JPH03151898A

JPH03151898A - 固定化酵素利用フローインジェクション測定法

Info

Publication number: JPH03151898A
Application number: JP29314289A
Authority: JP
Inventors: Kazutoshi Yamazaki; 和俊山崎; Yoshihide Sawada; 芳秀澤田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1989-11-10
Filing date: 1989-11-10
Publication date: 1991-06-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は固定化酵素を利用したフローインジェクション
測定法に関し、より特定的には、ＮＡＤＨｌまたはＮＡ
Ｄ　（Ｐ）を補酵素とする脱水素酵素の基質を、少なく
とも過酸化水素発生型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを利
用して測定する方法に関する。

〔従来の技術〕

各種の生物学的研究や臨床検査等において、生体由来物
質や自然界に存在する数多くの物質が測定されている。

しかしながら、測定対象となる目的物質の中には、直接
測定し難い物質も存在する。このような直接測定の困難
な目的物質は、該目的物質が関与する酵素反応を利用し
て間接的に測定されている。

すなわち、酵素反応により生成した物質や、酵素反応に
関与する補酵素を測定する方法が用いられている。

特に、多くの酵素反応に関与する補酵素である、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチ下（酸化型はＮＡＤで、
還元型はＮＡＤＨで示される）、またはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフェート（酸化型はＮＡＤ
Ｐで、還元型はＮＡＤＰＨで示される）を測定する方法
がよく用いられている。なお、本明細書中においては、
ＮＡＤ（Ｐ）及びＮＡＤ　（Ｐ）Ｈなる表現を用いるが
、これらは、ＮＡＤ及び／またはＮＡＤＰ、並びにＮＡ
ＤＨ及び／またはＮＡＤＰＨをそれぞれ示すものとする
。

ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの定量法としては、以下の（１）〜（
３）の方法が公知である。

（１）ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの紫外領域の特定波長（例えば
、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの種火吸収波長である３４０ｎｍ）
における吸収を直接測定する方法、（２）ＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈに特定の励起波長の光を照射し、光励起させ、その
ときに発生する蛍光を測定する方法（特開昭５９−５１
３４９号）、並びに（３）ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈにメチレンブルーを作用させ過
酸化水素を生成させ、該過酸化水素によりフェリシアン
化カリウム存在下でルミノールを酸化することによって
生じる化学発光を測定する方法〔佐伯行−他；臨床化学
、第１θ巻、第４号２８６−２９３　（１９８１））。

しかしながら、上述した（１）〜（３）の方法では、以
下のような問題があった。

（１）の方法では、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈが紫外領域で測定
される。従って、血液や生体組織等の生体試料を分析す
る場合には、該生体試料中に含有されている干渉物質の
影響を受は易い。

（２）の方法では、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの蛍光強度が弱い
ため、測定が難じい、検出器の感度を上げたとしても、
ノイズレベルも同時に上昇するため、感度を一定以上に
上げることも困難である。

（３）の方法は、発生した過酸化水素を化学励起して発
光させ、蛍光を検出するものである。従って、同じく蛍
光検出法を利用した（２）のような光源の光のフラツキ
等の影響をほとんど受けず、ダイナミックレンジの広い
高感度測定が可能である。しかしながら、ＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈとメチレンブルーとの反応速度が遅く、測定に多大
の時間を必要とする。さらに、化学発光を測定するため
、比色により測定を行う場合と異なり、自動分析機に適
用することが難しい。

上述したように、何れの方法を用いても、ＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈを安定的に高感度で測定することは難しく、目的成
分の濃度が低くなると測定不可能となっていた。

上記の問題を解決する定量法として、特開平１−２５７
４９９号には、特定のＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼを
、目的物質含有試料及び酸素を含有する系に添加し、ｐ
Ｈ７〜１１の範囲で酵素反応を起こさせ、生成した過酸
化水素を測定する方法が提案されている。ここでは、中
性−アルカリ領域における酵素反応を用いることが可能
とされており、従って比色分析によりＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ
を容易にかつ正確に測定し得ることが可能とされている
。

