TW570979B - Genes encoding for the polypeptides having fucose sulfuric acid-containing polysaccharide decomposing activity - Google Patents

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Nobuto Koyama
Takeshi Sakai
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Description

570979 A7 B7 五、發明説明（·） 解糖性 造藻程 構岩工 之含因 糖的基 多用之 酸有Ife 硫有多 糖具該 C 藻，、肽 岩上因多 含製基之 在調之得 成物肽取 造化多所 域碼子之法 領编分性方 術於低活該 技關之解由 之為糖分經術 屬明多糖及技 所發該多、之 明本和酸法前 發析硫製先 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 來自海藻之含岩藻糖硫酸多糖為以總稱性被稱為岩藻 衣聚糖之岩藻糖作為主成分之硫酸化多糖，且已知亦含 有半乳糖、葡萄糖醛酸、木糖、甘露糖、«萄糖等β此 些構成糖之種類和量，乃依據其來源海藻之種類而異。 例如，已有報告將市售Sigma公司製的岩藻衣聚糖分成13 種分子種類〔Carbohydrate Research)、第 255卷、第 213〜2 2 4 頁（ 1 9 9 4 ) ] 〇 若將其大致區別，則可分成實質上不含糖醛酸之構成 糖主成分為岩藻糖者、和含有糖醛酸且於其構成糖中含 有岩藻糖和甘露糖者兩種。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 關於含岩藻糖硫酸多糖之生物活性雖已報告有増強巨 噬細胞活性、抑制癌轉移、抗凝血等各種活性，但在調 查含岩藻糖硫酸多糖中具有分子種之活性本體為在何種 分子種上，乃必須將含岩藻糖硫酸多糖予以分離精製並 且進行調査。但是以前之方法，因為其分離不夠充分故 難以大量調製成為藥品。又，含岩藻糖硫酸多糖為分子 量極大之硫酸化多糖，就其原樣使用作為醫藥品則因具 有抗原性、均勻性、抗凝血活性等之問題，故必須將含 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（> ) 岩藻糖硫酸多糖分解至某些程度。 將含岩藻糖硫酸多糖予以酵素性分解，調製低分子化 物之方法為一種可在穩定溫度之條件下進行反應，並且 為可由酵素之受質專一性取得均勻低分子化物之有利方 法。以往已報告鮑魚、海扇、海膽、海生徹生物等為分 解含岩藻糖硫酸多糖並且産生酵素。但是，此些酵素為 在一般生體内微量含有且加上具有多數的含岩藻糖硫酸 多糖分解酵素，故為了取得單一酵素，乃必須進行種種精製 工程。再者，此些酵素之胺基酸序列和基因構造等並未 完全明白。 發明所欲解決之課題 本發明之目的為提供编碼造成在含岩藻糖硫酸多糖之 調製和構造解析、或低分子化含岩藻糖硫酸多糖之調製 上，具有有用的含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽之基 因、及提供可使用該基因於基因工程中取得具有含岩藻 糖硫酸多糖分解活性之多呔。 解決課題之手段 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明者等為了闌明具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性 之多肽的胺基酸序列及鹼基序列，對於生産含岩藻糖硫 酸多糖分解酵素之徹生物的基因進行致力研究，結果闊 明编碼造成具有來自Alterofflonas屬細菌、Flavobacterium 屬細菌之含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽之基因為各 存在二種，並且確定其全鹼基序列，並且首先蘭明該多 肽之胺基酸序列，且亦再成功開發出使用該基因之工業 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 9 97 70 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 明 説明發 Λ 五 之 呔 多 之 性 活 解 分 糖 多 酸 硫 糖 藻 。 岩明 含發 有本 具成 産完 生且 於並 ， 有法 上方 具或 出 ， 離肽 單多 於之 BSG? 44-J 爵 栏 為活 明解 發分 一 糖 第多 之酸 明硫 發糖 本藻 則岩 ，含 明有 發具 本成 說造 概碼 若编 有 基 的 列 序 A N D 之 呔 多 之 性 活 等 同 有 具 上 能 機 於 性 活 其 c 與因 之 因 基 明 發 1 第 明 發 本 有 含 於 關 為 明 發 二 第 之 明AO 發DN 本組 tgll 5 D 載 組現 重表 明之 發胞 二細 第主 明宿 發為 本作 入胞 tim Du. 插細 於物 關植 為或 明胞 發細 三物 第動 之 、 明物 發生 本徹 之 體 現 表 之 明 發 三 第 明 發 本 由 經 於 關 為 明 發 四 第 之 明 發 本 形 轉 之 明 發 四 第 明 發 本 養 培 於 關 C 為 體明 形發 轉五 之第 形之 轉明 所發 體本 截 i 性特 活其 解為 分肽 糖多 多之 酸性 硫活 糖等 藻同 岩有 含具 有上 具能 集機 採於 物性 養活 培其 該與 由或 並ife ， 多 體之 和 性 活 其 或 肽 多 C 之法 性方 活造 解製 分之 糖肽 多多 酸之 硫性 糖活 藻等 岩同 含有 有具 具上 之能 徵機 ~分 1糖 號多 编酸 列硫 序糖 之藻 表岩 列含 序有 有具 具旦 於 ， 關列 為序 明酸 發基 六胺 第之 之示 明所 發者 本一 任 肽 多 之 性 活 等 同 有 具 上 能 機 於 性 活 其 與 或明 呔說 多單 之簡 性之 活式 解圖 圖 之 率 成 形 〇 澱 圖沈 置之 位糖 之多 2 - 酸 RF硫 3糖 藻 F-岩 R K ο 含 出出 示 示 為為 圖圖 1 2 第第 -------Μ丨^^裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 和 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（+ ) 第3画為示出fdl A之位置圖。 第4圖為示出f dlB之位置圖。 第5圖為使用DEAE-Sephrose FF之層析圖。 發明之實施形態 以下，具體說明本發明。 本發明為關於编碼造成具有含岩藻糖硫酸多糖分解活 性之多肽之基因。該基因所编碼造成之多肽之一例可列 舉來自Alteroaonas屬細菌之具有下式（1)之橋型含岩藻 糖硫酸多糖分解活性之多肽。 (1)對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多糖（以下， 稱為含岩藻糖硫酸多糖-F)作用，令該含岩藻糖硫酸多 耱低分子化。 (a) 構成糖：實質上不含糖醛酸。 (b) 不會經由 Flavobacteriuai sp.SA-0082(CCRC 第 910069號）生産之岩藻衣聚糖分解酵素而被實質上低分 子化。 具有此含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多呔為Alteroiaonas sp SN-10G9所産生之橋型含岩藻糖硫酸多糖分解酵素， 該酵素可如參考例1-(3)記載般調製。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述之含岩藻糖硫酸多糖-F可如參考例1記載般調製。 又，Flavobacteriuffl sp. SA-0082(CCRC第 910069號） 生之一之岩藻衣聚糖分解酵素可如參考例5記載般調製。 具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之另外多肽，可例示 來自Flavobacterium屬細菌之具有下述（2)之含岩藻糖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 kl B7 五、發明説明（^ ) 硫酸多糖分解活性之多呔。 (2)對具有下述理化性質之含岩藻糖硫酸多糖（以下， 稱為含岩藻糖硫酸多糖-ϋ)作用，令該含岩藻糖硫酸多 糖低分子化，游離出至少一種以上選自下述式〔I〕、 〔II〕、 〔III〕及〔IV〕之化合物。 (C)構成糖：含有糖醛酸。 (d)經由 Flavobacteriuin s p . SA-0082(CCRC 第 910069 號）生産之岩藻衣聚糖酵素而被分解。 ；I衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-口
I 〇=S=0 I OH 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（> 0H I 0=S=0
OH 〔II〕
〇 =s =0 I• OH OH I o=s=o 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
OH
CiiO 0
OH o=s=o I OH 0 •8. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公势） 570979 A7 B7 五、發明説明（7 )
〇—S =〇 〇=s=0 OH 〇Η (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 此具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽為 Flavobacterium sp. SA-0082生産之岩藻衣聚糖分解酵 素，該酵素可如參考例5記載般調製。 於本發明中所謂具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多 肽，不僅為指天然型之含岩藻糖硫酸多糖分解酵素，且 只要具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之於天然胺基酸序 列中經由胺基酸之缺失、取代、插入、加成等，令胺基 酸序列改變之多呔亦為包含於本發明所含之意義。 又，此處所稱之天然型含岩藻糖硫酸多糖分解酵素， 可列舉如來自Alteroffionas屬細_、Flavobacterium屬 細_之酵素，但本發明並不被其限定，且當然亦包含來 自其他細蘭類、酵母類、絲狀舗類、子囊菌類、擔子菌 類等微生物之酵素、或來自植物、動物等生物體之酵素。 於本說明書中，所謂於機能上具有同等活性之多fe為 指如下物質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（反） 於天然存在之蛋白質中，除了编碼造成其之基因的多 型性和變異以外，雖然經由生成後，蛋白質於生體内及 精製中之修飾反應，可引起其胺基酸序列中胺基酸殘基 之缺失、加成、插入、取代等變異，但已知有與不具有 此些變異之蛋白質顯示實質上同等之生理、生物學活性 者。即使具有此類構造上之差異，於其機能上並未察見 大為不同者則稱其為於機能上具有同等活性之多肽。 即使於人工蛋白質之胺基酸序列中導入如上述變異之 情況亦為同樣，雖然此時可能製作出更加多樣之變異體 ，但只要與不具有變異者顯示出實質上同等之生理活性 ，則將此些變異體解釋為於機能上具有同等活性之多肽。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如，於大腸桿菌中所表現之蛋白質N終端存在之甲 硫胺酸殘基多之情形中，雖然經由甲硫胺酸胺基酸胜ife 酶之作用將其除去，但卻依據蛋白質之種類而生成具有 甲硫胺酸殘基者、及不具有甲硫胺酸殘基者兩者。但是 ，有無此甲硫胺酸殘基，對於蛋白質之活性多不會造成 影繼。又，已知於人類間白素2(IL-2)之胺基酸序列中、 或半胱胺酸殘基經絲胺酸取代之多Bfe為保持間白素2活 性〔Science、第 2 2 4 卷、1431 頁（ 1 9 8 4 )〕〇 再者，於基因工程中進行蛋白質生産時，屢屢進行表 現為融合蛋白質型式。例如，為了增加目的蛋白質之表 現量，在目的蛋白質之N終端加成來自其他蛋白質N終 端之胜肽鏈，於目的蛋白質之N終端、或C终端加成適 當的胜ife鏈令其表現，並於加成之胜肽鏈中使用具有親 -10-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（9 ) 和性之載體，則可輕易進行目的蛋白質之精製。 又，於目的蛋白質之胺基酸序列中，將一個或數個胺 基酸殘基進行至少一種缺失、加成、插入、或取代之多 肽，而與目的蛋白質於機能上具有同等活性之情況亦不 少，而此類多肽及编碼該多呔之基因為來自天然單離者 或人工所製作者均包含於本發明。 一般於基因上指定胺基酸之密碼組（三個鹼基之組合） ，已知於每胺基酸種類中各存在1〜6種。因此，编碼 造成胺基酸序列之基因雖亦依據胺基酸序列而異，但亦 可存在多種。基因於自然界中絶非安定存在，且於其核 酸中並非不常發生變異。基因上所發生之變異亦有時並 不會對所编碼之胺基酸序列造成變化（稱為無磬變異）， 於此倩形中乃産生不同基因编碼造成相同之胺基酸序列 。因此，即使單離出编碼造成某特定胺基酸序列之基因 ，亦無法否定將含有其之生物予以繼代後出現多種基因 编碼造成相同胺基酸序列之可能性。 又，於人工製造多種基因编碼造成相同胺基酸序列上 ，若使用各種基因工程性手法則不難進行。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如，於基因工程之蛋白質生産中，编碼造成目的蛋 白質之本來基因上所使用之密碼組於所使用之宿主中的 使用頻率低之情形中，則蛋白質之表現量低。於此類情 形中，經由對编碼之胺基酸序列不會造成變化，且將密 碼組人工變換成宿主所頻繁使用者，則可進行策劃目的 蛋白質之高表現。如此，编碼造成特定胺基酸序列之基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 ------------- 五、發明説明（） 的部分胺基酸序列，並且檢紂可利用作為探針或引子之 合成的寡核甘酸之製作。 首先，例如 Alteromonas sP· SN-1009 或 FlavobacteriuiH sp. SA-0082，且其次由此培養物，分別單離、精製所 産生之含岩藻糖硫酸多糖分解酵素。 其次，對於所精製之各含岩藻糖硫酸多糖分解酵素， 取得關於其部分胺基酸序列之資料。於決定部分胺基酸 序列上，例如將含岩藻糖硫酸多糖分解酵素直接依常法 ，經由Exliaan分解法用於胺基酸序列分析（例如，可使用 Protein Sequencer 476A、 APP〇lied Biosysteros公司 製），決定含岩藻糖硫酸多糖分解酵素之N終端胺基酸 序列。或者，對精製之含岩_糖硫酸多糖分解酵素，以 專一性高之蛋白質水解酶例如Achroroobacter protease I、N-甲苯磺醯基苯基丙胺醯基氯甲基酮（TPCK)-胰 蛋白酶等予以作用，進行限定水解，並將所得之胜肽斷 Η使用逆相条HP LC予以分離、精製後，若對於精製之胜 肽斷Η進行胺基酸序列分析，則取得許多胺基酸序列資 料。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝· 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 擇基度對因具 選為程成基成 ，料之合之造 素資併須肽碼 酵該間必多编 解以時，性為 分並此之活乃 糖，S解計 多料酸換分設 酸資甘，糖之 硫之核酸多酸 糖列寡甘酸甘 藻序併核硫核3-岩酸簡寡糖寡-1 含基之之藻 ， 之胺列長岩酸 得分序愈含甘 所部基成有核 理的鹼合具寡 處一成須成的 此專合必造高 如；計則碼性 對關設低編 一 相礎愈於專 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 570979 B7 五、發明説明（& ) 有含岩藻糖硫酸多糖分解活性多肽基因之選殖上的重要 要因。 其次，必須檢討經由南向雜交法所合成之寡核甘酸與 编碼造成具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性多肽基因之專 一性雜交作用的條件。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如，將 Alt, ero®onas sp· SN-1009 或 Flavobacteriuin sp. SA-0082之基因組DNA，以適當的限制酶予以完全切 開，並以瓊脂糖顏電泳分離後，位常法以尼龍膜等進行 點漬。雜交作用為首先例如將含有6XSSC(1XSSC)為將 8. 77克之氯化鈉及4.41克之檸檬酸鈉溶解於1公升水中 之物質）、1%月桂基硫酸鈉（SDS)、 100>ug/iil鮭魚精 子DNA、5xDenhart’s(分別含有0·1%濃度之兔血清白 蛋白、聚乙烯基毗咯烷酮、Ficoll)之預雜交溶液中65°C 下保溫數小時並於尼龍膜上點清後，例如加入以32 P等 予以標幟之合成寡核甘酸並於42 °C下保溫一晚。將此尼 龍膜以含有0 · 1 % S D S之1 X S S C於4 2汜洗淨3 0分鐘後， 依據自動放射顯像術檢測與合成之寡核甘酸探針雜交之 DN A斷Η。此時，經由所使用之合成寡核甘酸之長度和 與编碼造成具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性多呔基因之 互補性，檢討保溫溫度和洗淨溶液之鹽濃度等並可有效 選擇最適條件。 取得如此處理檢測之含有编碼造成具有含岩藻糖硫酸 多糖分解活性多肽基因之DNA斷片的方法，可為將相當 於直接檢測帶位置之DN Α斷Η由膠萃取、精製後，製作 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（0 ) 嵌入通常所使用之宿主-載體条之載體中的基因庫，並 以南向雜交法同樣之條件進行菌落雜交、或噬薗斑雜交 ，篩選含有目的DN A斷Η之選殖株，並將其單離。或者 直接將 Alteroinonas sp· SN - 1009或 Flavobacterium sp. S A-0082之基因MDN A以適當的限制酶切開後，製作 嵌入通常所使用之宿主-載體条之載體中的基因庫，並同 樣地以雜交法篩選出含有目的DNA斷片之選殖株，將其單 離。 所使用之宿主-載體条可使用公知之物質，可列舉例如 以大腸桿菌作為宿主之PUC18，PUC19等之質體載髏、或 又-噬_體等之噬菌體載體，但並非限定於此。 此些宿主-載體条之種類和操作方法若為一般所用之 種類和方法即可，且例如為Moleucular，Cloning，A L a b o r a t o r y M a n u a 1，第二販〔J · S a in b r ο o fc 等著；冷泉 港1989年發行〕所記載。 若可選出含有目的DN A斷片之載體，則於載體中所插 入之目的DN A斷Η的驗基序列可依通常之方法，例如雙 脫氧法[Proceeding of the National Academic of Science of the USA (Proc· Nat· Acad. Sci. ,U.S.A.) 、第74卷、第5 4 6 3頁（1 9 7 7 )〕予以決定。所決定之鹼基 序列經由與含岩藻糖硫酸多糖分解酵素之N終端分析、 部分胺基酸序列、分子量等之比較，則可得知所取得之 DNA斷片中的基因構造及該基因所编碼之多肽的胺基酸 序列。 -1 5 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 【裝·
、1T 570979 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 岩 含 述 上 以 用 使 又 胺含 R 分有PC 部具用 之成使 素造可 酵碼 ， 解编 分得 糖取 多， 酸酸 硫甘呔 糖核多 藻寡性 之活 得解 所分 礎糖 基多 為酸 列硫 序糖 酸藻 基岩 法 方 之 因 基 之 由因 可基 中的 間目 時之 短法 在交 為雜 ，於 法用 R 吏 C 侯 1Γ 可 得 DN取 匣料 卡資 用列 使序 以酸 C 亦基法 中胺方 其之之 c 多 Η 法不斷 將 如 例
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行斷 進NA Η I 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（4 ) 再者，若將上逑所得之含岩藻耱硫酸多糖分解酵素基 因、或其一部分作為探針之Alteromonas sp. SN-1009 或 FlavobacteriuHi sp. SA - 0082之基因組 DMA經由南向 雜交法進行解析，刖可由所檢測之帶之位置，取得含有 编碼造成具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性多肽之基因之 Alteroraonas s p. SN- 109或 F1 avobacteriuro s p . S A -0082之基因組DN A限制酶斷H斷片大小的資料，又，經 由所檢測之帶之數目，可預告編碼造成具有含岩藻糖硫 酸多糖分解活性多肽之基因及顯示互補性之基因數目， 且含此些基因之DN A斷片可經由前述同樣之方法予以單 離。 如此所得之DN A斷Η是否含有編碼造成目的酵素之基 因，可經由製作含有最終所單離之該DN Α斷片之表現載 體，並且使用該載體進行宿主之轉形，其次進行此轉形 體之培養，並且測定所表現之多肽的含岩藻糖硫酸多糖 分解活性則可確認。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於本發明中，由Alterofflonas sp. SN-1009單離出具 有序列表之序列编號1及序列编號2所分別表示之胺基 酸序列，且單離出具有編碼造成具有含岩藻糖硫酸多糖 分解活性多肽鹼基序列之基因。编碼造成具有序列编號 2及序列编號2所分別表示之胺基酸序列之多肽的鹼基 序列例，分別示於序列表之序列编號5及序列编號6。 又，由Flavobacterium sp. SA-0082單離出具有序列 表之序列编號3及序列编號4所分別表示之胺基酸序列 -1 8 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 kl B7 五、發明説明（V ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，且具有编碼造成具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性多呔 鹼基序列之基因。编碼造成具有序列编號3及序列编號 4所分別表示之胺基酸序列之多肽的鹼基序列例，分別 示於序列表之序列编號7及序列编號。 經由使用本發明基因之鹼基序列，以雜交作用取得编 碼造成具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性或機能上同等活 性多肽之基因之方法，例如可蓮用以下之方法。
首先，將目的基因源所得之染色體DNA、或由ibRNA經 由逆轉錄酶所製作之cDNA，依常法連接至質體和噬«體 載體並且導入宿主，製作基因庫。將此基因庫於平板上 培養，並將生長之_落在噬菌斑移至硝基纖維素或尼龍 膜，並經由變性處理將DN A固定於膜上。將此膜例如於 含有32 P等予以標_之探針（所使用之探針可為编碼序列 表之序列編號1〜4任一者所示之胺基酸序列、或其部分 之鹼基序列，巨例如可使用序列表之序列编號5〜8任一 者所示之鹼基序列、或其部分）之溶液中保溫，並於膜上 之{) N A與探針之間形成雜交。例如將D N A固定化之膜於含 有 6XCCS、 1%SDS、 鮭魚精子 DNA、 5X 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 中 液 溶 之 下 °c 之 針 探 與 行 進 時 經 〇 ，株 後殖 去選 洗之 針交 探雜 之成 丨附形 Μ吸針 !性探 一 與 專出 非定 將鑑 ，等 後術 交影 雜顯 C 射 用放 乍BJ AT. ΤΠΒΠ 六X自 雜由 因 基 0 〇 之 止因得 為基所 一 之認 單Ife確 成多 ， 變的列 株目序 殖碼基 選编鹼 之入定 插決 已下 ，如 中如 株例 殖因 選基 之之 操得得 此所所 將此 交 雜 成 形 至 覆 && 獨ί 作 如 於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（d) 是否為編碼造成具有目的之含岩藻糖硫酸多糖分解活性 或機能上具有同等活性之多肽之基因。 鹾基序列之決定，若轉形體為以質體所轉形之大腸桿 _，則可在試管等中進行培養，並且依常法萃取質體。 將其以限制酶切斷取出所插入之斷片，並於Ml 3噬_體 等之中進行次選殖，且依據雙脫氧法決定鹼基序列。即 使使用噬_體載體之重組體亦可經由基本上同樣之步驟 ，決定出鹼基序列。關於由此些培養至決定鹼基序列為 止之基本性的實驗法例如記載於Molecular Cloning A Laboratory Manual 第二販[J . Sambrook 等著。冷泉港 實驗室1 9 8 9年發行〕等。 於確認所得之基因是否為编碼造成具有目的之含岩藻 糖硫酸多糖分解活性或機能上同等活性之多肽之基因， 可將所決定之鹼基序列或其編碼之胺基酸序列與本發明 序列表之序列編號5〜8任一者所示之鹼基序列或序列表 之序列編號1〜4任一者所示之胺基酸序列進行比較。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於所得之基因為全部不含有编碼造成具有含岩藻糖硫 酸多糖分解活性或機能上具有同等活性多肽之區域時， 刖以所得之基因作為基準，製作合成D N A引子，並經由 P C R將不足之區域放大，且以所得之基因斷片作為探針 ，再對DMA庫或cDNA庫進行篩選，則可決定出於本發明 基因雜交之具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性或機能上具 有同等活性之多肽的全部编碼區域之鹼基序列。
另一方面，由本發明基因之驗基序列，可設計出PCR -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（β ) 反應用之引子。經由使用此引子進行PCR反應，則可檢 測出與本發明基因相同性高之基因斷H,並且亦可進一 步取得其基因全體。 其次令所得之基因表現，測定含岩藻糖硫酸多糖分解 活性，並且確定所得基因之機能。 便於依下列方法使用编碼造成具有本發明含岩藻糖硫 酸多糖分解活性多肽之基因，生産具有含岩藻糖硫酸多 糖分解活性多肽。 首先，使用含有编碼造成具有目的含岩藻糖硫酸多糖 分解活性多肽基因之載體進行宿主之轉形，其次依通常 所用之條件進行此轉形體之培養，則可産生具有含岩藻 糖硫酸多糖分解活性之多肽。此時該多肽亦可以包含體 (inclusion body)形式産生。宿主可使用徹生物，動物 細胞植物細胞等之培養細胞。 便利經由例如測定含岩藻糖硫酸多糖分解活性，進行 表現之確認。活性測定可例如以重組體大腸桿菌之細胞 萃取液作為酵素液進行測定。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於察見具有目的之含岩藻糖硫酸多糖分解活性多肽之 表現之情況中，例如轉形體若為大腸桿菌，則依據培養 基組成、培養基之PH、培養溫度、誘導劑之使用量、使
