JPS6017520B2 - トリグリセリド検出用一体型要素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、血清のような水性溶液中のトリグリセリドの
実質的に乾燥分析用要素に関する。 血清トリグリセリド量は種々な型の過脂肪血症及びァテ
ローム性動脈硬化性心臓病（Ｋａｈｌｋｅ、Ｗ．Ｍｅｄ
．Ｗｓｃｈｔ．９１、ｐ．２６（１９６６）、Ｋ血、Ｐ
．Ｔ．及びＢ９ｓｓｅｔ、Ｄ．Ｒ．、Ａｍｅｒ．ｌｎｔ
ｅｍ．Ｍｅｄ．、５９、ｐ．４６５（１９６３）の診断
にますます重要になってきている。血清トリグリセリド
測定の慣用方法は、トリグリセリドを加水分解してグリ
セリンを遊離しそしてグリセリンを種々な試薬で処理し
てスベクトロフオトメトリーにより定量しうる化合物を
生成することから成る。一般に加水分解は塩基を用いて
行う。しかしながらＢ比ａｌｏ等による米国特許第３７
０３５９１号及びＳｔｏｒｋ等による米国特許第３７５
９７９３号には加水分解を行う為にリパーゼのみを用い
た酵素的方法（’７９３）又はプロテァーゼとの組み合
せによる酵素的方法（’５９１）についての記載がある
。一般に三種の酵素的方法がグリセリン（源はなんであ
ってもよい）の測定に従釆から用いられている。 それらは次の通りである。

【ａ｝ Ｇａｒｌａｎｄ及び
Ｒａｎｄｉｅの方法（Ｇａｒｌａｎｄ、Ｐ．Ｂ．及びＲ
ａｎｄｉｅ、Ｐ．Ｊ．Ｎａｔｍｅ、１９６ ｐ．９８７
−９８８（１９６２））グリセリン＋ＡＴＰグリセリン
キナーゼ Ｌ−ば一グリセロホスフエート＋ＡＤＰ ＡＤＰ＋ホスホエノールピルベート ピルベートキナーゼピルベート＋ＡＴＰ ピルベート十ＮＡＤＨ ラクテート デヒドロゲナーゼラクテート＋ＮＡＤ十 ‘ｂ｝ Ｗｅｉｌａｎｄの方法（Ｗｅｉｌａｎｄ、０．
ＢｉｏｃｈｅｍＺ．、３２９ｐ．３１３（１９５７）グ
リセリン十ＡＴＰグリセリンキナーゼ Ｌ−Ｑ−グリセロホスフエート＋ＡＤＰ Ｌ一Ｑ一グリセロホスフエート＋ＮＡＤ＋Ｑ‐グリセロ
ホスフエートＮＡＤＨ デヒドロゲナーゼ 十ジヒドロキシアセトンホスフエート十日十【ｃｌ グ
リセリンデヒドロゲナーゼ法（比ｇｅｎ、Ｊ．日．及び
ＨＥｇｅｎ、Ｐ．Ｂ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．及
びＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、４０ ｐ．１１２９（１９６
２））州セー′ン州州ず；リ寺半−ゼジヒドロキシアセ
トン十ＮＡＤＨ＋Ｈ＋ 【ａ’法の変法はドイツ国特許第２６６５５５６号、英
国特許第１３２２４６２号及び米国特許第３７５９７９
３号に記載されている。 すべての場合ＮＡＤＨ生成又は消失をＵ．Ｖ．分光光度
計で３４仇のの波長において測定する。多くの市販のキ
ットで利用されている‘ａー法は三種の酵素を順次用い
ておりそしてＮＡＤＨの消失を測定する。｛ｂ｝法は二
種の酵素を順次用いており、一種の酵素を用いたグリセ
リンデヒドロゲナーゼ反応（‘ｃー法）の場合と同機に
生成するＮＡＤＨを測定する。‘ｂ｝法及びｃ’法は非
常にｐＨに敏感であり、そして厳密なｐＨコントロール
を行わない場合は誤差を招く、またこれら三法（特に‘
ａ｝法）においては鑑別酵素ばかりでなく助因子、ＮＡ
Ｄ（Ｈ）の安定性が考慮すべき重要なことである。Ｃｈ
ｅｎ、日．Ｐ．及びＥ１一Ｍｅｑｕｉｄ、Ｓ．Ｓ．、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａＩＭｅｄｉｃｉｎｅ、７、４６０（
１９７３）に現行の酵素法の欠陥が非常に詳しく述べら
れている。トリグリセリド分析の別法がドイツ国特許第
２１３９１６計弐こ記載されている。この特許の方法は
、トリグリセリドを加水分解し、得られたグリセリンを
酸化してホルムアルデヒドとしそして安定で水及びアル
コール可溶性の無色のアセチルアセトン金属コンプレッ
クス及びアンモニアとホルムアルデヒドとの反応により
着色化合物を生成することから成る。ベルギー国特許第
８０１７４２号及び対応する米国特許第３９９２１５８
号に、血清及び尿のような液体の定性分析及び定量分析
に用いる一体型要素について記載されている。 この一体型要素には好ましくは試薬層と流体接触又は連
絡している多孔性拡散層が含まれ、試薬層には液体成分
又はその分解生成物と相互作用のある物質が少くとも一
つ含まれる。この特許にはトリグリセリド分析組成物を
そのような乾燥分析要素に組み入れうろことに関するい
かなる記載もなくまたこの明細書に記載の型の分析組成
物についていかなる記載もない。Ｋｏｄｉｔｓｃｈｅｋ
等（ｔｈｅ Ｊｏｍ雌ｌ ｏｆ 母ｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ、９８：３ ｐｐｌｏ６３−１０６８（１９６９）及
びＪａｃｏ戊等（〜ｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔひ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ８８ｐｐ２５０
−２５５（１９６０））にはＱーグリセロリン酸オキシ
ダーゼの製造及び性質について記載されている。この酵
素はＱ−グリセロホスフェートから０２への電子の移動
を媒介し、その際日２０２及びジヒドロキシアセトンホ
スフェートの生成を伴つ。更に、Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔ
ｅｒは、Ｊ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
２３４、２７９４頁（１９５９年）に、ラクトバシラセ
ェに属する微生物からのＱ−グリセロリン酸オキシダー
ゼの生成について記載している。本発明の要素により液
体のトリグリセリド／グリセリン含量の分析が非常に簡
単になる。そのような分析にこれらの要素を用いる場合
は、試薬混合が不必要でありそして分析を自動化可能で
あり、研究員がほとんど参与しなくてもトリグリセリド
ノグリセリンの迅速な測定が可能である。本発明に従っ
て水性液中のトリグリセリド検出用の一体型要素が提供
されるｄ この要素には使用の条件下で試薬層と流体接
触する拡散層が含まれそして所定の順で行われる反応を
触媒する酵素を含有する相互作用のある物質が含まれる
。前記反応は、もし存在するならばグリセリンの脂肪酸
ェステル（たとえばトリグリセリド）を加水分解してグ
リセリンとしそしてもともと遊離の形で存在していたか
又はェステルの加水分解により遊離したグリセリンをＬ
−Ｑ−グリセロホスフエートへ転化しそれを順次酸化し
て好ましくは溶液中のトリグリセリド及び／又はグリセ
リン濃度に比例した検出可能な変化を生成することから
成る。好ましい態様に従って、検出可能な変化の存在及
び／又は程度の測定を容易にする為にこの要素には更に
酵素及び／又は試薬から成る指示薬組成物が含まれる。
′要素へ適用する液体試料中に含まれるトリグリセリド
が加水分解されそしてこの加水分解により遊離の状態に
なったグリセリン又は液体試料中に含まれていたグリセ
リンは酵素的に酸化され、液体試料のトリグリセリド／
グリセリン含量に好ましくは定量的に関連した検出可能
な変化を要素中で生成するように種々な相互作用のある
物質が要素中に配置されている。 場合によっては要素は支持体を含んでもよい。トリグリ
セリドを加水分解しそしてグリセリンの検出を行う相互
作用のある物質を以下のごとく要素中に組み入れること
が好ましい。 【ａ｝ すべて試薬層中に組み入れるか又は｛ｂ】トＩ
Ｊグリセリド加水分解酵素を拡散層中にそしてグリセリ
ン及びその酸化生成物と相互作用のある物質を一つ又は
それ以上の別々の試薬層中に組み入れるか又は‘ｃｌ
トリグリセリド加水分解組成物を拡散層と試薬層との間
の分離した層にそしてすべてのその他の相互作用のある
物質を試薬層中に組み入れる。 試薬層は指示薬組成物を含むのが好ましくそれは酸素が
電子受容体である時酵素的に触媒されたグリセリンの酸
化の際生成する過酸化水素と反応して、要素へ適用する
液体試料中のトリグリセリド又はグリセリン含量と関連
した色変化を要素中に生じさせる。 非常に好ましい態様では、トリグリセリド加水分解酵素
及び協働物質は拡散層中に含まれる。 拡散層はグリセリン検出に必要な相互作用のある物質を
含む試薬層の上に位置する。この明細書に記載の分析要
素は主にトリグリセリド測定用要素として言及する。 しかしながらそれらにトリグリセリドを加水分解する加
水酵素を組み入れても入れなくてもそれらは同様にグリ
セリンの測定に有用であるか又はすべてのその他の必要
な相互作用のある物質を含めることによる、検出可能な
生成物の生成に必要な一つの相互作用のある物質の検出