しかしながら、上記特開平１−２５７４９９号に開示さ
れている定量方法は、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼを
用いたＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの定量法の基本釣な方法を開示
しているが、具体的な自動分析機への適用方法等につい
ては開示していない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、上述した従来法の種々の問題点を解決するも
のであり、その目的とするところは、ＮＡＤＨまたはＮ
ＡＤ　（Ｐ）を補酵素とする脱水素酵素の基質を、高感
度にかつ安定に測定することができ、簡単な測定装置に
より迅速に測定でき、さらに自動分析機において即実施
し得る具体的な測定方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段及び作用〕本願発明者らは
、分析装置の簡略化及び自動分析器への適用を容易とす
るには、フローインジェクシッン法を用いればよいので
はないかと考え鋭意検討した結果、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオ
キシダーゼをある種の担体に固定化させた固定化酵素を
フロー系に配置する方法が有利であることを見出した。

ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼとしては、本発明者らが
先に土壌中の微生物から分離したものであって、中性か
ら弱アルカリ性でも安定であり、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈに特
異的に作用して過酸化水素を生成する性質を有するＮＡ
Ｄ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（特開昭６３−２５１０８２
号）に着目した。そして、このＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシ
ダーゼが脱水素酵素と共存し得ることを発見した。

これらの新しい知見に基づき、さらに検討した結果、固
定化酵素カラム中にＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、さ
らに必要に応じＮＡＤ　（Ｐ）を補酵素とする脱水素酵
素を固定化しておき、フロー系に該固定化酵素カラムを
配置すれば、フローインジェクシッンされた目的物質含
有試料と固定化酵素との反応によりＨ！　Ｏ，が発生さ
れ、この発生したＨ３Ｏ３を適当な過酸化水素検出法に
より検出することに成功し、本発明をなすに至った。

すなわち、本発明は、固定化酵素利用フローインジェク
シッンにおいて、少なくとも過酸化水素発生型ＮＡＤ　
（Ｐ）Ｈオキシダーゼを含む固定化酵素に、フロー状態
の目的物質含有試料を接触させて酵素反応を生じさせる
工程と、この酵素反応により生成した過酸化水素を測定
する工程とを備えることを特徴とするものである。

目的物質がＮＡＤＨの場合には、固定化酵素としては過
酸化水素発生型ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼが用いら
れ、目的物質がＮＡＤ　（Ｐ）を補酵素とする脱水素酵
素の基質である場合には、固定化酵素として、該脱水素
酵素と過酸化水素発生型ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼ
とが用いられる。

過酸化水素　生　ＮＡＤ（Ｐ　　Ｈオキシ　−ゼの１！本発明において用いる過酸化水素発生型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
オキシダーゼは、特開昭６３−２５１０８２号に開示さ
れたバチルス属に属する微生物から単離されたものであ
る。この酵素の酵素化学的及び理化学的諸性質を次に示
す。

（１）作用及び基質特異性、ＮＡＤＨ及び／またはＮＡ
ＤＰＨの酸化を特異的に触媒し、ＮＡＤ及び／またはＮ
ＡＤＰと過酸化水素とを生成させる。

（２）至適ｐＨ＝ｐＨ６，５〜８．０において高い活性
を示す。

（３）ｐＨ安定性；３０℃で２４時間保持すると、ｐＨ
７〜９において９０％以上の活性が残存する。

（４）分子量及び構造；分子量的５００００のサブユニ
ット２個から構成される。１個のサブユニットあたり１
分子のＦＡＤを含む。

本酵素の作用機構は、次式（１）で示される。

ＮＡＤ（Ｐ）ＨｔキシダーゼＭＡＤ（Ｐ）Ｈ＋　Ｈ”　　＋（ｈ　　　　　　　ＮＡ
Ｄ（Ｐ）　　＋ＨｔＯｚ・・・・・・・−・　（，１）上記のごとく、本発明において用いるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオ
キシダーゼは、中性からアルカリ性側でも強い活性を示
すため、同じく中性からアルカリ性側で至適活性域を有
するＮＡＤ　（Ｐ）を補酵素とする脱水素酵素と組み合
わせて使用することができる。また、Ｋｍ値が３．２Ｘ
ｌＯ−’Ｍであり、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈは速やかに酸化さ
れ、過酸化水素が生成すると考えられる。

目的物質がＮＡＤ　（Ｐ）を補酵素とする脱水素酵素の
基質の場合には、次の式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の反応
が進み、Ｈ！０．が生成する。

本発明では、固定化酵素として、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキ
シダーゼ、さらに必要に応じて脱水素酵素が用いられる
。固定化法としては、酵素を固定するための常法を適宜
利用することができる０例えば、不溶性担体にイオン結
合または共有結合により酵素を結合させる方法、半透膜
でできたマイクロカプセルやゲル粒子の格子中に酵素を
閉込めた包括法、あるいは酵素蛋白質分子間に架橋試薬
を反応させて架橋結合を作り、分子と分子とを繋いで不
溶性粒子とする方法等がある。