I 用時期、培養時間等，決定最適條件，則可以良好效率 産生具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽。 使用通常之方法可由轉形體之培養物精製出具有含岩 藻糖硫酸多糖分解活性之多呔。於轉形體為如大腸桿菌 _ 2 1 -本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 ΑΊ B7 五、發明説明（w) 般於細胞内蓄積具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多呔 時，於培養終了後經由離心分離收集轉形體，並以超音 波處理等其弄碎後，予以離心分離則可取得無細胞萃取 液。其後，使用鹽析、離子交換、膠過濾、斥水、親和 性等各種層析等之一般的蛋白質精製法，則可精製出目 的之多ifeo雖然依據所使用之宿主-載體条而有表現産 物分泌至轉形體外之情況，但此時可由培養上清液同樣 地進行精製。 轉形體所産生之具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多 肽，於蘭體内産生時雖與_體内之各酵素共同存在，但 由於與具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽量相比乃 極微量，故其精製極為容易。再者，若使用細胞作為宿 主，則可大幅降低作用於含岩藻糖硫酸多糖之來自宿主 之酵素。又，於具有含岩藻糖硫酸多糖基因分解活性之 多肽為被分泌至_體外之情況中，雖然共同存在培養基 成分等，但其可輕易地與具有含岩藻糖硫酸多糖分解活 性之多肽分離。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，例如宿主為大腸桿_之情形中，表現産物可以不 溶之包含體型式形成。此時，於培養終了後可經由離心 分離收集蘭體，並將其以超音波處理等弄碎後，進行離 心分離等收集含有包含體之不溶性部分。將包含體洗淨 後，以通常所使用之蛋白質溶化劑例如尿素和胍鹽酸鹽 等將其溶化，並巨視需要進行離子交換、膠過濾、斥水 、親和性等各種層析予以精製後，經由途上使用透析 -22-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（Η ) 法或稀釋法等之操作，則可取得保持活性之具有目的之 含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽。視需要若將此樣品 再以各種層析予以精製，則可取得具有高純度含岩藻糖 硫酸多糖分解活性之多呔。 尚，於生産與具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽 於機能上具有同等活性之多肽之情形中，亦可使用同樣 的生産方法、精製方法。 如此經由本發明，則可提供具有含岩藻糖硫酸多糖分 解活性之多呔的一級構造及基因構造ο又，亦可進行具 有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽或與其活性於機能 上具有同等活性之多呔的基因工程性製造。 若使用本發明之基因工程性製法，則可取得廉價且具 有高純度含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽或與其活性 於機能上具有同等活性之多呔。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以上，將産生含岩藻糖硫酸多糖分解活性之Alteromonas 屬細_或F]avohacteriuffi鼷細蘭予以培養生産含岩藻糖 硫酸多糖分解酵素之方法，為了同時生産蛋白酶和其他 之多糖分解酵素，且為了單離出目的之含岩藻糖硫酸多 糖分解酵素，乃必須進行與極麻煩酵素之分離精製，又 ，為了誘導酵素之生産乃必須於培養時於培養基中添加 昂貴的含岩藻糖硫酸多糖，誘導出含岩藻糖硫酸多糖分 解酵素，但依據本發明則可廉價地提供具有高純度之含 岩藻糖硫酸多糖分解活性分解多肽。 實施例 -2 3- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（p) 以下，列舉實施例更具體說明本發明，但本發明並不 被以下之實施例所限定。 參考例1 (1) 將乾燥之高果美海帶2公斤以自由粉碎機M-2型 (奈良機械製作所製）予以粉碎，並於4. 5倍量之80%乙 醇中以8 0 °C處理2小時後將其過濾。對於殘渣，將上述 80 %乙醇萃取、過濾之工程再重覆3回，則可取得乙醇 洗淨殘渣1870克。於殘渣中加入36公升水，於100°C處 理2小時，經由過濾取得萃取液。將萃取液之鹽濃度使 與4 0 G m Μ之氯化鈉溶液相同後，將5 %氣化鯨蠟基吡啶鏘 鹽添加至不再産生沈澱為止，並且離心分離。此沈澱以 8 0 %乙醇重覆洗淨，並將氯化鯨蠟基毗啶鏘鹽完全除去 後，溶解於3公升之2 Μ氯化鈉中，以離心分離除去不溶 物，並懸浮於經2Μ氯化鈉平衡化之100毫升DEAE-CeUulofine Α-800，且於攪拌後過濾，除去樹脂。將 此濾液加至以2M氯化鈉平衡化之〗00毫升DEAE-Cellulofine A- 8 0 0柱中，並將直接通過之部分以超濾器（過濾膜之排 除分子量10萬）進行脫鹽及除去低分子，旦以離心分離 除去此時所産生之沈澱。將此上清液冷卻乾燥，取得精 製之高果美海帶之含岩藻糖硫酸多糖混合物82.2克。 (2) 將上述之本身高果美海帶之含岩藻糖硫酸多糖混合 物7克，溶解於700毫升含有0.2M氯化鈣P之20raM醋酸鈉 (PH 6.0)後，加至事先以含有0.2氣化鈣之2ϋιηΜ醋酸鈉 (ΡΗ6.0)平衡化之 4000 毫升 DEAE-Sephiarose FF 柱，並 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 ΟΧ 297公釐） -------J 丨 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 570979 A7 B7 五、發明説明（d) 以含有0.2M氮化鈣之20®M醋酸鈉（PH6.0)將柱充分洗淨 後，以0〜4M之氣化鈉梯度予以溶出。收集氯化鈉濃度 為0.9〜1.5M所溶出之部分，以裝設排除分子量10萬之 超濾膜之超濾器予以濃縮脫鹽後，冷凍乾燥，取得含岩 藻糖硫酸多糖-F之冷凍乾燥樣品4. 7克。 又，收集氣化鈉濃度為0.05〜0.8M所溶出之部分，並 以裝設排除分子量10萬之超濾膜之超濾器予以濃縮脱鹽 後，冷凍乾燥，取得含岩藻糖硫酸多糖-ϋ之冷凍乾燥樣 品2 .】克。 (3)將 Alteroffionas sp· SN-1009(CCRC第 910070號）接 種至其中已分注含有葡萄糖0.25 %、蛋白臃1.0%、酵 母萃取物0.05%之人工海水（Gerffiarin Laboratory公司 製）PH8.2所組成之培養基600毫升且經殺®U2{)°C、20 分鐘）之2公升三角燒瓶中，並於2 5 °C下培養2 5小時， 將其作為種培養液。將含有蛋白腺200克、酵母萃取物 4克、及消泡劑（信越化學工業公司製KM70)4毫升之人 工海水PH8.0所組成之培養基18公升，放入30公升容積 之醱酵缸中並於20°C之下殺麵20分鐘。冷卻後，添加另 外使用1 2 0 °C、 1 5分鐘殺菌之2公升人工海水中溶解2 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 克參考例1-(1)方法所調製之來自高果美海帶之含岩藻 糖硫酸多糖-F，並接種上述之種培養液600毫升，於24°C 下2 0小時、每分鐘1 G公升之通氣量和每分鐘2 5 0迴轉之 攪拌速度之條件下進行培養。培養終了後，將培養液離 心分離，取得蘭體及培養上清液。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（-ο 培養上清液中之橋型含岩藻糖硫酸多糖分解酵素之活 性，於使用含岩藻糖硫酸多糖-F作為受質，依參考例2 記載之方法予以_定時，其為10aU/Bl·培養液。 將所得之培養上清液以分级分子量1萬之超濾器予以 濃縮後，以離心分離除去所生成之沈殺，並以8 5 %飽和 硫酸銨鹽析，以離心分離收集所生成之沈殺，且對含有 1/10濃度人工海水（Gerfflarin s)之20®M Tris — 緩衝 液（PH8.2)充分透析，取得400毫升之精製酵素。 令所得之精製酵素液，吸附至事先以含有5fflM曼氮化 鈉及1/〗〇濃度人工海水（Gerfflarin s)之2()mM Tris~HC1 緩衝液（ρΗ8·2)平衡化之 DEAE-Cellulofine A-800(生化 學工業公司製）柱，並以相同之緩衝液將吸附物充分洗 淨後，以相同緩衝液中含有200ffiM、300raM、 400·Μ、及600mM氯化鈉之溶液將其溶出，收集活性部分。 所得之活性部分的酵素活性依參考例2記載之方法予 以測定時，其為2 0 4 0 0 in L ( 2 Q · 4 ϋ )。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 所得之活性部分以分级分子量1萬之超濾器予以濃縮 後，一邊添加含有1〇ηιΜ氯化鈣及50πιΜ氯化鈉之20πιΜ Tris -H C 1緩衝液ρ Η 8 . 2，一邊進行超過濾，完全經緩衝液取 代。 含所得之酵素溶液，吸附至事先以相同緩衝液平衡化 之I)F,AE-Sepharose FF柱，以相同之緩衝液將吸附物充 分洗淨，以氯化鈉濃度為150wM之相同緩衝液再進行洗 淨，其後以含有150fflM至400ϊβΜ氯化鈉之相同緩衝液進行 -26-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 kl --- B7 -----〜_________ 五、發明説明（^ ) 氡化鈉之梯度溶出。 收集所得之活性部分，以超過濾濃縮後，以Sephacryl S- 2 0 0進行（® _濾。於溶出液使用含有5πιΜ叠氮化鈉及1/1〇 濃度 Gerniarin 3 之10“ Tris-HCl 緩衝液 pH8.0。尚，以 該層析求出分子量時，其為約10萬。 收集所得之活性部分，以超過濾濃縮後，一邊添加含 有10mM氯化鈣、氣化鉀，及i50fflM氯化鈉之20βϊΜ Tris -HC1緩衝液（PH8 2) 一邊進行超過濾，完全經緩衝液取代 。將此酵素液加至事先以相同緩衝液所平衡化之1)£^-C e 1 1 u 1 〇 f i n e A _ 8 〇 〇，並以相同緩衝液洗淨後，進行1 0 0 M 至350mM氯化鈉之梯度溶出。 收集所得之活性部分，以含有50aM氛化鈉之相同緩衝 液充分透析後，吸附至事先以含有SOniM氣化鈉之相同緩 衝液平衡化之DEAE-Cellulofine A-800,並以相同之緩 衝液洗淨後，以5flmM至150bM氣化鈉進行梯度溶出。收 集所得之活性部分，取得精製酵素。 又，以SDS(月桂基硫酸鈉卜聚丙烯醯胺電泳求出該精 製酵素之分子量時，其為約9萬。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 參考例2 使用參考例1 - ( 2 )工程所得之含岩藻糖硫酸多糖-F ,並 旦如下述測定橋型含岩藻糖硫酸多糖分解活性。 即，令含有2.5%含岩藻糖硫酸多糖4溶液12#1。6#1 1M氯化鈣溶液和9>ul 4M氣化納溶液、60>ul 5Q»M醋酸 和眯唑和Tris-HCl之緩衝液（PH7 · 5)和21 # 1水，和12 // 1 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4g ( 210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（d) 之分解活性測定用被檢測液予以混合，並於30°C反應3 小時後，以l〇〇°C處理反應液10分鐘，離心分離後，將 1 0 0 #】以Η P L C予以分析，測定低分子化之程度。 準備使用被檢測液所用之緩衝液，代替分解活性測定 用被撿測液，並且依據同樣條件進行反應者、及使用水 代替含岩藻糖硫酸多糖-F溶液並且進行反應者作為對照 ，且分別同樣地以Η P L C進行分析。 上述反應条中，於1分鐘將1^4 mol含岩藻糖硫酸多 糖-F之岩藻糖基鍵切斷之酵素量視為1單位之酵素。所 切斷之岩藻糖基鍵之定量為依據下式求出〉 { (12X 2.5) / (100X MF)} X {(MF/M) - 1} X { 1/ (180 X 0.01)} X 1 0 0 0 = U/ in 1 (12X 2.5)/100:於反應条中所添加之含岩藻糖硫酸多 糖-F (mg) MF:受質含岩藻糖硫酸多糖-F之平均分子量 Μ :反應産物之平均分子量 (MF/M)-〗：1分子之含岩藻糖硫酸多糖-F經由酵素所 切斷之數目 1 8 0 :反應時間（分） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 . 0 1 :酵素液量（《I 1 0 尚，HP LC之條件為如下述。 裝置：L- 6 2 0 0型（日立製作所製） 柱：0H耳食SB-806(8®mX 300ram)(昭和電工社製） 溶離液：含有叠氮化鈉、25raM氯化鈣、及50ιβΜ氯 -28-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（π ) 化鈉之25mM咪唑緩衝液（pH8) 檢測：差示折射率檢測器（Shodex RI-71、昭和電工 公司製） 流速：1 m ] /分
柱溫：2 5 °C 為了測定反應産物之平均分子量，將市售已知分子量 之支鏈澱粉（STANDARD P-82、昭和電工公司製）以下述 HPLC分析同樣之條件下進行分析，並將支鏈澱粉之分子 量與OHpak SB- 8 0 6之保持時間之關俗，以曲線表示，作 為汾定上述酵素反應産物分子量之標準曲線。 參考例3 使用參考1-(2)工程所得之含岩藻糖硫酸多糖-U,並 且如下述測定含岩藻糖硫酸多糖分解活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ϋϋ 1 - - - - - 1— ΙΑ..二 - - I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將2 . 5 %含岩藻糖硫酸多糖-U溶液5 0 /i 1、和1 0 # 1之 分解活性測定用被檢測液、和60 # 1含有66 Μ氯化鈉之 83mM磷酸緩衝液ΡΗ7.5予以混合，於37°C反應3小時後 ，將反應液1D5#1和水12ml混合、攪拌、並測定其在 230η πι之吸光度（AT)。準備僅使用被檢測液所用之緩衝 液，代替分解活性測定用被檢測液，並且依據同樣條件 進行反應者、及使用水代替含岩藻糖硫酸多糖-U溶液並 a進行反應者作為對照，且分別同樣地測定吸光度（A B 1 及 A B 2 ) 0 上述反應糸中，於1分鐘將l/iin〇l甘露糖和糖醛酸間 之配糖體鍵予以脱離性切斷之酵素量視為1單位之酵素。 -29-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（J) 所切斷之鍵的定量為以脫離反應時所産生之不飽和糖醛 酸之毫莫耳分子趿光俗數視為5. 5進行計算。尚，酵素 之活性為依下述式算出。 (AT-AB1-AB2)X 2 . 1 0 5 X 1 2 0 / 5 . 5 X 1 0 5 X 0 . 0 1 X 1 8 0 =U / 祖 1 式中， 2 · 1 0 5之測定吸光度之樣品液量（πι 1 )、 120為酵素反應液之液量1) 5. 5為不飽和糖醛酸於230ηιη中之毫莫耳分子吸光僳數 (/ ffl Μ )、 1 0 5為稀釋所使用之反應液液量（# 1 ) 0.(Π為酵素液量（ml) 1 8 0為反應時間（分） 參考例4 U)將含岩藻糖硫酸多糖-F及含岩藻糖硫酸多糖-ϋ之 分子量，以使用Sephacryl S-500之膠過濾法求出時， 則顯示出各以約1 9萬為中心之分子量分布。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2)含岩藻糖硫酸多糖-ϋ及含岩藻糖硫酸多糖-F於各 氛化納濃度中，過量氣化鯨蠟基Btt啶鑷鹽存在下之沈澱 形成性示於第2圖。 第2圓之縱軸為表示沈澱形成率（％),且橫軸為表示 氯化鈉濃度（M)。圖中，實線及白圈為表示含岩藻糖硫 酸多糖Ml於各氯化銷濃度之沈澱形成率，且圖中，點線 及白5角為表示含岩藻糖硫酸多糖-F於各氨化鈉濃度（M) -30-本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（w) 之沈澱形成率。 沈澱形成率之測定為在溶液溫度3 7 °C中，如下述進行。 將含岩藻糖硫酸多糖-U及含岩藻糖硫酸多糖-F分別以 2 %之濃度溶解於水及4 Μ之氯化鈉，並經由混合各種比 例，調製溶解於各種濃度氯化鈉之含岩藻糖硫酸多糖-I) 及含岩藻糖硫酸多糖-F溶液各1 2 4 1。其次，將氯化鯨 蠟基吡啶錨鹽以2 . 5 %濃度溶解於水及4 Μ氯化鈉中，並 經由將其混合，調製溶解於各種濃度氯化鈉之1.25 %氯 化鯨蠟基毗啶鏘鹽溶液。 將溶解於水之2 %含岩藻糖硫酸多糖-ϋ及含岩藻糖硫 酸多糖-F， 1 . 2 5 %氯化鯨蠟基毗啶鏘鹽完全地沈澱則必 須為3. 2倍容量。於是，對於溶解於各濃度氯化鈉之2% 含岩藻糖硫酸多糖-U及含岩藻糖硫酸多糖-F各125>u 1, 添加4 G 0 # 1溶解於各種濃度氯化鈉之氯化鯨蠘基吡啶錨 鹽溶液後，充分攪拌並且放置3 0分鐘後，予以離心分離 並且依據苯齡-硫酸法〔Analytical Chemistry、第28 卷、第350頁（1956)〕測定上清液中之糖含量，並算出 各種氯化納濃度下之各含岩藻糖硫酸多糖之沈澱形成率。 (3 )以下列所示方法分析含岩藻糖硫酸多糖-F之成分。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 首先，依據 Journal of Biological Chemistry、第 175卷、第595頁（ 1 9 4 8 )之記載、定量岩藻糖量。 將含岩藻糖硫酸多糖-F之乾燥樣品，以0.5 %之濃度 溶解於1當量之鹽酸中，以1 1 0 °C處理2小時，令構成 單糖進行水解。令使用GlycoTAG™及GlycoTAG™ Reagent 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（V)
Kit (均為寶酒造公司製）水解所得之單糖的還原性終端 ，予以毗啶基-(2卜胺基化（PA化），並以HPLC調査構成 糖之比率。 其次，依據 Analytical Biochemistry、第4 卷、第 3 3 0頁（1 9 6 2 )之記載，定量糖醛酸量。 又，依據 Bioichemical Journal、第 84卷、第 106頁 (1962)之記載，定量硫酸含量。 此含岩藻糖硫酸多糖-F之構成糖為岩藻糖、半乳糖， 其莫耳比為約1 0 : 1。糖薛酸及其他中性糖則於實質上 並不含有。又，岩藻糖與硫酸基之莫耳比為約1: 2。 以上述方法為準測定含岩藻糖硫酸多糖-ϋ之成分。其 結果，含岩藻糖硫酸多糖-U之構成糖為岩藻糖、甘露糖 、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、糖醛酸。其他之中 性糖則於實質上不含有。又，主要成分之岩藻糖：甘露 糖：半乳糖：糖醛酸：硫酸基以莫耳比為約10: 7: 4: 5 : 20 〇 (4) 以髙速-高感度旋光計SEPA-300(堀場製作所製）測 定此含岩藻糖硫酸多糖-F冷凍乾燥物之比旋光度時，為 -1 3 5度。 又，含岩藻糖硫酸多糖-ϋ之比旋光度為_ 5 3 . 6度。 (5) 令1%之含岩藻糖硫酸多糖-F溶液16毫升、50πιΜ之 磷酸緩衝液（pH8.G)12毫升和4Μ之氯化鈉4毫升和32fflU/ml 之下述參考例5記載之橋型岩藻衣聚糖分解酵素溶液8 毫升混合，並於2 5 °C下反應4 8小時。並未察見經由反應 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -------^— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 570979 Μ Β7 五、發明説明（W ) 生成分解物〇 於上述條件下，含岩藻糖硫酸多糖-U與參考例5記載 之岩藻衣聚糖分解酵素於2 5 °C下反應4 8小時。確認隨著 反應之進行而使得2 3 0 nffl之吸光度増加，且判定經由本 酵素而令含岩藻糖硫酸多糖-U被分解。 參考例5 參考例4記載之岩藻衣聚糖分解酵素為依據以下之方 法予以調製。該岩藻衣聚糖分解酵素之生産中所使用之 簡株若為具有該酵素生産能力之_株，則為任何菌株均 可，其具體例可列舉例如Flavobucteriuffl sp. SA-0082 株（{](：1^第 9 1 0069號）。 本_株為由青森縣之海水中所新撿索取得之菌株，此 舖株為以IMavobacterium sp· SA-0082表示，於平成7 年3月2 9日（原寄存日，於通商産業者工業技術院生命 工學工業技術研究所中，以F E R Μ B P - 5 4 Q 2之寄存編號予 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 及 C 菌源葡 當之 存存之碩、等 W 適等 保寄用，糖粉 Η 為鹽 種號使可藻澱3Ϊ等鋅 Μ69所則岩 、d、銨 、 所00為者、糖C1化鹽 究91若素酸乳 &氯鎂 研第源酵藻 、no、、 展RC養解、糖{01銨鹽 發CC營分末露sa酸鉀 業以之糖粉甘ca硫 、 工日入聚藻、、、鹽 品24加衣海糖腺豆酸 食月所藻 、蔗白大磷 國12中岩糖 、蛋脂 、 貴年基産聚油、脫鹽 在96養生衣甘物、鈉 且19培巨藻 、取物入 ，於之並岩糖萃取加 存 ，株 、如芽母萃可 寄心 ® 用例麥酵肉亦 際中本利用 、以 、他 國究於可利糖源液其 以研 株可萄氛浸 、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（p) 無機質、及金屬鹽類。 於培養本岩藻衣聚糖分解酵素之生産菌時，雖然生産 量為依據培養條件而變動，但一般以培養溫度為15 °C〜 30 °C、培養基之pH為5〜9為佳，且以5〜72小時之通氣 攪拌培養下則可令本岩藻衣聚糖分解酵素之生産量達到 最高。培養條件當然依據所使用之_株、培養基組成等 ，設定成令本岩藻衣聚糖分解酵素之生産量變成最大。 本岩藻衣聚糖分解酵素於蘭體中或培養物上清液中均 存在。 將上述之Flavobficterium sp. SA-0082株於適當培養 基中培養，並收集其蘭體，且若以通常所用之細胞破壤 手段例如超音波處理等將顏體弄碎，則可取得無細胞萃 取液。 其次，由此萃取液經由通常所使用之精製手段，分可 取得精製之酵素樣品。例如，經由鹽析、裡子交換柱層 析、斥水結合柱層析、膠過濾等進行精製，則可取得經 純化之本岩藻衣聚糖分解酵素。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，由上述培養液除去_體之培養上清液中，因為亦 大景存在本酵素（蘭體外酵素），故可經由與_體内酵素 同樣之精製手段予以精製。 示出岩藻衣聚糖分解酵素之精製例。 將 Flavobact'erium sp . SA-0082(CCRC 第 910069 號）接 種至其中已分注含有葡萄糖0.25 %、蛋白腺1.0%、酵母 華取物0.05%之人工海水（Germarin Laboratory公司製） -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7___ 五、發明説明（—） PH7.5所組成之培養基6D0毫升且經殺菌（120°C、20分） 之2公升三角燒瓶中，並於2 4 °C下培養2 4小時，將其作 為種培養液。將含有葡萄糖0 · 2 5 %、蛋白諫1 · 〇 %、酵 母孽取物〇·〇5%、及消泡劑（信越化學工業製、 〇·〇1%之人工海水（Gerniarin丨^“^以”製“7.5所組 成之培養基20公升，放入30公升容積之藤酵®中並於 120 °c下2 4小時，每分鐘公升之通氣量和每分鐘125迴 轉之攪拌速度之條件下進行培養。培養終了後，將培養 液離心分離，取得蘭體。 將此閡體懸浮於含有2 0 0 ®M氯化鈉之2〇1BM醋酸-碟酸緩 衝液（P Η 7 · 5 )中，超音波弄碎後，予以離心分離則可取 得_體萃取液。以參考例3記載之方法測定此菌體華取 液中之岩藻衣聚糖分解酵素之活性時，檢測出培養基1 毫升中之活性為5®ϋ。尚，關於活性測定乃記載於後。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於本萃取液中，加入終濃度為90%飽和之硫酸鞍，擾 拌溶解後，離心分離，並將沈澱懸浮於與上述菌體萃取 液相同之緩衝液中，且以含有5〇81>1氯化鈉之2〇HlM醋酸碟 酸緩衝液（Ρ Η 7 · 5 )充分透析。將透析所産生之沈殿以離 心分離除去後，令其吸附至事先以含有5GraM氯化鈉之20ΗΙΜ 醋酸-磷酸緩衝液（PH7 . 5)平衡化之DEAE-Sephar*ose FF 柱，以相同緩衝液將吸附物充分洗淨後，以5(lmMS6l30ffiM 氣化鈉之直線濃度梯度令其溶出，並且收集活性部分。 其次，於此活性部分煱入終濃度為4M之氣化鈉，且令其 吸附至事先以含有4M氣化鈉之20mM磷酸緩衝液（PH8.0) -3 5 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 平衡化之苯基- Sepharose-CL-4B(Pharmacia公司製）柱 ，以相同緩衝液將吸附物充分洗淨後，以4M至1M氯化鈉 之直線濃度梯度令其溶出，並且收集活性部分。其次， 將此活性部分以超濾器濃縮後，以事先經含有5 0 m Μ氯化 鈉之lQniM碟酸緩衝液平衡化之Sephacryl S-300 (Pharmacia公司製）進行_ g濾並且收集活性部分。此 酵素之分子量以Sephacryl S-30G之保持時間求出為約 46萬。其次，將此活性部分以含有25mM氯化鈉之ΙΟιηΜ磷 酸緩衝液（PH7)予以透析。令此酵素液吸附至事先以含 有2 5ϋιπΜ氯化鈉之ΙΟβιΜ磷酸緩衝液（pH7)平衡化之Mono Q HR 5/5 (Pharmacia公司製）柱，並以相同緩衝液將吸附物 充分洗淨後，以25GmM至45()inM氯化鈉之直線濃度梯度令 其溶出，收集性部分，取得精製酵素。以上之精製工程 示於表1。尚，蛋白質之定量可經由測定酵素液之2 180 τι hi 吸光度而進行。此時將lffig/ml蛋白質溶液的吸光度以1.0 計算。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 一 36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（W) 表1 工程 總蛋白質 量（mg) 總活性 (毫單位） 總蛋白質 量（mg) 産率 (% ) _體萃取液 61,900 101,000 1.63 100 硫酸銨鹽析 33,800 88,600 2.62 87.7 DEAE-Sepharose FF 2,190 40,400 18.4 40.0 苯基-Sepharose CL-4B 48.2 29,000 601 28.7 Sephacryl S-300 7.24 19,600 2,710 19.4 Mono Q Π.824 15,600 18,200 14.9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 又，依據下述之方法亦可精製岩藻衣聚糖分解酵素。 將 Flavobacteriuro s p . SA-0082(CCRC第 9610069號）接 種至其中已分注含有«萄糖0.1%、蛋白諫1.0%、酵母 举取物0.05%之人工海水（Geriaarin Laboratory公司 製）PH7.5所組成之培養基600毫升且經殺菌（120 °C、20 分鐘）之2公升三角燒瓶中，並於2 4 °C下培養2 0小時， 將其作為種培養液。將含有來自高果美海帶之岩藻衣聚 糖0.3%、蛋白練0.5%、酵母萃取物0.01%、及消泡劑 (信越化學工業製KM70)0.01%之人工海水（Germarin Laboratory製）pH所組成之培養基2f)公升，放人30公升 容積之醱酵缸中並於1 2 0°C下殺菌2 0分鐘。冷卻後，接 -3 7 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 Α7 Β7 五、發明説明（4 ) 種上迷之種塔養液6 3 0毫升，並於2 4 °C下2 0小時、每分 鐘〗0公升之通氣暈和每分鐘2 5迴轉之攪拌速度之條件下 進行培養。培養終了後，將培養液離心分離、取得薗體 及培養液上清液。將本培養所得之蘭體懸浮於含有2 Ο Ο hiM 食鹽之2G«iM醋酸-磷酸緩衝液（PH7.5)，於超音波弄碎後 ，離心分離取得_體萃取液。於測定此菌體萃取液中之 岩藻衣聚糖分解酵素之活性時，撿測出培養基1毫升中 之活性為2 0 ro ϋ。 另一方面，將此培養液上清液以超過濾（過濾膜之排 除分子量1萬MAmicon公司製）予以濃縮，並且，測定 岩藻衣聚糖分解酵素，則檢測出每1毫升培養液為6 m I) 之活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於上述培養液上清液之濃縮液中，加入終濃度為9 0 % 飽和之硫酸銨，攪拌溶解後離心分離，並且將沈澱懸浮 於與上述誠體萃取液相同之緩衝液中，且以含有5DmM食 鹽之2GinM醋酸-磷酸緩衝液（PH7.5)充分透析。將透析所 産生之沈澱以離心分離除去後，令其吸附至事先以含有 50“食鹽之20πιΜ醋酸-磷酸緩衝液（PH7.5)平衡化之DEAE-Sepharose FF柱，以相同緩衝液將吸附物充分洗淨後， 以至GflOmM氯化鈉之梯度令其溶出，收集活性部分。 