JPS5892853A - 多層膜及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、電気化学的センサーに用いて好適な多層膜及
び該新規な多Ｆ−膜の製造方法に関する。

嘆は、・ｌ常、ポーラログラフセルと称される（以下に
おいては、そのように称する）電気化学的分析’を位差
測定用セルにおいて練剤される。これらのヒルは、未知
物質を、セルからの電気的信号によって測定しうる物質
に変換する酵素を含んでいる。多種多様な分析技術及び
センサー類が、各種物改の測定に゛利用可能である。医
学的分野に特に重要なことは、血液等の体液、体組織、
食物等・、て含まれる各種物質のけ瞼分析で゛ある。こ
のような′＊Ｊ質には、グルコース、尿素、尿酸、トリ
グリセリド類、リン脂質類、クレアチニン、アミノ酸二
！１１、乳酸、キサンチン、コンドロイチン等がある。

血中又はその他の体液中のグルコース濃度を制御父は監
視するためめセンサーの開発は、糖宋病壱者ノ正常す血
中グルコース濃度を維持するために、特に重要である。

通常、血液試料’−ｔ、生成した過酸化水素のポーラロ
グラフイによるへ１１定器（・鑓出器）を備えたグルコ
ースオキシダーゼを極を用いて、グルコース濃度をオン
ライン分析するために患者から採取される。通常、この
よりな…１１１１定器、陽極、陰極、電解質、及びｌ＠
定化酵素金含む特殊な組成の膜を備えた、過酸化水素測
定用酵素電極から成る。

酵素は、測定すべき未知物質自体が電気化学的に不活性
であっても、その未知試料の酵素による変換又は反［ζ
により、得られる生成物が測定可能となる場合、即ち、
ポーラログラフイーを用いる手段によって測定可能とな
る場合には、ポーラログラフセルと共に使用されてきた
。前述したように、医学的に嶌要な最も一般的な問題は
、血中グルコースを測定せんとする要請である。即ち、
グルコース自体が電気化学的に不活性であるという点に
問題がちる。しかしながら、グルコースオキシダーゼ存
在下、次の反応：即ち、 水素（市０り が起こる。この反応により生じる過酸化水素は、ポーラ
ログラフ測定器により測定可能であり、その哨果、適当
な検量及び計算によって、遊離したＨ２Ｏ１Ｉｔから、
もとの試料中のグルコース量を測定することが口Ｔｅじ
となる。

一般に、４−ラログラフセルは、電気的絶縁性のくダ器
、嘆と電気的に接触してい、る指示もしくは感知電極及
び線膜と電気的に接触している参照電匝とから成る。１
接触”という表現は、膜と電極との接触が、直接的に又
は電′ｐｓ質層を介してなされている場合を含むもので
ある。各種形態のセルが従来技術において広く知ら゛れ
、また認められている。本発明の目的のために特に好適
なセルは、クレメンス（Ｃｌｅｍｅｎｓ）らの米国特許
第４，０９２，２３３号に示されている。

従来技術では、酵素膜の構造に関して、第２の親水性膜
を第１の前記した膜から一定の距離を置いて　配置する
ことが知られている。両膜間の空間には、高濃度の酵素
層が介在する。第２の膜の開放面社、被検物質が接触す
る試験表面となる。

この糧の酵素膜は、ザ・ニューヨークアカデミー−オブ
・サイエンス（ｔｈｅ　Ｎｅｗ　ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅ
ｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ）の年報、１０２．２９−４
９（１９６２）に記載されてい、る。この論文には、ｐ
Ｈ感知電極が反応により生じたグルコン酸を測定するた
めに使用されることが示されている。その装置では、酵
素が２つの酢酸セル口“、−黒膜間−に捕捉されている
ことが開示されている。グルコースは膜を介して拡散し
、更に酵素によってグルコン酸に変換され、しかる後、
グルコン酸はｐＨ感知ガラス側へ向かう方向と供給〔ド
ナー（ｄｏｎｏｒ）　）溶液側に戻る方向へと拡散する
。

感知電極に面する前記第１の膜は、感知電極が感受性を
有する物質が透過し得る物質から成る。

例えば、この膜は、酵素反応基質に対して透過性である
が、酵素自体に対しては非透過性である。

それがキュプロファン（Ｃｕｐｒｏｐｈａｎｅ）からで
きていてもよいが、反応生成物の一つが常温常圧下で気
体であって、この気体を介して測定することが望まれる
場合には、線膜は、イオンに対して非透過性であるが酸
素、二酸化炭素又はアンモニア等の気体に対してわずか
に透過性である親水性合成樹脂から成っていてもよい。