また、固定化のための担体としては、セルロース、ポリ
アクリルアミドゲル、ポリスチレン、またはセファデッ
クス（ファルマシャ社製）等を用い得る。

本発明においては、固定化法及び固定化担体の何れにつ
いても、何ら制限を受けるものではない。

望ましくは、耐アルカリ性及び耐溶媒性に優れたセルロ
ースやセファデックス等を用いた結合法が、酵素の安定
性及び固定化強度の点から好ましい。

脱水素酵素とＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼの双方を固
定する場合には、（１）脱水素酵素とＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ
オキシダーゼを同一担体に固定化させてカラムに充填す
る方法、（２）脱水素酵素とＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダ
ーゼを別りの担体に固定化し、これらの担体を適当な割
合で混合して固定化酵素カラムに充填する方法、あるい
は（３）脱水素酵素を固定化した第１の固定化酵素カラ
ムとＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼを固定化した第２の
固定化酵素カラムとをフロー系に直列に挿入する方法等
が考えられる。

上記（１）、（２）の方法のように同一の固定化酵素カ
ラムにＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼと脱水素酵素とを
充填して使用し得るのは、用いるＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキ
シダーゼが中性〜アルカリ性で高い活性を示すからであ
る。即ち、上述したＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼを用
いることにより、測定系を簡略化できる。

ヱ旦二及勿揚底フローインジェクション法を構成するための装置の構成
については、従来よりフローインジェクション法を実施
するのに用いられている適宜の装置が用いられる０例え
ば、バッファのような適宜の移動媒体を送液する装置に
より移動媒体をフロー系に送液する。そして、フロー系
の途中に試料注入装置を配し、該試料注入装置よりも後
段に、固定化酵素を充填したカラムを挿入する。そして
、固定化酵素カラムの後段に、後述のＨ，Ｏ！検出方法
を実施するための検出装置を配置する。

なお、Ｈｔ　Ｏｘ検出に際して、Ｈ，Ｏ，を他の物質と
反応させる方法を用いる場合には、固定化酵素充填カラ
ムに、反応させる物質を併せて充填しておいてもよい。

フローインジェクション法を用いるものであるため、使
用する装置は上記のようにかなり簡略化される。しかも
、液体クロマトグラフィーのような分離操作を必要とし
ないため、操作時間も短縮される。

遇鼠上水皇坐挾班本発明の第２の工程では、酵素反応により生成した過酸
化水素が検出される。過酸化水素の検出方法としては、
（１）白金電極を用いた電気化学的検出法、（２）フェ
リシアン化カリウム存在下（アルカリ領域）で、ルミノ
ールを酸化することによって生じる化学発光を測定する
方法等があり、何れも、従来のＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ測定法
と比べて高感度の測定が可能である。特に、（１）の場
合には、検出装置が安価であり、使用方法も簡単となる
。また、（２）の場合には、広いダイナミックレンジで
高感度の測定が可能である。なお、Ｈ２Ｏ３の検出方法
自体については、上記の２種の方法に限定されるもので
はない。

亀■亘凰作目的物質含存試料が、全血試料、血漿または血清等のよ
うに血液試料の場合には、本発明の第１の工程に先立ち
、除蛋白操作を行うことが好ましい、この除蛋白操作は
、フローインジェクション測定系でオンラインで行うこ
とができる。すなわち、目的物質を選択的に吸着し、妨
害物質となる血中酵素のような蛋白を通過させるという
前処理を行うための除蛋白カラムを、試料注入装置より
も後段に配置し、例えば六方パルプを組み合わせること
により、カラムスイッチング法により除蛋白することが
できる。このような除蛋白操作により、ＬＤＨのような
妨害物質をフロー系においてオンラインで除去すること
ができる。

本発明はフローインジェクション測定法を用いるもので
あり、液体クロマトグラフのように目的物質のみを分離
するものではない、従って、上記前処理操作により血中
酵素を予め取り除くことにより、より高精度に目的物質
を測定することができる。

■　の′　　　　　の　　゛本発明によれば、上述した式（１）により発生した過酸
化水素を検出することによりＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを定量す
ることができる。