其次，於此活性部分加入終濃度為4M之氯化鈉，且令 其吸附至事先以含有4M食鹽之20fflM磷酸緩衝液（PH8.0) 平衡化之苯基-S e p h a r 〇 s e C L - 4 B柱，以相同緩衝液將吸 附物充分洗淨後，以4M至1 Μ食鹽之梯度令其溶出，並且 -38-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 570979 Α7 Β7 五、發明説明（w) 收集活性部分。其次，將此活性部分以超濾器（Amicon 公司製）濃縮後，以事先經含有5()ιιιΜ食鹽之IOihM磷酸緩 衝液平衡化之Sephacryl S- 2 0 0進行膠過濾並且收集活 性部分。其次，於此活性部分加入終濃度為3.5M之食鹽 ，且令其吸附至事先以含有3.5MK食鹽之ΙΟιηΜ磷酸緩衝 液（PH8)平衡化之苯基- Sepharose HP柱，以相同緩衝液 將趿附物充分洗淨後，以3.5M至1.5M食鹽之梯度令其 溶出，並且收集活性部分，取得精製酵素。此酵素之分 子量以Sephacryl S-200之保持時間求出為約7萬。 實施例1 (1)將橋型含岩藻糖硫酸多糖分解酵素之生産菌株 AlteroiRonas sp· SN-1009(CCRC 第 910070號）接種至其 中已分注含有葡萄糖0.25%、蛋白腺1.0%、酵母萃取 特J0.05%之人工海水（Gerrsarin Laboratory公司製） PH8.0所組成之培養基500毫升且經殺菌（12D°C、20分鐘） 之2公升三角燒瓶中，並於2 5 °C下培養2 3小時，培養終 了後，將培養液離心分離收集_體，令半量之菌體於1 0 毫升之萃取緩衝液〔5GmM Tris-HCl緩衝液（PH8.0)、 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1 0 0 m Μ乙二胺四醋酸（E D T A )〕中懸浮後，添加1毫升溶 解於萃取緩衝液之2 0 BI g /ifl ]溶顧酶溶液，並於冰浴上保 溫3 0分鐘。其次，添加〗0毫升之蛋白酶K溶液〔1 g / m 1 蛋白酶K、 50mM Tris-HCl緩衝液（ρΗ8·0)、 100mM EDTA 、1 % S D S〕後，於5 0°C下保溫2小時。其後恢復至室溫 ，加入等容量之T E緩衝液〔1 0 ra Μ T r i s - H C 1緩衝液（p Η 8 · 0 ) -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（W ) 、IffiM EDTA〕飽和苯酚並溫和攪拌1小時，以lOOOOrp® 離心20分鐘後，回收上層（以下將此操作簡稱為苯酚萃 取）。 於此上層，加入等容量之T E緩衝液飽和苯酚/氯仿1 : 1 並且溫和攪拌，以1 0 0 0 0 r p in離心2 0分鐘後，回收上層（ 以下將此操作簡稱為苯酚/氯仿萃取）。再度進行苯酚 /氯仿萃取後，於水層加入0 . 1 Μ氣化鈉並且再加入2倍 量之苯酚，目以玻璃棒捲取析出之D Ν Α後，以8 0 %乙醇 清洗並且輕輕風乾。將此基因組DNA於20毫升之溶解20 A g / m 1核糖核酸酶A之T E緩衝液中溶解，於3 7 °C下保溫 5小時並旦分解R Ν A。於苯酚萃取、苯酚/氯仿萃取後， 同先前處理添加乙醇後回收D N A ,並懸浮於5毫升之T E 緩衝液中。經由以上之操作，取得基因組D Ν A約2 0毫克。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2)將實施例1-(1)所調製之基因組DN A 100徹克，以 1 0單位之限制酶S a u 3 A I並於3 7 °C下切開1分鐘4 0秒鐘將 其部分分解後，予以苯酚/氯仿萃取並旦回收上層。於 上層中加入1/10倍容量之3M醋酸鈉水溶液（PH5.0)及2.5 倍容量之乙醚令D Ν A沈澱，以離心分離回收沈澱後，以 8 0 %乙醇清洗並且風乾（以下將此操作簡稱為乙醇沈澱） 。將所得之部分分解物以1.25-5 Μ氯化鈉密度梯度超離 心法進行大小分級，並將含有1 0〜2 0 k b ρ大小之部分經由 乙醇沈澱回收DNA。將所得之基因組DMA部分分解物0.18 μ g|5| Novagene^： W] ^ λ Blue STAR B a m Η I arm 0 . 6 /i g 混合，並且使用寶酒造公司製D N A連接套件予以連結後 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 — 五、發明説明（β ) ，使用 Stratagene公司製 GigaPack II Gold kit將；I 噬 _體進行包裝，製作Alteroiaonas sp· SN-1Q09之基因 組DM A庫。 (3)將參考例】-(3)所得之 A]teroro〇nas SP· SN-1009 之精製橋型含岩藻糖硫酸多糖分解酵素蛋白質200pffl〇l ，加至2 0 m Μ磺酸氫銨平衡化之脱鹽用柱（f A S T D E S A L T I N G COLUMN PC 3·2/10、Pharmacia公司製）後，以相同缓衝 …液予以溶出，取代緩衝液。以玻璃收集溶出液並且濃縮 乾燥後，於一次裝入吡啶1 0 # 1、4 -乙烯基毗啶2 1、 三-N-丁基膦2#1、水10#1之玻璃試管中，將玻璃瓶連 同試料放入，並且於玻璃試管封管後，於9 5 °C反 1 0分 鐘令其吡啶乙基化。反應終了後取出玻璃瓶，並與水共 沸數回，除去揮發性成分。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於所得之毗啶乙基化之含岩藻糖硫酸多糖分解酵素蛋 白質中，加入40#1含有8M尿素之IOkM Tris-HCl緩衝液 (ί>Η9·η)、90#]之 lOmM Tris-HCl 緩衝液（ΡΗ9·0)及 0·5 pmol之Alteroeionas蛋白酶1(寶酒造公司製），並於30°C 下切開一晚，由所得之切開物以HPLC条統（Ssiark System 、Pharmacia公司製）精製出胜肽斷片。柱為使用# RPC C2/C18 SC2.1/10(Pharroacic 公司製），並以 10#1/ 分之流速進行。溶出為使用含有0 · 1 2 %三氟醋酸水溶液 (溶出液A )及0 · 1 %三氟醋酸之腈（溶出液B )作為溶出液 ，&將溶出液B之比例以0%加至樣品，並於90分鐘使 溶出液B之比例升至5 5 %為止之直線濃度梯度法進行溶 -4 1- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（4(7 ) ，分離精製。對於各胜肽部分進行胺基酸序列分析，決 定出部分胺基酸序列F27(序列编號9)、F34(序列编號10) 、F 4 7 (序列編號1〗）、F 5 2 (序列编號1 2 )。 (4)將實施例1-(1)所調製之基因組DNA20yug,以限制 酶 BamHI、EcoRI、H i nd I I I N Pst I N SacI、Sail、 SphI、 及S b a I各1 0 fl單位分別於3 7 °C下切開4小時後，予以苯 酚/氯仿萃取、切開物以乙醇沈澱予以回收，並將各1 〇 A g再以相同限制酶50單位分別於37°C下切開16小時後 ，予以苯酚/氯仿萃取，並以乙醇沈澱回收切開物。將 此切開物各5 # g進行瓊脂糖_電泳，並且依據南向點漬 法（文獻：基因研究法II、第218〜221頁、東京化學同 人），於Amersham公司製尼龍膜〔商品名Hybond-N+ )〕 上轉錄D N A。 由實施例1 - ( 3 )所決定之部分胺基酸序列F 2 7 (序列编 號9)合成混合寡核甘酸pFDA27(序列编號13),使用作為 雜交作用之探針。將合成之寡核苜酸20ρ®ο1，使用 MEG AL ABEL KIT、寶酒造公司製）以予以標_。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將上述調製之濾紙於含有6XSSC、1%SDS、lOOyUg/ml 鮭魚精子D N A、5 X I) e ϊΐ h a r I s之溶液中，以6 5 °C進行3小 時預雜交作用後，加入O.5pffi〇l/®1濃度之標幟探針，於 42°C下進行一晩雜交、雜交終了後，首先於6XSSC中室 溫下10分鐘、1XSSC、0.1%SDS中室溫下10分鐘、1XSSC 、η .〗％ S I) S中4 2 °C下3 0分鐘進行洗淨，並且除去多餘水 分後，於富士軟Η公司製Imagining Plate曝光30分鐘 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 Α7 Β7 五、發明説明（〜） 後，以富土軟 Η 公司製 BAS 2000 Imagining Analyser 予以檢測。 其結果，於BamHI、EcoRI及Sail切開物之23fcbp以上 的位置、Hindlll切開物於約4·8、 i·4、及〇.3kbp之位 置、Pst, I切開物於23kbp以上及3.6kbp之位置、SacI切 開物於23kbp以上及9.8kbp之位置，SphI切開物於23kbP 以上、4.9kbp、及3.0kbp之位置、Xbal切開物於約12、 5 . 2、及3 · 5kbP之位置分別察見與探針雜交之帶。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 將來自實施例1-(2)所調製之Alteroaionas sp· SN-l〇09 基因組DN A庫之含有含岩藻糖硫酸多糖分解酵素基因之 選殖株，依據Novagene公司之；Iblue Star操作說明書， 以噬_斑雜交法進行篩選。首先，令噬菌體庫感染大腸 桿_£!?16 47，並於直徑8.5公分之L培養基平板4枚上 ，每1枚形成約500個噬菌斑。對此平板，將第1枚 Amersham公司製尼龍膜〔商品名Hybond N+ 〕接觸均3〇 秒鐘、第2枚為接觸約2分鐘，並且對各平板以各2枚 進行印取_菌體。將此尼龍膜於浸有〇 · 5 Μ氫氧化鈉、1 · 5 Μ 氯化鈉溶液之紙上進行5分鐘變性處理，其次，於浸有 0 · 5 Μ T r i s - H C ]緩衝液（Ρ Η 7 · 0 )、3 Μ氯化鈉溶液之紙上中 和處理5分鐘後，以2 X S S C予以清洗。將此尼龍膜與合 成寡核苜酸p F 1) A 2 7 (序列編號1 3 )，以前述南向雜交之相 同條件下進行雜交、洗淨、撿測時，取得1 8値陽性訊號 。由原來之平板採集陽性訊號附近之噬菌斑，並於S Μ緩 衝液中懸浮，再度於新平板上形成噬菌斑，且重覆同樣 -4 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明) 操作，則可單離出1 4個産生陽性訊號之噬舗體。 依據Novagene公司之>uBlue Star操作説明書，令所 得之各噬蘭體感染大腸桿_ BM 2 5. 8後，選出安比西林 耐件蘭落，將噬_體變換成質體形式。將所得之各選殖 株的蘭落接種至含有10# g/ffil安比西林之培養基（1%胰 蛋白練、0 . 5酵母萃取物、0 . 5氯化鈉），並由3 7 °C整夜培 養之培養液依據鹼性溶蘭法，調製質體DNA。使用此質體 DNA，將大腸桿_JM 109(寶酒造公司製）轉形，並且將所 得各選殖株之_落接種至含有l〇〇/i g/®l安比西林之L 培養基中，並由3 7 °C整夜培養之培養液依據鹼性溶菌法 ，再度調製質體DNA。將所得之各選殖的質體分別命名 為 PSFDA1、 2、 4、 5、 6、 7、 8、 10、 11、 12、 13、 14、
Ifi、及 PSFDA17。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將各質體分別以位於；I B1 u e S t a r V e c t, 〇 r之選殖部位 兩端的限制酶N o t I切開，並且以0 . 3 %瓊脂糖_電泳予以 解析，則可察見已插入8.4〜17.4kbp之斷片。又，將各 質體分別以限制酶H i nd I I I切開，並如前述進行南向點漬 後，經由合成寡核甘酸P F 1) A 2 7 (序列编號1 3 )進行雜交作 用予以解析，則可分成提供約4.8kbp帶（pSFDAl、及 PSFDA17)、提供約 4.8及（K3kbp帶（PSFDA5、6、7、 11 及 PSFDA13)、提供約 1.4kbp帶（pSFDAlQ)、提供約 G.3kbp 帶及其以外大小之帶（？3?1^2、及？3?0八14)、提供約4.8 kbp帶及其以外大小之帶（PSFDA16)、提供5 . Okbp以上大 小之帶（PSFDA4、及PSDA12)六群、但是，除了提供約 -44-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ΑΊ B7 五、發明説明（心） 1.4kbp帶之PSFDA10以外，由於檢測出數個於瓊脂糖膠 電泳之溴化乙錠染色中分別極為近似大小之帶，故推定 於各質體中，在大約相同位置之基因組DNA，插入約4·8 及0.3khp之Hindlll斷Η或者任一者，或其部分。又， 與此PFDA27雜交之約4·8及〇.3kbp之Hindlll斷片被推測 為在基因組上非常接近之部分。因此，所得之14個質體 大致可分群為提供約1.4kbp帶及其以外之質體，推測基 因組DNA Hind III切開物以南向雜交所檢測出具有約4·8 、1.4、及0.3kbp任一者，或者具有約4·8及0.3kbp兩者 。由所得之質體中，對於具有約1〇 · 2kbP插入斷H、含有 約4 · 8及0 · 3kbp兩者之Hindi I I斷Η之PSFDA7、及具有約 8.4khp插人斷片且含有約1.4kbp之Hindlll斷片之PSFDA10 ，以各種限制酶切開後，以瓊脂糖膠電泳進行分析並且 製作限制酶輿圖，並將與合成寡核甘酸PFDA27雜交之區 域次選殖至質體PUC119等之後，依據雙脱氧法解析驗基 序列。由PSFDA10之約1.4kbp Hindlll斷片中，雖然察 見PFDA27之17個鹼基中14個驗基一致之序列，但由於與 編碼F27胺基酸序列之序列不一致，故認為此斷片雖與 PFDA27雜交，但為與橋型含岩藻糖硫酸多糖分解酵素基 因無關傜之斷片〇另一方面，由PSFDA7之約4.8及〇.3kbp 兩者之Hindi I ΐ斷Η中，察見與一個PFDA2 7序列完全一 致，目.亦含有周圍序列之编碼與實施例1 - ( 3 )所決定= 部分胺苺酸序列F27(序列编號9) 一致之雨胺基酸之序列。 又，由於此約4.8kbp和0.3kbp之Hindlll斷H，於限 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 11 - In -- i «m ί ί I n ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 570979 Β7 五、發明説明（《 ) 制酶輿圖上距離約3 k b ρ以上，比參考例1 - ( 3 )記載之 Alter〇M〇nas sp. SN-1009所精製之橋型含岩藻糖硫酸 多糖酵素之_過濾法所測定之分子量約1 G萬所預測之該 酵素基因的大小更大，故可預測具有至少二種類似之基 因。 將導人PSFDA7之大腸桿109株，以Escherichia co 1 i JM109/pSFDA7^ τκ 〇
對於P S F 1) A 7 ,再以使用引子伸長法之雙脱氧清詳細解 析鹼基序列，並且決定PSFDA7之10.2kbp插入斷Η中、 8.3纟1^之鹼基序列時，察見2646個_基（含有終止密碼 子）之讀取框1(以下，稱為0RF-1)與2445個鹼基（含有終 止密碼子）之讀取框2(以下，稱為0RF-2)之二個讀取框。 基因組D N A H i nd I I I切開物以南向雜交所檢測出之約0 . 3 及4.85kbp之Hindlll斷H，正確為分別以140及4549鹼基 對之長度，分別含有部分或全長之0RF-1及00-2。於0RF (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 序 之 { 定27 F 決叫 )p序 (3酸 1-基 例胺 施分 實部 與素 於酵 ，解 中分 列糖 序多 酸酸 基硫 胺糖 之藻 碼岩 編含 所型 -2橋 號 編 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 號 编 列 序 j號 序編 列 0 ^ 基(^ ? 2 胺 5 rv」 分 部 與 } 見11 察號，編 外列 以序 列7( 序 F 之 、 致0) 及 此 因 ο 列 序 之 高πιο 常ΓΟ Θ 非te 性A1 同成 相造 Η η 碼多 編酸 上硫 質糖 實藻 為岩 7含 RF型 "橋 之 為 認 列酸 序硫 酸糖 基藻 胺岩 之含 碼型 编橋 所之 Τ定 VT R 決 ο 7 ΛΖ所 2 J X. F ，(3列 面1-序 方例酸 一 施基 另實胺 C 與分 素於部 酵亦素 解雖酵 分，糖 糖中多 號 编 列 序 序 之 致 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明Ur ) 以外，察見與部分胺基酸序列F 3 4 (序列编號1 0 )、及F 5 2 (序列編號12)相同性高之序列，但未發現於部分胺基酸 序列F 4 7 (序列編號1 1 )顯示出高相同性之序列。若比較 0 R F - 1與0 R F - 2所编碼之胺基酸序列，則在0 R F - 1之N終 端附近具有0RF-2中所沒有之（5 7個胺基酸序列之插入序 列，由於插入序列以後之胺基酸序列為顯示出7 0 %以上 非常高之相同性，故認為於0RF-1亦具有編碼含岩藻糖 硫酸多糖分解活性之多肽。如以上處理，決定出编碼具 有含岩藻糖硫酸多糖分解活性多肽之基因（0RF-2)及對 此基因顯示出非常高相同性之编碼具有含岩藻糖硫酸多 糖分解活性新穎多Ife之基因（0RF-1)的全部鹼基序列。
其結果示於第1圈。即，第1圖為表示0RF-1和ORF - 2 之位置圖。圖中之黑色箭頭為表示0RF-1之编碼區域及 方向、_中斜線之箭頭0為表示0RF-2之編碼區域及方向 。又，0 R F - 1之鹼基序列示於序列表之序列编號6 , 0 R F - 1所編碼之胺基酸序列示於序列表之序列編號2。再者 ，0RF-2之鹼基序列示於序列表之序列编號5, 0RF-2所 編碼之胺基酸序列示於序列表之序列编號1。 以上，依據本發明單離、精製出實質上編碼造成橋型 含岩藻糖硫酸多糖分解酵素之基因（OR卜2),及於基因 上顯示相同性並且編碼造成具有含岩藻糖硫酸多糖分解 活性之新穎多呔之基因（0RF-1)。 實施例2 為了構築實施例1所得之實質上編碼造成橋型含岩藻 -4 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T b-. 570979 A7 B7 五、發明説明（4知） 糖硫酸多糖多糖酵素基因（0RF-2)之直接表現載體，乃 令0RF-2之起始密碼組與表現載體上之最適化起始密碼 組一致，構築出插入0RF-2部分5’-區域之質體pEFDA-N=. 首先合成出合成DNA、FDA-N〗（序列编號14)及FDA-N2 (序列編號1 5 ) ^ F D A - N1為含有序列表序列编號5之鹼基 序列编號1-13序列之I5iner的合成DNA, FDA-N2為含有序 列表序列編號5之鹼基序列编號4 - 1 3序列之互補性序列 之15mer>的合成DNA。 將合成之DNA於含有G.2M Tris-HCl緩衝液（ρΗ7·5)、 〇 . 3 Μ氯化鈉之氯化鈉之溶液中，於7 0 °C下保溫1 0分鐘後 ，慢慢冷卻至室溫並且形成雙股、調製成合成I) N A連接 子F D A - N。所得之F D A - N為含有位於序列表序列编號5之 鹼基序列編號8 - 1 3之S n a B I部位，且於起始密碼組處可 與N c ο I部位連結、且於S n a B I部位之正下游可與B a id Η I部 位車結之合成DNA連接子。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 另一方而，令使用Τ7啓動基因之表現載體pET21d 「Novagene公司製〕，將其位於T7啓動基因下游之含有 為了令表現最適化之起始密碼組之Ncol部位，和位於複 選殖部位内之BamHI部位切斷。將此切開物與先前調製 之合成DN A連接子FDA-tU吏用DN A連接套件（賫酒造公司製） 予以連結後，轉形大腸桿_ J Μ 1 0 9，並且選擇出在含有 lOOyg/inl安比西林之L培養基平板上可生長之薗落。 將各選殖體接種至含有lOQ/ig/ml安比西林之L培養基 ，於37 °C過夜培養後，經由鹼性溶《法由培養《體調製 一 4 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570979 A7 B7 五、發明説明（π ) 質體DNA。質體J)NA以SmaBI切開後進行1%瓊脂糖膠電泳 ，選擇可經SaraBI切斷之質體，再以雙脱氣法進行插入 斷Η之鹼基序列之確認，取得在PET21d之NcoI-BamHI部 位間已捅入0RF-2之起始密碼組至SnaBl部位為止之區域 的質體PEFDA-N。 其次，將實施例1所得之質體PSFDA7約5/ig，以30單 位之S n a B I於3 7 Ό切開2小時後，以1 %瓊脂糖膠電泳予 以分離，將含有0RF-2大約全長區域之約2.5kbp SnaBI 斷Η並且予以萃取精製。將此SnaBI斷Η與先前構築之 質體PEFFU-N的SnaBI切開物混合，使用DNA連接套件連 結後，轉形大腸桿«JM109，並且選擇出在含有l〇fl#g/rol 安比西林之L培養基平板上可生長之舖落。同先前處理 調製質體DNA，於SnaBI切開後進行1%瓊脂糖膠電泳， 並且選出2.5kbP之SnaBI斷Η為游離之質體。再依據雙 脫氧法進行插入斷片方向之確認，選出〇 R F - 2為與Τ 7啓 動基因同方向插入之質體。將如此所得之插入位於PET21d Ncol部位之起始密碼組至0RF-2全長之表現質體命名為 P E F D A I I 1 0 3 〇 使用如此所示PEFDAII103轉形大腸桿®ί BL21(DE3)株 (Noivagene公司製）。將所得之大腸桿菌BL21(DE3)/ pEFDAII】f)3接種至含有100// g/ml安比西林及氯化鈣 之5毫升L培養基中，並於3 7 °C下振盪培養，於混濁度 〇.!). 600=0.8之階段下，加入終濃度1“之11)11("1後，將 培養溫度變成1 5 °C並且再進行一晚振盪培養。培養終了 -4 9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） i 1.^ϋ ϋϋ In i - I - . __.l·I - I ϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本百 〇
、1T 570979 A7 B7 五、發明説明） 後，將培養液離心分離收集ϋ體，於細胞弄碎用緩衝W [20mM Tris-HCl緩衝液（ρΗ7·5)、 10mM、氛化鈣、1〇®Μ 氯化鉀、0 · 3 Μ氯化鈉〕1毫升中懸浮、並以超音波處理 弄碎睛體0將其離心分離回牧上清液，作為大腸桿菌萃 取液。 對於作為對照之經Ρ Ε Τ 2 1 d轉形之大腸桿_ Β丨，2 1 (I) Ε 3) /pKT21d同時於相同條件下進行培養，調製大腸桿®萃 取液，並目.用於以下之分析。
首先，將大腸捍_萃取液以SDS聚丙烯醯胺膠電泳予以 分析，結果在大腸桿_ B L 2 1 ( D E 3 ) / P E F D A 1 1 1 0 3之萃取 液中，觀察到大腸桿SBL21(DE3)/pET21d之萃取液中 所未察見之分子量約9萬之帶。此分子量為與序列表序 列编號1所示之2编碼所得之胺基酸序列所計算之 多肽的分子景88210極為一致，並旦與Alteromonas sp· SN-1009所精製之橋型含岩藻糖硫酸多糖分解酵素之SDS 聚丙烯醯胺_電泳所分析之分子量約9萬一致。如上述 ，可確認大腸桿_BL21(DE3)/pEFDAII103為表現出〇RF - 2所編碼之多肽。 其次，以參考例2記載之方法測定大腸桿Μ萃取液之 橋型含岩藻糖硫酸多糖分解活性。 其結果，由大腸桿_BL21(DE3)/PEFDAII103之萃取 液中，檢測出520# g/al之橋型含岩藻耱硫酸多糖分解 活性。PJ1,可知0RF-2所编碼之多肱具有含岩藻糖硫酸 多糖分解活性，旦於具有本發明基因之大腸桿菌BL21 -5 0 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - ml ϋ— . I . n* ii -- -- - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（49 ) (DE3)/pEFDAII103之培養液1毫升中，生産出具有約 之含岩藻糖硫酸多糖分解活性之0RF-2所编碼之多 ife 〇 另一方商，由大腸桿蘭BL21(DE3)/pET21d之萃取液 則完全未檢測出橋蛩含岩藻糖硫酸多糖分解活性。 實施例3 由0RF-1及0RF-2之起始密碼組至15個鹼基為止之序列 為完全一致，姐在其區域内具有限制酶SriaBI部位。即， 由於實施例2所構築之質體PEFDA-N中的插入序列為於 ORF-〗和0RF-2完全相同，故此PEFDA-N可使用於構築0RF-1 之表現載體。 首先，將實施例1所得之質體PSFDA7約5>ug,以30單 位之S n a BI於3 7 °C切開2小時後，以1 %瓊脂糖膠電泳予 以分離，將含有0RF-〗大約全長區域之約3.2kbp SnaBI 斷片並且將其萃取精製。將此S n a B I斷片與質體P E F D A - N 之SnaB I切開物混合，使用DN A連接套件連結後，轉形大 腸桿鋪J Μ 1 0 9，並且選擇出在含有1 〇 ^ g /« 1安比西林之 L培養平板上可生長之菌落。 同實施例2處理調製質體DNA,於SnaBI切開後進行 】％瓊脂糖膠電泳，並且選擇出3 · 2 k b P之S n a B I斷Η為游 離之質體。再依據雙脫氧法進行插入斷片方向之確認。 選出0RP-1為與Τ7啓動基因同方向插入之質體。將如此 所得之插入位於pET21d Ncol部位之起始密碼組之0RF-1 f長之表現質體命名為PEFDAI103。 -5 1- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570979 A7 B7 五、發明説明（作） 使用如此所得之P E F I) A I 1 0 3 ,以實施例2同樣之方法 進行0 R F - 1所编碼之多肽之表現與含岩藻糖硫酸多糖分 解活性之確認。 卽，首先使用PEFDAI103轉形大腸桿鋪BL2UDE3)株。 將所得之大腸桿M BL(DE3)/pEFDAI103接種至含有100 安比西林及5“氯化鈉之5毫升L培養基中，並 於37。〇下振盪培養，於混濁度為O.D.600= 0.8之階段下 ，加入終濃度ΙίδΜ之IPTG後，將培養溫度變成15°C並且 胃進行一晚振盪培養。培養終了後，將培養液離心分離 收集舖體，於細胞弄碎用緩衝液1毫升中懸浮，並以超 音波處理弄碎蘭體。將其離心分離回收上清液，作為大 腸捍圈萃取液。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以SDS聚丙烯醯胺讎電泳分析大腸桿蘭萃取液，結果在 大腸桿鋪B L 2 1 ( D E 3 ) / P E F D A I 1 0 3之萃取液中，觀察到大 腸捍_1!丨,21(1)£：?)/1^721(1之萃取液中所未察見之分子 釐約10萬之帶。此分子量為與序列表序列编號2所示之 〇 R F -1編碼所得之胺基酸序列所計算之多肱的分子量9 4 9 1 0 極為一致，並且確認大腸桿菌BL21(DE3)/pEFDAI103為 表現出ORF-1所编碼之多肽。 其次，以參考例2記載之方法测定大腸桿薗萃取液之 橋型含岩藻糖硫酸多糖分解活性。 其結果，由大腸捍ijBL21(DE3)/PEFDAI103之萃取液 中，檢測出35 · 8mU/ml之橋型含岩藻糖硫酸多耱分解活 性。即，可知OR, 所編碼之多肽具有含岩藻糖硫酸多 -5 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（w ) 糖分解活性，目於具有本發明基因之大腸桿蘭BL21(DE3) /PEFDAI103之培養液1毫升中，生産出具有約7.2811)之 含岩藻糖硫酸多糖分解活性之0RF—1所编碼之多1 另一方面，由大腸桿菌BL21(DE3)/PET21d之萃取液 則完全未撿測出橋型含岩藻糖硫酸多糖分解活性。 實施例4 (1)將岩藻衣聚糖分解酵素之生産18 sp. SA-fl082(CCRC第910069號）接種至其中已分注含有 葡萄糖0.25 %、蛋白練1.0%、酵母举取物0·0 5 %之人 工海水（Germarin Laborotary公司製）ΡΗ8·0所組成之培 養基5 Π 0毫升且經殺鋪（1 2 0 °C、2 0分鐘）之2公升三角燒 瓶中，並於2 5 °C下培養2 3小時。培養終了後，將培養液 離心分離收集舖體，令其半量之_體懸浮於1 0毫升之萃 取緩衝液〔50ΐδΜ Tris-HCl 緩衝液（ΡΗ8·0)、lOOfflM 乙二 胺四醋酸（E I) T A )〕中之後，添加溶解於1毫升萃取緩衝 液中之2 0 m g / in 1溶薗酶溶液，並於冰浴上保溫3 0分鐘。 