シリコンゴム、テトラフルオロエチレン等をはじめとす
るこのような性質を有する各種の合成樹脂が知られてい
る０クラーク（Ｃ１ａｒｋ）により開発され、米国特許
第３．５３９，４５５号に記載された新型のプーラログ
ラフセルにおいて、酵素は、膜の電極側に配置され、白
金電極が生成した過酸化水素をｑｌＪ定している。グル
コースは低分子量で、膜を通過し、酵素と反応するが、
カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等の高分子物質は阻害さ
れて通過しない。・４素分子を保持するに十分大きな空
孔を有する多孔質フィルム上に酵素を置くことによって
、プラチナ表面と膜との間の薄いフィルムに酵素がｉＩ
Ｍ保持されることが開示されている。しかしながら、セ
ロファン膜は、尿酸又はアスコルビン酸ｆ等の低分子量
阻害物質が感知電極に達するこ−とを防止することはな
い。クラークは、２個の電極装置がその問題を克服する
ことを示唆している。補償電極が、ｌ算累非存在下で阻
害物質に関する信号を発し、一方、酵素電極が過酸化水
素及び阻害Ｉ物質を検出する０計算値から、グルコース
濃１度が決定される。しかしながら、その２つのセンサ
ー装置においては、２つのセルの整合に問題がある。

そこで、尿酸、アスコルビン酸等の低分子量阻害物質の
通過を防止し、一方、最小限の妨害で過酸化水素を通過
せしめ得る薄いフィルター膜を用い九酵素電極を使用す
ることが提案された。ここに、過酸化水素は通過させる
が、阻害物質に対しては。有効なバリヤーであるシリコ
ンゴム、酢酸セルロース等の膜物質があげられる。この
種の膜は、感知成極と感知系の幾つかの溝成物との間に
載置しなければならないので；嘆は、セきるだけ速やか
に測定平衡となるように、選択性を保持しつつ可９ヒな
限り薄くなければならないｏｉｌ酸化水素感知針の揚台
、この膜は２μ未満の厚さであｉことが必要である。し
かし、このような厚さの膜は、強度が不十分であるため
、実用化が困難でちる。そこで、多孔質基材上に薄層上
に上記物質を付着せしめることにより、所要の強度を付
与し、同時に過酸化水素の通過を−はとんど妨害しない
ようにする試みがなされた。かくして、弱い阻害物質の
排除層を薄くして、反応速度を高めることができる０ニ
ユーマン（Ｎｅｗｒｎａｎ）の米国特許第３，９７９，
２７４号に記載されているように、積層された二重の薄
膜に；いて、酵素接着剤が、繭二重の層を互いに結合す
るために使用されている。この膜は、基質の拡散を抑制
しさらには、高芥子量物質及び未知物質と反応し、かつ
層を互いに結合するための酵素調製物のバリヤーとして
働く支持層、並びに低分子量物質を！’ｆ４　ｒＬする
バリヤーとして作用するが、・ＪＡ酸化水素を通過させ
る実質的にＩ−Ｉ實な「−を含む。

しかしながら、これを開発するに当っては、酵素が接着
剤文は結合剤として作用する＊＊’補をその間に介在さ
せた２つの膜からなるサンドインチ構造を形成すること
が必要である。この浦のイ；告のものでは、酵素の使用
が多すぎると、拡散（の拡散速度が許容できない強度に
まで低下する。゛より薄い酵素、鳴を用いると、許容し
テ梯る拡攻聞となるが、酵素の充填量は十分ではなくな
るＯＴ能性がある。

さらにその後、英国特許第ｘ、４４２．３０３号（放射
計）において新たなる展開が見られるが、これによれば
、一単位として形ｈ２されたイ（均質膜である複合膜が
提案されている。この膜は２つの異なった層を有し−一
つは５μ以下の厚さを有し、他は強度を維持するために
十分なＩｌｌさを有している。酵素は嘆の表面に結合し
ている。他の先行技術は多くの欠点を示していた。

コヤマらの方法〔アナリチイカ・ケミカφアクタ（Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｅｍｉｃａ　Ａｃｔａ）、　１１
６　、３０７−３１１（１９８０））は、グルコースオ
キシダーゼを酢酸セルロース膜に同定している。この方
法は、多くの時間を費やす。即ち、多くの工程を含み、
しかも、単分子層が最大限可能な酵素量を担持させると
いう点において難点があった。

ザ・ジャーナル・オプ・バイオ、メディカル・マテリア
ルス・リサーチ（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉ
ｏｍｅｄｉａａｌｔＶｌａｔｅｒｉａｌＳＲｅｓｅａｒ
ｃｈ）　、　１３　、９２１−９３５（１９７９）にお
いて、ウィンが−ド（Ｗｉｎｇａｒｄ）らは、酵素の固
定化のために、プラチナのスクリーン又は線条を開示し
ている。この方法は、コヤマらの方法よりも大きな面積
が結合に利用されることを可能にしたもので、それ故、
更に多量の酵素分子を存在させることが可能となるであ
ろう０しかしながら、ウィンが−ドの試みは、酵素の単
分子層に限られるし、また、プラチナ線条め表面近傍の
みに分いて、プラチナ製スクリーンの開放空間を通して
拡散する基質の速やかな変換速度が維持されうるにすぎ
ない。このため、この先行技術は、以下の本発明に従っ
て行なわれるように、酵素が、基質が拡散する膜全体に
空間的に分布され、かつ理論的に可能な変換速度を浸酸
することができない。

