JPH01191698A

JPH01191698A - アンモニア分析装置

Info

Publication number: JPH01191698A
Application number: JP1549688A
Authority: JP
Inventors: Matashige Ooyabu; 大藪　又茂
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1988-01-25
Filing date: 1988-01-25
Publication date: 1989-08-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は生体試料、ことに血清、血漿などが含有する
アンモニア態窒素の分析装置に関する。

（ロ）従来の技術血清又は血漿中に存在するアンモニア態窒素の測定は特
に昏睡患者などの緊急検査として重要である。従来アン
モニア態窒素の測定は、採血直後から遠心分離して測定
に至るまで試料の冷却を要求し、しかも採血後３０分以
内に測定しなければならず、また採血用具は脱アンモニ
ア処理が必要である。それ故にアンモニア態窒素の測定
は多検体処理用の自動分析装置では困難であり、用手法
まｆ二は微量拡散法（いわゆるドライケミストリ法、例
えば中外製薬Ｃ蛛〕製アミテストＮ−アミノメータ）に
よって行われてきた。用手法としてはＬ−グルタミン酸
脱水素酵素（ＧＬＤＨ）を用いる比色法が実用化されて
いる。

またさらにＧＬＤＨおよびＬ−グルタミン酸酸化酵素（
ＧＬＸＤ）を用いて発生する過酸化水素をルミノール反
応による発光反応で検出するよう、上記酵素を固定化し
た固定化酵素カラムを用いて構成した装置（特開昭６ｌ
−１４１８７３）がこの発明の発明者により提案されて
いる。

（ハ）発明が解決しようとする課題しかしながら、上記固定化酵素カラムを用いる装置での
アンモニア態窒素の測定は、試料中のし一グルタミン酸
態窒素量が大となりアンモニア態窒素の分析精度が低下
するため、試料を予めグルタミン酸デカルボキシラーゼ
で前処理して、試料中のＬ−グルタミン酸を除去してお
く必要があり、臨床的に要求される緊急検査にはなじみ
にくいものである。

この発明はかかる状況に鑑みなされたものであり、こと
に上記のごとき前処理なしに血清、血漿等の生体試料中
に存在するアンモニア態窒素を簡便にかつ精度良く測定
しうるアンモニア分析装置を提供しようとするものであ
る。

（ニ）課題を解決するための手段かくしてこの発明によれば、移動相供給部、生体試料導
入部、該生体試料と反応して過酸化水素を遊離さ仕る固
定化酵素カラム部、ルミノール発光反応液供給部及び化
学発光検出部をこの順に管路接続してなる移動相流路と
ζ上記検出器で検出される萌記遊離過酸化水素とルミノ
ール発光反応液とによる発光強度に基づいて生体試料に
含有されるアンモニア濃度を算出しうる演算処理部とか
ら構成されたアンモニア分析装置であって、上記移動相
供給部が、デアミド−ＮＡＤ１グルタミン酸およびマグ
ネシウムイオンを含有する緩衝液の供給部からなり、上
記固定化酵素カラム部が、ＮＡＤ合成酵素（ＮＡＤＳ）
の固定化酵素層、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤ
Ｈ）の固定化酵素層及びＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ酸化酵素の固定
化酵素層を上記移動相流路の上流側からこの順に直列配
置した構成からなることを特徴とするアンモニア分析装
置が提供される。

この発明は、生体試料中に存在するアンモニア態窒素を
、アミノ基移転作用を有するデアミド−Ｎ　Ａ　Ｄを基
質とする一連の酵素反応に付し、これにより発生する過
酸化水素をルミノール発光反応により検出することによ
り、上記試料からし一グルタミン酸を除去する等の特別
な前処理を必要とせず、該試料を直接分析できうるよう
構成されたことを特徴とする。

この発明において分析対象とされる生体試料は、ことに
血清、血漿等の血液試料が好ましく、また該試料中に存
在するアンモニア態窒素とは、アンモニア分子またはア
ンモニウムイオン状態で含有されているＭ索のことをい
う。以下アンモニアという。

この発明の移動相供給部には、送液手段が具備されるが
該送液手段は通常の送液ポンプが使用できる。

この発明の上記試料注入部には、通常の試料分注器のご
とく一定量の試料を計量して移動相流路に供給できうる
ちのであればどんなものであってもよく、例えば液体ク
ロマトグラフィ用ループインジェクタ等が挙げられる。