其次，添加10毫升之蛋白酶K溶液〔lBig/ial蛋白酶K、 50inM Tris-HCl緩衝液（ρΗ8·0)、ΙΟΟβιΜ EDTA、1% SDS〕 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 後，於5 0 °C下保溫2小時。其後恢復至室溫，加入等容 量之 TE 緩衝液〔IQffiM Tris-HCl 緩衝液（ρΗ8·0)、ΙιπΜ E D T A〕飽和苯酚並且溫和穩定攪拌1小時，於1 〇 〇 〇 〇 r p 下離心20分鋳後回收上層。於此上層，加入等量之TE緩 和液飽和苯酚/氛仿1 : 1並且溫和攪拌力於1 〇 〇 〇 G r ρηι下 離心2 0分鐘後回收上層。再度進行苯酚/氯仿萃取後， -53-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 ___ _ 五、發明説明（h ) 於水層中加入〇」Μ氣化鈉並再加入2倍量之乙醇，以 玻璃棒捲取析出之DNA後，以80%乙醇清洗並且輕輕風 乾。令此基因組D Ν Α溶解於2 0毫升溶解2 0 // g / a 1核糖核 酸酶A之T E緩衝液中，於3 7 π下保溫5小時將R N A分解。 於苯酚萃取、苯酚/氯仿萃取之後，同先前處理添加乙 醇後固收I) N A，並且懸浮於5毫升T E緩衝液中。經由以 上之橾作，取得基因組DN A約20毫克。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2) 將實施例4-(i)所調製之基因組DNA in〇//g，以30 單位之限制酶S a u 3 A I於3 7。0下切開1分鐘4 0秒，令其部 分分解，並予以苯酚/氯仿萃取回收上層。於上層加入 1/10倍容積之3M醋酸鈉水溶液（ΡΗ5·0)及2·5倍容積之 乙醇令D Μ Α沈澱，經由離心分離回收沈澱後，以8 0 %乙 醇清洗並風乾。將所得之部分分解物以1·25-5Μ氱化鈉 密度梯度超離心法進行大小分级，並且由含有1 0 - 2 Q k b ρ 大小之部分，經由乙醇沈澱回收D N A。將所得之基因組 DNA部分分解物〇.2/i g與Novagene公司製入Blue Star BanHI arm 0.60>ug混合，使用寶酒造公司製D(U連接套 件予以連結後，使用Stratagene公司製Gigapack II Gold Kit進行將λ噬蘭體包裝，製作Flavobacterium s P · S A - 0 0 8 2之基因組D N A庫。 (3) 將參考例 5 所取得之 Flavobuiterium sp. SA-0082 之精製岩藻衣聚糖分解酵素蛋白質20Gpffl〇l，加至以20fflM 磺酸氫銨平衡化之脫鹽用柱（Fast Desalting Column Pc 3·2/10、Pharmaica公司製）後，以相同緩衝液予以溶出 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 經滴部中央標準局負Μ消費合作社印則水 Α7 Β7 五、發明説明（Η ) 、取代成緩衝液將溶出液以玻璃瓶收集並濃縮乾燥後 ,於一次放入毗啶1 〇 A 1、4 -乙烯基毗啶2 /i 1、三-N - 丁 基隣2 # 1、水1 0 # ]之玻璃試管中將玻璃管連同試料放 入，於將玻璃試管封管後，以9 5 °C下反應1 0分鐘令其吡 啶基乙基化。反應終了後，取出玻璃瓶，令與水共沸數 回除去揮發性成分。 對所得之毗啶基乙基化之岩藻衣聚糖分解酵素蛋白質 加入4 0 # ]含有8 Μ尿素之1 0 m Μ T r i s - H C 1緩衝液（p Η 9 · 0 ) 、之 10mM Tris — HC1緩衝液(pU9.0)及 0·5ρ®ο1 之 Ac hromobficter Protease Ι(寶酒造公司製），並於 30 °C 下切開一晚，以 HP I, C条統（Sfflart, System、Pharmacia 公 司製）由所得之切開物精製胜呔斷H。柱為使用A R P C C2/C18 SC2.1/10(Phariaacia 公司製），並以 100/zl/inin 之流速下進行。使用含有〇 . 1 2 %三氟醋酸水溶液（溶出 液A )及0 .〗％三氟醋酸之乙腈（溶出液B )作為溶出液進行 溶出，並且在溶出液B之比例為0 %時加入樣8 0，於8 0 分鐘將溶出液B之比例提升至5 5 %為止之直線濃度梯度 法予以溶出，並以溶出液B之比例為2 7 %以上所溶出之 波峰取得L· 2 7、L 3 ί及L 3 6等。再者，收集分離不佳之溶出 液Β比例為1 7〜2 7 %之部分，並旦濃度，於相同之Η P L C 条統添加後，以溶出型式於8 7分鐘中Ρ溶出液Β之比例 由1 5 %升牵4 0 %為止之直線濃度梯度予以溶出，取得溶 出部分I. R 8、 I, R 9、 L R 1 4 R及L R. 1 6等。對於所得之各胜肽 部分進行胺基酸序列分析，決定出部分胺基酸序列L 2 7 一 5 5 - 本紙張尺度適用中國國家標绛（CNS ) Λ4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、訂
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i、發明説明（β) (序列编號19)、及LR16(序列编號20)。 (4)將實施例4-(1)所調製之基因組DNA 2·4#®，以各 30單位之限制酶 EcoRI、 Hindlll、 Muni、 Spel、 Sbal、 及Sau3AI於37°C下切開3小時後，予以苯酚/氯彷萃取。 以乙醇沈澱回收切開物。將各切開物約0 · 5 # g，於E C 0 R 1 及Muni切開物中與EcoRI卡匣、於Hindlll切開物中與 Hindlll卡匣、於Spel及XabI切開物中與Xbal卡厘、於 sau3AI切開物中與Sau3AI卡厘為20ng連接套件將其連結 。反應物以乙醇沈澱回收並溶解於i0#1之水中，作為 使用卡匣DNA之PCR法的模板DNA。 另一方面，將實施例4_(3)所決定之部分胺基酸序列 LR14(序列编號19)之1〜6個胺基酸序列之PL14F17(序列 编號21)、3〜11個胺基酸序列之PL14F26(序列编號22) 之混合寡核甘酸，與各胺基酸序列同方向地予以合成。 加入先前調製之模板DNA各1// 1、卡匣引子C1 (寶酒造 公司製）20Pffl〇l、混合寡核甘酸PL14F17 (序列编號21) 100 Pinol、及滅菌水作成22//1,並於94°C下加熱10分鐘後 急冷。於其中加入之10倍濃度Ex Taq放大用緩衝液 (寶酒造公司製）、I6#1之1 · 25mM dNTP混合液，2·5單 位之Taka Ex Taq(寶酒造公司製）、及滅菌水作成I00#1 ，並以礦物油叠層。將此混合液用於自動基因放大裝置 加熱循璟機（DNA Thermal Cycler 480、寶酒造公司製） 之放大反應。PCR反應為進行25次循璟之94°C下0.5分鐘 變性，45 °C下2分鐘黏接、72 °C下3分鐘合成反應之循 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公楚） -------^裝— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570979 __ 五、發明説明（& ) 環，最後於7 2 °C下保溫7分鐘，完成合成。 其次，將滅菌水所1〇倍稀釋之第一回PCR反應液於94T 下加熱10分鐘後之物質作為模板DNA，進行第二回之PCR 反應。卽，加入經熱處理之第一回PCR反應液、卡 匣引子C2(寶酒造公司製）2〇ρβιο1、混合寡核甘酸PL14F26 (序列编號22)lfl0pffi〇l、1〇#1之10倍濃度Ex Taq放大用 緩衝液、16#1之1.25aiM dNTP混合液、2·5單位之Takara Ex Taq、及滅Μ水並且作成100/^1,再以礦物油ft層。 此混合液進行25次循環之94°C下Q · 5分鐘變性、55°C下 2分鐘黏接、72 °C下3分鐘合成反應之循環，最後於72 °C 下保溫7分鐘，完成合成。又，同時對於各反應液僅以 卡匣引子C2或僅以混合寡核甘酸PL14F26之反應液亦進 行PCR反應，作為各引子之非專一性放大産物之對照組。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 以瓊脂糖嘐電泳分析反應液，並旦與非專一性放大産 物之對照進行比較時，於許多反應液中檢測出數條放大 帶。由其中背景較低、且一個帶被強烈大之Muni切開物 -EcoRI卡匣之第二回PCR反應液，萃取精製出約〇.7kbp 之帶 〇 將此 DMA斷 Η 與 pT7blue T-Vector、 Novagen公司 製）混合，並且使用DN A連接套件予以連結後，轉形大腸 桿MJM109,並選擇出在含有100/ig/inl安比西林， 0 · 0 0 4 % X - G a 1及1 in Μ I P T G之L培養基平板上可生長之 白色菌落。將各轉形體接種至含有100# g/ffll安比西林 之L培養基，於37 °C過夜培養後，經由鹼性溶菌法由培 養菌體調製質體DNA,選出已插入約（K7kbp帶之質體並 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X 297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（μ ) 且命名為PT7-Mun。此pT7-Mun之插入序列以雙脱氧法進 行鹼基序列分析時，發現编碼造成連接至第二回PCR反 應所用之PL14F26序列之部分胺基酸序列LR14(序列編號 i9)第12値以後胺基酸序列之區域。再於下游中發現编 碼造成與部分胺基酸序列L27(序列编號16)顯示出非常 高相同性之胺基酸序列之區域。由此可得知此約〇.7kbp 之DNA斷片為岩藻衣聚糖分解酵素基因之一部分。此約 〇.7kbp DNA斷Η之引子PL14F26至與EcoRI卡匣連結點為 止之序列示於序列编號2 3。 (5)將實施例4-(1)所調製之基因組DNA 20#g,各以 1〇〇單位之限制酶 BamHI、 EcoRI、 Hindlll、 PstI、 SacI 、Sail、SphI、及Xbal於37°C下切開4小時後，予以苯 酚/氛仿萃取。切開物以乙醇沈澱予以回收，將各 再以相同之限制酶5 G單位分別於3 7 °C下切開1 6小時後， 予以苯酚/氯仿萃取，以乙醇沈澱回收切開物。將此切 開物各5// g令以0.8%瓊脂糖膠電泳，並以南向點漬法 將DNA轉印至Amersham公司製尼龍膜Hybond N+上。 另一方面，將實施例4-(4)所得之PT 7-M un約4 # g以來 自載體之BamHI及SphI切開，並且將游離之含有部分約 〇.7kbp之岩藻衣聚糖分解酵素基因之斷Η予以萃取精製。 使用BcaBEST Labeling Kit(寶酒造公司製）以32 ρ標犧 此DNA斷片，並且調製出雜交之探針DNA。 將上述調製之濾紙於含有6XSSC、1%SDS、100/zg/Kl 鮭魚精子DHA、5xDenhart，s溶液中，於65°c下進行1 -5 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） ^ 裝 訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 570979 ΑΊ Β7 五、發明説明（巧） 小時預雜交後，加人約1 〇 〇萬C P in / m 1濃度之標織探針， 於6(TC下進行一晚雜交。雜交終了後，首先於6XSSC中 室溫下10分鐘、2XSSC、0.1% SDS中室溫下10分鐘、 0.2XSSC、0.1% SDS中室溫下5分鐘，再於0.2XSSC 、0.1% SDS中45 °C下30分鐘進行洗淨，除去過多之水 分後，於富士軟Η公司製Imaging Plate中曝光30秒後 ，以富士軟Η公司製BAS 2 0 0 0 Ifflaging Analyzer予以檢 测。 其結果，於BamHI、Sail及SphI、Sail切開物之23kbp 以上位置察見一條，於EcoRI切開物之約8及3kbp位置 察見二條、於hindlll切開物之約11及4kbp位置察見二 條、於PstI切開之約12及2.5kbp位置察見二條，於SacI 切開物之約6 kbp位置察見一條分別與探針強力雜交之 帶。由此，強力提示出 Flavobacterium sp· SA-0082 之基因組DN A上具有二種岩藻衣聚糖酵素。 (6)將來自實施例4-(2)調製之Flavobacteriuni sp· SA-0082基因組DNA庫之含有岩藻衣聚糖分解酵素基因之 選殖株，依據Novagene公司之；IBlue Star操作說明書 ，以噬菌斑雜交法予以篩選。 首先，令噬菌體庫（library)滅染大腸桿菌ER1647, 於直徑8.5公分之L培養基平板5枚上，每1枚形成約 300値噬Μ斑。以Aroersham公司製尼龍膜Hybond N +接 觸平板約30秒鐘，轉印取得噬菌體。令此尼龍膜於0.5M 氫氧化鈉、1.5M氯化鈉溶液中變性5分鐘，其次於0.5 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 570979 A7 B7 五、發明説明（以） Μ T r i s - H C 1緩衝液（ρ Η 7 . 0 )、3 Μ氯化鈉溶液中，中和處 理5分鐘，並以2XSSC清洗後風乾。將此尼龍膜以紫外 線照射處理令DNA固定後，於實施例4-(5)之南向雜交相 同條件下進行雜交、洗淨、檢測，結果取得3 6値陽性訊 號。由原來之平板取出陽性訊號附近之噬菌斑，於S Μ緩 衝液中懸浮回收噬菌體。對於所得之數値噬菌體液，再 度於新平板上形成噬菌斑，經由重覆同樣之操作刖可單 離出9個提供陽性訊號之噬菌體。 依據Novagene公司之；IBlue Star操作說明書，令所 得之各噬菌體_染大腸捍_BM25.8後，於含有10G；ug/ml 安比西林之L培養基平板上塗開，選擇出安比西林耐性 之®落，將噬菌體變換成質體之形式。將所得之各選殖 株菌落接種至含有lOO^ug/ml安比西林之L培養基，並 由37 °C過夜培養之培養液，以鹼性溶_法調製出質體DNA 。使用此質體DNA，轉形大腸桿麵JM109(寶酒造公司製） ，並將所得之各選殖株_落接種至含有lOO^g/ial安比 西林之L培養基，並由37 °C過夜培養之培養液，以鹼性 溶菌法再度調製出質體DNA。將所得之各選殖株質體分別 命名為 P S F L A 1、5、 1 0、 1 1、 1 2、 1 3、 1 5、 1 7、及 pSFLA18〇 將各質體分別以限制酶Kpnl、SacI、及Xbal之適當組 合切開後，令以瓊脂糖膠電泳，並且如前述進行南向雜 交作用，作成各插入斷片之限制酶輿画並且解析。其結 果，檢測出數個以瓊脂糖膠電泳之溴化乙錠染色，分別 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） r_^^裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 L0. 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（π ) 極為相似大小之帶，且大致分成經由SacI切開之與PT7-Mun約0.7kbp插入斷Η雜交之帶為二條之PSFLA1、 10、12 、15、及PSFLA18組，及同樣地經由ΚρηΙ切開之與PT7-Mun約0.7kbp插人斷片雜交之帶為二條之PSFLA5、11、 13 及 PSFLA17 組。再者，可知 pSFLAS、PSFLA10、及 PSFLA17三個質體為經由Xbal切開游離出約6kbp之斷片 ，提示出實施例4-(5)之南向雜交作用所檢測之約6kbp 之Xbal切開物之帶為呈二條帶重合，可知於 Flavobacteriuffl sp. SA-0082之基因組 DNA 上，岩藻衣 聚糖分解酵素基因至少為二種。 於是，將各群質體所選出之PSFLA10及PSFLA17再進行 插入斷Η之解析。即，將此些質體約3/ig,以Xbal切開 、游離並且萃取精製出約6kbp之斷H。將此些Xbal斷片 分別與氯黴素耐性載體PHSG399(寶酒造公司製）之Xbal 切開物混合，使用DNA連接套件（寶酒造公司製）予以連 結後，轉形大腸桿菌JM109,選擇出可在含有3Q#g/ffil 氯徽素、〇 · 0 0 4 % X - G a 1、及1 ηι Μ I P T G之L培養基平板 上生長之白色菌落。將各選殖體接種至含有30；ug/inl 氣徽素之L培養基中，於37 °C過夜培養後，以鹼性溶菌 法由培養_體調製出質體D N A，於限制酶切開後進行瓊 脂糖_電泳予以解析。其結果，取得來自P S F L A 1 0之約 6kbp DNA相對於載體DNA分別以逆向插入之PH10X6-1及 PH106X-2。又，同樣地取得插人來自PSFLA17之約6kbp DNA 之 PH17X6-7 及 PH17X6-11。導入 PH106X-1之大腸桿® -6 1- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） m 1.^^1 m m ϋ.— u - - —ϋ —ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570979 A7 B7 五、發明説明（p ) JM，l〇g株為以 Escheriichia coli JM109/pH10X6-l表不 ，而導人PH17X6-7之大腸桿菌JM109為以Escherichia coli JM109/PH17X6-7表示。對於此些質體，以直接引 子延長法、或以限制酶切開後進行次選殖之雙脱氧法解 析詳細的鹼基序列時，分別察見來自PSFLA1()之約6kbP DNA斷片之2094個鹼基（包含終止密碼子）之讀取框、及 來自PSFLA17之約6kpb DMA斷片之2115値鹼基（包含終止 密碼子）之讀取框，並且察見此些讀取框所编碼之胺基 酸序列中，與實施例4-(3)所決定之部分胺基酸序列顯 示非常高相同性之區域。 將來自PSFLA10之讀取框命名為fdlA、來自PSFLA17之 讀取框命名為f d 1 B。 其結果示於第3圖及第4圖。即，第3圖為示出PSFLA10 内之fdlA之位置圖，第4圖為示出PSFLA10内之fdlB位置 圖。圖3中之黑箭頭為分別表示fdl A之编碼區域及方向 ，且第4圖中的黑箭頭為分別表示fdlB之编碼區域及方 向。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於fdl A编碼造成之胺基酸序列中，發現與實施例4-(3) 所決定之岩藻衣聚糖分解酵素部分胺基酸序列L36(序列 编號17)及LR14(序列编號19) 一致之序列，及與部分胺 基酸序列L27(序列编號16)、LR9(序列编號18)及LR16( 序列编號2 0 )相同性非常高之序列。再者，於實施例4 -(3)中被命名為LR8之胜肽部分，在胺基酸序列分析中 被檢測出各循璟具有二個胺基酸序列，並無法決定出胺 一 62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（Η ) 基酸序列，但因為經由決定出fdl A所編碼之胺基酸序列 中兩處之序列，可說明各循環所檢測之胺基酸衍生物， 故得知此部分中已插入含有此兩處序列之胜肽。將各序 列命名為LR8-1(序列编號24)及LR8-2(序列編號25)。由 於fdl A所编碼之胺基酸序列為與實施例4-(3)之岩藻衣 聚糖分解酵素部分胺基酸序列分析所得之全部的胺基酸 序列一致或者顯示出高相同性，故認為其實質上编碼造 成Flavobacterium sp. SA-0082之岩藻衣聚糖分解酵素。 另一方面，於fdl B所编碼之胺基酸序列中，亦察見與 岩藻衣聚糖分解酵素部分胺基酸序列LR14(序列编號19) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 及LR8-〗（序列编號24)—致之序列，或與部分胺基酸序 列L27(序列编號16)、LR16(序列编號20)、及LR8-2(序 列编號2 5 )相同性高之序列，但於部分胺基酸序列L 3 6 (序列編號17)及LR9(序列編號18)並未察見顯示出高相 同性之序列。但是，若比較f d 1 A和f d 1 B，則因為鹼基序 列及胺基酸之相同性為分別高至約6 7 %及約5 6 % ,故認 為fdlB亦為编碼造成具有岩藻衣聚糖分解活性之多！fe。 如上述處理，決定出認為编碼造成具有岩藻衣聚糖分解 活性多呔之基因（fdlA)及於其基因中顯示出非常高相同 性之基因（fdlB)的全部鹼基序列。fdlA之鹼基序列示於 序列之序列编號7, fdlA所编碼造成之胺基酸序列示於 序列表之序列編號3。再者，fdlB之鹼基序列示於序列 表之序列编號8, fdl B所編碼之胺基酸序列示於序列表 之序列编號4。 -6 3 -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 _________________ 五、發明説明（) 以上，依據本發明單離，精製出被認為實質上编碼造 成岩藻衣聚糖分解酵素之基因（fdlA)及於其基因中顯示 出相同性，旦被認為编碼造成具有岩藻糖硫酸多糖分解 活性之新穎多肽之基因（fdlB)。 實施例5 首先，構築實施例4所得之被認為實質上编碼造成岩 藻衣聚糖分解酵素之基因（fdlA)的直接表現載體。 實施例4所得之質體PH10X6-1為來自PSFLA10之約6kbp Xbal斷H，於與fdlA基因及載體上之lac啓動基因方向 之方向上插入。將此PH10X6-1以fdlA基因内部之SacI切 開，再度位於fdlA基因起始密碼子位置之BspHI切開後 ，以1 %瓊脂糖_電泳予以分離，並且切出编碼造成f d 1 A N終端區域之約4〇〇pb DNA斷片且將萃取精製。
另一方面，令使用T7啓動基因之載體pET21d(Novagene 公司製），將含有位於T7啓動基因下游之令表現最適化之 起始密碼子之Ncol部位、及位於多選殖部位内之SacI部 位切斷後，插入先前調製之编碼造成fdlA N終端區域 之約40flbp的BspHI_SacI斷片，並且構築出質體PEFLA 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 10-No
其次，令質體PH10X6-1經由Hindlll切開，將fdlA基 因内部及來自載體之Hindlll部位切斷，並且切出编碼 含有fdlA基因終止密碼子之C終端區域之約2 kpb DMA 斷片旦將其萃取精製。將此斷Η與先前構築之質體 PEFLA10-N的Hindlll切開物連結，並且選擇出在fdlA -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 ------------ 五、發明説明（W ) 基因令長再生方向上插入該2kbp Hindlll斷Η之質體。 將如此所得之己插入PET21d之Ncol部位之起始密碼子至 fd】 A全長之表現質體命名為PSFLAIO。 使用如此所得之PSFLA10轉形大腸桿菌BL21(DE3)株 (N〇vagene公司製）。將所得之大腸桿菌BL21(DE3)/ PSFLA10接種至含有安比西林之5毫升L培養 基中並且於37下振盪培養，於混濁度為〇.D· 600=〇.8 之階段，加入終濃度IwM之IPTG後，使培養溫度變成15°C 並再振盪培養一晚。培養終了後，將培養液離心分離並 且收集菌體，將其懸浮於細胞弄碎用緩衝液〔2〇· Μ磷酸 鈉緩衝液（ΡΗ7.0)、〇·3Μ氯化鈉〕0.5毫升中，以超音波 處理弄碎薗體。取出部分懸浮液，作為大腸桿菌破淬液 。再將其離心分離除去不溶物，作成大腸桿菌萃取液。 對於作為對照之pET21d所轉形之大腸桿菌BL21(DE3) /pET21d同時於相同條件下進行培養，並且調製出大腸 捍_破碎液及萃取液，並用於以下之分析。 首先，將大腸桿菌破碎液以SDS聚丙烯醯胺膠電泳進 行分析，結果於大腸桿薗BL21(DE3)/pSFLAlfl之破碎液 中，觀察到大腸桿_BL21(DE3)/pET21d破碎液中所未 見到之分子量約7.6萬之帶。此分子量與序列表序列编 號3所示之fdl A编碼所得之胺基酸序列計算出之多肽分 子量75, 740極為一致，且與參考例5記載之 Flavobacterium sp. SA-0082精製之岩藻衣聚糖分解酵 素經過膠過濾法分析之分子量約7萬極為一致。如上述 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） .—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 570979 A 7 、^ ---------—* -一 — 1'發明説明（M) 3確認大腸桿菌BL2l(DE3)/pEFLA10為表現出fdlA所编 m >多肱。 其次，以參考例3記載之方法測定大腸桿菌萃取液之 ^岩藻糖硫酸多糖分解活性。 其結果，可知大腸桿菌BL21(DE3)/PEFLA10萃取液中 之岩藻衣聚糖分解活性為2,3Q0inU/ffil。即，得知fdlA所 編碼之多肽為具有岩藻糖分解活性，且於具有本發明基 因之大腸桿菌BL21(ED3)/pEFLA10之培養液1毫升中， 生産出約2 3 0»ϋ之具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之fdlA 所編碼之多ife。 另一方面，由大腸桿菌BL21(DE3)/pET21d之举取液 $完全未檢測出岩藻衣聚糖分解活性。 實施例6 構築實施例4所得之编碼認為具有含岩藻糖硫酸多糖 分解活性之新穎多肽之基因fdlB之直接表現載體。於此 fdlB基因之起始密碼子之位置中，雖然存在BspHI辨識 序列，但因受到其上游序列之影饗而甲基化，故使用大 腸捍菌JM109作為宿主所回收之質體可直接以BspHI予以 切開。於是，使用PCR法所放大之DN A斷片路進行構築。 實施例4所得之質體pH17X6-7,為來自PSFLA17之約 6kbp的Xbal斷片在與fdlB基因及載體上之lac啓動基因 相同方向上插入。首先，將PH17X6-7之fdlB基因内部及 來自載體之ΚρτιΙ部位切斷後，令其自我連結構築成質體 ΡΗ17Χ6-7Κ。以此ΡΗ17Χ6-7Κ作為模板，並於fdlB之编碼 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） --------τI-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} :6 570979 A7 B7 i、發明説明（κ) ®域更上游之位置上，以fdlB同向之合成DNA引子17X6F4 (序列编號26)及可連接至載體之M13引子M4(賫酒造公司 製）之組合進行PCR反應。PCR反應為在與實施例4 - (4)同 樣之反應液組成中，進行25次循環之94°C下ϋ·5分鐘之 變性、55°C下0.5分鐘之引子連接、72°C下1分鐘之合 成反應循環，最後於72 °c下保溫7分鐘並且完成合成。 反應液於苯酚/氯仿萃取後，以乙醇沈澱回收經放大之 約Ikbp的DNA斷Η。將此斷Η之位於fdlB基因起始密碼 子位置之B s ρ Η I及位於编碼區域内之M f 1 I部位切斷後， 以3%瓊脂糖膠電泳以分離，切出编碼造成fdlB之N終 端區域之約450bp的BspHI-Mfll斷Η並且予以萃取精製。 另一方面，令同實施例5使用Τ7啓動基因之表現載體 PET21d,將Hcol部位與位於多選殖部位内之BanHI部位 切斷後，插入先前調製之编碼fdlB之N終端區域之約 4 5 0 bp 的 BspHI-Mfll斷 Η ,構築出質體 PEFLA174-N。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 --------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其次，將質體ΡΗ17Χ6-7位於fdlB基因内部之NspV部位 及位於fdlB基因下游之EcoRI部位切斷，並且切出编碼 造成含有fdlB基因終止密碼子C終端區域之約2kbp NspV-EcoRI斷Η並且予以萃取精製。將此斷Η插入先前構築 之質體P E F L A 1 7 - Ν之N s ρ V - E c 〇 R I間。將如此所得之已插 入位於pET21d Ncol部位之起始密碼子至fdlB全長之表 現質體命名為PEFLA17。 使用如此處理所得之P E F L A 1 7並以實施例3同樣之方 法，進行fdlB所编碼之多肽之表現與岩藻衣聚糖分解活 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 性之確認。 即，首先使用PEFLA17轉形大腸桿菌BL21(DE3)株。將 所得之大腸桿_BL21(DE3)/pEFLA17接種至含有100/i g/ffil 安比西林之5毫升L培養基並且於37 °C下振盪培養，於 混濁度為〇.〇.600=0.8之階段下，加入終濃度11!1^1之 IPTG後，使培養溫度變成15°C並且再振盪培養一晚。培 養終了後，將培養液離心分離且收集Μ體，於細胞弄碎 用緩衝液〇 . 5毫升中懸浮，並以超音波處理弄碎菌體。 取出部分懸浮液作為大腸桿_破碎液。再以離心分離除 去不溶物，其將作為大腸桿菌萃取液。 將大腸桿舗破碎液以SDS聚丙烯醯胺膠電泳予以分析 ，結果於大腸桿菌BL21(DE3)/pEFLA17之破碎液中，觀 察到大腸桿菌BL21(DE)/pET21d之破碎液中所未見到之 分子量約7.7萬之帶。此分子量為與序列表序列编號4 所示之fdlB编碼所得之胺基酸序列計算之多肽分子量 76,929極為一致，可確認大腸桿菌8121〇£3)/卩£?1^17 為表現出f (ΠΒ所编碼之多肽。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其次，以實施例3記載之方法測定大腸桿菌萃取液之 岩藻衣聚糖分解活性。 其結果，由大腸桿菌BL21(DE3)pEFLA17之萃取液檢測 出4 8 0ffiU/ffll之岩藻衣聚糖分解活性。即，得知fdlB所编 碼之多肽為具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性，且於具有 本發明之大腸桿菌BL21(DE3)/pEFLA17培養液1毫升中 ,産生約48ιηϋ具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之fdlB所 -6 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 ΑΊ Β7 五、發明説明（W ) 編碼之多肽。 另一方面，由大腸桿菌BL21(DE3)/pET21d之萃取液 中，完全未檢測出岩藻衣聚糖分解活性。 實施例7 調查實施例5及實施例6所得之具有含岩藻糖硫酸多 耱分解活性之多肽對於含岩藻糖硫酸多糖-U之作用。 卽，於50#1之IOObiM磷酸緩衝液（PH7.5), 50//1之 2. 5 %含岩藻糖硫酸多糖-U,及10# 1之4M氯化鈉混合 液中，添加1 0 # 1實施例或實施例6所得之具有含岩藻 糖硫酸多糖分解活性之多肽溶液，並於25 °C下保持。由 反應開始之1 6、4 0及6 5小時之時間下分取反應液，並以 HPLC分析反應産物。HPLC之條件為如下述。 柱：Shodex SB802.5(昭和電工公司製）