に有用である。拡散層及び試薬層を有する一体型分析要
素について米国特許第３９９２１５８号に記載されてい
る。 この明細書に記載の要素はこの型のものであり、そして
次の【１’、｛２）及び【３’から成る。‘１）アナラ
ィトの濃度を試薬層に対して見掛上均一とする働きをす
る拡散層、■ 使用の条件下で拡散層と流体接触する試
薬層及び‘３’ 場合によっては支持体 次‘１｝、‘２’及び【３’の働きをする種々な酵素及
びその他の相互作用のある物質を要素の一又それ以上の
層中へ組み入れる。 ｛１｝ 拡散層へ適用する液体試料中に含まれるトリグ
リセリドの加水分解【２’液体中に遊離の状態で存在す
るか又は加水分解により遊離の状態となるグリセリンの
酸化及び【３｝ 液体中のトリグリセリドノグリセリン
含量に関連した検出可能な変化（たとえば色素生成）の
提供。 この明細書でいう分析要素中の層間の“流体接触”とは
流体（液体であっても気体であってもよい）がそのよう
な要素中の流体接触している拡散層及び試薬層又はその
他の層の重ね合わされた領域間を通りうろことを意味す
る。 別の言い方でいえば流体成分を、流体接触している層間
を移動させうろことが“流体接触”により意味される。
流体接触しているそのような層は連続的でありえるけれ
どもそれらを以下に詳しく述べる介在層によって分離す
ることもできる。しかしながら相互に流体接触している
層間に物質的にはさまれる要素中の層は層と接触する流
体間の流体の通過をさまたげない。相互作用のある物質
：本発明の要素では、トリグリセリド及び／又はグリセ
リンを以下の反応に従って定量的に測定する。 １ トリグリセリド十日ＯＨ リパーゼグリセリン十脂肪酸 ２ グリセリン十ＡＴＰグリセリンキナーゼＬ一Ｑ−グ
リセロホスフエート＋ＡＤＰ３ Ｌ一Ｑ−グリセロホス
フェート＋電子受容体Ｑ−ＧＰオキシダーゼジヒドｏキ
シアセトンホスフェート十測定可能なスベシーズ酸素が
電子受容体である場合、日２０２を｛３’において検出
可能なスベシーズとして生成しそして比０２検出を以下
の反応に従って行うのが好ましい。 ４ 比０２十日２Ａ（還元）パーオキシダーゼＡ（酸化
）十４０（検出可能な生成物）４において、ＱＡ（還元
）−染料の還元型である染料前駆体Ａ（酸化）一日２Ａ
の酸化により生成した染料好ましい組成物を併用した反
応ではグリセリン及び／又はトリグリセリド濃度と比例
して検出可能なスベーズが生成する。 この試薬系により本発明の要素に慣用のトリグリセリド
分析技法と比べて多くの独特な特長が与えられる。 先ず第一は、オキシダーゼの存在下でＱ−グリセロホス
フェートと反応して検出可能な変化（好ましくは順次反
応して検出可能な変化を生成する中間体）を生成しうる
電子受容体はどれも指示薬組成物に使用可能であり、従
って電子供与体選択に依存して可視のスペクトルのいく
つかの波長の一において反応の測定を行うことができる
ことである。可視での測定の方が３４仇肌での測定より
妨害を受けにくい。第二は、０２又はその他の電子受容
体がＱーグリセロホスフェートオキシダーゼ反応の助因
子であるのでＮＡＤ十又はＮＡＤＨの安定性は考慮しな
くてもよい。先行技術反応系を妨害するであろう、ＮＡ
Ｄ十又はＮＡＤＨを利用する血清成分（たとえばラクテ
ート＋ラクテートデヒドロゲナーゼ）は本発明要素で利
用する反応を防害しない。最後にこの反応系に用いる酵
素は比較的広いｐＨ範囲に亘つて活性であり従って厳密
なｐＨコントロールを行うことはこの要素では必要ない
ｏ本発明の好ましい要素には、要素へ適用する試料中に
存在するトリグリセリドをグリセリンへ加水分解するト
リグリセリド加水分解組成物が含まれる。 この態様に従って、業界周知の技法を用いてトリグリセ
リドをグリセリンへ加水分解する。前記組成物は多層要
素中に組み入れることができる。酵素的技法が好ましい
。これらの方法には一般にリパーゼで血清試料を処理す
る工程が含まれ、その際プロテアーゼ若しくはエフェク
ター（界面活性剤）のような加水分解促進剤をリパーゼ
と共に用いてもよいしトリグリセリドの性質に依存して
リパーゼ単独で用いてもよい。ＢｕＣａｌｏ等は好まし
くはリゾプスアリズ′ス（バーデルマー）及び類似の微
生物からのりパーゼとプロテアーゼとを組み合せて血清
トリグリセリドの加水分解を行い、一方Ｓｔｏｒｋ等は
リゾプスアリズスのみからのＩＪバーゼを用いて加水分
解を行うことについて開示している。リパーゼ調製物、
プロテアーゼ、界面活性剤及びその他の相互作用のある
物質は凍結乾燥状態で容易に入取しうるか又は容易に乾
燥できるので、これらを以下に記載の方法でこの明細書
に記載の型の要素中へ容易に組み入れることが出来る。
これらの要素を用いて血清トリグリセリド特に蛋白質結
合トリグリセリドの加水分解を行うのに好ましい組成物
はリパーゼの相溶性混合物（以下に記載）及び加水分解
のエフェクターとして界面活性剤を含む。 前記相溶性混合物はそれ自体は血清中に存在する蛋白質
会合トリグリセリドを加水分解することができないか又
は不望の遅速度でしか行いえない。前記技法に従ったト
リグリセリド加水分解用の有用なりパーゼは植物からの
ものか又は動物からのものであってもよいが、この明細
書に記載の型の要素に用いるのに特に以下に詳細に記載
するように界面活性剤と組み合せて用いる場合はカンジ
ダルーゴサから採取するりパーゼのような微生物リパー
ゼが好ましくかつ非常にすぐれていることを見し、出し
た。 クロモバクテリウムビスコサムからのＩＪパーゼ、粗の
ままか又は精製したパラリポリティクムの変種、フクモ
ト等によるＪ．Ｑｎ．Ａｐｐｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
、１０、２５７−２６５（１９７４）に記載のごとくし
て精製したりゾプスアリズス（デルマーの変種）及び同
様の活性を有するリパーゼ調製物も有用である。その他
の有用なりパーゼ及びそれらの製造方法は以下の米国特
許に記載されている。 グランデルによる１９５９年５月２６日公告の第２既細
細５号メルカー等による１９６５年２月２日公告の第３
１６８４４８号ャマダ等による１９６５年６月１５日公
告の第３１８９５２９号フクモト等による１９６６年７
月２６日公告の第３２６２８６３号及びマウバーナイ等
による１９７０モ５月１９日公告の第３５１３０７３号
特に好ましい市販のリバーゼには、マイルスラボラトリ
ーズ（インジアナ州、エルクハート）により供給される
小麦豚芽リバーゼ、ウィルソンラボラトリーズにより供
聯合されるリパーゼ３０００、シグマケミカル社により
供給されるステアプシン（リパーゼ３０００及びステア
プシンは聡臓の酵素である）及びェンザイムディベロッ
プ社により供給されるリパーゼＭ（力ンジダシリンドラ
ツセ（カンジダルーゴサ）から採取）がある。 前述のごとく、非イオン性界面活性剤及びアニオン性界
面活性剤はリパーゼ調製物のエフェクターとして有用で
ありそしてそれら自体は蛋白質結合トリグリセリドを加
水分解することが出来ないか又は許容不可な程の低速度
でしか行いえないことが見し、出された。 リパーゼ調製物と界面活性剤との有用な配合物を以後相
溶性混合物と呼ぶ。理論上はいかなる界面活性剤も本発
明の首尾よい実施に用いるのに適切な候補である。しか
しながら界面活性剤の中にはリパーゼ調製物のヒドロラ
ーゼ活性を阻害するものもある。 たとえばリゾブスアリズスからの微生物リパーゼはオク
チルフェノキシポリェトキシェタノール（界面活性剤物
質）により阻害される。従って、リパーゼ調製物と界面
活性剤とを合せようとする前に組成物のこれら二つの構
成分の相溶性を測定することが重要である。そのような
測定は以下に記載の試験により行うのが好ましい。この
試験に首尾よく適合するりパーゼ調製物と界面活性剤と
の混合物をこの明細書では相溶性混合物と呼びそしてそ
れのそれぞれの構成分を互いに相溶性であると言う。リ
パーゼと界面活性剤との相熔性混合物は以下のごとく容
易に試験される。 測定すべき界面活性剤を、約１なし、し１の重量％の間
の種々な濃度で緩衝していない人工血清（特にバリデー
ト、ワーナーランバート社、モーリスプラインス、Ｎ．
Ｊ．のジヱネラルヂアゴノステイツクスディヴィジョン
により販売されている血清標準）へ添加しそして３７０
で約５分間培養する。 この時点で本発明のリパーゼ調製物議料を添加しそして
約２０分間培養する。この溶液の一部（〜０．２Ｍ）を
次いで水（沈殿生成を助ける為にＣａＣ１２１．３のＭ
含有）で１．６の‘まで希釈し、１０分間沸騰水浴中に
暦きそして透明になるまで遠Ｄ分離（００、３７０００
Ｘｇ１０分）する。透明上澄液０．４の上中のグリセリ
ンを、ガーランド、Ｐ．Ｂ．及びランドル、Ｐ．Ｊ．に
よる方法によって定量的に測定し総体積１．２の‘中の
値を求める。前記試験を行う時、リパーゼ調製物以外の
