械被覆技術を採用する場合、隣接する層も同時に被覆
することもしばしば可能であり、この場合、感光写真フ
イルム及びペーパーの調製のための当業者には周知のホ
ツパー被覆技術を採用する。

中間層の接着の問題は、例えば写真フイルムに採用され
る補助材料を極めて薄く塗布することを含む表面処理法
によって、有害な影響をもたらすことなく解決される。

展着層がフィルター及び展着の機能を果す場合には、こ
の層は、例えば混合有機溶媒に溶解した酢酸セルロース
などの結合剤の２層を同時に被覆して以下に述べるよう
なブラツシュポリマ一層を形成することにより得られる
。

このような技術は、多重層の複数回の被覆工程を単数回
被覆工程に減ずることにより製造作業を単純化する一方
、高度に有用な展着及びフィルタ一層を提供する。

望むならば、これら分離した層の一方もしく待両方は、
例えばＴｉＯ２などの反射しうる顔料を分散した状態で
含有していてもよい。

このような方法で調製された層の物理的構造として、一
般的一等方性多孔質上側層を含み、この層は一次的には
展着層の役割をなし、適用される試料の量のバラつきに
も拘らず、下側層に対し分析液を均一な見掛け濃度で供
給し、また、主としてフィルター儒の役をなす多孔質下
側層を含む。

これら２層の件の状態は英国特許第１３４２２８号に記
載されている混合有機溶媒を相異なる割合で使用するこ
とにより、或いは上述ブラツシュポリマ一層の使用によ
り、製造中に調整される。

酢酸セルロースが結合剤として使用されている場合の溶
媒の特に有用な組みあわせは、アセトン、キシレン、ジ
クロロエタンが３．５：２：１．１乃至４．５：１：０
の割合で含まれているものである。

展着層の厚さは、展着剤が吸収しなければならぬ試料の
量、及び吸収されるべき試料の量に影響を与える空隙割
合、に依存する。

約５０乃至３００ミクロンの範囲の厚さの展着層は特に
有用であるが、この範囲外にあってもある種の素子に対
しては受けいれられ、望ましい場合がある。

等方性多孔算展着層を調製する場合、空隙率が層全体の
少くとも約２５％、好ましくは５０７９５％であるのが
よい。

多孔質展着層の空隙率を種々に変えることによって、展
着層の全体的な透過率、試料の展着に必要な時間などの
素子の特性に修正を加えることができる。

容易に理解されるように、層の空隙率は、例えば、適当
な大きさの特定の材料を選ぶことにより、或いは等方性
多孔質ポリマーが展着層に使用される場合溶媒或いは乾
燥条件を変更することにより、調整することができる。

このような層の空隙率は、例えばＣｈａｌｋｌｅｙによ
りＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａ
ｌＣａｕｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、４、４７（１９
４３年）に記載された統計的方法、層の容積に等しい容
積の、固型材料の実際の重量と層の重量とを直接に計量
しその比率を決定する、などの様々の技術によって相当
程度まで正確に計算することができる。

孔径はいずれの場合でも、反応剤層に供給される最初の
試料成分或いは他の物質が展着するのに十分な程度であ
ることが望ましい。

以下の実施例は本発明の効果的な実施を説明するための
ものである。

実施例 １ 先述方法によって調製した潰したアスコルビン酸オキシ
ターゼ１０−１２μｇ及び５×１０−３モルのレベルの
ｏ−フエニレンージアミンヲ含有する混合物を調製した
。

種々のレベルのこれら混合物に、組成后すぐにアルコル
ビン酸を添加し、２０°±２℃の反応を、３５０ｍμに
おける吸収の増大をフォローすることにより観察した。

第１図は５分を点とするアスコルビン酸の種々のレベル
で得られた折り返しアスコルビン酸分析のグラフである
。

第１図に示されているよう、５分終点の色変化は、人間
の血清におけるアスコルビン酸の既知の正常域（ ０．
５−１５ｍｇ／ｄｌ）及び異常域（１． ４−２．８ｍ
ｇ／ｄｌ）を包含する０−１０ｍｇ／ｄｌのアスコルビ
ン酸域に直線的に対応している。

同様に、このような材料は、酵素を乾燥状態で得て他の
反応剤を組み込むための従来の凍結乾燥もしくは乾燥技
法を利用した、公知の種々の“ウエブ状”分析素子のい
ずれかと組みあわせてもよい。

実施例 １２ アスコルビン酸同定の分析素子。

アスコルビン酸検知のための多層素子は以下のように調
製された。

０． ２ ５ｍｍ厚の酢酸セルロース支持体を、ゼ
ラチン（１０．７ｇ／ｍ２）、りん酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．０）及びｏ−フエニレンジアミン（０．１０
ｇ／ｍ２）を含む指示層でまず被覆した。

乾賑後この層を、ゼラチン（５．４ｇ／ｍ２）、りん酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）、ビス（ビニルスルフ
オニルメチル）エーテル（０．０ ６ ｇ／ｍ２）、ポ
リエチレンクリコールのオレインエーテル（０．３ｇ／
ｍ２）及びアスコルビン酸オキシターゼ（０．６Ｐ／ｍ
）を含む反応剤層で更に被覆した。