柱溫：2 5 °C 溶離液：含有5 μ Μ疊氪化鈉之5 0 in Μ氯化鈉水溶液 流速：1毫升/分鐘 檢測器：差示折射率檢測器（S h 〇 d e X R I - 7 1昭和電工 公司製） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 尚，因為目前已知之反應産物為具有下逑構造，故使 用下述物質作為標準物質。尚，下述之式〔I〕〜〔IV〕 物質可使用以下方法所製造者。 將乾燥高果美海帶以自由粉碎機M-2型（奈良機槭製作 所製）予以弄碎，並於1 0倍量之8 5 %甲醇中7 0 °C下處理 2小時後將其過濾。於殘渣中加入20倍量之水，並於 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（w) 1 0 0 °C處理3小時，經由過濾取得萃取液。令萃取液之 鹽濃度與400IBM氛化鈉溶液呈相同後，添加5%氯化鯨蠟 基吡啶錨鹽至不再産生沈澱為止，並且離心分離。將此 沈澱以乙醇充分洗淨，將氯化鯨蠟基吡啶鏘鹽完全除去 後，以超濾器（過濾膜之排除分子量10萬）（A®ic()ri公司 製）予以脫鹽並且進行除去低分子，且以離心分離除去 此時所産生之沈澱。將此上清液冷凍乾燥，取得精製之 高果美海帶岩藻衣聚糖。産率相對於乾燥高果美海帶粉 末重量為約4 %。 其次將5%之該精製高果美岩藻衣聚糖溶液6 0 0毫升、 和ΙΟΟιηΜ磷酸緩衝液（pH8.0)750毫升和4M之氯化鈉150毫 0升和17 5Gi«U/ml之參考例5記載之岩藻衣聚糖分解酵素 溶液3 . 4 7毫升混合，並於2 5 °C下反應1 4 4小時。使用孔 徑大小3 5 0 G之透析膜將反應液透析，並收集分子量3 5 0 0 以下之部分。此部分以Micro Acilizer G3(旭化成公司 製）予以脱鹽後，將其加至使用10 roM醋酸銨平衡化之DEAE -Sepharose FF柱（4公分X25公分）之離子交換層析。以 醋酸銨之濃度梯度實施溶出，並且分取溶出液各50毫升 。第5圏中示出該層析之溶出。經由該層析取得9値部 分U )〜（i )。其中之（a )、 （ b )、 （ c )及（f )部分為使用於 構造解析。 < 其次，對於（a )、 （ h )、 （ c )、 （ f )部分依常法進行構造 解析，於確認（a )部分為下述式〔I〕之化合物、（b )部分 為下述式〔III〕之化合物、（c)部分為下述式〔IV〕、 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -------*丨^^衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 570979 A7 B7
OH 五、發明説明（W ) (f)部分為下逑式〔II〕之化合物後，使用各部分作為 上述反應産物之分析的標準品。 尚，使用上述DEAE-Sepharose FF柱之離子交換層析 中之各部分的分级號碼為（a): 42-43(b)84_91(c): 51 -52(f) : 6 2 - 6 3 〇 〔I〕 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 Μ Β7 五、發明説明（w OH I 〇=S=0
OH 〔II〕
--------—#衣— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 o=s=o
I
OH
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
OH I 0=5=0 I
OH 〔111〕
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X297公釐） -72- 570979 A7 B7 五、發明説明（〜）
〔IV〕 -〇 XH. HO
HO
Ο I 〇=S =0 I OH ；—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述反應産物之分析結果為，使用實施例5所得之具 有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽時，反應産物僅為 上述〔I〕、 〔 I I〕、及〔I I I〕，但使用實施例6所得 之具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多呔時之反應産物 為上述〔U、 〔II〕、及〔III〕加上含有大量〔IV〕 ，且即使繼續其後之反應，〔I V〕亦不會分解成〔I〕。 即，可判定如實施例5處理所得之fdlA所编碼之多肽 為作用於含岩藻糖硫酸多糖-U，且如上逑之〔I〕、 、\呑 來 出 離 游 位 單 斷 切 終 最 以 為 糖 三 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 含切 之此 於終 因由 用最 基並 作以1B， 為為fdlfe 肽亦 及多 多糖ΊΑ之 之六fd碼 碼3 有编 編IV含所 所 f 由因 1B述 ，基 fd上 中各 之如 β 出 得旦 例生 所， 施産 η理-UC 實 _ II處糖來 及桿 c CO 多出 5 腸 及例酸離 例大 、施硫游 8 施體 1 實糖位例實組 II如藻單施於重 Γ 而岩斷實 各 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（ 性岩 活含 解有 分具 糖為 多肽 酸多 硫之 糖碼 藻编 岩所 、 B 含 1 d 出 f 測及 檢1A 中fd 液認 取確 萃 a 0 ， 桿性 腸活 大解糖 此二分藻 以 液 取 萃 菌 桿 腸 大 是 但 ο 性 活 解 分 糖 多 酸 硫 比部 液僅 碎Ife 破多 菌之 桿生 腸産 大所 c 與 a 現 ml、 5 結life被 ，多式 析體型 分組肽 以重多 予之性 泳量溶 電徹可 _ 出型 胺測性 醯撿活 _ 僅以 丙，為 聚較分 β t 素成 1 酵加fd 解以及 分為1A 糖號fd 聚訊查 衣泌調 藻分在 岩之 ， 之用是 82過於 00透 。 A-膜現 g測表 P.預式 S ，型 U8I素體 ί酵驅 泌前 分之 外端 體終 Μ Ν 為至 硫為 甲域 之區 始之 開止 由為 測基 預殘 乃酸 ， 胺 時丙 列之 序個 酸24 基第此 胺、為 端値認 終25為 N 第因 碼至 。 編別號 之分訊 施 實 與 為 在 存 之 號 訊 泌 分 性 水 斥 酸泌 5 胺分例 故 俗 有 0 具體 性質 溶現 可表 之之 肽號 多訊 體泌 組分 重各 r B 各 1 d 之fd 中及 A 6 1 例fd 施去 實除 及築 1 入 fd導 在游 於下 2 用正號 成之编 合基列 計殘序 設胺ffl( ，醯Ba 先胺Q-首麩L->teFD 1 6 { 2 子 第引 及 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 ε 之Ba 始酶 開制 之限 ο 1X 子 序 至 酸 之 位 號 號 编 列 序 基 鹼 之 7 號 编 列 序 表 列 序 在 為 扭 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 合 配 游 上 列 序 之 序 為 表 Γ0序 ffle基 28驗 之之 位 7 部號 I I Η 编 a 列 3J 序 成 合 號 编 板 模 AO為 DN作 成10 合LA • F 之 E r P Θ ® 之 21築 性構 flf 補 5 互例 的施 列實 序以 之 行 進 合 組 之 例 施 0 行 應進 反 ， R Ϊ C 中 3 成 組 液 應 反 之 R ί 6 榜 X 同 在 Σ 子K之 為 引 環 « 以 循 反 並Rfi次 又 實 與 °c 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（w ) 下〇·5分鐘之變性、“”下1分鐘之引子黏接、72°〇下 2分鐘之合成反應循璟。且最後於72°C下保溫7分鐘並 且完全合成。反應液以瓊脂糖膠電泳予以分離後，將放 大之約1.4kbp之DNA斷Η予以華取精製。將此斷片依實 施例1(4)同樣之方法，調製出插入pT7 Blue T-Vecter (N〇Vagene公司製）之質體ΜΑ並且確認齡基序列。將所 得之質體之配合至引子- FDL-Q、Bam之BaroHI部位及位於 fdlA編碼區域内之SnaBI切斷後，以丙嫌酸胺膠電泳 予以分離，並且切出编碼fdlA之開始之甲硫胺酸至第26 個麩胺醯胺殘基以後之8終端區域之約48〇bi^BaRlHI-SnaBI斷片，並將其萃取精製。 另一方面，將使用與實施例5同樣之T7啓動基因之表 現載體pET21a(Navagene公司製），位於多選殖部位内之 Hindi II部位切斷，並將實施例5所調製之编碼含有fdlA 基因終止密碼子之C終端區域之約2kbp的Hindlll DNA 斷片，令T4啓動基因與fdlA基因為同方向地予以插入， 構築出質體PEFDLA-C。將此PEFDLA-C之來自多選殖部位 之BafflHI部位及位於fdlA编碼區域内之SnaBI部位切斷， 並且插入先前調製之編碼fdl A開始之甲硫胺酸至第26値 麩胺_胺殘基以後之N終端區域之約480bp的BamHI-SnaBI 斷片，取得質體P E F D L A 1 0 1。 此質體pEFDLAlOl為在T7啓動基因之下游連接來自PET21a 之14個殘基的N終端前導序列（序列编號29)之编碼連繫 序列表序列编號3之第2 6個以後序列之多肽。 -7 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 570979 A7 B7 五、發明説明（7斗） (2)引子FDL-Q-Bam設計中所用之fdlA之第26個糖胺 醱胺殘基以後之20値鹼基序列，為同樣地與fdlB之第25 値麩胺醯胺殘基以後之序列（序列表序列编號8之齡基 序列編號73-92)—致。因此，實施例8-(1)所使用之引 子卩1)1,-〇-8&111可就其原樣使用於£(111}表現載體之構築， 且使用基本上與實施例8-(1)同樣之方法，構築fdlB表 現載體 PEFDLB101。 首先，製作使用FDL-Q-Bani進行PCR反應所用之序列表 序列编號8之鹼基序列编號1489-15Q8序列之互補性20mer 之合成DNA 17X6R1 (序列編號30)。以實施例6構築之 PEFLB17作為模板，並且以引子FDL-Q-Bam和17X6R1之 組合進行PCR,將放大之約1.4kbp的DNA斷Η予以萃取精 製。將此斷Η插入ΡΤ7 Blue T-Vector,調製質體DNA並 巨確認其鹼基序列。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -I...... I - - - I n«. I 11 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 其次，將所得之質體之配合至引子FDL-Q-Ba®之BaeiHI 部位及位於f dlB编碼區域内之NspV部位切斷後，以5% 聚丙烯醯胺膠電泳予以分離，並且切出編碼fdlB之開始 之甲硫胺酸至第25個之麩胺醯胺殘基以後之N終端區域 之約210bp的BamHI_NspV斷H,並且予以萃取精製。 另一方面，將實施例4所得之質體Ρ Η 1 7 X 6 - 7之E c 〇 R I 部位切斷，並且切出含有f dlB基因全長之約2 · Gkbp的 EcoRI斷Η並將其萃取精製。將此斷Η以pET21a於多選 殖部位内之EcoRI部位，令T7啓動基因與f dlB基因為相 同方向地插人，構築質體PEFDLB-W。將此pEFDLB-W之來 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（β 之 位 部 於 位 及 位 部 之 内 域 區 碼 编 胺 P 硫Ob 甲 2 之約 始之 開域 B 1 區 d f 端 碼終 编 N 之之 製後 調以 1刖基 先殘 入胺 插醯 a胺 並麩 ， 個 殖斷25 選切第 多位至 自部酸 體 質 得 取 Η 斷 施 實 至 接 連 之 游 下 因 基 動 啓 7 Τ 在 i D 9 為 F 2 01PE號 B1體编 D 質列 EF得序 P /{V _)ρ/τ列 質(1序 此8-導 例前 端第 終之 之 4 基號 殘编 個列 14序 之列 同序 相繫 全連 完碼 01编 Α1之 β 多 之 列 序 後 以 個 及 « Ν 養 培 10之 LA體 F 組 Ε 重 p S 之行 得進 所 ， 2)法 €方 ).之 (1樣 8-同 伊 5 施例 實施 用實 使以 藻 岩 之與 築量 構現 所表 6 之 及呔 5 多 例體 施組 實重 行各 進之 ο 且得較 並所比 7 -，1 之 製U 性 調EF活 之h解 液 G 分 取A1糖 萃FL聚 體PE衣
Fia Ε Ρ 捍 用腸10 使大有 ，形含 卽轉至 •f ,0 Λί —^ϋ mu I ml in ϋρΑ^ -I: --- —-Hi I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\呑 或 接且 Mu 分 ， 體中 形養 轉培 之 L 得升 所毫 將 5 C 之 株林 3)西 DEbh 1(安 為 度 濁 混 之 液 養 培 於 〇 養 培 盪 振 下 °c 之 Μ 0 ΊΧ 度 濃 終 入 加 下 段 階 之 為 成 度 溫 養 培 使 後 I# 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 漆 枚 D 並U液 離P碎 液升，破 養M S skat 將0.腸 ，液大 後衝為 了緩作 終用液 養碎浮 培破懸 。胞分 晚細部 一 於出 養浮取 培懸 C 盪其體 振將舖 再，碎 並體弄 ρ 蘭理 15集處 _ 胺ί 時 醯W 。烯# 液Β解二# ^ ^ fe as 染 桿以藍 腸，亮 大液西 成取麥 作萃克 ，及行 物液進 溶碎法 不破常 去蘭依 除桿 ， 心腸後 離大離 其各分 將將泳 再 電 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 B7 五、發明説明（# ) 任何之大腸桿_破碎液中均觀察到表現出大量預測分子 量之多肽。同時經由與泳動之血清白蛋白量之比較，估 計其表現量，且以參考例3記載之方法測定各萃取液中 之岩藻衣聚糖分解活性。其結果記載於表2。 表2 質體 培養液每Π之表現 蛋白量（《ig/Ι) (破碎液）（萃取液） 培養每1ml 之活性（fflU/ ffll)(萃取液） PEFLA10 fdlA 5 1 200 PEFDLA101 fdlA 10 10 1300 PEFLA17 fdlB 35 氺 34 PEFDLB101 fdlB 75 75 5700 #於檢測界限以下而無法估計 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -------r— — (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如表2所示，破碎液中所含之目的多肽之表現量，以 加成N終端前導序列取代被預測為分泌訊號之序列而予 以構築之 pEFDLA101(f(ilA)、pEFDLBlOUfdlB)者，比具 有被預測為分泌訊號之直接表現質體P E F L A 1 Q ( f d 1 A )、 P E F L A 1 7 ( f (Ufi )之任何基因倩況，均顯示出高於2倍左 右之生産量。 ~ 7 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 Μ Β7 五、發明説明（W ) 又，得知具有分泌訊號之情形為萃取液中存在之目的 多肽量較破碎液極端減少，且所表現之多肽乃多以不溶 型式存在，相對地，除去分泌訊號之情形分在萃取液中 檢測出與破碎液大約等量之目的多肽，旦所表現之多呔 幾乎為以可溶型式存在。再者，萃取液中之活性量亦對 應於目的多肽之存在量大為上升。 實施例9 調査實施例2及實施例3所得之具有含岩藻糖硫酸多 糖分解活性多肽，對於含岩藻糖硫酸多糖_卩之作用。 即，於 500#]之 50mM 眯唑- HC1 緩衝液（PH7.5)、50#1 之參考例1 - ( 2 )記載之含岩藻糖硫酸多糖-F 2 . 5 %溶液 、5 0 # 1之1 Μ氯化鈣及7 5 # 1之4 Μ氯化鈉混合液中，添 加】〇 〇 # 1實施例2或實施例3所得之9 . 7 hi U / m 1具有含 岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽溶液，並再加入蒸餾水 使全量為1毫升。於25°C下反應18小時後，以HP LC分析 反應産物。HP LC之條件為如下述。 柱：Shodex SB804(昭和電工公司製）
柱溫：2 5 °C 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 溶離液：含有疊氮化鈉之50raM氯化鈉水溶液 流速：1毫升/分 撿測器：差示祈射率檢測器（S h 〇 (i e X R I _ 7 1昭和電工 公司製） 經由上述本發明基因所编碼之多呔之作用，分析生成 反應之産物，結果使用實施例2及實施例3所得之具有 -79-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（"） 含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽之反應産物中，均以 Η P L C撿測出二個滯留時間為8 . 6 2分鐘及9 . 3 0分鐘之波峰。 尚，若比較使用實施例2所得之具有含岩藻糖硫酸多 肽分解活性之多肽，及使用實施例3所得之具有含岩藻 糖硫酸多糖分解活性之多肽之情況，則以實施例2之9 . 3 0 分鐘物質産生較多。 發明之效果 依據本發明，首先闌明具有含岩藻糖硫酸多糖分解活 性之多肽的胺基酸序列及鹼基序列，且藉此可提供具有 含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽，旦提供具有含岩藻 糖硫酸多糖分解活性之多肽的工業性有利之基因工程性 製法。 若依據本發明，則於含岩藻糖硫酸多糖分解酵素之誘 導生産中，並不需要培養基中添加含岩藻糖硫酸多糖， 巨生産性高。又，不同時産生蛋白酶和其他之多糖分解 酵素等酵素，且亦可輕易精製。經由提供具有含岩藻糖 硫酸多糖分解活性之多肽的胺基酸序列及鹼基序列，則 可以此胺基酸序列為基礎，製作具有抗含岩藻糖硫酸多 糖分解活性之多肽抗體，和以鹼基序列為基礎，製作對 於具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽的鹼基序列專 一之探針和引子。 _ 8 0 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） Λ— -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 570979 A7 B7 五、發明説明（Μ 配 列 表 序列编號：1 序列長度：8 1 4 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜肽 序列：
Met Lys lie Arg Asn Val Cys Arg Ser Ala Val Leu Leu Gly Leu 15 10 15
Met Ser Leu Asn Thr Tyr Ala Glu Thr Lys Ala Asp Trp Met Gin 20 25 30
Gly Asn Trp Gly lie Ser Tyr Arg lie Pro Gly Gly Asp lie Asn . 35 40 45
Tyr Ser Gly Ser His Val Ala Glu Tyr Asn Val Arg Ala Ala Val 50 55 60
Glu Gin lie Ser Ala lie Pro Gly Leu Lys Trp Val Gin lie Asn 65 70 75
Leu Thr Asn Gly Ala Ser Gly Asp Arg Phe lie Val Pro Val Thr 80 85 90
Glu Val Glu Ala lie Asn Pro Leu Ser Ala Pro Asn Ser lie Asn 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 95 100 105
Asp Leu Tyr Asp Pro Thr Leu Pro Gly Arg Asp Leu Phe Glu Gin 110 115 120
Leu Ala Leu Ala Phe Lys Ala Lys Gly lie Arg Val Val Ala Tyr 125 130 135 lie Ala Thr Gin Gly Pro Gly Met Leu Lys His Gly Ala Glu Asn 140 145 150 -81 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X297公t ) 570979 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（和）
Ser Met Asp Glu Asp Asp Ser lie Thr Asp Cys Lys Ser Ser Lys 155 160 165
Pro Leu Val Thr Asp Leu Asp Thr Gin Val Tyr Cys Ser Ala Asn 170 175 180
Met Asn Arg Trp Arg Asp Tyr Val Leu Glu Gin Tyr Pro Ser Thr 185 190 195
Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Glu Leu Ala Met Val Asn lie Val Glu 200 205 210
Thr Leu Ser Leu Arg Tyr Gly Ser Thr lie Asp Gly Trp Trp Phe 215 220 225
Asp His Ser Gly Phe Gly Asp Ser Glu Leu Leu His Ala Ala Ala 230 235 240
Leu Ala Gly Asn Asn Asp Ala Ala Val Ala Phe Asn Glu Gly Asp 245 250 255
Lys Val Pro Leu Val Asn Asn Pro Glu Thr Leu Asp Asp Tyr Thr 260 265 270
Phe Gly His Pro Thr Pro lie Gly Ser Glu Val Ser Ser Asp Asp 275 280 285
Lys Asn Leu Pro Met Leu Thr Ser lie Glu Ala Thr Leu Asp Gly 290 295 300 lie Leu Thr Gly Ser Gly Asp Asp Val Gly Ser Val Gly His Met 305 310 315
Phe Met Pro Leu Gin Glu Ser Trp Asn Gly Gly Thr Val Val Phe 320 325 330
Ser Glu Ala Lys Gly Ser Asp Trp Leu Asn Arg Ala Leu Lys Ala 335 340 345
Gly Gly Ala Phe Thr Trp Ala Leu Ser Gin Asp Ser Asn Asp Glu 350 355 360 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公势） -82- -------— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 、11 570979 A7 B7 五、發明説明（w )
Leu Gly Gly Gly Gly Ala Arg Leu lie Ser Glu Pro Gin Val Lys 365 370 375
Met Leu Glu Arg Met Ser Phe Asn lie Gly Lys Gin Leu His Met 380 385 390
Asn Leu Asp Gly Ser Asp Gly Asp Thr Ala Tyr Asp Asp Ser Val 395 400 405
Asn Gin Tyr Thr Ala Thr Val Asn Gly Ala Asn Phe Val Asp Asp 410 415 420
Val Thr Arg Gly Lys Val Ala Ser Phe Thr Glu Asp Asp Gin Leu 425 430 435
Glu Leu Asp Asn Tyr Gin Gly lie Ser Gly Gly Asn Ala Arg Thr 440 445 450
Thr Met Ala Trp lie Lys Thr Ser Asp Ser Lys Gly Asp lie lie 455 460 465
Asp Trp Gly Asn Asn Thr Thr Ser Glu Arg Trp Trp Leu Arg Leu 470 475 480
Val Asp Gly Lys Phe Lys Leu lie Leu Lys Gly Pro Asn Leu Thr 485 490 495
Gly Thr Thr Thr Leu Asn Asp Asp Gin Trp His His lie Ala Val 500 505 510
Val Ala Ser Asp Asn Val Val Ala Asn lie Lys Val Tyr lie Asp 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 515 520 525
Gly Val Leu Glu Thr Val Ala Val Asn Asp Asn Ala Ser Thr Thr 530 535 540
Phe Asp Thr Thr Leu Gly Gly Asn lie Gin lie Gly Gly Ala Tyr 545 550 555