本発明（てよれば、ポリマーと酵素とつ１らなる複数の
層から形成された多層膜が提供され、それら　　　゛複
数の層は、協働して、従来技術（（おける問題を克服す
ることができる。本発明の積層技術ま、従来の単層酵素
層がす／１ドイツチ構造で挟着された三層膜の使用上に
みられる問題を生ずることなく、複合多層構造中に存在
するより多くの酵素を利用することによって、酵素分ｉ
調製物の利点を引き出すことができる。

酵素が複数の層に亘って存在するため、酵素の全体的な
分布は均一になるように思われ、その丸め、各個々の層
に生じる不均一性が除去されるという点に、本発明の大
きな利点がある。

加えて、個々の層における異常酵素濃度によって起きる
、分析対象物の拡散′における重大な障害は、複数の酵
素含有層に亘る分散対象物の全体的な拡散１（よって相
殺され、不連続的なあるいは異常・・−％い酵素濃度は
効果的に均一化される。

本両明の原理を、グルコース含量についての血液分析を
例にとって詳述する。しかしながら、本発明は各機酵素
系、？リマー膜組成物に適用され、□・：Ｊられた多ｉ
ｌＩは、各種組成についての多数の液体の分析に使用し
うるものである。血液の液体部分は、蛋白質、脂質、そ
の他の物質か・ら成る。非等）などが存在し、＜解質と
しては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）及び各種の金属
塩（ナトリウム、カリウム、マグネンウム、カルシウム
、鉄及び銅等の陽イオン並びに塩素化物イオン、リン酸
イオン、電炭酸イオン、並びに炭酸イオン等の陰イオン
から成る）等がある。リン酸塩、災酸塩及び＋ｉ　ｌ、
Ｑ酸塩は、正常な通常の粂件下で、血液のｐＨを一定値
に維持するための緩衝剤として作用する０仮に、血液試
料がセル中の膜の片側に配置され、かつグルコースオキ
シダーゼ及び酸素の水溶液が膜の他の側に配置されたな
らば、ある低分子量゛吻質は、血液から膜を通過してグ
ルコースオキシダーゼ溶液に移行するであろう。しかし
、酵素等の高分子量物質は嘆を通過しない。各種物質の
膜透過速度は、嘆の性質によって一定となる。適宜物質
を選択して、所望の分子量、例えば約３００で分子を分
割するような膜を調整することが可能である０このこと
は、約３００以上の分子量を有する物質は通過しないと
いうことを意味する。

・低分子量物質であるグルコースは、膜を通過シ、酸素
の存在下、グルコースオキシダーゼと反応して、グルコ
ノラクトン及び過酸化水素を生成する。水の存在下で−
、グルコノラクトンは、自然に加水分解してグルコン酸
を生成する。

グルコン酸及び過酸化水素は、グルコースオキシダーゼ
に比べて比較的低分子量の物質であり、膜を通過する０
速やかに）ｈ　Ｏｔに分解し得る情分子１１： 量の酵素であり、また年代学的液体中に存在しているペ
ルオキシダーゼ及びカタラーゼは、嘆を通過できない。

以上、例示的に説明したが、本祐明で（・寸、液体中ヅ
）各種成分の分析に、′仔適な酵素ならばいかなるもの
でも使用できることが理解されよう。

本＼ろ明では、多Ｉ１１＃膜は電気化学的分析用セルに
１・用され、このセルは米国特許第４，０９２，２２３
号ｊ／ｆ示されて１＾るように、一般に、絶縁性容器、
陽嘱及び陰極から成る。本発明の膜は、クラーク（Ｃ１
ａｒｋ）、米国特許第３，５３９，４５５号のようなよ
り古い型式の装置−にも使用され得る。この型の装置は
、容器内で一定の間隔に保たれた感知電極（陽極）と−
参照電極（陰極）とを利用するもので、参照電極は、感
知電極から隔離され、また電解質を保持できるようにさ
れている。膜は電気的に電険と接触しており、電流は陽
極と陰極との間に。

又は参照電極と感知電極との間に流れる。また膜につい
ては以下に記載されているとおりである。

本発明の多層膜は、複数のポリマ一層もしくは゛　ポリ
マー相及び複数の酵素含有層もしくは酵素含有相によっ
て特徴づけられる。核層の混和又は拡散が起こると考え
られるため、噛及び相という語は、接触面で相互作用全
村こす層を意味ｊ−１相互に置き換えられて使用される
。通常、多ｉ→嗅（寸、少すくとも１つの叱較的高密度
のポリマニＩ橿、比較的高密度の複数のヂリマニ層及び
代数の酵素含有層から成る。かくして、幾つかのポリマ
一層が酵素層（でよって隔離されている。

本発明の特徴は、積層膜がその２つの最外層の１つとし
て、比較的高密度のポリマ一層を含んでいることである
。該層すなわち外＋４は、適当なポリマーを溶媒に溶解
し、ついで（８られた溶液を適当な物質の表面に拡げる
ことにより形成される。