すべての混合物成分を含む試料に関してブランク試験を
行い、グリセリン又は血清のその他の成分に基づく反応
を差し引くことが非常に望ましい。有効グリセリンの５
０％以上（理論濃度）の遊離を促進する組成物は有利で
あると考えられる。１０分以内に７０％以上の有効トリ
グリセリドの加水分解を行う組成物は好ましくそして約
１０分以内に実質的に完全な有効トリグリセリドの加水
分解則ち９０％を越える加水分解を行う組成物は非常に
好ましい。 そのような好ましい組成物の例を以下の表及び例に示す
。前記の有用なりバーゼのヒドロラーゼ活性を促進する
に有利であることが見し、出された界面活性剤には非イ
オン性界面活性剤及びアニオン性界面活性剤がある。 これら非イオン性及びアニオン性界面活性剤には、デオ
キシコレート、ケノデオキシコレート、コレート及び粕
胆じゆう塩混合物を含む胆じゆう塩のような天然界面活
性剤並びにトライトソＸ−２００としてロームアンドハ
ース社により市販されているアルキルアリールポリエー
テルスルホネートのナトリウム塩、アルカノールとして
Ｅ．１．ジュポン社により販売されているアルキルアリ
−ルポリエーテルスルホネートのナトリウム塩、商品名
トライトンＸ−１１４、１００、１０２及びトライトン
ｎ一１０１でロームアンドハース社から販売されている
ようなアルキルフェノキシポリェトキシェタノールのよ
うな合成界面活性剤が含まれる。好ましいアルキルフェ
ノキシポリェトキシェタノールはオキシェチレン単位が
約２０より少し・ポリオキシェチレン鎖を含みそして約
１５より低い値の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有
する。その他の特に有用な界面活性剤を以下の例に示す
。プロテアーゼは一般に前述の先行特許に記載されてい
るようなリパーゼ調製物のエフェクターとしても有用で
ある。 これらのプロテアーゼにはキモトリプシン、ストレプト
マイセスグリセウスプロテアーゼ（登録商標プロナーゼ
で市販）、アスベルギルスオリゼ一及びバチルスサブチ
ルスからのプロテアーゼ、エラスターゼ、パバイン及び
ブロメラィンがある。このような酵素の混合物ももちろ
ん使用することができる。界面活性剤及びプロテアーゼ
のようなエフェクター並びにリパーゼの要素における有
用濃度は、分析に課せられた制御時間、酵素調製物の純
度及び活性、トＩＪグリセリドの性質等のような不定因
子に依存して広範囲に変化する。 典型的な有用濃度を以下に例示するが本発明はそれに制
限されるものではない。グリセリン分析：トリグリセリ
ド加水分解が前記方法により要素中で行われたならばグ
リセリン分析を前述の酵素及び相互作用のある物質を用
いて行う。 最初に、グリセリンキナーゼ（２・７・１・３０）を用
い、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下でグリセリ
ンのＬ−Ｑーグリセロホスフェートへの転化を触媒する
。 一般にグリセリンキナーゼは本発明の首尾よい実施に有
用である。しかしながら大腸菌及びカソジダミコデルミ
アから得られる酵素も好ましい。他のグリセリンキナー
ゼは業界周知である。そのような物質に関する完全な報
告及びそれらの調製及び反応性に関する更に詳し い説
明 は「Ｔ．Ｅ．Ｂａ皿ａｎ、ＥｍＭｍｅＨＥｎ肋ｏｏ
ｋ、１、Ｓｐｒｉｎ袋ｒｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９
６９）Ｐ餌、４０１−４０２」に記載されている。この
反応系の次の段階は、Ｌ一Ｑーグリセロリン酸オキシダ
ーゼ及び電子受容体の存在下でＬ−Ｑ−グリセロホスフ
ェートを酸化して検出可能な変化を引きおこすことから
成る。検出可能な変化は好ましくは色変化又は色生成で
ありそれは好ましい場合は、液体試料中に含まれるグリ
セリンと定量的に関連する。酸素消費のようなその他の
検出可能な変化の測定によっても分析結果を得ることが
できる。オキシダーゼの存在下でＱ一グリセロホスフェ
ートの酸化に伴う検出可能な変化の生成を可能にする電
子受容体はこの反応に用いるに適する候補である。 電子受容体として特に好ましいものは着色生成物を生成
する物質か又はそれ自体着色していないけれども色素を
生成する反応（単独反応か又はいくつかの複数の反応）
により検出しうる化学的中間体を生じる物質である。特
定の電子受容体の有用性を使えそうな電子受容体を用い
て実験的に測定することができる。非常に好ましい電子
受容体は酸素でありそれはオキシダーゼの存在下でＬ−
Ｑ−グリセロホスフェートを酸化してジヒドロキシアセ
トンホスフヱート及び過酸化水素を生成する。 このタイプの反応における過酸化水素の存在及び量を測
定する方法は当然周知である。別の好ましい態様では電
子受容体として、酵素及び基質の存在下での還元の際色
変化をおこすか又は色素を生成する着色又は無着色物質
を用いる。前述のごとくそのような物質を特別な使用還
境下で試験することにより選択できる。この方法を用い
ることによりあるインドフェノール、フェリシアン化カ
リウム、及びあるテトラゾソゥム塩が有用な電子受容体
であることが見し・出された。特に、２・６ージクロロ
フェノールインドールフェノールのみ又はそれとフェナ
ジンメタスルフェートとの組み合せ並びに２一（ｐ−イ
ンドフエニル）一３−（ｐ−ニトロフエニル）一５−フ
エニルー２Ｈ−テトラゾリウムクロライドのみ又はフヱ
ナジンメトスルフエートとの組み合せが本発明反応の電
子受容体として有用であることがが見し、出された。Ｌ
−Ｑ−グリセロリン酸オキシダーゼは種々な源から採取
しうる微生物酵素である。 以下に詳述するようにある源から採取する酵素の性質は
他の源から採取する酵素の性質より望ましい。一般に酵
素をストレプトコツカセェ、ラクトバシラセェ及びべジ
オコッカスから得ることができる。ストレプトコッカス
フアェカリスの培養から得られる酵素は特に好ましく、
前記の菌の特別な菌株はアメリカンタイプカルチャーコ
レクションから入取しうる。特に有用でありかつ好まし
い酵素は、前記コレクションへの寄託に基づき同定した
ＡＴＣＣＩ１７００、ＡＴＣＣＩ９６３４皮びＡＴＣＣ
Ｉ２７５５の菌株から得られる。 以下の例に記載するようにＡＴＣＣＩ２７５５からの酵
素は、他の二つの菌株かち得られる酵素より幾分広いｐ
Ｈ範囲に亘つて活性を示す。次の二つの文献には酵素並
びにそれの調製及び抽出に有用な技法に関する記載があ
る。 Ｋｏｄｉｔｓｃｈｅｋ、Ｌ．Ｋ．及びＵｍｂｒｅｉｔ、
Ｗ．Ｗ．ストレプトコツカス フアエシウム、Ｆ２４の
Ｑーグリセロリン酸オキシダーゼ、ジャーナルオブバク
テリオロジー、Ｖｏｌ．９８、Ｎｏ．３ ｐ．１０６３
一１０６８（１９６９）並びにＪａｃｏｂｓ、Ｎ．Ｊ．
及びＶａｎＤｅｍａｒｋ、Ｐ．Ｊ．“ストレプトコツカ
スフアエカリスＩＯＣＩのＱ−グリセロリン酸酸化酵素
の精製及び性質”。 これらの文献のいずれかに記載の方法に従って製造した
酵素は本発明の首尾よい実施に有用である。総組成が未
知の酵素調製物を用いる時、分析結果を妨害することが
ある汚染物の抽出に注意を払わねばならない。たとえば
、以下に記載のごとく採取するＬ−Ｑ−グリセロリン酸
オキシダーゼのある調製物はかなり高濃度の不純物を含
んでいたので、不望の妨害のない血清トリグリセリド分
析の前に粗調製物を、慣用の分画及びカラム分離技法を
用いて精製せねばならなかった。Ｌ一Ｑ−グリセロホス
フェートの酸化の際生成する過酸化水素の量を定量する
指示薬組成物を用いて、グリセリン及び／又はトリグリ
セリド含有水性溶液、たとえば血清中のグリセリンの検
出を行うことが好ましい。 酵素的に生成する過酸化水素検出用指示薬組成物は業界
周知であり、特にグルコース及び尿酸の酵素的検出にお
ける指示薬組成物として周知である。多数の他の特許の
中で米国特許第３０９２４６５号及び同第２９８１６０
６号にはそのような有用な指示薬組成物に関する記載が
あり、そしてそのような組成物は以下に概説する方法を
用し、てこの明細書に記載の型の要素中へ容易に組み入
れられる。過酸化水素指示薬組成物は一般に、過酸化作
用のある物質、好ましくはパーオキシダーゼ、並びに過
酸化水素及び過酸化作用を有する物質の存在下で色素を
生成するか又は色変化を起こす染料形成性物質から成る
。 別法として染料前駆体は、＆０２及びパーオキシダーゼ
の存在下で酸化の際実質的な色変化をおこさないが酸化
状態で色素成物質か又は色素変化生成物質（たとえば発
色剤）と反応して可視でそして好ましくは定量的な化学
反応の証を生成する一つ又はそれ以上の物質であっても
よい。米国特許第２班１６０６号には特にそのような指
示薬組成物に関する詳細な記載がある。後者の染料前駆
体、即ちカップリング反応により色素を生成する染料前
駆体は本発明の実施に好ましい。パーオキシタトーゼは