Thr Gly Leu lie Asp Lys Val Leu Val His Asp Arg Ala Leu Asp 560 565 570 —83— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4坭格（210X29*7公t ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570979 kl __'___B7 五、發明説明（W )
Glu Ser Glu lie 61u Tyr Val Val Asn Ser Ser Asn Ala Asp Leu 575 * 580 585
Asp Leu Giu Val Ala Leu Asp Val Arg Phe Glu Glu Ser Ala Asn 590 595 600
Ser Thr Lys Val Thr Asp Asn Ser lie Tyr Gly Arg His Gly Thr 605 610 615
Asn Arg Gly Ala lie Thr Gly Val Phe Asp Ala Glu Arg Asn Ser 620 625 630
Asn Val Tyr Ser Leu Asp Gly Val Asp Ser Gly Glu Asp lie Asn 635 640 645
Asp Leu Lys Asp Ser Asp Tyr Glu His Glu Val Val Met Thr Thr 650 655 660
Asp Asn Ser Lys Asp Ser Lys Gly Tyr Ser Gly Val Asn Gly Ala • 665 670 675
Gly Pro Arg Thr Val Met Ala Trp lie Lys Thr Thr Phe Gly Gly 680 685 690
Ala Val lie Ala Gin Trp Gly Asn Lys Asn Ser Val Asp Gly Glu 695 700 705
Gin Tyr Glu Val Arg Leu Lys Asn Gly Ala Leu Arg Leu Asp lie 710 715 720
Thr Gly Gly lie lie Lys Gly Thr Thr Ser lie Asn Asp Gly Glu 725 730 735
Trp His His lie Ala Val Val Ser Pro Asp Glu Gin Leu Ala Asn 740 745 750
Thr Lys Leu Tyr Val Asp Gly Val Leu Glu Thr Ala Thr Thr Ser 755 760 765
Gly Ser Gin Ala Thr lie Asp Thr Lys Thr Leu Asn Gly Asp Ser 770 775 780 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規桔（210X 29*7公f )1 -84- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 衣. 570979 A7 B7 五、發明説明（w).
Lys Asp Val lie lie Gly Ser Thr Phe Val Gly Glu Met Asp Asp 785 790 795
Phe lie lie His Gin Arg Ala Leu. Arg Gin Phe Glu Val Lys Asn 800 805 810
Ser Ala Gly Leu 序列编號：2 序列長度：8 8 1 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜呔 序列：
Met Lys lie Arg Asn Met Cys Cys Thr Ala Leu lie Val Ser Leu 1 5 . 10 15
Met Gly Cys Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Ser Ser Pro Glu Val 20 25 30
Glu Val Asp Asn Gly Val Glu lie Gin Pro Glu Pro Glu Val Glu 35 40 45 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro 50 55 60
Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu 65 ，70 75
Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Asp lie Arg Ala Ser 80 85 90
Trp Met Gin Gly Asn Trp Gly Ser Phe Arg lie Ser Gly Gly 95 100 105 -85- (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公势） 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 570979 A7 ___'_ B7 五、發明説明（fe?)
Asp lie Ser Gin Asn Glu Ser His Val Asn Glu Tyr Gin Val Ala 110 115 120
Pro Ala Val Glu Gin lie Ala Ala lie Pro Gly Leu Lys Trp Leu 125 130 135
Gin Val Asn Leu Ser Asn Gly Ala Phe Gly Asp Arg Phe lie Val 140 145 150
Pro Val Pro Glu Val Glu Ala lie Asn Pro Asn Ser Ala Pro Asn 155 160 165
Ser Ser Ala Asp Leu Phe Asp Pro Ala Leu Pro Gly Asp Asp Leu 170 175 180
Phe Glu Gin lie Ala Leu Gly Leu Gin Ala Lys Gly lie Lys Val 185 190 195
Val Ala Tyr. lie Ala Thr Gin Gly Pro Ala Met Leu Lys His Gly 200 205 210
Ala Glu Arg Ser Met Asp Phe Asp Asp Ser lie Val Asp Glu Ser 215 220 225
Asp Gly Ser Ala Cys Lys Ser Ser Arg Pro Val Val Ser Asp Pro 230 235 240
Asp Thr Gin Val Tyr Cys Ser Ala Asn Met Asn Arg Trp Arg Asp 245 · 250 255
Tyr Val Leu Gin Gin Tyr Pro Ser Thr Ser Leu His His Ser Phe 260 265 270
Gin Leu Gly Leu Val Asn lie Val Glu Thr Leu Ser Leu Arg Tyr 275 280 285
Gly Thr Leu lie Asp Gly Trp Trp Phe Asp His Ser lie Tyr Gly 290 295 300
Asp Tyr Asn Leu Leu Pro Asp Ala Ala Arg Ala Gly Asn Ser Asn __305 310 315 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210X297公釐) i — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（紅）
Ala Ala Val Ser Leu Asn Leu Glu Gly Asp lie Phe Leu Ser Asn 320 ' 325 330
Asn Pro Glu Val Met Glu Asp Phe Thr Gly Gly His Pro Thr Pro 335 340 345 lie Ala Arg Val Val Ser Ser Asp Asp Thr Asn Leu Pro Met Leu 350 355 360
Thr Ala lie Glu Asp Ala Pro Asn Gly lie Phe Thr Gly Thr Gly 365 370 375
Asp Asp Val Asp Ala Leu Gly His Met Phe Leu Pro Leu Gin Glu 380 385 390
Thr Trp Asn Gly Gly Thr Val Val Phe Ser Glu Ala Lys Gly Thr 395 400 405
Glu Trp Leu Asn Arg Val Thr Arg Ala Gly Gly Ala Leu Thr Trp 410 415 420
Ala Leu Ser His Glu Gly Ser Val Ser Gly Gly Glu Ala Met Leu 425 430 435 lie Ser Ala Pro Gin Ala Lys Met Leu Ala Arg Met Gin Leu Asn 440 445 450 lie Gly Lys Gin Leu Asp Met Asp Leu Asp Gly Ala Asp Gly Ala 455 460 465
Thr Ala Tyr Asp Asp Ser VaKAsn Gin His Thr Ala Thr Val Thr 470 .· 475 480
Gly Ala Thr Phe lie Asp Asp Val Thr Arg Glu Lys Val Ala Ser 485 · 490 495
Phe Thr Glu Thr Asp Leu lie Thr Leu Asn Asn Phe Thr Gly lie 500 · 505 510
Leu Gly Glu Ser Ala Arg Thr Thr Met Ala Trp lie Lys Thr Ser ___515 ·_ 520 525 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公龙) 巧7 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丁 II 、-0 570979 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 _____B7 五、發明説明（外）
Asp Ser Asn Ala Asp Val lie Gin Trp Gly Lys Gin Glu Thr Ser 530 535 540
Glu Ala Trp Tyr Val Gly Leu Asp Asn Gly lie Leu Gin Leu Asn 545 550 555 lie Gin Gly Ser Thr Val lie Gly Ala Ser Val Leu Asn Asp Asp 560 565 570
Ser Trp His His lie Ala Val lie Ala Pro Asp Asn Ser lie Ala 575 580 585
Asn Thr Gin Val Tyr lie Asp Gly Val Leu Glu Thr Leu Thr Val 590 595 600
Asn Asp Gly Gly Ser Ser Thr Phe Asn Thr Val Ala Asp Thr Asn 605 610 615
Val Val lie Gly Gly Glu Phe Thr Gly Leu lie Asp Lys Thr Val 620 625 630
Val Tyr Asn Arg Ala Leu Glu Glu Ser Glu lie Asp Tyr lie Val 635 640 645
Asn Ser Ala Asp Ala Asp lie Asp Leu Gly lie Ser Leu Asp Val 650 655 660
Arg Phe Asp Glu Asp Ala Asn Ala Thr Thr Val Ala Asp Asn Ser 665 670 675
Ala Tyr Glu Arg Ser Gly lie Asn Arg Gly Ala lie Thr Gly Val 680 685 690
Phe Asp Ala Thr Arg Asn Ser Asn Val Tyr Ser Leu Asp Gly Val 695 700 705
Asp Ser Gly Glu Asp Leu Asp Asp Leu lie Asp Ser Asp Tyr Glu 710 715 720
His Gin lie Val Met Thr Thr Asn Asn Lys Arg Asp Asn Lys Gly 725 730 735 尺度適用中國國家lii7CNS) A4^ ( 210x2(w># )~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
570979 ΡκΊ Β7 五、發明説明（打） ·
Tyr Ser Gly Val Asn Gly Gly Asp Pro Arg Thr Val Met Ala Trp 740 745 750 lie Lys Thr Thr Phe Gly Gly Ala Val lie Ala Gin Trp Gly Asn 755 760 765
Lys Asp Ser Val Asp Gly Glu Gin Tyr Glu Val Arg Leu Lys Asn 770 775 780
Gly Glu Leu Arg Val Asp lie Thr Gly Gly Leu lie Lys Gly Thr 785 790 795
Thr Leu lie Asn Asp Gly Glu Trp His His lie Ala Val Val Ser 800 805 810
Pro Asp Asp Gin Leu Ala Asn Thr Lys Leu Tyr Val Asp Gly Val 815 820 825
Leu Glu Thr Thr Thr Thr Ser Gly Ser Gin Thr Thr lie Asp Thr 830 835 840
Leu Thr Leu Asn Gly Asp Ser Lys Asp Val lie lie Gly Ser Thr 845 850 855
Phe Val Gly Glu Met Asp Asn Phe Val lie His Gin Arg Ala Leu 860 865 870
Lys Gin Phe Glu Val Lys Val Ala Ala Gly lie 875 880 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 序列編號：3 序列長度：6 9 7 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜肽 序列： -89- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公浼） 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 570979 A7 • B7 五、發明説明（#)
Met lie Lys Lys Tyr Asn Leu lie Lys Thr Gly Val lie Thr Phe 1 5 10 15
Leu Val Leu Phe Phe Gin Gin Thr Tyr Ala Gin Thr Thr Thr Val 20 25 30
Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Pro Tyr Leu Lys Gin Asp Asn Val 35 40 45
Asp Val Lys Leu Ala Pro Gly Thr Tyr Asn Val Asn Gly Phe Asp 50 55 60
Val Gly Glu Asp Arg Leu Phe Ser Thr Thr Pro Leu Phe Leu Phe 65 70 75
Glu Gly Ser Asn Ser Thr Tyr Asp Phe Thr Asp Val Lys Leu Asn 80 85 90 lie Asn Thr Val Val Leu Thr Lys Phe Gly Asn Asn Glu Val Asn 95 100 105
Glu lie Gin lie Leu Gly Asn Asn Asn Val Leu Lys Asn Leu Lys 110 115 120
Leu Glu Asp lie Gly Thr Thr Ala Pro Ser Asn Arg Ala Gin Ser 125 . 130 135 0 lie Val lie Asp Gly Arg Asp Asn Arg lie Glu Gly Phe His Leu 140 145 150
Thr lie Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Gly Tyr Gly Asp Ala Phe Gly 155 160 165
Lys Gly Gly Gly Ser Val lie Asn His Arg Lys His Ser Gly Val 170 175 180
Leu He Arg Gly Leu Arg Asn His Leu Lys Asp Cys Thr lie lie 185 190 195
Ser Arg Ser Tyr Gly His lie Val Phe Met Gin Ala Ala Ser Tyr __ _2M_ 205_ 210 尺度適用中國國家標準( CNS ) A4規格（210X 297公犮)-90-~' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（) '
Pro Thr Val Glu Gly Cys Tyr lie Glu Gly Glu Met Arg Ser Thr 215 220 225
Asp Asp Met Leu Ala Glu Glu Gly Thr Gly Ser Pro Ala Asp Lys 230 235 240
Val Asp Phe Met Thr Val Trp Gly Tyr Lys Leu Pro Ala Gly Tyr 245 ， 250 255
Met Met Ser Leu Gin Glu Gly Gly lie Arg Ala Tyr Asn Ala Gly 260 265 270
Thr Thr Tyr lie Asp Gly Val Glu lie Gin Arg Ala Thr Asp Asn 275 280 285
Pro Thr Val Leu Asn Cys Thr lie Lys Asn Ala Arg Thr Gly Val 290 295 300
Thr Leu Ala His Ala Asn Gly·Thr Lys Tyr Val Glu Gly Cys Thr 305 310 315
Val Leu Gly Cys Glu Asn Gly Tyr Ser lie Gly Ser Gly Thr Val 320 325 330
Val Asn Cys Gly Ala Asp Ala lie Tyr Gly Pro Val Phe Lys Asn 335 340 345
Thr Tyr Gly Ser Asp Lys Gly Tyr Asn Ala Asp lie Thr lie Leu 350 355 360
Pro Pro Ser Asp Ala Tyr Tyr Asn Gly His Asp Ala Val Ala Tyr 365 370 375 lie Gly Gly Ser Asn His Asn Leu Thr Phe Arg Ser Glu lie Thr 380 385 390
Glu lie Pro Ser Asn Leu Lys lie Met Val Ser Gly Asp Leu Gin 395 400 405
Gly Leu Arg Val Leu His Gly Ser Asn Pro Ser Gin Asn Asn Phe --------- 410 — 415_420 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇x 297公漦） -91- (請先閱讀背面之注意事項乔填寫本頁
、1T 570979 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 kl _ 五、發明説明（打）
Ala Gly Thr Asn lie Val Leu Arg Asn Leu Thr Asn Phe Pro Val 425 430 435
Asp Leu His Ser Asp Ser Ser Asn lie Thr Val Thr Ser Cys Asp 440 445 450
Thr Asp Asn lie Thr Asp Asn Gly%Thr Asn Asn Ser lie Glu Ala 455 460 465 lie Asp Cys Asp Ser Asp Asn Leu Ala Leu Lys Gly Glu Ala Ser 470 475 480
Gin Ser Ser Ser Arg Pro Ser Asp Gly Phe Ala Ala Asn Ala lie 485 490 495
Asp Gly Asn Thr Asn Gly Ala Trp Ser Asn Asn Ser Val Ser His 500 505 510
Thr Gly Thr Glu Glu Asn Pro Trp Trp Gin Val Asp Leu Gly Thr 515 520 525
Asp Ala lie lie Gly Ser lie Asn lie Phe Asn Arg Thr Asp Gly 530 535 540
Cys Cys Lys Gly Arg Leu Asp Asn Phe Thr Val Tyr Val lie Asp 545 550 555
Lys Asp Asp Lys Val Thr Phe Ser Lys Thr Tyr Val Thr Val Pro 560 565 570
Asp Pro Ser lie Thr Val Asp Ala Gly Gly Val Asn Gly Lys lie 575 580 585
Val Lys lie Val Leu Asn Asn Ser Ser Gin Ala Leu Ala Leu Ala 590 595 600
Glu Val Glu Val Tyr Gly Thr Ser Leu Ser Asn Lys Glu Thr lie 605 610 615
Lys Asn Pro lie His Phe Tyr Pro Asn Pro Val Glu Asp Glu Val _620_625_630 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公犮) -92- (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 、-口 570979 A7 B7 五、發明説明（％ ) #
Thr lie Ser Leu Glu Ser Ala Asp Leu Asn Leu Asn Glu Thr Arg 635 640 645
Val Val lie Tyr Asn lie Lys Gly Gin Lys lie Leu Glu Thr Thr 650 655 660
Pro Ser Asn Ser Thr Glu Val Asn Leu Asn Leu Ser His Leu Pro 665 670 675
Thr Gly Val Tyr Leu lie Arg Val Ser Asp Gin Asn Lys Asn lie 680 685 690 lie Asn Lys lie Val Lys Leu 695 序列编號：4 序列長度：7 0 4 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜肽 序列：
Met Lys Lys Tyr Ser lie Leu Lys lie Gly lie lie Ala Val lie 15 10 15
Met Leu Phe Val Gin Gin Ser%Tyr Ala Gin Thr Thr Thr Val Tyr 20 25 30
Ser Leu Glu Asp Leu Leu Pro Tyr Leu Lys Gin Asp Asn Val Asp 35 40 45
Val Lys Leu Ala Pro Gly Thr Tyr Asn lie Asn Ala Phe Asp lie 50 55 60
Thr Gin Gly Lys Phe Ser Asn Pro Leu Phe Leu Phe Glu Gly Ser _65_70 _75 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規桔（210X 297公楚) -93- 請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁 、=口 P. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570979 A7 五、發明説明（> ) 經 中 央 標 準為 員 合 社 印 製
Asn Asn Thr Phe Asp Phe Thr Asp Val Lys lie Asn lie Asn Thr 80 85 90 Leu Val Leu Thr Lys Phe Gly Asn Asn Glu Val Asn Glu lie Gin 95 100 105 lie Leu Gly Asn Asn Asn Val Leu Lys Asn Leu Lys Leu Glu Asp 110 115 120 lie Gly Thr Thr Ala Pro Ser Asn Arg Ala Gin Ser lie lie Met 125 130 135 Asp Gly Arg Asp Asn Arg lie Glu Gly Phe His Leu Thr lie Arg 140 145 150 Gly Ser Tyr Pro Tyr Gly Tyr Gly Asp Ala Phe Gly Lys Gly Gly 155 160 165 Gly Ser Val lie Asn His Arg Lys His Ser Gly Val Leu lie Arg 170 175 180 Gly Leu Arg Asn His Leu Lys Asp Cys Thr lie lie Ser Arg Ser 185 190 195 Tyr Gly His lie Val Phe Met Gin Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val 200 205 210 Glu Gly Cys Tyr lie Glu Gly Glu Met Arg Ser Thr Asp Asp Met 215 * 220 225 Leu Ala Glu Glu Gly Thr Gly Ser Pro Ala Asp Asn Val Asp Phe 230 235 240 Met Thr Val Trp Gly Tyr Lys Leu Pro Ala Gly Tyr Met Met Ser 245 250 255 Leu Gin Glu Gly Gly lie Arg Ala Tyr Asp Ala Gly Thr Thr Tyr 260 265 270 lie Asp Gly Glu Val lie Gin Arg Ala Thr Asp Asn Pro Thr Val "tt---—----m---- 285 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )Λ4規格（210X 297公犛） —94— .I 策 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 570979 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（Ο
Leu Asn Cys Thr lie Lys Asn Ala Arg Thr Gly Val Thr Leu Ala 290 295 300
His Ala Lys Gly Thr Lys His Val Glu Asn Val Lys Ala lie Gly 305 310 315