この発明の装置に用いられる固定化酵素カラム部は、Ｎ
ＡＤ合成酵素（ＮＡＤＳ）の固定化酵素層、Ｌ−グルタ
ミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）の固定化酵素層及びＮＡ
ＤＨ酸化酵素の固定化酵素層を上記移動相流路の上流側
からこの頭に直列配置して構成される。上記直列配列と
は１つのカラム内で上記各固定化酵素層を所定の順序で
多重層構造に充填して構成されたものであってもよく、
また各固定化酵素を別々に充填したカラムを上記類に従
って管路接続して構成されたものであってもよい。上記
各固定化酵素層は、所定の酵素を多孔性ガラスピーズに
グルタルアルデヒド法等により固定化した充填剤で形成
されることが好ましい。

この発明に用いる化学発光検出器としては、反応液の発
する４２０ｎｍ近傍の波長の光の強度を測定する光電子
増倍管が使用できる。

この発明に用いる演算処理部は、上記検出器で検出され
る化学発光強度に基づいて試料中のアンモニア濃度を算
出しつるよう構成される。すなわち、上記検出器からの
出力信号をＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換器、ＣＰＵ及び記
憶部からなるマイクロコンピュータ、記録部およびイン
タフェースを具備して構成されるものである。上記マイ
クロコンピュータには、上記検出器からの発光強度と濃
度既知のアンモニア標準液とを多点較正して決定される
検量線か予め記憶される。上記のごとき演算処理部には
通常のデータ処理器が使用でき、例えば島津製クロマト
バック等が挙げられる。

この発明のルミノール発光反応液供給部は、ルミノール
発光反応液を移動相流路に導入しうるちのであり、上記
固定化酵素カラム部と上記化学発光検出部との間の移動
相流路に接続されろルミノール発光反応液供給流路から
構成される。上記ルミノール発光反応液はルミノール試
薬および触媒（通常赤血塩）から構成される。従って上
記ルミノール発光反応液供給流路は、これらの各成分を
予め混合調製して供給するように構成されてもよく、各
成分を独立して供給するように構成されていてもよい。

前者の場合の１つの構成例としてはルミノール試薬供給
流路と発光触媒供給流路とを合流し、かっこの合流路の
少なくとも一部をミキシングコイル休に形成して移動相
流路の所定の部分に接続する構成等が挙げられる。一方
後者の場合の１つの構成例としては移動相流路の所定の
部分に、上記のごときルミノール試薬供給流路および発
光触媒供給流路をそれぞれ近接して接続し、かつこれら
の接続部の後段の移動相流路の一部をミキシングコイル
状に形成する等の構成が挙げられる。上記それぞれの場
合において各成分を移送する送液手段は、各流路にそれ
ぞれ独立に設けられていてもよく、また１つを共有する
ものであってもよい。後者の場合さらに移動岨供給部の
送液手段と共有されていてもよい。

この発明の移動…供給部に用いる移動相としては、　ｐ
Ｈ７〜８の例えばリン酸緩衝液に、デアミド−ＮＡＤ、
グルタミン酸およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２°）が
含有された緩衝液が用いられる。

（ホ）作用この発明によれば、移動相流路に導入された試料は、該
移動相に含有されているデアミド−ＮＡＤ、グルタミン
酸およびマグネシウムイオンと共に、ＮＡＤＳ固定化酵
素層、ＧＬＤＨ固定化酵素層およびＮＡＤＨ酸化酵素固
定化酵素層をこの順に通過する間、試料中に含有されて
いるアンモニア態窒素（以下アンモニア）は下記一連の
酵素反応に付され、る。

デアミド−ＮＡＤ＋ＮＨｓ°−ユ史Δ工ば辷啼　ＮＡＤ
”　　　　　　　　・・・（【）ＮＡＤ”　＋グルタミ
ン酸　−ＳユＪΣ旺呻ＮＨ３＋α−ケトグルタル酸十Ｎ
ＡＤＨ＋Ｈ”・・・（ＩＦ）ＮＡＤＨｉＯ；＋Ｈ”　　
”　　’−’　ＮＡＤ”　＋ＨｔＣｈ　−（ＩＩＩ）す
なわち試料中のアンモニアは、デアミド−ＮＡＤおよび
マグネシウムイオンの存在下Ｎ　Ａ　Ｄ　ＳによってＮ
　Ａ　Ｄ　”に変換化され〔（■）の反応〕、次いて生
成したＮＡＤ’はグルタミン酸の存在下ＧＬＤＨによっ
てＮ　Ｈｊ＋α−ケトグルタル酸十ＮＡＤＨ＋Ｈ”に変
換され〔（■）の反応〕、生成したＮＡＤＨ＋Ｈ”は次
いでＮＡＤＨ酸化酵素によって酸化されてＮＡＤ”およ
びＨｔ０２を生成する〔（■）の反応〕。