過酸化水素が別の物質を酸化する際反応を触媒する酸素
である。 パーオキシダーゼは一般に鉄ポルフィリンを含有する複
合蛋白である。パーオキシダーゼは西洋わさび、じやが
し、も、いちぢくの樹液、かふくら（植物パーオキシダ
ーゼ）、牛乳（ラクトパーオキシダーゼ）及び白血球（
ベルドパーオキシダーゼ）中に存在しまた微生物中にも
存在する。「Ａｃｔａｃｈｅｍ．Ｓｃｃａｎｄ第４巻、
第４２２〜４３４頁、１９５０王、Ｔｈｅｏｒｅｌｌ及
びＮねｅｈｌｙ著」に開示されているようなある合成パ
ーオキシダーゼも満足のいくものである。 へミン、メトヘモグロビン、オキシヘモグロビン、ヘモ
グロビン、ヘモクロモゲン、アルカリ性へマチソ、ヘミ
ン誘導体及びその他の、過酸化作用を示すその他のある
物質はかようなパーオキダーゼに劣る。酵素ではないが
過酸化作用を有するその他の物質には、チオシアン酸鉄
、スズ酸鉄、フェロシアン酸第一鉄、シリカゲルに吸着
させた第二クロム塩（たとえば硫酸クロムカリウム）等
がある。 これらの物質は本質的にパーオキシダーゼ程満足すべき
ものではないが同様に有用である。過酸化水素及び過酸
化作用のある物質の存在下で色素を生成する染料前駆体
は次の物質と必要な場合は発色剤をも含む。 ‘１ー アニリン及びその誘導体のようなモノアミン、
オルトートルイジン、／ゞラートルイジン等、■ オル
トーフエニレンジアミン、Ｎ・Ｎ′−ジメチルー／ぐラ
ーフエニレンジアミン、Ｎ・Ｎ′−ジエチルフヱニレン
ジアミン、ベンジジン、ジアニシジン等のようなジアミ
ン、（３１ フェノールそれ自体、チモール、オルト−
、メター及びパラークレゾール、Ｑーナフトール、８−
ナフトール等のようなフェノール・【４１ カテコール
、グアイヤコール、オルシノール、ピロガーロール、ｐ
・ｐ−ジヒドロキシジフヱニル及びフロログルシノール
のようなポリフヱノ−ル、【５１ サリチル酸、ピロカ
テキシ酸及び没食予酸のような芳香族酸、‘６） ロイ
コマラカイトグリーン及びロイコフェノールフタレイン
のようなロィコ染料、（７｝ ２・６ージクロロフエノ
ールインドフエノールのような着色染料、‘８’ ヱピ
ネフリン、フラボン、チロシン、ジヒドロキシフヱニル
アラニン及びトリブトフアンのような種々な生物学的物
質、【９）グアィャクゴム、グアィャコン酸、沃化カリ
ウム、沃化ナトリウム及びその他の水溶性沃化物、ビリ
ルピン並びに、｛１０ ２・２ーアジンージ（３ーエチ
ルベンゾチアゾリンー■−スルホン酸及び３・３ージア
ミノベンジジンのような特別な染料。 パーオキシダーゼの存在下で過酸化物により酸化可能で
ありそして検出可能なスベシーズを提供しうるその他の
指示薬組成物には、パーオキシダーゼの存在下で酸化さ
れる時それ自体とカップリングするか又はそれの還元形
態のものとカップリングして染料を提供する化合物が含
まれる。 そのような自動カップリング化合物には、オルトアミノ
フヱノール、４一アルコキシナフトール、４ーアミノー
５ーピラゾロン、クレゾール、ピロガロール、グアイカ
コール、オルシノール、カテコ−ルフロログルシノール
、ｐ・ｐージヒドロキシジフェニル、没食子酸、ピロカ
テキン酸、サリチル酸等のような種々なＯＨ基を有する
化合物が含まれる。この型の化合物は周知でありそして
ＴｈｅＴｈｅｏｒｙ ｏｆ 仇ｅ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐ
ｈｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ、Ｍｅｅｓ＆ ＪａｍｅｓＥｄ
、（１９６６）（特に第１７章）のような文献に記載さ
れている。オキシクロム化合物と呼ばれるその他のロィ
コ染料は米国特許第３８８０６５８号に記載されており
そして適切な置換基をもったかような化合物は拡散性で
ありえる。米国特許第３８８０６５８号に記載されてい
る非安定化オキシクロム化合物は本発明の実施に好まし
いと考えられる。好ましい態様ではパーオキシダーゼの
存在下で酸化可能でありそして発色剤と酸化縮合を行い
える、フェノール基又は活性メチレン基を有するような
化合物を含む指示薬組成物によって検出可能な変化が与
えられる。そのような酸化可能な化合物の代表的なもの
にはたとえば、ベンジデン及びその同族体、ｐーフェニ
レンジアミン、Ｐーアミノフェノール、４−アミノアン
チピリン等がある。多数の自動カップリング化合物を含
む広範囲のそのような発色剤はＭｅｅｓ ＆ Ｊａｍｅ
ｓ（前述）及び「Ｋｏｓａｒ、Ｌｉｇｈｔ一Ｓｅｎｓｉ
ｔｉｖｅ Ｓ＄ｔｅｍ、１９６ふｐａｇｅｓ２１５一２
４９」のような文献に記載されている。好ましい染料前
駆体は４−メトキシ−１−ナフトール、２一（３・５−
ジメトキシ−４ーヒドロキシフエニル）一４・５ービス
（４ージメチルアミノフエニル）イミダゾール、１・７
ージヒドロキシナフタリンと４ーアミノアンチピリン（
ＨＣＩ）との組み合せ、及び４ーィソプロポキシ−１−
ナフトールである。 この明細書に記載の要素に有用な種々な指示薬組成物の
成分濃度は、試験下の試料中のグリセリン濃度、検出装
置の複雑性、生成染料等に非常に依存しそして専門家に
より容易に決定しうる。典型的な値を以下の例に示す。
分析組成物のその他の成分濃度も分析下の溶液（即ち血
清（希釈又は未希釈）、グリセリン及び／又はトリグリ
セリドのその他の複雑な水溶液）に依存して広範囲に可
変である。 下記の表１により、この明細書に記載の新規な分析組成
物の種々な成分の一般に有用でかつ好ましい濃度範囲に
関するリファレンスが与えられる。表１ 当然有用な結果がこれらの範囲外で得られることもある
。 前記表１において１国際単位とは、３７０、柵７で１分
間に１マイクロモルの基質を転化する酵素量を意味する
。 業界周知のごとく、それぞれの酵素はｐＨ一活性プロフ
イル（ｐＨの変化による酵素活性の変化を図示的に表示
）を有する。 本発明の新規な一連の反応においてそれぞれの酵素が活
性である最適軸範囲を表０１こ示す。表 ０ 柵一値 リパーゼ ５一９グリセリン
キナーゼ ７一９Ｌ−Ｑーグリセロリン
酸オキシダーゼ ６．３−８．０パーオキシダーゼ
６−８前記表からそれぞれの試薬を含
むこの明細書に記載の要素の層を約６．０と約８．０の
間のｐＨ、非常に好ましくは約７．０と約８．０の間の
ｐＨに緩衝することが一般に望ましいことが容易に理解
されよう。 ある種の酵素しか含まぬ特別な層を、特定酵素の最適ｐ
Ｈを考慮して緩衝することができる。この型の緩衝を行
う方法は業界周知であり、適切な濃度の緩衝液を組成物
中に溶解又は分散させ次いで乾燥して層状要素を構成す
ることから成る。前記ｐＨ値に緩衝するに適切な緩衝液
は仇ｏｄによるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔひ５、４６７（１
９６６）に詳細に記載されている。 特に好ましい緩衝液はリン酸カリウムのようなリン酸塩
である。拡散層 この明細書で用いる「拡散層」という言葉は、液体試料
を受容しうる等方的に多孔性の層か又は別の構造で液体
試料を受容しうる層を意味する。 液体試料は、拡散層へ直接か又は拡散層と流体接触して
いる層を通してそれへ適用するかのいずれかの方法で適
用する。拡散層内では試料及び少くとも一つの溶解又は
分解成分の溶媒又は分散線質が分布し、要素の試薬層に
面する拡散層の表面で前記のような成分は見掛上均一濃
度となる。そのような濃度の均一性は以下に記載するよ
うな技法で測定する。この明細書の全文を通じ、拡散し
た試料成分には当然適用試料中に存在するトリグリセリ
ド、グリセリン又はグリセリンの酸化生成物の一つ以上
が含まれる。厚みにより存在する濃度勾配又は別のファ
クターで拡散層内に存在する濃度勾配に関してそのよう
な均一濃度とすることが可能であることはもちろんのこ
とである。そのような勾配が結果測定の間検出されない
か又は公知の補正方法を用いて調整可能であるならば定
量的試験結果を得るのにそのような勾配が存在にしても
いかなる困難も呈さない。拡散層を等方的に多孔性の層
とすることが出来る。 この明細書で用いる「等万的に多孔性」という言葉によ
り、拡散層内のすべての方向に実質的に多孔性であるこ
とが意味される。そのような多孔性の星度を必要である
か又は所望ならばたとえば孔サイズ、ボイドボニューム
又は他の指標に関して可変であることが理解されよう。
この明細書で用いる、等方的多孔性（ｉｓｏｔｒｏｐｉ
ｃ ｐｏｒｏｓｉｔｙ）又は等方的に多孔性の（ｉｓｏ
ｔｒｏｐｉｃａｌｌｙｐｏｒｏｕｓ）という表現は炉過
膜に関して用いられる表現であるが膿表面間を貫通する
孔を有する膜を示す為にいましば用いられる等孔性（ｉ
ｓｏｐｏｒｏ瓜）又はィオノトロピー性（ｉｏｎｏｔｒ
ｏｐｉｃ）と混同してはならないことを理解されたい。
同様に、膜の少くとも片側にスキンを有する炉過膜を示