Cys Glu Gin Gly Tyr Ser lie Gly Ser Gly Thr Val Ser Asn Cys 320 325 330
Ser Gly Asp Ala Gin Tyr Gly Pro Leu Leu Ser Phe Ala Tyr Ser 335 340 345
Ser Asp Lys Asn Thr Asn lie Asp lie Glu Val Leu Pro Ala Glu 350 355 360
Asn Tyr Tyr Asn Gly Ser Glu Thr Ala Ala Tyr Val Gly Gly His 365 370 375
Ser His Asn lie Thr Leu Arg Gly Gly Asp Pro Asn Ala Asp Leu 380 385 390
Arg Val Gin Val Gly Gly Glu lys Asn Asn Val Arg Leu Leu Gly 395 ' 400 405
Val Thr Ser Asn Gin Asn Pro Leu Ser Ala Ser Asn Leu Glu Leu 410 415 420
Asn Asn Leu Thr Asn Phe Pro Val Val Leu Asp Glu Met Ser Ser 425 430 435
Asn lie lie Val Glu Ser Cys Gly Glu Val Thr Asn Asn Gly Ser 440 445 450
Asn Asn Ser lie Thr Asp Cys Pro Asp Gly Pro lie Ser Phe Pro 455 460 465
Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Arg {en Gly Asn Asn Arg Phe Thr Phe 470 475 480
Trp Val Ala Ala Asn Gly Gly Asp His Ala Tyr Ser lie Lys Tyr -485. 490 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\d 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公飨） •95· 495 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 570979 A7 B7 五、發明説明（料）.
Asn Asp Gly lie Ser Gly Asn lie Asn Asp Tyr Glu Asp Leu Phe 500 505 510
Pro Glu Gly Glu Glu Ser Phe Trp Val Phe Thr Pro Val Glu Gly 515 520 525
Arg Asp Gly Tyr Phe Phe Val Asp Cys Val Gly Gly Gly Asp Lys 530 535 540
Gin Arg Leu Ser Ala Thr Thr Asp Ser Gly Leu Pro Val Met Val 545 550 555
Ser Lys Thr lie Thr Ser Ala Ser Val Gin Trp Ser Val Val Gin 560 565 570
Pro Glu Gly Arg Asp Thr Phe His lie Thr Asn Asp Tyr Ala Arg 575 · 580 585
Met Val Gly Ala Asn Thr Thr Thr Asn Gin Thr lie Leu Ser Thr 590 595 600
Val Gly Asn Thr Ser Asn Gin Ser Arg Phe Glu Val Leu Glu Val 605 610 615
Ser Asn Tyr Ser Leu Ser lie Lys Asn Asp lie Leu Asn Asn Asn 620 625 630 lie Thr Val Phe Pro lie Pro Thr Ser Asp lie Leu Asn lie Asn 635 640 645
Leu Lys Asn Met Glu Ser Val. Thr Val Glu Leu Tyr Asn Ser lie 650 655 660
Gly Gin Lys lie Leu Ser Lys Glu lie Lys Gin Gly Glu Asn Thr 665 670 675
Leu Asn Leu Ser Gly lie Tyr Thr Gly Val Tyr Leu Leu Lys Leu 680 685 690
Asn Asp Gly Gin Asn Ser Tyr Thr Lys Arg lie lie Met Lys 695 700 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規·格（210X 297公犛） -96- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁
、1T IAW. 570979 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 五、發明説明（) 序列編號：5 序列長度：2 4 4 2 序列類型：核酸 股數：雙股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：基因組D N A 起源 生物名:Altermonas s p . 株名：S I N - 1 0 0 9 序列：
ATGAAAATAC GTAATGTTTG TCGTAGTGCG TACGCAGAAA CAAAAGCTGA TTGGATGCAA GGAGGAGATA TTAATTACTC AGGTAGTCAT GAACAAATCT CAGCAATTCC TGGTTTGAAG TCTGGTGATC GTTTTATAGT CCCTGTAACA CCTAACAGTA TTAATGACTT ATACGATCCT CTGGCATTAG CCTTCAAAGC TAAAGGCATA CCTGGCATGC TCAAGCATGG TGCTGAAAAC TGTAAATCGT CTAAGCCATT AGTAACCGAT ATGAATCGCT GGAGAGATTA CGTTTTAGM TTTGAATTGG CAATGGTCAA TATTGTAGAA GATGGCTGGT GGTTTGATCA TTCAGGTTTT CTAGCTGGAA ATAATGATGC GGCAGTAGCC AATAACCCAG AGACATTAGA CGATTACACC GTTTCnCTG ATGATAAAAA CCTACCTATG ATTTTAACTG GTTCAGGTGA TGATGTAGGC GAAAGTTGGA ATGGTGGCAC TGTTGTATTT CGAGCATTAA AAGCCGGAGG TGCATTTACA GTGCTTTTAG GCTTGATGTC TTTAAATACA 60 GGTAACTGGG GGATCAGTTA TCGAATACCT 120 GTTGCAGAAT ACAATGTAAG AGCCGCAGTT 180 TGGGTACAAA TTAATTTAAC CAACGGTGCA 240 GAAGTTGAAG CCATTAATCC TTTATCCGCT 300 ACTTTACCTG GGCGAGATCT TTTTGAGCAA 360 AGAGTTGTTG CTTATATTGC GACTCAAGGG 420 TCGATGGATG AAGATGACTC CATTACTGAC 480 CTTGATACAC AAGTTTACTG TTCAGCAAAT 540 CAATACCCAT CAACCAGTCT TTATAGAAGT 600 ACATTATCAC TGCGTTATGG AAGTACAATT 660 GGTGACAGTG AATTACTTCA TGCTGCGGCT 720 TTTAATGAAG GCGATAAAGT TCCTTTGGTA 780 TTTGGTCATC CAACACCTAT AGGTAGTGAG 840 TTAACGTCTA TAGAAGCTAC TTTAGATGGT 900 TCTGTGGGAC ATATGTTTAT GCCACTTCAA 960 TCTGAAGCGA AAGGATCTGA CTGGCTTAAT 1020 TGGGCACTAA GCCAAGACAG TAATGATGAG 1080 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規棉（210X 297分松） -97 570979 經濟部中央標唪局員工消費合作社印繁 kl B7 五、發明説明（外） : TTAGGTGGTG GCGGAGCAAG ATTAATTTCA GAACCGCAGG TAAAAATGCT TGAACGTATG 1140 AGTTTTAATA TAGGTAAACA ATTACATATG AATCTAGATG GTTCAGATGG TGATACTGCT 1200 TATGATGACT CCGTCAACCA ATATACCGCT ACTGTAAACG GTGCTAATTT TGTTGATGAT 1260 GTTACAAGAG GAAAAGTTGC AAGTTTTACT GAAGACGACC AGTTAGAACT AGACAATTAT 13Z0 CAAGGTATTT GAGGTGGAAA TGCGCGTACA ACCATGGCTT GGATAAAAAC TTCAGACAGC 1380 AAAGGCGATA TTATTGATTG GGGTAATAAC ACAACAAGCG AACGTTGGTG GTTACGTTTA 1440 GTTGACGGTA AATTTAAACT GATATTAAAA GGTCCTAATC TTACAGGAAC TACAACACTT 1500 AATGACGACC AATGGCACCA TATTGCTGTT GTAGCTTCTG ATAACGTAGT TGCTAATATC 1560 AAAGTATACA TTGATGGTGT TTTAGAAACT GTTGCTGTAA ATGACAATGC TTCAACTACC 1620 TTCGATACAA CCTTAGGTGG CAATATACAA ATAGGTGGGG CCTACACCGG ACTTATCGAT 1680 AAAGTGCTTG TGCATGATAG AGCATTAGAT GAAAGCGAGA TTGAGTATGT TGTTAATTCA 1740 TCCAATGCTG ATCTTGATTT AGAGGTTGCA TTAGATGTGC GTTTTGAAGA GTCAGCAAAC 1800 TCAACTAAAG TAACCGATAA TTCTATATAT GGACGTCATG GCACAAATCG AGGTGCTATT 1860 ACTGGCGTGT TTGATGCAGA ACGTAACAGC AATGTGTACT CACTTGATGG TGTTGATAGT 1920 GGCGAAGATA TAAATGATTT AAAAGATAGC GACTACGAAC ATGAAGTTGT AATGACAACA 1980 GATAATTCTA AAGACTCAAA AGGTTATAGT GGAGTTAATG GTGCAGGTCC GCGTACTGTA 2040 ATGGCATGGA TAAAAACAAC TTTTGGCGGT GCTGTTATTG CCCAATGGGG TAATAAAAAT 2100 TCAGTTGATG GCGAACAATA TGAAGTTCGT TTAAAAAATG GTGCACTGAG ATTAGATATT 2160 ACAGGTGGCA TTATTAAAGG CACAACATCA ATTAATGATG GCGAGTGGCA TCATATTGCT 2220 GTGGTTTCAC CTGATGAACA GTTAGCTAAT ACTAAATTGT ATGTTGATGG TGTACTAGAA 2280 ACAGCAACCA CTTCGGGTTC TCAAGCAACG ATTGATACTA AAACTCTTAA TGGCGATAGC 2340 AAAGACGTAA TAATTGGTAG TACGTTTGTT GGCGAGATGG ACGATTTTAT TATTCATCAA 2400 CGCGCHTAA GACAGTTTGA AGTGAAAAAC TCAGCAGGAC TC 2442 序列编號：6 序列長度：2 6 4 3 序列類型：核酸 -98- 股數：雙股 ^本紙張尺度適用中國國家標準（〇奶）六4規枱（210'/297公犮) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 、1Τ 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 五、發明説明（π ) 拓撲學：直鐽狀 序列種類：基因組DNA 起源 生物名：Altermonas s p . 株名：S I N - 1 0 0 9 序列： ATGAAAATAC GTMTATGTG TTGTACTGCT TTAATCGTAA GTTTAATGGG CTGCGGTGGT 60 TCTGGTTCAG AAGCTAGTTC TCCTGAAGTA GAAGTTGATA ATGGAGTAGA AATTCAACCT 120 GAACCAGAAG TTGAACCTGA GCCAGAAGTT GAACCTGAAC CAGAAGTTGA ACCTGAACCA 180 GAAGTTGAAC CTGAACCAGA AGTTGAACCT GAGCCAGAAG TTGAGCCTGA ACCAGAAGTT 240 GAACCTGAAC CAGAAGATAT AAGAGCCTCA TGGATGCAAG GTAACTGGGG AATCAGCTTC 300 AGAATTTCTG GTGGTGACAT CAGTCAAAAT GAAAGTCATG TAAATGAATA CCAAGTAGCA 360 CCAGCTGTTG AGCAAATAGC CGCAATTCCT GGATTAAAGT GGTTACAAGT TAATTTAAGT 420 AACGGGGCTr TTGGCGACCG TTTTATTGTA CCTGTACCTG AAGTAGAAGC TATTAATCCA 480 AATTCAGCGC CAAACAGCTC GGCAGATTTA TTTGATCCTG CATTACCTGG CGATGACTTA 540 TTTGAACAAA TaGCACTAGG ACTTCAA3CC AAAGGCATAA AAGTAGTAGC ATATATTGCG 600 ACTCAAGGTC CTGCAATGCT GAAACATGGC GCAGAAAGAT CGATGGATTT TGATGATTCT 660 ATTGTTGATG AATCAGATGG CAGTGCTTGT· AAATCTTCAA GACCTGTCGT TTCTGATCCT 720 GATACGCAAG TTTATTGTTC AGCAAATATG AATCGCTGGA GAGATTATGT GTTACAGCAA 780 TACCCATCAA CAAGTTTGCA TCATAGTTTT CAATTGGGAC TCGTCAATAT TGTAGAAACT 840 TTATCACTAC GTTACGGCAC TCTGATTGAT GGTTGGTGGT TTGATCATTC TATTTACGGT 900 GACTACAACT TACTTCCTGA TGCTGCAAGA GCGGGAAATA GCAATGCTGC GGTTTCTCTT 960 AATTTAGAAG GGGATATTTT CTTAAGTAAT AACCCAGAAG TGATGGAGGA TTTTACCGGC 1020 GGACATCCAA CACCGATTGC TCGAGTTGTT TCATCTGATG ATACCAATTT ACCCATGTTA 1080 ACGGCTATAG AAGATGCTCC AAACGGTATT TTTACAGGAA CAGGTGATGA TGTAGATGCT 1140 TTAGGGCACA TGTTTTTACC GCTGCAAGAA ACCTGGAATG GCGGAACTGT AGTATTTTCA 1200 GAAGCCAAAG GAACTGAGTG GCTTAACAGA GTTACTCGAG CTGGCGGCGC ATTAACTTGG 1260 GCATTAAGCC ATGAAGGCAG TGTTTCTGGT GGTGAGGCTA TGTTGATTTC TGCACCACAA 1320 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210x2y，釐） -99- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\d 570979 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 Μ Β7 五、發明説明（W ) GCAAAAATGC TTGCACGTAT GCAGCTAAAT ATTGGTAAAC AACTCGATAT GGATTTAGAT 1380 GGTGCCGATG GCGCTACGGC TTATGATGAT TCTGTCAATC AACATACAGC TACGGTTACA 1440 GGTGCGACAT TTATAGATGA TGTTACTCGT GAAAAAGTGG CAAGCTTTAC TGAAACAGAT 1500 CTGATTACGT TAAACAATTT TACTGGTATT TTAGGCGAAA GTGCTCGTAC AACAATOGCT ΙΠΠΟ TGGATAAAAA CATCAGACAG TAACGCAGAT GTTATTCAAT GGGGTAAACA AGAGACGAGT 1620 GAAGCTTGGT ATGTGGGCTT AGACAATGGA ATACTTCAAT TAAATATTCA AGGTTCTACG 1680 GTTATTGGCG CAAGTGTACT TAACGATGAT AGTTGGCATC ATATTGCTGT TATCGCGCCT 1740 GATAATTCAA TTGCCAATAC TCAAGTCTAT ATCGATGGTG TTTTAGAAAC ACTTACCGTG 1800 AATGATGGTG GTTCATCTAC ATTTAATACA GTGGCAGACA CCAACGTTGT AATAGGAGGA 1860 GAGTTTACTG GCCTTATAGA TAAAACCGTT GTGTATAACA GAGCATTAGA AGAAAGCGAG 1920 ATTGATTATA TTGTTAATTC AGCTGACGCA GATATTGATT TAGGTATTTC ACTTGATGTG 1980 AGGTTTGATG AAGATGCTAA TGCAACAACA GTAGCTGATA ATTCTGCCTA TGAACGTTCA 2040 GGTATAAATC GAGGTGCCAT TACGGGCGTT TTTGATGCAA CACGTAACAG CAATGTTTAT 2100 TCACTTGATG GTGTTGATAG CGGCGAAGAT CTAGATGATT TAATAGATAG TGATTATGAG 2160 CATCAAATTG TTATGACAAC CAATAACAAA AGAGATAACA AAGGTTATAG TGGCGTGAAT 2220 ·· GGCGGTGATC CTCGAACTGT TATGGCATGG ATAAAAACAA CCTTTGGTGG TGCTGTTATT 2280 GCTCAATGGG GTAATAAAGA TTCAGTCGAT GGCGAACAAT ATGAAGTGCG CTTGAAAAAT 2340 GGCGAACTTA iiAGTCGATAT CACTGGGGGG CTTATTAAAG GAACAACATT AATAAACGAT 2400 GGCGAATGGC ATCATATTGC TGTTGTATCT CCTGATGATC AATTAGCTAA CACTAAACTT 2460 TATGTTGATG GTGTTCTAGA AACGACCACC ACCTCCGGCT CTCAAACAAC AATAGATACG 2520 TTAACCCTTA ACGGTGACAG CAAAGACGTA ATCATTGGAA GTACTTTTGT TGGCGAGATG 2580 GATAACTTTG TTATTCATCA ACGTGCTTTA AAACAATTTG AAGTAAAAGT CGCCGCAGGT 2640 ATT * 2643 序列編號：7 序列長度：2 0 9 1 序列類型：核酸 股數：雙股 n nn —10U— 拓撲學：直鏈狀 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4^格（210X297公犮） 衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 570979 A7 B7 五、發明説明（π ) 序列種類：基因組D N A 起源 生物名:Flavobacterium s p . 株名:SA-00882 序列： 經濟部中央榡率局員工消費合作枉印製 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 ATGATAAAAA AATACAATTT AATTAAAACA GGAGTTATTA CATTTCTAGT TTTGTTTTTT 60 CAGCAAACTT ACGCACAAAC AACCACAGTA TATTCTTTAG AAGACTTACT ACCCTATTTA 120 AAACAGGATA ATGTAGATGT TAAATTAGCC CCAGGAACTT ATAATGTTAA TGGTTTTGAT 180 GTAGGTGAAG ACAGGTTGTT TTCCACTACT CCACTTTTTT TGTTTGAAGG GTCTAACAGT 240 ACTTATGACT TTACAGATGT AAAGCTTAAC ATCAATACGG TTGTGTTAAC CAAGTTTGGA 300 AATAATGAGG TTAATGAAAT TCAGATTTTA GGAAATAACA ATGTTCTTAA AAACTTAAAA 360 CTAGAAGATA TTGGAACAAC AGCTCCTTCT AACAGAGCTC AGTCTATTGT TATAGATGGG 420 CGAGACAATA GAATAGAAGG TTTTCATTTA ACCATTAGAG GATCTTACCC TTATGGATAT 480 GGAGATGCTT TTGGAAAAGG AGGAGGTTCC GTAATTAATC ACCGAAAACA TTCAGGTGTT 540 TTAATAAGAG GATTACGTAA TCACCTAAAA GATTGTACCA TTATTTCTCG TTCTTATGGG 600 CATATAGTAT TCATGCAAGC AGCAAGTTAC*CCAACTGTGG AAGGTTGTTA TATTGAAGGT 660 GAAATGCGTT CAACCGATGA TATGTTGGCA GAAGAAGGAA CAGGTTCTCC AGCAGATAAA 720 GTAGATTTTA TGACGGTTTG GGGATATAAG TTACCAGCTG GTTATATGAT GAGTTTACAA 780 GAAGGAGGAA TTAGAGCATA TAATGCAGGA ACCACTTATA TTGATGGAGT AGAGATTCAA 840 CGAGCAACAG ACAACCCTAC CGTTCTAAAT TGTACTATTA AAAATGCAAG AACAGGAGTA 900 ACATTAGCAC ATGCAAATGG AACAAAATAT GTTGAGGGTT GTACTGTTTT AGGATGTGAA 960 AATGGATACT CCATAGGAAG TGGAACTGTA GTAAACTGTG GAGCAGATGC TATTTATGGA 1020 CCTGTATTTA AAAATACATA CGGAAGCGAT AAAGGGTACA ATGCAGACAT TACCATTTTG 1080 CCACCTAGTG ATGCTTACTA CAACGGACAT GATGCTGTAG CATACATTGG AGGATCAAAT 1140 CATAACCTTA CTTTTAGAAG TGAAATAACA GAAATTCCAA GCAATTTAAA AATTATGGTC 1200 TCTGGAGATT TACAAGGATT AAGAGTATTG CATGGAAGTA ATCCTAGTCA GAATAATTTT 1260 GCTGGAACCA ACATTGTTTT AAGAAATTTA ACAAACTTTC CTGTAGACTT ACATTCAGAC 1320 _^ -101- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規枱（210X 297公釐) 570979 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 A7 __B7 五、發明説明（^ ) AGTTCTAATA TAACTGTTAC TTCTTGTGAT ACGGATAATA TTACAGACAA TGGTACAAAT 1380 AATAGTATTG AAGCTATAGA TTGCGATTCG GATAATTTAG CTTTAAAAGG AGAAGCTAGT 1440 CAATCATCCT CTCGTCCAAG TGATGGTTTT GCAGCAAATG CCATTGATGG AAATACAAAT 1500 GGGGCATGGT CAAACAATTC TGTTTCTCAT ACGGGTACAG AAGAAAATCC ATGGTGGCAA 1560 GTAGATTTAG GAACAGATGC TATTATAGGT AGCATCAATA TTTTTAACAG ΛΛ(：ΛΠΛΤ(1ΠΤ 1020 TGTTGTAAAG GTAGATTAGA TAATTTTACT GTTTACGTGA TAGATAAA6A TGATAAGGTT 1680 ACATTTTCTA AMCCTATGT TACCGTTCCA GATCCGTCTA TAACTGTTGA TGCAGGTGGT 1740 GTGAATGGAA A.UTTGTAAA AATTGTTTTG AATAACAGTT CACAGGCTTT GGCTTTAGCA 1800 GAGGTAGAAG TGTACGGAAC GTCTTTGTCT AATAAAGAAA CTATAAAGAA TCCTATTCAT 1860 TTTTATCCTA ACCCGGTAGA AGATGAGGTA ACTATTTCTT TAGAGTCAGC CGATTTAAAT 1920 TTAAACGAGA CTCGAGTTGT TATTTATAAT ATAAAAGGTC AAAAAATACT AGAAACAACT 1980 CCAAGTAATT CCACGGAAGT TAATTTAAAC TTATCTCACT TACCAACAGG AGTTTATTTA 2040 ATAAGAGTAA GCGATCAAAA TAAAAATATC ATAAATAAAA TTGTAAAATT A 2091 序列编號：8 序列長度：2 1 1 2 序列類型：核酸 股數：雙股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：基因組D N A 起源 生物名：Flavobacterium sp. 株名：SA-0082 序列： ATGAAAAAAT ATTCTATCCT AAAAATAGGA ATTATAGCTG TTATAATGTT GTTTGTTCAG 60 CAGTCTTACG CACAAACAAC CACAGTATAT TCTTTAGAAG ACTTACTACC CTATTTAAAA 120 CAGGATAATG TAGATGTTAA ATTAGCCCCA GGAACTTATA ATATCAATGC ATTTGACATT 180 ACTCAAGGAA AATTTTCGAA CCCCTTATTT CTTTTTGAAG GGTCTAATAA TACTTTTGAT 240 -102- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） IT (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 570979 A7 ___.