また、上述した式（ｎ）及び（ＩＩＩ）の反応により、
ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを間接的に生じる酵素反応における基
質量を測定することもできる。このような基質としては
、３α−ヒドロキシステロイド（胆汁酸等）、３β−ヒ
ドロキシステロイド、乳酸、グルコース−６−リン酸、
アルコール、コレステロール、グルコース等が挙げられ
る。

また、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを定量することにより、酵素活
性を測定することもできる０例えば、クレアチンホスホ
キナーゼやアミラーゼの活性が容易に測定され得る。

〔実施例の説明〕

ＮＡＤＨの（ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼの固定化）ＮＡＤ　（
Ｐ）Ｈオキシダーゼの固定化は、セルロースを担体とし
た臭化シアン法を採用した。すなわち、５００単位のＮ
ＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼを、０．５ＭのＮａ　ＣＪ
！を含むＯ，ＩＭの炭酸緩衝液（ｐＨ＝８．３）１０ｒ
ｒ／！に溶解し、同緩衝液で十分膨潤させたＣＮＢｒで
活性化されたセファローズ４Ｂ（ファルマシア社製）１
０ｍｊ！のゲル懸濁液に添加し、室温にて２時間撹拌反
応させる。

反応後、濾過により同緩衝液を除去し、ゲルをＩＭのエ
タノールアミン溶液に懸濁し、２時間室温で撹拌させる
。撹拌後、濾過によりエタノールアミン溶液を除き、Ｏ
，１Ｍ炭酸緩衝液（ｐ　、Ｈ−８，３）及び０．５Ｍの
ＮａＣｌ２を含む酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）で洗浄し
、再度上記炭酸緩衝液に懸濁し、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキ
シダーゼ固定化酵素ゲル懸濁液とする。

上記の操作により、ＣＮＢｒで活性化されたセファロー
ズ４Ｂ、１ｍｊ！あたり３０単位のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキ
シダーゼが固定化されていた０本固定化酵素ゲル懸濁液
を、直ちに高速液体クロマトグラフィー用ステンレスカ
ラム（内径４．０園×長さ２０■、接水化学工業社製）
に充填し、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼ固定化酵素カ
ラムとして用意した。

（測定装置及び手順）上記のようにして調製した固定化酵素カラムを、第１図
に示す測定系に組み込み、ＮＡＤＨの定量を行った。第
１図の装置は、以下の各要素で構成されている。

ｌ・・・移動媒体、２・・・送液ポンプ、３・・・イン
ジェクタ、４・・・酵素反応液、５・・・酵素反応液用
送液ポンプ、６・・・ＮＡＤＨ固定化酵素カラム、７・
・・電気化学検出器。

なお、本装置において、送液ポンプ２．５は島津製作所
製ＬＣ−３Ａポンプ、電気化学検出器７は接水化学工業
社製ＥＣＤ−１２０を用い、白金電極により過酸化水素
の検出を行った。また、移動媒体ｌとして、２０ｍＭの
リン酸緩衝液（ｐＨ＝６．８）、酵素反応液４として５
ｍＭのβ−ＮＡＤ及び２ｍＭのＦＡＤを含む１０ｍＭ、
　　リン酸緩衝液（ｐ）Ｉ−７，２）を用いた。

（定量結果）第１図の装置を用い、ＮＡＤＨが、それぞれ、１０．２
０，３０及び５０ｎｇ含有されている試料を注入した場
合の測定結果を第２図に示す。また、この第２図の結果
に基づいて得られた検量線を第３図に示す、第３図から
明らかなように、本実施例の測定方法によればＮＡＤＨ
濃度と検出ピークの高さとの間に良好な比例関係が成立
することがわかる。

なお、第３図では、第２図の測定結果における検出ピー
クの高さとＮＡＤＨ濃度との関係により検量線を作成し
たが、検出ピークの面積゛とＮＡＤＨの濃度とにより検
量線を作成してもよい。

２　デヒドロアン　ロス−ロンの（β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）
Ｈオキシダーゼの同時固定化） β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
オキシダーゼの同時固定化は、実施例１において用いた
「５００単位のＮＡＤＨオキシダーゼ」を、「５００単
位のＮＡＤ　（Ｐ）Ｈオキシダーゼと１０００単位のβ
−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（シグマ社製）Ｊに
変更した以外は、実施例１と同一の操作で行った。