す異方性（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ）という表現と反対
の意味で用いられる等方性（ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ）とい
う表現と等方的多孔性を混同してはならない。 たとえば、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏ雛、ＪａｍｅｓＦＩｉ肌Ｅｄ、Ｐｉ
ｅｎ皿 Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（Ｉ９７０）を参
照されたい。 言うまでもなく拡散の度合は拡散すべき液体の容積に幾
分依存している。 しかしながら、拡散により得られる見頚上均一な濃度は
実質的に液体試料容積とは無関係でありかつ拡散の度合
とはかかわりないことを強調しておく。従って本発明の
要素には一般に正確な試料適用技法は必要でない。しか
しながら特別な供試液容積を用いることは、好ましい拡
散時間等の理由により望ましいことがある。これらの要
素により、拡散層の都合のよい大きさの領域（たとえば
１地の領域）内に完全に採取されうる非常に小容積の試
料を用いて定量的な結果を得ることができるので、液体
試料適用の後過剰の水分を要素から除く必要はない。更
に、拡散層内で拡散がおこりそして拡散物質は明きらか
な実質的な横方向瀞圧を受けることなく流体接触してい
る試薬層へ提供されるので、可溶性試薬を用いた時先行
技術の分析要素を用いていまいま見られたリンギング（
ｒｉｎｇｉｎｇ）問題は生じない。拡散層は拡散層が流
体接触する試薬層に面する表面で単位面積あたりに拡散
成分に関して見鞠上均一濃度を生成すればよく、そして
前記米国特許第３９９２１５８号記載の試験法により特
定層が拡散に適しえるかどうか決定するのは非常に容易
である。等方的に多孔性の層を種々な成分を用いて製造
することが出来る。ある態様では粒状物質を用いてその
ような層を製造することが出来る。そのような層は粒子
間の相互連絡空間によって等方的に多孔性になる。分析
下の試料成分に対し望ましくはすべて化学的に不活性で
ある種々な型の粒状物質が有用である。 二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛筆のよ
うな顔料は望ましい。その他の望ましい粒子はケィソウ
士及び天然又は合成重合体から由来する微結晶コロイド
性物質である。そのような微結晶物質は、「ジャーナル
オブポリマーサィェンス、第２巻、第４８１−４聡頁、
１９６７年」に発表された表題が「コロイド性大分子現
象、パートロ、重合体の新規な微結晶、０．んゞディス
タ（Ｂａｔｔｉｓｔａ）等著」に記載されている。 本Ｚ発明に使用するに十分なコロイド性物質にはアピセ
ル■という商品名でＦＭＣ社から販売されている微結晶
セルロースがある。樹脂ビーズ又はガラスビーズのよう
な均一サイズの球状粒子も使用可能でありそしてそれら
は選択的炉過のような均一な孔が有利な場合に特に望ま
しい。選んだ粒状物質がガラスビーズ等の場合のように
粘着性がない場合には、それを処理して接触箇所で互い
に粘着性の粒子を得ることができよって等方的に多孔性
の層の形成が容易になる。例えば適切な処理は次のよう
にして行うことができる。即ち非粘着粒子を、親水性コ
ロイド（たとえばゼラチン又はポリビニルアルコール）
の溶液のような薄い粘着層で被覆しそして層中で相互接
触するようにさせる。コロイド（即ちバィンダ）被覆が
乾燥した時、層はもとの姿を保持しておりそしてその成
分粒子間の開放空間ももとのままである。そのような粒
状物質に替わるものとして又はそれに加えて、拡散層を
等万的に多孔性の連続重合体相を用いて製造することが
できる。 ブラッシユ（ＢＩ雌ｈ）重合体を製造するに有用な方法
を用いてそのような重合体を製造することは可能である
。ブラッシュ重合体層は、重合体を二つの液体の混合物
に溶解させることにより基体上に生成させることが出来
る。前記液体の一方は低沸点の重合体にとって良好な溶
媒でありそして他方の液体は高沸点でありそして、重合
体にとって溶媒ではないか又は少くともそれの不良な溶
媒でしかない。そのような重合体溶液を次いで基体上に
被覆しそして制御条件下で乾燥する。低沸点溶媒はすみ
やかに揮発しそして被覆は、不良溶媒であるか又は溶媒
でない液体中で厚くなることができる。適切な条件下で
の蒸発につれ、重合体は等方的に多孔性な層として生成
する。多くの異なる重合体を単独でか又は組み合わせて
、本発明に用いる等方的に多孔性のブラッシュ重合体拡
散層製造に用いることができる。それらの代表的なもの
には、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリウレタン及
び酢酸セルロースのようなセルロースェステルがある。
広範囲の物質が拡散層として有用である。 しかしながら通常分析下の液体に耐性のある、即ちそれ
らと接触した際実質的に非膨潤性である物質が望ましい
。層の乾燥厚の約１０〜４０％の膨酒が標準的である。
更に等方的に多孔性等の性質を有する有用な拡散層を得
ることは可能であるけれども、灯心効果を回避する為に
拡散層の材料を実質的に非繊維性とすることが望ましい
。 灯心効果とは、繊維状物質から成る拡散層をスベクトロ
フオトメトリー測定の背景又は環境として用いる時繊維
間又はそれに沿ったアナラィトの見掛上不均一分布及び
ぶちを生じる傾向をいう。試薬層 本発明の要素中の試薬層は、拡散層内に拡散可能な成分
へ浸透可能、好ましくは均一に浸透可能でありそしてそ
れが適切な時、場合によっては多孔性である。 本願明細書で用いるように「浸透性」という言葉には、
多孔性、膨潤性又はその他の特性から生じる浸透性とい
う意味が含まれる。トリグリセリド、グリセリン又はグ
リセリンの分解生成物と相互作用のある酵素及びその他
の試薬が分布（即ち溶解又は分散）しているマトリック
ひスを一般にそのような層に含めることが出来る。相互
作用のある物質については以下に記載する。単に検出可
能なスベシーズを受容する集水孔として働く層をこの明
細書ではしジストレーション層と呼ぶ。タ 相互作用の
ある物質（即ち酵素及びその他の試薬）をマトリックス
物質内に溶解又は分散させることにより分布させること
が出来る。 これら相互作用のある物質の均一分布が望ましい場合が
多いが、相互作用のある物質がたとえばリパーゼ、グ０
リセリンキナーダ、Ｑーグリセロリン酸オキシダーゼ等
のような酵素である場合は均一に分布させる必要はない
。これら酵素は反応の際消費されず連続的に再使用され
る触媒として働く。試薬層は拡散層へ均一に浸透可能で
あることが望ましい。 均一流体を層の表面へ均一に提供する時、同一装置及び
同一条件を用いての層表面の種種な領域におけるそのよ
うな流体濃度の測定結果が実質的に等しく（即ち等しく
しうる）なるような浸透性が「層の均一浸透性」という
言葉により意味される。均一浸透性により、たとえばこ
の明細書で記載のような不望の濃度勾配が回避できる。
この明細書に記載のレジストレーション層又は試薬用の
マトリックス材料の選択は当然可変であり、そしてそれ
は要素の目的とする使用方法並びに、以下に記載するよ
うに要素に組み入れる特別な相互作用のある物質に依存
する。 望ましいマトリックス材料には天然及び合成物質の双方
を含む親水性物質が含まれうる。前記天然物質にはゼラ
チン、ゼラチン誘導体、親水性セルロース誘導体多糖類
（たとえばデキストラン、アラビアゴム、アガロース等
）がありそして前記合成物質には、ポリ（ビニルアルコ
ール）及びポリ（ビニルピロリドン）、アクリルアミド
重合体等のような物質がある。セルロ−スェステル等の
ような親油性物質も有用でありうる。ある場合には物質
の選択は特定要素の使用パラメーターとなる。たとえば
プロテアーゼを以下に記載のごとくトリグリセリドの加
水分解を補助するのに用いる場合、ゼラチンは特に好ま
しい試薬マトリックスではない。試薬層の浸透性を強化
する為にもともと多孔性でない場合には、分析下の液体
の分散媒質又は溶媒中で緩徐に膨潤しうるマトリックス
材料を使用することが有用である場合が多い。浸透性に
加えて試薬層には、本発明の一体型要素において得られ
る分析結果検出の際はん点又はその他のノイズとしてあ
らわれるか又はそれらの原因となる性質が実質的にない
ことが望ましい。 紙のような繊維質物質を透過性煤質として使用する時み
られることがあるが、試薬層内のたとえば色若しくは構
造のむらにより検出エネルギーの不均一な反射又は透過
がおこり有利でない。このような事態はたとえば試薬層
内に検出しうる変化が生じそしてそれが検出される時お
こる。フィルター及びその他の紙のような繊維物質は全