この点に付、例えば、アセトンに酢酸セルロースを溶解
することがあげられる。溶媒にポリマーを溶解してフィ
ルムを形成することにより、溶媒／非溶媒混合物中にポ
リマーを分散して形成される他の、ｊｅ　＋７マ一層と
比べて比較的高密度である層が得られる。高密度ポリマ
ーから成る皮膜１は、低密度層の露出１表面上に形成さ
れるが、該・・−（密度層は、破酸、アスコルビン酸及
び非ガス状高分子等の中寄物質が感知電極側に移行する
ことを阻止し、−〃、溶媒及び例えば、酵素反応生成物
（過酸化水素など）等の低分子量の種を通過させるとい
う機能を有する。

高密度ポリマ一層の製造に使用されるポリマーとして、
特に酢酸ポリマーを例示したが、従来膜形成用として公
知の酢酸セルロースのコポリマー寺からも、この様な性
質を示す膜を製造することができる。

一１定時間を短縮するには、基１−膜の全体的な厚きは
、彼測定物の種類により異なるが、約７０μを超えない
ことが好ましいことが判っている。本発明の多層膜にお
ける各層は、厚さを広範囲に変え得ることが理解される
であろう。とのように、高密度層は、低密度多孔性ポリ
マ一層と比べて、比較的薄い。これらは、同じ厚さであ
ってもよい。

ある条件下では、低密度多孔質１−は、高密度層より薄
くてもよいが、一般に、高密度層が低密度多孔Ｗ層より
も薄い。

４疼フイルム工業用に使用されるような多層フィルム形
成装置を、本発明の多層膜形成用に使用する仁とができ
る。膜は、各層が必ずしも明確に区別されない複数の相
から成るが、しかし、複数の相は、各々が別個独立に形
成される場合、多１−中において比較的多孔性のいくつ
かの相及び、最終的な多層膜において比較的非多孔性で
かつ高密度であって、多層膜において血液試料等の試料
に面する相を着するという特徴がある。この発明の詳細
な説明の目的のために、この高密度層のことを、嘆の最
外層と呼ぶことにする。

積層膜において、各種構成物又は層の気孔率及び厚さは
、それらが互いに接合されるので、変わりうる。一般に
、２つの隣接層の接触部分には拡散領域が存在する。比
較的高密度の層１は、これよりも多孔性で低密度の層と
同様のポリマーから形成される。各／　ＩＪママ−間に
は、ＰＩＩ素含有層が設けられている。加えて、比較的
多孔性のポリマ一層全体には、微粒竿状分散型酵素又は
カブセル保護型酵素が均一５４散されている。しかしな
がら、核酵素は、多層膜全体に分散せしめてもよい。積
層膜を形成する各相又は層の性質は、これらを個々別々
に形成した場合、次の通りである。即ち、比較的多孔性
・で高密度の？リマー相は、これだけを形成して試験し
た場合、分子量を特定の値、例えば、約３００で分割す
る。また、多孔性ポリマー相は、これだけ・を形成して
試験した場合、それが形成された表面に隣接する物質の
表面上において酵素書質を自由に通過させるが、大きな
蛋白質等の巨大分子を遮断゛ｒる〇 分析物の検出に際し、所望の性質を付与するために、本
発明の偵は、多段階の工程で製造される。

例えば、比較的高密度の膜すなわち第１構成物は、膜と
相互作用又は結合しない適当な表面上に、酢酸セルロー
ス等の適当□なポリマーをアセトン等の溶媒に、溶解−
て成る溶液を塗布又は展開することにより形成される。

フィルム形成用基材の代表的な表面は、ガラス及びポリ
エチレン等のある種の合成樹脂である。フィルムは、従
来公知のフィルム形成Ｉｔを用いて形成され、それによ
り、得られたフィルムの厚さを゛制御することが可能で
ある。

該表面上に展開した後、形成フィルムは乾燥される。こ
の薄いフィルムは、比較的非多孔性の相として働き、又
、よ快多孔性の相と比べて薄くてもよい。該相の厚さは
、一般に２〜５μの範囲であるが、咳フィルムの大きさ
は、本発明の目的に応じて、限定されない。

複数の比較的多孔性の層は、適当なポリマーを混合溶媒
に溶解してフィルムを形成することにより製造される。

多孔質層形成用混合溶媒は、７Ｆリマー用溶媒とポリマ
ー用非溶媒とを含む。混合溶媒は、相を変換して相に孔
を形成することができるようなものである。

相変換型ポリマ一層は、上記のように形成されるが、比
較的高密度の層の表面に直接形成してもよい。画形成用
溶液は、同一のポリマーを含んでいてもよく、好ましく
は同一の溶媒が使用されていてもよいので、接触面又は
境界面には両者の拡散領域が形成され、その結果、両相
間には明確な区別がなくなる。まず高密度フィルムを形
成することが好ましいが、確かに、形成順序を入れかえ
てもよい。第２のフィルムが第１のフィルム上に形成さ
れる場合、第１のフィルムは必ずしも乾燥していなくて
もよい。即ち、＃ｃ１のフィルムが指触による粘着性を
有していてもよい。この場合には乾燥後に該フィルムの
上面に皮（莫が形成されると考えられる。