コノ層を更に、微結晶セルローズ（８６ｇ／ｍ２）（Ｆ
ＭＣ社から商標名Ａｖｉｃｅｌとして販売されている）
とポリビニルピロリドン（２．２ｇ／ｍ２） とを水と
インプロピルアルコール溶媒の混合液に溶かした展着層
で被覆した。

この素子を、ｐＨ６．８の０．０５モルりん酸塩緩衝液
に溶かしたアルコルビン酸水溶液の新しく調製した試料
の１０μｌアリコット（ ａｌｉｑｕｏｔｓ）を展着層
に適用することにより評価した。

ミリボルト変化（ΔｍＶ）の函数として、相対的なケイ
光変化を３４０ｍμ励起及び４００−６００ｍμ放射に
より観察した。

この試験結果を第■表に示す。以上の結果は、この素子
が、試料を塗布后僅か３分間で水性試料中のアスコルビ
ン酸の濃度を決定するために有用であることを示してい
る。

本発明は、その好ましい実施態様を参照しながら説明し
たけれども、本発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、
種々の変形例、応用例が考えられることが埋解されるべ
きである。

【図面の簡単な説明】

図面は、５分を終点として、種々の濃度レベル（０−１
０ｇ／ｍ２）のアスコルビン酸に対応する色変化のグラ
フであって、色変化はアスコルビン酸に直線的に対応し
ていることを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アスコルビン酸検出のための組成物であって、十分
   な量のアスコルビン酸オキシターゼ、カップリング物質
   、及び緩衝物質であって水を添加することにより前記組
   成物誉約５．７乃至８．７のｐＨに緩衝しうる緩衝物質
   、を含み、 更に、前記アスコルビン酸オキシターゼが少ｋとも約１
   ０μｇ／ｍｌであり、前記カップリング物質が約５×１
   ０−３乃至１０−２モルであってデヒドロアスコルビン
   酸と相互作用して検出可能な生成物を生成するものであ
   るアルカルビン酸検出のための組成物。 ２ 前記アスコルビン酸オキシターゼがキュカルビータ
   ペポメデュローサ（ Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ
   ｍｅｄｕｌｌｏｓａ、カボチャの一種）から得たもので
   ある特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３ 特許請求の範囲第１項記載の組成物であって、前記
   組成一が水性組成物からなり、約５−７乃至８．７のｐ
   Ｈに緩衝されており、少くとも約１０μｇ／ｍｌのアス
   コルビシ酸オキシターゼ及び、デヒドロアスコルビン酸
   反相互作用して検出可能な生成物を生成する約５×１０
   −３乃至１０−２モルのカツプリング物質、含有する組
   成物。 ４ カツプリング物質が、ｏ−、ｍ−もしくはｐ−フエ
   ニレンジアミンである特許請求の範囲第３項記載の組成
   物。 ５ 約６．８乃至７．２のｐＨに緩衝されている
   特許請求の範囲第３項記載の組成物。 ６ 少なくとも約１０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸オキ
   シタニゼ、約５×１０−３乃至１０−２モルの濃度のｏ
   −、ｍ−もしくはｐ−フエニレンジアミン及び緩衝物質
   を含み、前記組成物が約６．８乃至７．２のｐＨを有す
   る水硅組成物である特許請求の範囲第１項記載の組成物
   。 ７ アスコルビン酸の検出のための素子であって、展着
   層及び反応剤層が使用状態では液体接触しており、約０
   ．１０乃至０．６０ｇ／ｍ２の濃度のアスコルビン酸オ
   キシターゼ及び約０．０１乃至１．０ｇ／ｍ２の濃度の
   カップリング物質を含んでなる、アスコルビン酸検出素
   子。 ８ アスコルビン酸オキシターゼがＣｕｃｕｒｂｉｔａ
   ｐｅｐｏ ｍｅｄｕｌｌｏｓａからなる特許請求の範囲
   第７項記載の素子。 ９ カップリング物質がｏ−、ｍ−もしくはｐ−フエニ
   レレジアミンである特許請求の範囲第７項記載の素子。 １０ 特許請求の範囲第７項から９項のいずれかに記
   載の素子であって：前記素子は液体中におけるアスコル
   ビン酸を検出するために使用され：使用状態では雇体接
   触している展着層、反応剤層及び指示層を含んでなり；
   反応剤層が約０．１０乃至０．６０ｇ／ｍ２の濃度のア
   スコルビン酸オキシターゼを含み；指示層が約０．０１
   乃至１．０ｇ／ｍ２の濃度のカップリング物質を含んで
   なる素子。 １１前記アスコルビン酸オキシターゼが約５．７乃至８
   ．７に緩衝されている特許請求の範囲第１０項記載の素
   子。 １２ 特許請求の範面第７項から１１項のいずれかに記
   載の素子であって：使用状態では展着層、反応剤層及び
   指示層が液体接触しており、更に支持体を有し；反応剤
   層は展着層及び指示層の間に位置し；指示層は反応剤層
   と支持体との間に位置し：反応剤層が約０．１０乃至０
   ．６０ｇ／ｍ２の濃度のアスコルビン酸オキシターゼを
   含み；指示層カ約０．０１乃至１．０ｇ／ｍ２の濃度の
   ｏ−フエニレンジアミンを含んでなる素子。