体に亘つて浸透性であるけれどもそれらは繊維の寸法及
び空間のような構造的変化に基づき紙の部分、部分の領
域間で多様な浸透性を示す。従ってそのような物質は均
一浸透性であるとは考えられずそしてそういうものとし
て有用ではあるけれども本発明の拡散又は試薬層には好
ましくない。種々な好ましい態様では、本発明要素の拡
散層及び試薬層を非繊維性物質を用いて製造する。もち
ろんのことであるが繊維質物質を非繊維質物質と適切な
組み合せで用いることも可能である。支持体 一体型分析要素を自己支持性とすることが出来るか又は
拡散層、試薬層及び任意のその他の共働層を支持体上に
被覆することが出来る。 このように用いる有用な支持体材料には、紙、ポリオレ
フィン被覆紙並びに種々な重合体状物質がある。かよう
な重合体状物質にはたとえば酢酸セルロース、ポリ（エ
チレン、テレフタレート）、ポリカーボネート及びポリ
スチレンのようなポリビニル化合物がある。支持体は不
透明であってもよいが当然検出様式に依存して光又はそ
の他のエネルギーを透過可能である。用いる支持体はい
ずれの場合も目的とする検出様式と相反さない。好まし
い支持体には約２０血のと約９０仇肌の間の範囲内の波
長の電磁放射線を透過しうる透明な支持体物質がある。
勿論のことであるが透明支持体は２００−９０仇の全範
囲の波長を透過しうる必要はなく指示波長の範囲のみを
透過可能であればよい。要素が支持体を含む場合は、試
薬層を要素の支持体と拡散層との間に位置させる。特に
好ましい本発明要素の透過範囲は、前述の種々な好まし
い指示薬組成物に関する記載から明きらかであろう。 支持体の厚さは、たとえば検出放射線の強度及び検出装
置の感度のような種々なファクターに依存して非常に広
範囲に可変であるけれども支持体の厚さ‘ま約１なし、
し約１０ミルの間であるのが好ましい。その他の層 好ましい態様では本発明の分析要素をスベクトロフオト
メトリー分析の反射技法による分析操作に用いるに適合
させる。 この態様に従ってそのような要素には一般に比色反応又
は他の指示薬反応によるスベクトロフオトメトリー用の
適切な背景を提供する為の反射層が含まれる。支持体を
用いる場合測定は通常支持体側を通して行う。反射層は
トリグリセリド、グリセリン及び／又はグリセリンの分
解生成物が試薬層又は指示薬層（即ちトリグリセリド又
はグリセリンの分解を触媒する酵素を含む試薬層の下に
ある層であって過酸化水素検出用の手段しか含まぬ層で
ある）へ通れるようになっておりそしてそれによりリフ
ラクションスベクトロフオトメトリー用の有効な背景が
提供されねばならない。白色背景は一般にこの目的に好
ましい。試薬層又はしジストレーション層中の指示薬用
の背景としての機能の観点から反射層を通常拡散層及び
試薬層又はしジストレーション層の間にはさむ。しかし
ながら試薬層としジストレーション層との間にあるのが
適切な場合には反射層をそのように配置する。反射性は
たとえば拡散層としても働く層によっても付与可能であ
るしまた、要素内でその他の機能を有さない付加の層に
よっても付与することができる。二酸化チタン及び硫酸
バリウムのような顔料は反射性でありそして反射層に有
利に用いることができる。ブラツシュ重合体も適切な反
射物質を構成することができる。もちろんのことである
が顔料拡散層も、拡散層でもありえるブラッシュ重合体
層がこの目的に有用であると同様にこの目的に有用であ
りえる。ある好ましい態様では、ブラッシュ重合体層に
顔料をも組み込み拡散及び／又は反射を強化することが
できる。ブラッシュ重合体と共に層に含まれうる顔料の
量は非常に可変であり、そしてプラッシュ重合体１重量
部に対し約１ないし約１の重量部の顔料が好ましくプラ
ッシュ重合体１重量部に対し約３ないし約６部が最も好
ましい。炉過層を要素に存在させてもよい。 そのような層の組成及び製造は業界周知である。炉過層
が存在する場合それらは、指示薬反応を妨害又は別のや
り方で定量を妨害する成分を試料から除去する働きをす
る。従って、全血液中のトリグリセリドの分析に多層分
析要素を使用する際、炉過層によって赤血球細胞が取り
去られ、血清は下層へ輸送される。血清又は他の流体を
分析する際、炉過層は、最初の指示反応を妨害又は混乱
させうる不望の成分を除去する働きをすることができる
。前記ブラッシュ重合体層もある環境下では炉過層とし
て機能を果しうる。この要素を全血液の分析に用いる場
合、炉過層の孔サイズは０．５なし、し５ミクロンであ
るのが望ましい。プロテアーゼが作用するゼラチン又は
その他の天然若しくは合成物質のような物質からマトリ
ックスが主に構成されている試薬層中へプロテアーゼを
組み入れることにより、要素へ試料を適用することによ
ってそのような試薬層が湿っているような場合に正常な
蛋白分解反応が生じる。 プロテアーゼ、従って加水分解組成物をゼラチン又は同
様の試薬マトリックス中で含む要素で測定を行うことが
できるけれども、プロテアーゼの作用に耐性のある層中
へ加水分解組成物を組み入れることは非常に望ましく、
更に試薬層又はその他の層のゼラチン（又は類似物）マ
トリックスをプロテアーゼから保護するその他の方法と
して、アナライト浸透性バリア層を要素へ組み入れてプ
ロテアーゼが要素中のゼラチン又はその他の蛋白質含有
マトリックス物質と接触するのを選択的に防ぐ事が非常
に好ましい。この構成では比較的小さな過酸化水素分子
がバリア層を通って下に位置する層へ達しさえすれば検
出反応が行われるように、加水分解組成物の成分を有す
る層中にグリセリン分解酵素を入れることが望ましい。
この構成では大分子のプロテアーゼがプ。テアーゼの形
態をうける層中へ移動するのが妨がれる。場合によって
はグリセリン測定試薬を試薬層へ組み入れてもよく一方
加水分解試薬を拡散層中へ組み入れてもよい。プロテア
ーゼの移動を阻止する為に用いる場合は、バリア層を、
要素の種々な成分と相綾性である広範囲の物質から構成
することができる。好ましい物質には親水性重合体状物
質があり、この物質は記載したごとくプロテアーゼを排
除しながら所望の様式で過酸化水素又はグリセリンが通
れるようになっておりそして系のその他の成分に関し妨
害効果を示さない。保護バリア層として特に好ましいも
のはポリ（イソプロピルアクリルアミド）のようなポリ
（アクリルアミド）樹脂又はアガロースの被覆である。
要素製造 本発明の一体型分析要素製造の際層を単独に予備形成し
そして積層して要素全体を構成することが出来る。 単独部材として製造した層はその表面上を典型的には溶
液又は分散液で被覆しそしてそれから乾燥した層を物理
的にはがすことができる。しかしながら何回ものはがし
及び積層工程の必要性を回避しうる簡便方法は裸表面又
は支持体上に最初の層を被覆し、所望ならその後これら
前もって形成した被覆上へ直接次の層を被覆することか
ら成る。そのような被覆は翼被覆装置を用いて手で行う
か又は浸債被覆若しくはビード被覆のような方法で機械
により行うことができる。機械被覆技法を用いる場合、
感光性写真フィルム及び紙の製造においてよく知られて
いるホツパ被覆技法を用いて隣接層を同時に被覆可能で
あることが多い。中間層粘着問題は、写真フィルムで用
いられるような非常に薄い下塗り層を適用することから
成る表面処理により、有害作用をもたらすことなく克服
することができる。本発明のある態様に従って拡散層が
炉週及び拡散の機能を果す場合には、以下に記載するよ
うに混合有機溶媒に溶解してブラッシュ重合体を提供す
る酢酸セルロースのようなバィンダの二層を同時に被覆
することにより拡散層を好都合に製造する。 そのような方法により、多数回に及ぶ多層の被覆を一回
で行えるようになり一方非常に有用な拡散及び炉過層が
得られるようになる。 場合によっては所望により個々の層双方ともか又は一方
がＴｉ０２のような反射性顔料を層中に分散含有してい
てもよい。このようにして製造する層の物理的構造は一
般に等方的多孔性上層と多孔性下層とから成る。 この多孔性上層は主に拡散層として作用して適用試料の
容積の変動（前述のごとく）にもかかわらずアナラィト
の下層に対する見掛上の均一濃度を提供しそして前記多
孔性下層は主に炉過層として作用する。これら二層の多
孔度は、英国特許第１３４２２８号記載か又は前述のブ
ラッシュ重合体層に関する記載のごとく種々な割合の混
合有機溶媒を用いることにより製造の間に制御すること
ができる。酢酸セルロースをバィンダとして用いた場合
の溶媒の特に有用な配合物は約３．５：２：１．１ない
し４．５：１：０の割合のアセトン、キシレン及びジク
ロロェタンから成る。 拡散層の厚さは可変でありそして目的とする試料容積に
幾分依存し、この試料容積は簡便さ及び清潔さの理由か
ら拡散層が吸収せね‘まならない量であり、更に拡散層
の厚さは、層中に吸収されうる試料量にも影響しうる層
のポィドボニュームにも依存する。約５０ミクロンない