第１の＃構成物又は高密度層を形成する之めの酢酸セル
ロース等のポリマー溶液は、酢酸セルロースポリマーを
ケトン等の不活性有機溶媒に溶解することにより調製さ
れる。典型的なケトン溶媒としては、例えば、アセトン
、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン等があげられ
る。溶解し合う溶媒の混合液も使用可能である。溶媒中
のポリマー・１度は、１〜５チ好ましくは２〜３％の範
囲である。該フィルムは、１〜１０μ、好ましくは２〜
５μの厚さを有する袋路生成フィルムを製造できる、適
当なフィルム塗布器を用いて製造さ・ルる。

本°也明の多Ｉ−嘆のうち、比較的多孔性な部分である
後者の相変換構成物すなわちｉ２の層は、ケトン等の不
活性有機溶媒中で、酢酸セルロース又は他の適当なポリ
マー溶液を調製することにより製造される。次に、ポリ
マー用の非溶媒又は非溶媒混合液をポリマー溶媒の溶液
と混合する０酢酸セルロース等の具体的なポリマー、及
び、列えはエタノール、水等の具体的な非溶媒には制限
はなく、他のものを使用してもよい。ポリマーとして酢
酸セルロースを使用する場合は６、水と混合された低級
アルコール類が本目的のためには好ましい。

本発明においては、複数の低密度ポリマー！−が多層膜
中に設けられ、破膜の各層は、中間の酵素層により隣接
層どうしが隔離されている。該酵素層は、分散を容易に
する添加剤を含むことがある酵素水溶液又は懸濁液から
形成されてもよい。一般に、最外層すなわち最上層は、
低密度層又は多孔性ポリマ一層の片側もしくは一方のを
面上に形成される比較的高密度の層である。そして、次
の層は、酵素層であり、次が別の多孔性、１？　リマー
Ｉ−１更にその次が別の酵素ｆ−１等々となっている。

・撥 以上に記載したように、該積層技術（ｌこよれば、膜全
体に多電の酵素を添加で縛るという酵素添加調製上の利
点が発揮され、その結果、高い基質変換速度が得られる
。そのため、従来の酵素積層技術に与られた欠点を生じ
ることなく、これが達成される□これら欠点には、あら
ゆる不均一性が含まれる。即ち、ある部分における間隙
もしくは空隙、他の部分での酵素の凝集、及び凝集酵素
部分での拡散抑制による分析対象物の移行阻害である。

４−′晴朗の多層膜において繰り返し酵素層を設けた場
合は、微視的には、酵素層のある一層において酵素の不
均質分散が生じたとしても、全体的に平均化され、巨視
的には、−均一に分散された状態となる。このように、
酵素が多層になっている結果、該嘆及面の主軸に平行な
面上の単位面積当り、実質的に等しい酵素量が含まれる
ことになる。

いかなる１つの酵素層の酵素濃度範囲に関する分析対象
物の拡散障害も複数の薄ａ＃素層を設けることにより、
最小限にすることができる。同時に、１つの１ヅい独立
した酵素層を設けたとした場合よりも、より多層の酵素
を嘆全体に包含せしめることができよう。

図から明らかなように、各層の個数及び厚さを、所望の
移行特性及び系応答特性に志じて、例えば第３図のよう
に変更してもよい。四に、多種類の酵素を一つの多層膜
中で用いてもよいことは明白であろう。

またフィルム厚を変えたり、高密度相並びに低密変相の
膜を組合せて利用することにより（＄４図参照）、単に
１層又は２層用いるだけでは容鳩に得られない多様なフ
ィルム気孔時、性が得られる０ある場合には、酵素は、
これらが接触−針、る溶媒の悪影響を受ける。従って、
酵素感応性が問題となる場合には、特に本発明が有利で
ある。

膜形成ポリマー（例えば、酢酸セルロース）用溶媒（例
えばアセトン）を用いることにより、酵素が溶媒と接触
する場合よゆも極めて有効に酵素を保護することができ
るＯそれは、隣接層は段階的に形成されるの′１：〜、
次の層が形成される迄に前の層が全部又は一部面化して
しまうからである。

溶媒感応性酵素を更に確実に保護するには、峙に、隣接
層中の溶媒からも更に保護するには、′酵素をカプセル
化して保護した酵素電極膜”という名称が付くれて、同
日に出願された同−出願人の特許明細＃に記載されてい
る通りに、酵素をマイクロカプセル化すればよい。

１ぐ発明の膜が用いられる代表的電気化学センサーとし
ては、マイルス・うがラトリー製のバイオステーター（
ＢＩＯ８ＴＡＴＯＲ）グルコース電極（米国特許ｊｇ　
４０９２２３３号参照）があげられる。

本発明の膜の全体的な厚さは、約４０〜１００μの範囲
であり、好ましくは約７０μである。高密度層は約２〜
５μの範囲であり、また、低密度の各層は約２〜２０μ
の範囲である。これらの数値変更は、図面で見られる層
の厚さが広範囲であるのと同様に、本発明の所望の範囲
内で許容される。好ましい膜厚は約７０μである。