上記一連の酵素反応により生成されたＨ　ｔ　Ｏｔは、
発光反応部において赤血塩の存在下ルミノールと下記（
ＩＩ／）式のごとく発光反応する。

・・・（ＩＶ）上記ルミノール反応（ＩＶ’）に基づ＜　４２０ｎｍ近
傍の発光強度か化学発光検出器により検出される。該発
光強度と予め設定された検量線に基づいて検出される試
料中のアンモニアの定量がなされる。

以下実施例によりこの発明の詳細な説明するが、これに
よりこの発明は限定されるものではない。

（へ）実施例第１図はこの発明のアンモニア分析装置の−例の構成説
明図である。図においてアンモニア分析装置（１）は、
フローインジェクション分析法に基づく装置構成に形成
されている。すなわち、移動相貯留槽（２）、送液ポン
プ（３）、試料注入部（４）、固定化酵素カラム部（５
）、ルミノール発光反応液供給部（６）および化学発光
検出器（７）をこの順に管路接続してドレインへ延設さ
れる分析流路（ａ）と、化学発光検出器（７）で得られ
る出力に基づいて、被検試料中のアンモニア濃度を演算
しうるデータ処理部（８）から主として構成されている
。

上記試料注入部（４）はループインジェクタで構成され
、さらに図示しない自動温度調節器が設定されており、
これによって試料３７±０．５℃に保持されるよう設定
されている。なお、この自動温度調節器は上記移動相貯
留槽（２）にも接続されておりこれによって移動相も同
温（３７±０．５℃）に保持されるよう設定されている
。

上記固定化酵素カラム部（５）は’、ＮＡＤ合成酵素（
ＮＡＤ、Ｓ）の固定化酵素層（５１）、Ｌ−グルタミン
酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）の固定化酵素層（５２）およ
びＮＡＤＨ酸化酵素の固定化酵素層（５３）がそれぞれ
アクリル製カラム内に形成されたものを、分析流路（ａ
）の上流側からこの順に連結して構成されている。これ
らの固定化酵素層（５１）（５２）（５３）を連結した
上記カラム部（５）は、内径３ｍｍ。

全長４０ｎ＋ｍのカラムに構成されている。上記各固定
層は、細孔径５００人を有しかつ大きさ２０７８０メツ
シユのガラスピーズを担体として、それぞれ所定の酵素
をグルタルアルデヒドを用いた供給結合法により固定化
したものを充填して構成されている。

、　　上記ルミノール発光反応液供給部（６）は、分析
流路（ａ）に管路接続されるルミノール発光反応液供給
流路（６）から構成されている。該ルミノール発光反応
液供給流路（ｂ）は、ルミノール試薬貯留槽（６１）お
よび前記送液ポンプ（３）をこの順に管路接続して構成
されるルミノール試薬供給流路（ｂｌ）と、赤血塩試薬
貯留槽（６２）および前記送液ポンプ（３）をこの順に
管路接続して構成される赤血塩試薬供給流路（ｂ２）と
、これらの管路（ｂｌ）および（ｂ２）を合流しかつミ
キシングコイル部（６３）を有して前記分析流路（ａ）
に管路接続される混合流路（ｂ、）とから構成されてい
る。

上記化学発光検出器（７）としては、光電子増倍管が使
用されている。

上記データ処理部（８）は、上記検出器（７）での光電
子増倍管の電圧出力値をデジタル変換するＡ／Ｄ変換器
（８１）、該デジタル値を記憶しかっこのデジタル値に
対応する濃度を予め設定された検量線に基づいて算出す
るマイクロコンピュータ（８２）、上記算出濃度値を記
録・表示する記録表示部（８３）およびインタフェース
（８４）を具備して構成されている。具体的には島津製
クロマトバック等が用いられる。なおこのアンモニア濃
度算出の基準となる検量線は、予めアンモニア濃度が既
知の標準液とこれに対応する光電子増倍管からの出力電
圧とを多点較正して作成されている。

上記送液ポンプ（３）は、０．５〜１．０ｍＱ／　ｍｉ
ｎの流量に調節されている。

移動相（２１）としては、１０　ｍ　Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ＝７．１）に、デアミド−Ｎ　Ａ　Ｄ　（３０ｍｇ
／　ｄ１２）　、グルタミン酸（３０ｍｇ／　ｄｆ２）
　、塩化マグネシウム（２０ｍｇ／ｄｆ２）を混合した
緩衝液ＣｐＨ＝７〜８）が用いられる。