し約３００ミクロンの厚さの舷散層が特に有用であった
。 しかしながら他の厚さも許容可能でありそしてそれは特
定要素にとって望ましいこともある。等万的に多孔性の
拡散層を製造する時、ボィドボリュームが総体積全体の
少くとも約２５％であることが有用でありそして５０−
９５％が望ましい。 多孔性拡散層のボイドボリュームの多様性を有利に用い
て、拡散層の総浸透性又は試料が拡散するに必要な時間
のような要素の特性を改変することができる。たとえば
適切なサイズの粒状物質を選定することによってか又は
拡散層に等方的に多孔性のブラツシュ重合体を用いる時
溶媒若しくは乾燥条件を変化させることによって層内の
ボィドボリュームを変化させることができることが理解
されよう。そのような層のボイドボリュームは、「ジャ
ーナルオブザナシヨナルカンサーインステイチュート、
チャークレィ（Ｃｈａｌｋｌｅｙ）著第４巻、第４７頁
、１９４３王」に記載の統計的方法のような種々な方法
及び層の実際の重量と、層の体積と等しい体積の固体物
質の重量とを直接秤量しかつそれらの割合を決定するこ
とにより適切な精度で計算することができる。前記固体
物質は層の成分から構成されており比較可能である。も
ちろんのことであるが孔サイズはどの場合もトリグリセ
リドを拡散させるに十分でなければならずそしてトリグ
リセリドの分解生成物は、要素中の種々な相互作用のあ
る物質の位置の見地から適切でありうる。マトリックス
を含みかつ相互作用のある物質が組み入れられている被
覆溶液又は分散液をこの明細書に記載のごとく製造し、
被覆しそして寸法が安定な層を試薬層として形成する。 試薬層の厚さ及びその浸透性の度合は広範囲に可変であ
りそして実際の使用に依存する。約１０ミクロンないし
約１００ミクロンの乾燥厚が有用であった。加水分解組
成物を試薬層中に組み入れてもよい。 しかしながら本発明の非常に好ましい態様に従って、加
水分解組成物をたとえば次のような方法で拡散層中に組
み入れる。 即ち拡散層を構成する為に用いる被覆煤質中に凍結乾燥
状態の酵素を分散させ次いでこの混合物を試薬層に被覆
する。この態様に従って試料の拡散及びトリグリセリド
の加水分解は実質的に同時に行われる。そして最初脂肪
酸ェステルか又は遊離のグリセリンとして存在する試料
中のグリセリンは試薬層へ送られる。このような構成に
より試料が拡散するに必要な時間を利用してそれが試薬
層中のグリセリン分析試薬と即座に反応できるようにす
る。別法として加水分解組成物を含む特有な性質を有す
る層を拡散層とグリセリン分析試薬含有層との間に組み
入れて試料がグリセリン検出試薬に達する前で拡散が完
了した後に加水分解を完了させることができる。酵素的
加水分解組成物を組み入れる時はいつでも、組成物のｐ
Ｈを約６と８．０、好ましくは約７．０と８．０の間に
緩衝する時に最適結果が得られる。 かくして加水分解組成物を試薬層中へ組み入れる時か又
はグリセリン検出試薬を有する別の層へ組み入れる時約
７．０のｐＨによって最適結果が得られる。加水分解組
成物が第二の試薬層又は拡散層中に存在する時同様のｐ
Ｈ値を用いる。加水分解組成物を含む層中のリパーゼ濃
度は広範囲に亘つて可変である。 しかしながら一般に約９０００ないし約２７０００Ｕ／
あの範囲内のりパーゼ濃度が有用であることが見し、出
された。このレベル未満では実質的に完全な加水分解は
おこり得ない。多分依然として有用であろうがこれらの
レベルより上の濃度は通常不必要である。本発明の好ま
しい態様に従って約１３０００ないし約２６０００Ｕ／
枕のオーダーのリパーゼを用いる。プロテアーゼをリパ
ーゼと配合して加水分解促進剤として用いる場合、約３
６０００なし、し約１０５０００Ｕ／めの間のレベルで
用いる。好ましい態様に従って約７２０００ないし約９
００００Ｕ／〆の間の濃度でプロテアーゼを用いる。本
発明の要素のその他の成分の濃度に関してこれらのレベ
ルは当然前述のフオクターに依存して広範囲に可変であ
る。この明細書に記載のすべての層を、米国特許第３９
９２１５８号に記載のように溶液又は分散液から被覆す
ることにより製造するのが好ましい。 層へ均一な被覆性質を付与する被覆助剤を含めることが
必要である場合が多い。被覆助剤をこの為又は前述の加
水分解促進と関連した目的の為に用いるいかなる場合も
、それらによって種々な層に存在するりパーゼ若しくは
他の酵素又はその他の試薬が阻害されないことが重要で
ある。 この為に特に有用な被覆助剤には、商品名トライトン（
Ｘ−１００、１０２、１６５、３０５及び４０５カざ特
に好ましい）でロームァンドハース社により販売されて
いるオクチルフェノキシポリェトキシェタノール、商品
名界面活性剤１船でオレィンマチェソン社により販売さ
れている（Ｐーノニルフヱ／キシ）グリセリン並びにユ
ニオンカーバィド‘こより販売されているようなポリエ
チレングリコールがある。当然加水分解促進剤として有
用な界面活性剤は、製造の際物質の被覆特性を改善する
被覆助剤としても働きうる。被覆助剤として用いる時約
０．１夕／わないし１．０夕／あの間のオーダーの界面
活性剤濃度が有用であることが見し、出された。被覆助
剤としての界面活性剤の好ましい濃度範囲は約０．３２
／〆ないし約０．６夕／めの間である。要素の使用 以下に示す例により示すごとく使用の際、通常約５なし
、し約５０〃そのオーダーの滴サイズの試料を、要素の
拡散層又はその他の一番外側の層へ適用する。 通常接触スポット又は遊離の滴として適用する。拡散層
通過の際試料滴は拡散し次いで下部の試薬層へ導びかれ
る。また拡散層又は試薬層通過の際、用いる態様に依存
して適用試料中に含まれるトリグリセリドはグリセリン
へ加水分解されそしてかくして生成したグリセリン又は
試料中に含まれていたグリセリンはグリセリンキナーゼ
と接触してＬ−Ｑ−グリセロホスフェートを生成しそれ
が次々と酸素の存在下でＱ−グリセロリン酸オキシダー
ゼと接触して日２０２を生成する。母０２と反応する指
示薬組成物を介在させることにより生じる検出可能な変
化を公知方法を用いて定量的に測定することができそし
て適用試料中のトリグリセリドノグリセリンの濃度を測
定しう ，る。以下の例により本発明を更に詳細に説明
する。 例１ｐＨ７の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶かした
脱イオンゼラチン２１．５多／で、４ーイソプロポキシ
−１ーナフトール（０．５４夕／め）、５・５ージメチ
ルー１・３一シクロヘキサンジオン（０．１夕／〆）、
アルキルフエノキシポリエトキシエタノール（０．４タ
ノで）、パーオキシダーゼ（６９９４ひ／め）、アデノ
シン５′ートリホスフエートジナトリウム塩（１．３夕
／枕）、Ｑーグリセロリン酸オキシダーゼ（１５０６ひ
／め）及びグリセリンキナーゼ（６４５ひ／力）（ワシ
ントン生化学社からのグリセリンキナーゼは満足な市販
酵素である）から成る試薬層でゼラチン下塗０．１８肋
ポリ（エチレンテレフタレート）フィルムを被覆するこ
とにより血清中にトリグリセリドとして存在する総グリ
セリン含量分析用の被覆要素を製造した。 ポリーｎーィソプロピルアクリルアミド０．３夕／〆を
含む層を試薬層上へ適用しそしてＴｉ０２４５．２夕／
で、酢酸セルロース６．５夕／で、リパーゼ９００ひ／
力及びオクチルフェノキシポリェトキシェタノール５．
４夕／れから成る拡散／反射層を下塗り層上へ被覆した
。これらの濃度成分を用いた場合、拡散層へ適用する血
清との反応は３７ｏ０で５−７分で本質的に完了しそし
てグリセリン又はＬ−Ｑ一グリセロホスフェートとの反
応は３７００において５分未満で完了した。 血清試料（１０山〆）を前記被覆へ適用しそして６６血
のにおける反射濃度を８分後に３７℃で測定した。 標準曲線（第２図は日２０２、水性グリセリン及びＬ一
Ｑ−グリセロホスフェートから標準曲線（第２図を作製
した。 血清の総グリセリン濃度をその曲線から測定した。被覆
へ適用した１０ムクの水から得られるＤＲをそれぞれの
場合に引いた。この被覆系による血清トリグリセリド定
量の結果とＫｅｓｓｌｅｒ及びにｄｅｍｅｒの半自動化
化学法による結果との比較を表ｍに掲げた。これら二法
の間には良好な相関関係があり、被覆要素が血清トリグ
リセリド試料に定量的に応答することが示された。表ｍ 例２ 例１に記載の要素を例１に記載の操作に従って反復試験
した。 二種のことなる量の血清トリグリセリドを用いた。正常
なしベルでは９０のｏ′ｄ‘の含有量であり高レベルで
は５６０ｍ９／ｄ‘の含有量であった。このデータ一の
結果を表Ｗに掲げた。表Ｎ これらの試験結果は、本発明の分析要素を液体中のトリ
グリセリド含量分析に用いた時のそれの定量的応答を示
す。 この明細書に記載の本発明要素を、それの水性液中のグ
リセリン又はトリグリセリド含有分析に関連して記載し