第１図にはポーラログラフセルの構成体が示されている
。該セルは、合成樹脂、ガラス又はその他の適当な物質
から成る絶縁性容器１０を構成要素とし、その断面積、
断面形状はいかなるものであってもよいが、好ましくは
円筒状である。該ゼルは絶縁歪１１により被蓋されてい
る。容器内には、絶縁ロッドすなわち導線１３を内包す
る円筒状カラム１２が設置されている。この導線は、白
金、金、銀、黒鉛（グラファイト）等から成る活性／露
出部材１４に接続されている。

ロンドもしくはカラム及びＤΦＣ電圧源１５と導通され
た蓋を介して、リード線が電極に付設されている。

容器の下端部には、リング又はリテイナー（ｒｅｔａｉ
ｎｅｔ漫の支持部材１６が設けられ、また、本発明の嘆
１７が中央ぺ極に最も近い支持容器の端部全周に、電極
の活性面からごく近接した距離をおいて設けられている
。膜は、あらゆる適宜の手段により固着されるが、その
手段としては、例えば、容器の冠状溝にＯ−ＩＪングを
はめ込む等の適宜な手段があげられる。セルには通常の
測定Ｈ８具（図示せず）が連結されている。

Ｉ 容器内圧が過変に上昇することを防止するため、例えば
、容器には″がス排出孔１８逅設けられているＯ 中央ロンドと容器壁との間には輪状空間が設けられ、例
えば、塩化銀で被覆された鋼線等の参照’ｆｌ極１９が
載置されている。空間２ｏには、少なくとも一部に、好
ましくは全部に混合液体電解質が充填されており、電解
質は空孔から室内に導入される。

ポーラログラフ分析法にあっては、通常２つの電極が使
用され、そのうちの一つは分極されており、被検物質が
脱分極される迄は通電し々い。第１図に示したセル構造
において、電極゛１９は陰極であり、分極されて、通常
、参照電極として用いられる。もう一方の電極、即ち第
１図に示されている電極１４け、陽極として機能し、被
検物質存在下では、分極しない。従って、比較的大電流
の通流を抑制することはなく、通常、センサー電極と［
７て用いられる。第１図に示された電極は絶縁関係（・
ζあり、室内に充填された電解質は両電極間で導通経路
を形成する。代表的な電解質′としては、例えば、塩化
ナトリウムもしくは塩化カリウムが挙げられ、炭酸塩、
リン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、アルカリもしくは希土類
塩を含む緩衝液又は他の有機緩衝液又はこれらの混合物
が用いられる。かかる電解質の溶媒としては当業者であ
れば周知である水、グリコール類、グリセリンおよびこ
れらの混合物があげられる。

第２図は多層膜の拡大断面図を示している。嗅は、高密
度層２１及び複数の低密度層すなわち多孔質層２２から
成り、低密度層は酵素層２３によって分離されている。

第２図において、酵素層２３は、高密度層２１及び多孔
質Ｊ＊　２２と同一の厚さで示されている。しかしなが
ら、第３１４に示されるように、これらの層は異なって
いてもよい。これらは物理的寸法が異なっているのに加
えて、化学的にも異なっていてもよい。酢酸ヒルロース
用溶媒が十分に蒸発していないと、ある程度の酵素は膜
の製造中、隣接層に拡散する可能性がある。

嘆表面２４は電極と電気的に接触している。１−２１の
外表面は、被検溶液と接触する試験表面を表わす。

第４図に示されるように、多〕ｔｉｉｌｌｌには、数層
の酵素層２３並びに数層の多孔質層２２及び高密；駆層
を設けてもよい。

本発明のＭｌは、まず、適当な表面上に比較的高密度の
ポリマ一層もしくはフィルムを塗布し、次に少なくとも
部分的にそれを乾燥することにより製造される。この第
１層を多層膜の第１構成体という。この高密度層が省略
されたならば、嘆を通して移送され、酵素と反ビするグ
ルコース量の増大によって引き起こされる酸素欠乏によ
って、測定はより非直線的になる。

８ｇ２構成体と呼ばれる多孔性相変換型ポリマー）−を
、上記薄１−上に直接形成してもよい。まず、１拠の多
孔質部分を形成し、次にその表面に直接、高密開部分を
形成することも可能である。複合膜の相変換構成体すな
わち多孔質部分は、アセトン専の不活性有機溶媒でポリ
マー溶液を調製することにより、形成される。次に、該
溶液にポリマー用非溶媒を混合する。好適な非溶媒とし
ては、アルコールと水との混合物があげられる。酢酸セ
ルロース金柑いる場合は、エタノールと水が好ましい非
ｒ４媒である。