（パーオキシダーゼの固定化）パーオキシダーゼ（シグマ社製）をＮ、Ｗｅｌｔｋｙら
の方法（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｔｏｐｈｙｓ、
、１３１，１．（１９６９））によりＣＭ−セルロファ
イン（チッソ株式会社製）・に固定化した。

（測定装置及び条件）第４図に示した装置を用いてデヒドロアンドロステロン
の定量を行った。８・・・移動媒体、９・・・送液ポン
プ、１０・・・インジェクタ、１１・・・酵素反応液！
、１２・・・酵素反応液Ｉ送液ポンプ、１３・・・β−
ヒドロキシステロイド脱水素酵素及びＮＡＤＨオキシダ
ーゼ固定化酵素カラム、１５・・・酵素反応液■、１６
・・・酵素反応液■送液ポンプ、１７・・・パーオキシ
ダーゼ固定化酵素カラム、１８・・・可視検出器。

送液ポンプ９、酵素反応液１送液ポンプ１２及び酵素反
応液■送液ポンプ１６としては、島津製作所社製　ＬＣ
−３Ａポンプを用いた。可視検出器１８は種水化学工業
社製ＵＶＤ−１２１を用い、５５５ｎｍで測定した。

移動媒体８とし７２０ｍＭリンＭｉｌｌ街液（ｐＨ−６
，８）／メタノール（混合比は容量比で６０／４０）を
用いた。また、酵素反応液■として５ｍＭ　　β−ＮＡ
Ｄ及び２ｍＭのＦＡＤを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ−７，２）を用い、酵素反応液■として４−アミノア
ンチピリンを０．０２％及びジスルホブチル−ｍ−１−
ルイジンを０゜０３％含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
＝７゜０）を用いた。

（定量結果）第５図は、上記の装置を用いて、それぞれ、ｌ。

５．１０ｍＭのデヒドロアンドロステロンのメタノール
溶液を注入した時の検量線であり、良好な直線性を示し
ている。

３８゛の（測定装置及び条件）第６図に図示した胆汁酸測定装置を用いて胆汁酸の定量
を行った。該装置は以下の各要素で構成した。

１９・・・除蛋白刃ラム、２０・・・インジェクタ、２
１・・・除蛋白送液ポンプ、２２・・・除蛋白液、２３
・・・除蛋白液槽、２４・・・六方バルブ、２５・・・
移動媒体送液ポンプ、２６・・・移動媒体、２７・・・
移動媒体槽、２８・・・酵素反応液■ポンプ、２９・・
・酵素反応液■、３０・・・３α−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼ固定化酵素カラム、３１・・・ＮＡ
ＤＨオキシダーゼ固定化酵素カラム、３２・・・酵素反
応液■送液ポンプ、３３・・・酵素反応液■、３４・・
・パーオキシダーゼ固定化酵素カラム、３５・・・可視
検出器。

ポンプ２１．２５．２８．３２としては、島津製作所社
製ＬＣ−３Ａポンプを、可視検出器３５としては、種水
化学工業社製　ＵＶＤ−１２１を用いた。３α−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼ固定化酵素カラムは日
本分光社製ＥｎｚｙｍｅＰａｋ−Ｈ３Ｄ　（内径４．６
ｍｍＸ長さ３５ｍｍ）を用いた。除蛋白カラムはセラマ
ウト−２５（種水化学工業社製、内径４ｍｍＸ長さ２０
ｍｍ）を用いた。

移動媒体２６には３０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ＝６
．８）／メタノール（混合比は容量比で６０／４０）を
、除蛋白液としては０．　５％酢酸アンモニウムを用い
、また、酵素反応液■、■は実施例２で用いた組成のも
のを用いた。

（定量手順及び結果）胆汁酸標準品あるいは血清試料を、インジェクタ２０か
ら、第６図（ａ）に示した流路系に１０μ！注入し、六
方バルブ２４のボー）Ａ−Ｂを介して除蛋白液２２と共
に除蛋白カラム１９に導入し、除蛋白刃ラム１９の充填
剤に試料中の胆汁酸を吸着させた。５分後に六方パルプ
２４の切換えにより第６図（ｂ）の流路系にした。移動
媒体２６を六方パルプ２４のポー）Ｄ−Ｅを介して除蛋
白カラム１９に通じ、除蛋白刃ラム１９の充填剤に吸着
した胆汁酸を脱着し、３α−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼ及びＮＡＤＨオキシダーゼ固定化酵素カラ
ム３０．３１系へ導き、生成したＨｔＯ＊を実施例２と
同様にパーオキシダーゼ固定化酵素カラム３４系で検出
した。