ルミノール試薬（６４）としては、７ｘｌＯ−’Ｍのル
ミノール溶液が用いられる。

赤血塩試薬（６５）としては、２　Ｘ　１０−”Ｍのフ
ェリシアン化カリ溶液が用いられる。

以上のごとく構成された装置（１）に、アンモニア態窒
素（以下アンモニア）を含有する試料（例えば遠心分離
後のヒト血清）を、試料分注器により所定量（例えばｉ
〜数μｍ２）ずつ分析流路に供給した場合、該試料中に
含有されているアンモニアは固定化酵素カラム部で所定
の酵素により移動相成分と次のごとく反応する。

デアミド−ＮＡＤ＋ＮＨ３”　−まＬＮＤ」し−ＮＡＤ
”　　　　　　　　・・・（１）ＮＡＤ”　＋グルタミ
ン酸　−ぶ」」月１→ＮＨ３＋α−ケトグルタル酸十Ｎ
ＡＤＨ；Ｈ”・・・（ＩＩ）ＮＡＤＨ＋Ｏ，＋Ｈ”　　
　　沿Ｖ頂灯り憔嵜　ＮＡＤ”　＋Ｈ２０ｔ　　・・・
（ＩＩＩ）上記反応（［）−（［Ｉ）−（［Ｉ［）に従
ってＨ２Ｏ，が生成される。このＨ２Ｏ２は発光反応部
において供給されるルミノール試薬と赤血塩の存在下下
記のごとく発光反応する。

・・・（ＩＶ）上記ルミノール発光反応の４２０ｎｍ近傍の発光強度が
、化学発光検出器の光電子増倍管により検出される。こ
のときの光電子増倍管からの電圧出力値がデータ処理部
に出力され、該データ処理部により上記出力対応アンモ
ニア濃度が出力されることとなる。

（ト）発明の効果この発明によれば、血清、血漿等の試料中に含有される
アンモニアを前処理することなく迅速に検出し、定量す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のアンモニア分析装置の一例の構成説
明図である。（２）・・・・・・移動相貯留槽、（３）・・・・・・
送液ポンプ、（４）・・・・・・試料注入部、（５）・・・・・・固定化酵素カラム部、（６）・・・
・・・ルミノール発光反応液供給部、（７）・・・・・
・化学発光検出器、（８）・・・・・・データ処理部、
（５１）・・・・・・ＮＡＤＳ固定化酵素層、（５２）
・・・・・・ＧＬＤＨ固定化酵素層、（５３）・・・・
・・ＮＡＤＨ酸化酵素固定化酵素層、（６１）・・・・
・・ルミノール試薬貯留槽、（６２）・・・・・・赤血
塩試薬貯留槽、（６３）・・・・・・ミキシングコイル
、（８１）・・・・・・Ａ／Ｄ変換器、（８２）・・・・・・マイクロコンピュータ、（８３）
・・・・・・記録表示部、　（８４）・・・・・・イン
タフェース、（ａ）・・・・・・分匠流路、（ｂ）・・・・・・ルミノール発光反応液供給流路、（
ｂｌ）・・・・・・ルミノール試薬供給流路、（ｂ、）
・・・・・・赤血塩試薬供給流路、（ｂ、）・・・・・
・混合流路。

Claims

【特許請求の範囲】１、移動相供給部、生体試料導入部、該生体試料と反応
して過酸化水素を遊離させる固定化酵素カラム部、ルミ
ノール発光反応液供給部及び化学発光検出部をこの順に
管路接続してなる移動相流路と、上記検出器で検出され
る前記遊離過酸化水素とルミノール発光反応液とによる
発光強度に基づいて生体試料に含有されるアンモニア濃
度を算出しうる演算処理部とから構成されたアンモニア
分析装置であって、上記移動相供給部が、デアミド−ＮＡＤ、グルタミン酸
およびマグネシウムイオンを含有する緩衝液の供給部か
らなり、上記固定化酵素カラム部が、ＮＡＤ合成酵素（
ＮＡＤＳ）の固定化酵素層、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵
素（ＧＬＤＨ）の固定化酵素層及びＮＡＤＨ酸化酵素の
固定化酵素層を上記移動相流路の上流側からこの順に直
列配置した構成からなることを特徴とするアンモニア分
析装置。