積層膜の第３の構成体は酵素含有層である。核層は、展
開を促進する添加剤を更に含むことがちる酵素水溶液又
は懸濁液から形成される。

、ｊ、７４　構成体として、別の相変換多孔性ン１？リ
マ一層を設けてもよい。

また、酵素含有物質の第５層を設けてもよい。

このように、本発明の多層膜は少なくとも１つの第１構
成体を含む。即ち、比較的％密度のポリマ一層と、少な
くとも２つの相変換型ポリマー相（即ち、＠２型の多孔
質層）とである。加えて、線膜は少なくとも２つの酵素
物質層を含む。本発明の膜は、少なくとも３又は４の酵
素層と３又は４の多孔質ポリマ一層とを含むことが好ま
しい。

本発明の嘆を製造するに際し、前述した製造工程のよう
に、層を連続形成してもよい。このため、例えば、第２
又は３図に示した膜が製造される。

あるいは、第４図に示した構成物を連続して製造しても
よい。

酵素の混合は、低温度、即ち０℃又はそれｌｄドで行な
うべきである。酵素の不活性化を避けるために、混合時
間も最少限にすべきである。

以下の実施１例は、本発明方法を示したものであるが、
本発明は、これにより、限定されるものではない。

実施例゛ 高密度フィルム部分を製造するために、３％酢酸セルロ
ースのアセトン溶液を２ｍ１ｌフイルム塗布器を用いて
、清浄なガラス基板上に塗布した。

１．５ｃｃのエタノールヲ１　（ｌ酢酸セルロースのア
セトン溶液５ｃｃと混合して、相変換酢酸セルロース形
１・ｙ相溶液を調製した。ついで、これを氷水塩浴中に
循き、攪拌を続けた。

次に、多孔質１彊を形成する核層２溶液を、１８ｍ１ｌ
塗布養を用いて、瀉１膜表面辷に塗布した。

ついで、展開フィルムを室温で数時間乾燥した。

咳フィルム表面が指触で粘着性を有し、又は部分的に乾
燥しギいるような適当な時期に、酵素層を多孔質層表面
上に形成した。

酵素調製物は、単に、グルコースオキシダーゼ水溶液等
の・傷当な酵素の混合物でもよい０例えば、グルコース
オキシダーゼ水溶液１　ｃｃを用いてもよい。該溶液は
、１　ｃｃ当り２，０００〜３，０ｆｌＯ−位のグルコ
ースオキシダーゼを含む。もちろん、酵素調製物には、
結合剤又はグルタルアルデヒド等の架橋剤のような他の
物質を配合してもよい。更に、調製液中の、水に対する
酵素の割合は、４易に被覆又は載置できる流動性ペース
ト又は溶液が形成されるならば、格別限定されない。測
定；て際し、十分な反応量を確保するため、溶液中には
光分量の酵素が配合されている。

次に、少なくとも１つの高密度１−と、少なくとも２つ
の多孔質層と酵素層とから成る多１−膜が捗られる迄、
ポリマーフィルム及び酵素Ｖ−を形成する前記工程を繰
り返す。生成物は、少なくとも３もしくは４の酵素層、
及び少なくとも３もしくは４の多孔質フィルム層を含む
製造物であることが好ましい。

本発明の多層膜は、そｐ厚さが約５０〜１００μの範囲
、好ましくは約７０μの自己支持フィルムである。積層
膜は、いかなる特殊な形態もしく　゛は大きさに形成さ
れていてもよく、又、容器をいかなる大きさのポーラロ
グラフセルもしくは電極にも適合できるように、あらゆ
る特殊な裁断又は寸法どりされていてもよい。特に、米
国特許第′４．０９２．２３３号に記載されているよう
に、電極に用いられる０−リングに固定されていてもよ
い。

適当な大きさの弾性状０−＋７ングに膜を固定するには
、接着操作を用いてもよい。膜を電極表面上に直接形成
して龜よい。

酢酸セルロースに加えて、他のポリマーを溶媒に溶解し
、少量の溶媒又は非溶媒を追加して相変換を起こさせて
、　膜物質としてもよい。このようなポリマーとしては
、ニトロセルロース、エチルセルロース及びその他のセ
ルロース誘導体があげられる。加えて、塩化°メチレン
がアセトン又はその他ケトン類の代わりに溶媒として用
いられるならば、ポリカーがネート昆代えてもよい０・
１］変換混合物中に混存する低−アルコール類の代わり
（゛こ、ホルムアミドが使用可能である。