たけれども、この要素を製造してＬ一Ｑ−グリセロホス
フヱート又はＡＴＰを定量可能であることは明きらかで
ある。 更にＬ一Ｑ−グリセロホスフェート及びＡＴＰのどちら
かの製造の際カップリングするグリセローリン脂質、ホ
スホエノールピルベート、リパーゼ又はグリセリンキナ
ーゼのような化合物も定量可能である。本発明をその好
ましい態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神
の範囲内でその改変が行いえることが理解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に従った要素の断面略図である。 第２図はこの明細書に記載の型の典型的な要素に関する
標準曲線を示す。打ＺＧ／ （Ｚ６ ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 拡散層及び試薬層を有し、かつ （ａ）トリグリセリド加水分解能のあるリパーゼ（ｂ）
   グリセリンキナーゼ（ｃ）アデノシン三燐酸 （ｄ）α−グリセロリン酸オキシダーゼ及び（ｅ）電子
   受容体を含む液体試料中のトリグリセリド検出用一体型
   多層要素であつて、拡散層へ適用する液体中に含まれる
   トリグリセリドが加水分解してグリセリンになり、この
   グリセリンがＬ−α−グリセロホスフエートに転化しそ
   してこのＬ−α−グリセロホスフエートの酸化に伴い電
   子受容体が還元されて検出可能な変化が得られるように
   前記物質（ａ）ないし（ｅ）を配置したことを特徴とす
   るトリグリセリド検出用一体型多層要素。 ２ リパーゼと共に相溶性界面活性剤であるエフエクタ
   ー又はプロテアーゼを併用した特許請求の範囲第１項記
   載の要素。 ３ 電子受容体を、２・６−ジクロロフエノールインド
   ールフエノール、２−（Ｐ−インドフエノール）−３−
   （Ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニル−２Ｈ−テトラ
   ゾリウムクロリド及び酸素から成る群から選ぶ特許請求
   の範囲第２項記載の要素。 ４ 拡散層及び試薬層を載置した支持体を更に含み、試
   薬層を支持体と拡散層との間にはさむ特許請求の範囲第
   １項記載の要素。 ５ 拡散層がリパーゼ及びプロテアーゼか又は相溶性界
   面活性剤であるエフエクターを含む特許請求の範囲第４
   項記載の要素。 ６ α−グリセロリン酸オキシダーゼを、連鎖球菌族、
   乳酸桿菌族及びペジオコツカスから成る群から選ぶ微生
   物源から採取する特許請求の範囲第１項記載の要素。 ７ α−グリセロリン酸オキシダーゼをストレプトコツ
   カスフアエカリスから採取する特許請求の範囲第６項記
   載の要素。 ８ 過酸化作用のある物質並びに過酸化水素及び前記過
   酸化作用を有する物質の存在下で検出可能な変化を引き
   おこす染料前駆体を含む指示薬組成物を更に有する特許
   請求の範囲第４項記載の要素。 ９ 過酸化作用を有する物質がパーオキシダーゼである
   特許請求の範囲第８項の要素。 １０ 染料前駆体が、過酸化水素及びパーオキシダーゼ
   の存在下で酸化されて着色染料を生成するロイコ染料を
   含む特許請求の範囲第９項記載の要素。 １１ 染料前駆体が過酸化水素及びパーオキシダーゼの
   存在下で酸化されて無色の生成物を生成しそれが次々に
   発色剤と反応して、存在する過酸化水素の量に比例して
   着色生成物を生成する物質が染料前駆体に含まれる特許
   請求の範囲第９項記載の要素。 １２ 染料前駆体が４−アミノアンチピリン及び１・７
   −ジヒドロキシナフタリンを含む特許請求の範囲第１１
   項記載の要素。 １３ （ａ）トリグリセリド加水分解能のあるリパーゼ
   （ｂ）グリセリンキナーゼ（ｃ）アデノシン三燐酸 （ｄ）α−グリセロリン酸オキシダーゼ及び（ｅ）過酸
   化水素指示薬組成物を含む一体型多層要素であつて、適
   用液体中に含まれるトリグリセリドが加水分解してグリ
   セリンになり、このグリセリンがＬ−α−グリセロホス
   フエートに転化しそしてこのＬ−α−グリセロホスフエ
   ートが電子受容体の存在下で酸化され、過酸化水素が生
   成し、そしてその過酸化水素が指示薬組成物と接触して
   検出可能な変化をもたらすように前記物質（ａ）ないし
   （ｅ）を配置する特許請求の範囲第１項記載の一体型多
   層要素。 １４ リパーゼと共に相溶性界面活性剤であるエフエク
   ター又はプロテアーゼを併用した特許請求の範囲第１３
   項記載の要素。 １５ 拡散層及び試薬層を載置した支持体を更に含み、
   試薬層を支持体と拡散層との間にはさむ特許請求の範囲
   第１３項記載の要素。 １６ 拡散層がリパーゼ及びプロテアーゼか又は相溶性
   界面活性剤であるエフエクターを含む特許請求の範囲第
   １５項記載の要素。 １７ リパーゼが、リゾプスアルヒゾス、カンジダール
   ゴサ及びクロモバクテリウムビスコサムから成る群から
   選ぶ源からの微生物リパーゼである特許請求の範囲第１
   ６項記載の要素。 １８ プロテアーゼを、ストレプトミセスグリセウム、
   アスペルギルスオソゼー及びバチルスサブチルスから採
   取するキモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、ブロ
   メライン及びその他のプロテアーゼから成る群から選ん
   だ特許請求の範囲第１６項記載の要素。 １９ 相溶性界面活性剤をオクチル及びノニルフエノキ
   シポリエトキシエタノールから成る群から選んだ特許請
   求の範囲第１６項記載の要素。 ２０ 相溶性界面活性剤は、親水性親油性バランスが約
   １５未満でポリオキシエチレン鎖中の炭素原子の数が２
   ０未満の界面活性剤である特許請求の範囲第１９項記載
   の要素。 ２１ グリセリンキナーゼが大腸菌か又はカンジダミコ
   デルミアから採取したものである特許請求の範囲第１３
   項記載の要素。 ２２ α−グリセロリン酸オキシダーゼを、ストレプト
   コツカセエ、ラクトバシラセエ及びペジオコツカスから
   成る群から選ぶ微生物源から採取する特許請求の範囲第
   １３項記載の要素。 ２３ α−グリセロリン酸オキシダーゼをストレプトコ
   ツカスフアエカリスから採取する特許請求の範囲第２２
   項記載の要素。 ２４ 過酸化作用のある物質並びに過酸化水素及び前記
   過酸化作用を有する物質の存在下で検出可能な変化を引
   きおこす染料前駆体を含む指示薬組成物を更に有する特
   許請求の範囲第１５項記載の要素。 ２５ 過酸化作用を有する物質がパーオキシダーゼであ
   る特許請求の範囲第２４項記載の要素。 ２６ 染料前駆体が、過酸化水素及びパーオキシダーゼ
   の存在下で酸化されて着色染料を生成するロイコ染料を
   含む特許請求の範囲第２５項記載の要素。 ２７ 過酸化水素及びパーオキシダーゼの存在下で酸化
   されて生成物を生成しそれが次々にその他の物質と反応
   して着色生成物を生成する物質が染料前駆体に含まれる
   特許請求の範囲第２５項記載の要素。 ２８ 染料前駆体を、２−（３・５−ジメトキシ−４−
   ヒドロキシフエニル）−４・５−ビス（４−ジメチルア
   ミノフエニル）イミダゾール、４−イソプロポキシ−１
   −ナフトール及び、４−アミノ−アンチピリンと１・７
   −ジヒドロキシナフタリンとの組合わせから成る群から
   選ぶ特許請求の範囲第２７項記載の要素。 ２９ （ａ）支持体、 （ｂ）トリグリセリド加水分解能を有するリパーゼ及び
   エフエクターとしてプロテアーゼか又は相溶性界面活性
   剤を含む拡散層並びに（ｃ）グリセリンキナーゼ、アデ
   ノシン三リン酸、α−グリセロリン酸オキシダーゼ及び
   過酸化水素と接触の際検出可能な変化を引きおこす指示
   薬組成物を含む試薬層から成る要素であつて前記試薬層
   が支持体と拡散層との間に位置する特許請求の範囲第１
   項記載の要素。 ３０ （ａ）支持体、 （ｂ）トリグリセリド加水分解能を有する微生物リパー
   ゼ及びエフエクターとしてプロテアーゼか又は相溶性界
   面活性剤並びに（ｃ）大腸菌か又はカンジダミコデルミ
   アから採取したグリセリンキナーゼ、アデノシン三リン
   酸、ストレプトコツカスフアエカリスから採取したα−
   グリセロリン酸オキシダーゼ及び、過酸化物とパーオキ
   シダーゼの存在下で検出可能な変化を生成する染料前駆
   体とパーオキシダーゼとを含む指示薬組成物から成り、
   更に試薬層が支持体と拡散層との間に位置し、そして液
   体試料が血清である特許請求の範囲第２９項記載の要素
   。