第７図は胆汁酸標準品として、それぞれ、コール酸ナト
リウム５．１０．２０μｇ　／　ｍ　ｌを本装置に注入
したときの結果である。この結果に基づいて作成した検
量線を第８図に示す、第８図において良好な直線性が得
られていることがわかる。

第９図は、健常人男子血清８００μｌに５０μｇ　／　
ｍ　！！のコール酸ナトリウム溶液２００Ｉｊｇを添加
混合後、その１０μｌを本装置に注入したときの測定結
果である。第９図から明らかなように、血清中の蛋白成
分またはアスコルビン酸もしくは尿酸等の還元性物質の
影響を受けることなく、血清中の胆汁酸を測定すること
が可能である。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明によれば、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの測
定及びＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを生成する脱水素酵素の基質の
測定が、固定化酵素カラムを利用したフローインジェク
ション法により、迅速に、さらに簡単かつ高精度に定量
され得る。固定化酵素カラムを用いてかつフローインジ
ェクション法により測定するため、測定装置が簡略化さ
れ、かつ自動分析機に簡単に適用することができ、さら
に測定コストを効果的に低減することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１においてＮＡＤＨの定量に用いた測定
系の構成図、第２図は実施例１における測定結果を示す
図、第３図は実施例１において得られたＮＡＤＨの検量
線を示す図、第４図は実施例２において用いた測定系の
構成図、第５図は実施例２で得られたデヒドロアンドロ
ステロンの検量線、第６図（ａ）及び（ｂ）は、実施例
３において用いた測定系の構成図であり、第６図（ａ）
は除蛋白カラムを通過させる状態を説明するための図、
第６図（ｂ）は除蛋白刃ラムから溶離された試料を固定
化酵素カラムに移送する状態を説明するための図、第７
図は胆汁酸標準品としてコール酸ナトリウムを注入した
場合の測定結果を示す図、第８図はコール酸ナトリウム
の検量線を示す図、第９図は実施例３においてコール酸
ナトリウム含有血清試料を測定した結果を示す図である
。図において、１，８．２６は移動媒体、２，９゜２５は
送液ポンプ、３．１０．２０はインジェクタ、４，１１
，１５，２９．３３は酵素反応液、５．１２．１６．２
８．３２は送液ポンプ、６゜１３．３０．３１は固定化
酵素カラム、７は電気化学検出器、１７．３４はパーオ
キシダーゼ固定化酵素カラム、１８．３５は可視検出器
、１９は除蛋白カラム、２１は除蛋白液送液ポンプ、２
２は除蛋白液、２３は除蛋白液槽、２４は六方バルブを
示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）フロー系に目的物質含有試料を注入して、該フロ
ー系において固定化酵素と接触させて酵素反応を生じさ
せ、測定を行う固定化酵素利用フローインジェクション
測定法であって、少なくとも過酸化水素発生型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダー
ゼを含む固定化酵素に、フロー状態の目的物質含有試料
を接触させ、酵素反応を生じさせる工程と、前記酵素反応により生成した過酸化水素を測定する工程
とを備えることを特徴とする固定化酵素利用フローイン
ジェクション測定法。
（２）目的物質がＮＡＤＨであり、前記固定化酵素とし
て過酸化水素発生型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを用い
る請求項１に記載の固定化酵素利用フローインジェクシ
ョン測定法。
（３）前記目的物質がＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする脱水
素酵素の基質であり、前記固定化酵素として脱水素酵素
及び過酸化水素発生型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを用
いる請求項１に記載の固定化酵素利用フローインジェク
ション測定法。
（４）フロー系に目的物質含有試料を注入し、該フロー
系において固定化酵素と接触させて酵素反応を生じさせ
、測定を行うフローインジェクション測定法であって、カラムスイッチング法により、目的物質含有試料中の血
中酵素を含む蛋白をフロー系においてオンラインで除去
する工程と、次に、少なくとも過酸化水素発生型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキ
シダーゼを含む固定化酵素に、フロー状態の目的物含有
試料を接触させ、酵素反応を生じさせる工程と、前記酵素反応により生成した過酸化水素を測定する工程
とを備えることを特徴とする固定化酵素利用フローイン
ジェクション測定法。