当業者であれば容易な本発明の変更は、特許請求の範囲
に含まれている。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の嗅が使用される従来の型式のポーラロ
グラフセルの部分縦断面図、第２図は本発明多層膜の拡
大断面図、第３．３ａ及び３ｂ図は本、　　発明多層膜
の３つの実施態様を示した断１酊図、第４図は本発明多
層膜の他の実施態様を示した断面図である。 １０・・・絶縁容器、１１・・・絶縁蓋、１２・・・内
情カラム、１３・・・絶縁ミツド又は導線、１４・・・
活性／鋸出部材、１５・・・Ｄ−Ｃ電圧源、１６・・・
支持部材、１７・・・膜、１８・・・ガス排出孔、１９
・・・参照電極、２０・・・空間、２１・・・高密度層
、２２・・・多孔質層、２３・・・酵素層。 ？ｉ ＦＩＧ、　３ｂ ＦＩＧ、　４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）／！Ｊマーを不活性有機溶媒に溶解し、該！リマ
   ーと反応せず、かつ該ポリマーとは結合しない不活性支
   持体表面上に該ポリマー溶液を塗布して、 前記ｆＩＩ液からフィルムを形成せしめ、それにより、
   第１の比較的高ｖＲ度のポリマ一層を得て、第１層を設
   け； ポリマー含有成分を不活性有機溶媒に溶解し、該ポリマ
   ーｉ液を該ポリマーの非溶媒と混合して分散液を得、つ
   いで該分散液を前記第１層上に塗布した後、これを乾燥
   して第２層を設け； ＃索溶液又は層温液から形成される３１ｇ３層を設け、
   ｌ［３層を萬２層の露出表面上に被覆し； ポリマー含有成分を不活性有機溶媒に溶解し、咳ポリマ
   ー溶液を該ポリマーの非溶媒と混合して分散液を得、つ
   いで該分散剤を第３層の露出表面上に塗布して第４層を
   設ける仁とにより多層膜を製造することを特徴とする、
   未知物質測定用の電気化学的センサーに使用して好適な
   多層膜の製造方法。 （２）多層膜を得るために、各層が１回もしくは２回以
   上連続して積層される特許請求の範囲′：４１項記載の
   多層膜の製造方法。 １３）　　＄１）マーが酢酸セル四−ス又ハ酢酸セルロ
   ースのコ４リマーである特許請求の範囲・第１項記載の
   多層膜の製造方法。 （４）不活性有機溶媒がケトンである特許請求の範囲第
   １項記載の多層膜の製造方法。 （５）第２層が、その中に均質に拡散された酵素を更に
   含む特許請求の範囲第１項記載の多層膜の製造方法。 （６）第２層が、その中にカプセル保護化酵素を更に含
   む特許請求の範囲第１項記載の多層膜の製造方法。 （７）　　ポリマーの溶媒及び非溶媒を含有する混合溶
   媒に該ポリマーを溶解して形成された第３層が相変換し
   て孔を形成し得る特許請求の範［中耳１項記載の多層膜
   の製造方法。 （８）複数の酵素含有層が、該酵素の水溶液又は懸濁液
   から形成される特許請求の範囲第１項記載の多層膜の製
   着方法。 （９）廊素がグルコースオキシダーゼである特許請求の
   範囲第１項記載の多層膜の製造方法。 ｔｏｏｌ　（ａ）　　第１の酢酸セルロースポリマーを
   不活性有機溶媒に溶解して溶液を調製し； （ｂ）　　該酢酸セルロースと反応せず、かつ該酢酸セ
   ルロースとは結合しない不活性支持体表１１１１上に噴
   筒１ポリマー溶液を塗布し；（ｃ）　　該第１ポリマー
   溶液からフィルムを形成せしめて、酢酸セルロースの第
   １層を得；（ｄ）　　第２の酢酸セルロースポリマーを
   不活性有機溶媒に溶解し、該第２／リマーを該ポリマー
   の非溶媒に混合してその分散液を調製し：（ｅ）　　第
   ２酢酸セルロースポリマー分散液を第１酢酸セルロース
   層上に塗布して、核酢酸ヒルロースポリマーからフィル
   ムを形成し；（ｆ）　　酵素水溶液又は懸濁液を調製ｊ
   ７、第２−リマーの表面上に該酵素を層状に破曖し；（
   ２））　　（ｄ）　、　（ｅ）及（バｆ）の操作を１回
   以上繰り返して、さらに１以上の＠２ポリマ一層及びさ
   らに１以上の酵素層とを積層（、； 隣接多層酢酸セルロースポリマーｆｌａｔ−Ｎ造するこ
   とを特徴とする１、未知物質測定用の電気化学的センサ
   ーに使用して好適な特許請求の範囲第１項記載の膜の製
   造方法。 ａｏ　　第１及び第２酢酸セルロースポリマーについて
   使用される不活性有機溶媒が同一である特許請求の範囲
   第１０項記載の膜の製造方法。 Ｑｚ　　不活性有機溶媒がケトンである特許請求の範囲
   第１１項記載の膜の製造方法。 （１３１不活性有機溶ｉがアセトンである特許請求の範
   囲第１１項記載の膜の製造方法。 （１４１ＭＬＩＩＥがグルコースオキシダーゼであって
   、水とエタノールとの混合液中に存尭する特許請求の範
   囲第１０項記載の膜の製造方法。 （１５Ｉ　　実質的に均一なポリマーの第１層と、該第
   １７−より多孔性のポリマ一層から成る複数の第２型層
   と、酵素を含有する複数の第３型層とから成り、複数層
   間の境界部分が拡散領域であって、未知物質の電気化学
   的分析用ポーラログラフセルに使用される、全体の厚さ
   が約４０〜１００μの多層膜。 ｆｌｆｉ）　　第１層が、約２〜５に厚の酢酸セルロー
   スである特許請求の範囲第１５項記載の多層膜。