-_ B7 五、發明説明（…） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 TTTACAGATG TTAAAATAAA CATCAATACT CTGGTGTTAA CAAAGTTTGG 6AATAATGAA 300 GTCAATGAAA TTCAGATTTT AGGAAATAAC AATGTTCTTA AAAACTTAAA ACTAGAAGAT 360 ATTGGAACAA CAGCTCCTTC TAACAGAGCC CAGTCAATTA TAATG6ATGG GCGAGACAAT 420 AGAATAGAAG GCTTTCATTT AACCATTAGA GGATCTTATC CTTATGGATA TGGAGATGCT 480 TTTGGAAAAG GAGGAGGTTC CGTAATTMT CACCGMAAC ATTCAGGTGT TTTAATAAGA 540 GGATTACGTA ATCACCTAAA AGATTGTACT ATTATTTCTC GTTCTTATGG GCATATAGTA 600 TTTATGCAAG CAGCAAGTTA CCCAACTGTA GAAGGTTGTT ATATTGAAGG TGAAATGCGT 660 TCAACCGATG ATATGTTGGC AGAAGAAGGA ACAGGTTCTC CAGCGGATAA TGTAGATTTT 720 ATGACGGTTT GGGGATATAA GTTACCAGCT GGTTATATGA TGAGTTTACA AGAAGGAGGA 780 ATTAGAGCTT ATGATGCTGG TACCACTTAT ATTGATGGAG AAGTAATCCA AAGAGCAACA 840 GATAACCCTA CCGTTCTAAA TTGTACCATT AAAAATGCAA GAACAGGAGT GACTTTAGCA 900 CATGCTAAAG GAACAAAACA CGTAGAAAAT GTTAAGGCTA TTGGGTGTGA GCAAGGATAT 960 TCAATTGGTA GTGGTACAGT GAGTAATTGT AGTGGTGATG CTCAGTATGG TCCGTTGTTA 1020 AGTTTTGCTT ATTCTAGTGA TAAAAATACG AATATAGACA TAGAAGTTTT GCCTGCAGAA 1080 AATTATTATA ACGGTAGTGA AACTGCTGCT TACGTTGGAG GACATTCTCA TAATATTACA 1140 CTAAGAGGAG GTGATCCTAA TGCGGATCTT AGAGTTCAGG TAGGGGGAGA AAAAAATAAC 1200 GTTAGGTTGC TTGGAGTTAC TTCTAATCAA AATCCACTTT CTGCTTCAAA TTTGGAACTG 1260 AATAATTTAA CTAATTTTCC TGTAGTGTTA GATGAAATGA GTTCTAATAT TATTGTGGAG 1320 TCATGTGGGG AGGTTACCAA TAACGGAAGT AATAATAGTA TTACTGACTG CCCAGATGGA 1380 CCAATTAGCT TTCCAGATTC AAGCAAAGCG TATCGTTTAG GAAATAATAG ATTTACATTT 1440 TGGGTTGCGG CCAATGGAGG AGATCATGCT TATTCTATAA AGTATAATGA TGGTATTAGT 1500 GGTAACATTA ATGATTATGA GGATTTGTTT CCAGAAGGAG AAGAGTCTTT TTGGGTTTTT 1560 ACTCCAGTAG AGGGAAGAGA CGGATACTTT TTTGTTGATT GTGTTGGTGG TGGTGATAAA 1620 CAAAGATTGT CAGCTACTAC AGATAGTGGC TTGCCAGTAA TGGTGTCAAA AACCATTACA 1680 AGTGCATCTG TTCAATGGTC TGTAGTGCAA CCAGAAGGAA GAGATACTTT CCATATAACG 1740 AATGATTATG CTAGAATGGT AGGAGCTAAT ACAACTACTA ATCAAACCAT TTTGTCTACT 1800 GTTGGGAACA CCTCAAACCA ATCTCGTTTT GAAGTTCTTG AAGTTTCTAA CTATTCTTTA 1860 AGTATTAAAA ACGACATCTT AAACAATAAT ATTACGGTTT TTCCTATTCC AACATCTGAC 1920 -103- (对先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 kl B7 五、發明説明（ ATTCTTAATA TAAATTTAAA AAATATGGAG TCTGTTACTG TTGAATTATA CAACTCAATA 1980 GGTCAAAAAA TATTATCAAA AGAAATTAAA CAAGGTGAAA ATACCCTAAA CTTGTCTGGT 2040 ATTTATACAG GAGTTTATTT GTTAAAATTG AACGATGGAC AAAATTCTTA TACAAAAAGA 2100 ATTATTATGA AA 2112 序列编號：9 序列長度：7 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鐽狀 序列種類：胜肽 斷Η型：中間部斷片 序列：
Thr Thr Met Ala Trp lie Lys 1 5 序列編號：l 〇 序列長度：1 8 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鐽狀 序列種類：胜呔 斷Η型：中間部斷H 序列：
Gly Thr Thr Ser lie Asn Asp Gly Glu Glu His His His Ala Val 1 5 10 15
Val Ser Ρρ〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（210X297公釐） -104- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 序列编號：1 1 序列長度：15 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜肽 斷Η型：中間部斷片 序列：
Gly Pro Asn Leu Thr 61y Thr Thr Thr Leu Asn Asp Xaa Gin Thr 15 10 15 序列编號：1 2 序列長度：2 4 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓樸學：直鐽狀 序列種類：胜肽 斷片型：中間部斷片 序列：
Ala Asp lie Met Xaa Gly Xaa Xaa Gly lie Ser Tyr Arg lie Pro 1 5 10 15
Gly Xaa Asp lie Asn Tyr Ser Gly Ser 20 序列編號：1 3 序列長度：1 7 -1 0 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 參衣_ 570979 A7 B7 五、發明説明（Μ) 序列類型：核酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸合成D Μ A 序列： ACNATGGCNT GGATHAA 17 序列編號：1 4 序列長度：1 5 序列類型：核酸 股數：單股 拓樸學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸合成DN A 序列： CATGAAAATA CGTAG 15 序列編號：】5 序列長度：1 5 序列類型：核酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列種類：其他之核酸合成D N A 序列： GATCCTACGT ATTTT 15 序列編號：1 6 序列長度：3 0 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（w) 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：言鏈狀 序列種類：胜呔 序列：
Xxx Pro Ala Gly Tyr Met Met Ser Leu Gin Glu Gly Gly lie Arg 1 5 l〇 15
Ala Tyr Asn Ala Gly Thr Thr Tyr lie Xxx Gly Val Glu lie Gin 2〇 25 . 30 序列編號：1 7 序列長度：2 2 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜呔 序列：
Gly Glu Ala Ser Gin Ser Ser Ser Arg Pro Ser Asp Gly Phe Ala 1 5 . 10 15
Ala Asn Ala lie Asp Gly Asn 20 序列編號：1 8 序列長度：1 9 序列類型：胺基酸 股數：單股 -1 0 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -------i — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 570979 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 拓撲學：盲鐽狀 序列種類：胜肽 序列：
Xxx Tyr Val Thr Val Pro Asp Pro Ser lie Thr Val Asp Ala Gly 1 5 10 15
Gly Val Asn Gly 序列編號：1 9 序列長度：1 8 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜版 序列：
Phe Gly Asn Asn Glu Val Asn Glu lie Gin lie Leu Gly Asn Asn 1 5 10 15
Asn Val Leu * 序列編號：2 0 序列長度：1 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -------— 411^衣— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜肽 序列： -1 0 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（、w)
Tyr Val Glu Gly Cys Thr Val Leu Gly Cys Xxx Xxx Gly Tyr Ser 15 10 15 lie Gly 序列编號：2 1 序列長度：]7 序列類型：核酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸合成D N A 序列： THGGNAAYA AYGARGT 17 序列編號：2 2 序列長度：2 6 序列類型：核酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸合成D N A 序列： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) AAYAAYGARG TNAAYGARAT HCARAT 29 序列编號：2 3 序列長度：6 7 5 序列類型：核酸 股數：單股 拓撲學：直鐽狀 一 109- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 _ 五、發明説明（ 序列種類： 序列： AATAATGAGG TTAATGAAAT TCAGATTTTA GGAAATAACA ATGTTCTTAA AAACTTAAAA 60 CTAGAAGATA TTGGAACAAC AGCTCCTTCT AACAGAGCCC AGTCAATTAT AATGGATGGG 120 CGAGACAATA GAATAGAAGG CTTTCATTTA ACCATTAGAG GATCTTATCC TTATGGATAT 180 GGAGATGCTT TTGGAAAAGG AGGAGGTTCC GTAATTAATC ACCGAAAACA TTCAGGTGTT 240 TTAATAAGAG GATTACGTAA TCACCTAAAA GATTGTACTA TTATTTCTCG TTCTTATGGG 300 CATATAGTAT TTATGCAAGC AGCAAGTTAC CCAACTGTAG AAGGTT6TTA TATTGAAGGT 360 GAAATGCGTT CAACCGATGA TATGTTGGCA GAAGAAGGAA CAGGTTCTCC AGCGGATAAT 420 GTAGATTTTA TGACGGTTTG GGGATATAAG TTACCAGCTG GTTATATGAT GAGTTTACAA 480 GAAGGAGGAA TTAGAGCTTA TGATGCTGGT ACCACTTATA TTGATGGAGA AGTAATCCAA 540 AGAGCAACAG ATAACCCTAC CGTTCTAAAT TGTACCATTA AAAATGCAAG AACAGGAOTG 600 ACTTTAGCAC ATGCTAAAGG AACAAAACAC GTAGAAAATG TTAAGGCTAT TGGGTGTGAG 660 CAAGGATATT CA夕TT 675 -------t-ekII (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 序列编號：2 4 序列長度：1 4 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鐽狀 序列種類：胜呔 序列： His Ser Gly 〜1 Leu 1 5
He Arg Gly Leu Arg Asn His Leu Lys 10 -11 o - f 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 A7 B7 五、發明説明（) 序列编號：2 5 序列長度：1 〇 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜肽 序列：
Leu Asn lie Asn Thr Val Val Leu Thr Lys 1 5 10 序列編號：2 6 序列長度：2 1 序列類型：核酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸合成D N A 序列： GTTCAATAGT AACAGCAAAC C 21 ------1T------AWI (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 酸 7 8 272 核 號度型 编長類 列列列 序序序 成 合 酸 核 之 狀他 鏈其 股直 ： 單：類 : 學種： 數撲列列 股拓序序 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（) CCGGATCCCA AACAACCACA GTATATTC 28 序列编號：2 8 序列長度：2 1 序列類型：核酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸合成D N A 序列： TCCATCAATG GCATTTGCTG C 21 序列編號：2 9 序列長度：1 4 序列類型：胺基酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：胜肽 序列：
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gin Gin Met Gly Arg Gly Ser 1 5 10 序列编號：3 o 序列長度：2 0 序列類型：核酸 股數：單股 拓撲學：直鏈狀 序列種類：其他之核酸合成D N A 序列： ATGTTACCAC TAATACCATC 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T

Claims (1)

  1. 570979 修正 1牛爲 92.9- 30 六、申請專利範圍 第87 1 08300號「編碼具有含岩藻糖硫酸多糖分解活性之 多肽之基因」專利案 (92年9月30日修正本） 六申請專利範圍： 1 · 一種經分離之基因，其係選自具有編碼選自下述具有 含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多肽的DNA序列： ⑴該多肽係組成自下述序列表序列編號1及2任一 所示胺基酸序列之多肽，或該序列中有一或多個胺 基酸序列經缺失、加成、插入、取代至少一種而與 原始序列機能上具同等活性之胺基酸序列，並且具 有分解活性使具下述理化性質之含岩藻糖硫酸多糖 小分子化之多肽； (a) 構成糖：實質上不含糖醛酸， (b) 經由黃桿菌 SA-0082(Flavobacterium sp. SA- 0082) (CCRC第9 1 0069號）所生產之岩藻衣聚糖分 解酵素，實質上不被小分子化； 序列編號· 1 Met Lys lie Arg Asn Val Cys Arg Ser Ala Yal Leu Leu Oly Leu 1 5 10 15 Het Ser Leu Asn Thr Tyr Ala Gk Thr Lys Ala Asp Trp M Gin 20 25 30 570979 ^、申請專利範圍 Gly Asn Trp Gly lie Ser Tjt Arg lie Pro Gly Gly Asp lie Asn 35 40 45 Tyr'Ser Gly Ser His Val Ala Glu Tyr Asn Val Arg Ala Ala Val 50 55 60 Glu β"ΐη lie Ser Ala lie Pro Gly L⑽ Lys Trp Val Gin Ik Asn 65 70 75 Leu Thr Asn Gly Ala Ser Gly Asp Arg Phe He Val Pro Val Tiir 80 85 90 Glu Val Glti Ala lie Asn Pro Leu Ser Ala Pro Aso Ser He Asn 95 100 105 Asp. Leu Tyr Asp Pro Thr Leu Pro 61y Arg Asp Leu Pha Glu Gin 110 115' 1E0 Leu. Ala Leu Ala Phe Lys Ala Lys Gly lie Arg Val Val Ala Tyr 125 130 135 Ue Ala Thr Gin Gly Pro Gly Met Leu Lys His Gly Ala Glu Asn 140 145 ISO Ser Met Asp Glu Asp Asp Ser lie Thr Asp Cys Lys Ser Ser Lys 155 ISO 165 Pro Leu Val Thr Asp Leu Asp Thr Gin Val Tyr Cys Ser Ak Asn 170 175 180 Met Asn Arg Trp Arg Asp Tyr ?al Leu Glu Gin Tyr Pro Ser Thr 185 190 1S5
    570979 t、申請專利範圍 Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Glu Leu Ala Met Val Asn He Val Glu 200 205 210 Thr Leu Ser Leu Arg Tyr Gly Ser Thr He Asp Gly Trp Trp Phe 215 ZZ〇 225 Asp His Ser Gly Phe Gly Asp Ser Glu Leu Ley His Ala Ala Ala 230 235 240 Leu Ala Gly A$n Asn Asp Ala Ala Val Ala Phe hm Glu Gly Asp 245 250 £55 Lys Val Pro Leu Val Asn Asn Pro Glu Thr leu Asp Asp Tyr Thr 260 265 270 Phe Gly His Pro Thr Pro lie Gly Ser Glu Val Ser Ser Asp Asp 275 E80 2S5 Lys Asn Leu Pro Met Leu Thr Ser Ik Glu Ala Thr Leu Asp Gly 290 295 3⑽ lie Leu Thr Gly Ser Gly Asp Asp M Gly Ser VaKGly His Met 305 310 315 Phe Met Pro Lsu Gin Glu Ser Trp Asn Gly Gly Thr Val Val Phe 320 325 330 Ser Glu Ala lys Gly Ser Asp Trp Leu Asn A..rg Ala Leu. Lys Ala 335 340 346 Gly Gly Ala Phe Thr Trp Ala hm Ser Gin Asp Ser Asn Asp Glu 350 355 360
    570979 A8 B8 C8 _____ D8 7T、申M專利範圍 Leu Gly Gly Gly Gly Ala Arg Leu lie Ser Glu Pro Gin Val Lys 365 370 375 Met Leu Glu Arg Met Ser Phe Asn lie Gly Lys Gin Leu His Met 380 385 390 Asn Leu Asp Gly Ser Asp Gly Asp Thr Ala Tyr Asp Asp Ser Val 395 400 405 Asn Gin Tyr Thr Ala Thr Val Asn Gly Ala Asn Phe Val Asp Asp 410 415 420 Val Thr Arg Gly Lys Val Ala Ser Phe Thr Glu Asp Asp Gin Leu 4Z5 430 435 Glu Leu Asp Asn Tyr Gin Gly lie Ser Gly Gly Asn Ala Arg Thr 440 445 450 Thr Met Ala Trp lie Lys Thr Ser Asp Ser Lys Gly Asp lie lie 455 460 465 Asp Trp Gly Asn Asn Thr Thr Ser Glu Arg Trp Trp Leu Arg Leu 470 475 480 Val Asp Gly Lys Phe Lys Leu lie Leu Lys Gly Pro Asn Leu Thr 485 490 495 Gly Thr Thr Thr Leu Asn Asp Asp Gin Trp His His lie Ala Val 500 505 510 Val Ala Ser Asp Asn Val Val Ala Asn lie Lys Val Tyr lie Asp 515 520 525 Gly Val Leu Glu Thr Val Ala Val Asn Asp Asn Ala Ser Thr Thr 530 535 540 Phe Asp Thr Thr Leu Gly Gly Asn lie Gin lie Gly Gly Ala Tyr 545 550 555 Thr Gly Leu lie Asp Lys Val Leu Val His Asp Arg Ala Leu Asp 560 565 570 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填頁) 、言. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570979 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 ' Glu Ser Glu lie Glu Tyr Val Val Asn Ser Ser Asn Ala Asp Leu 575 580 585 Asp Leu Glu Val Ala Leu Asp Val Arg Phe Glu Glu Ser Ala Asn 590 595 600 Ser Thr Lys Val Thr Asp Asn Ser lie Tyr Gly Arg His Gly Thr 605 610 615 Asn Arg Gly Ala lie Thr Gly Val Phe Asp Ala Glu Arg Asn Ser 620 625 630 Asn Val Tyr Ser Leu Asp Gly Val Asp Ser Gly Glu Asp lie Asn 635 640 645 Asp Leu Lys Asp Ser Asp Tyr Glu His Glu Val Val Met Thr Thr 650 655 660 Asp Asn Ser Lys Asp Ser Lys Gly Tyr Ser Gly Val Asn Gly Ala 665 670 675 Gly Pro Arg Thr Val Met Ala Trp lie Lys Thr Thr Phe Gly Gly 680 685 690 Ala Val lie Ala Gin Trp Gly Asn Lys Asn Ser Val Asp Gly Glu 695 700 705 Gin Tyr Glu Val Arg Leu Lys Asn Gly Ala Leu Arg Leu Asp lie 710 715 720 Thr Gly Gly lie lie Lys Gly Thr Thr Ser lie Asn Asp Gly Glu 725 730 735 Trp. His His lie Ala Val Val Ser Pro Asp Glu Gin Leu Ala Asn 740 745 750 Thr Lys Leu Tyr Val Asp Gly Val Leu Glu Thr Ala Thr Thr Ser 755 760 765 Gly Ser Gin Ala Thr lie Asp Thr Lys Thr Leu Asn Gly Asp Ser 770 775 780 請 先 閱 讀 背 冬 Ϊ 事 項 再 訂 I線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ29<7公釐） 570979 8 8 8 8 ABCD 六 ^經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 申請專利範圍 Lys Asp Val lie He Gly Ser Thr Phe Val Gly Glu Met Asp Asp 785 79.0 795 Phe lie lie His Gin Arg Ala Leu Arg Gin Phe Glu Val Lys Asn 800 805 810 Ser Ala Gly Leu 序列編號：2 Met Lys He Arg Asn Met Cys Cys Thr Ala Leu He Val Ser Leu 1 5 l〇 15 Met Gly Cys Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Ser Ser Pro Glu Val 20 25 30 Glu Val Asp Asn Gly Val Glu lie Gin Pro Glu Pro Glu Val Glu 35 40 45 Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro 50 55 60 Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu 65 70 75 Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Asp lie Arg Ala Ser 80 85 90 Trp Met Gin Gly Asn Trp Gly He Ser Phe Arg lie Ser Gly Gly 95 100 105 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570979 ABCD 申請專利範圍 Asp lie Ser Gin Asn Glu Ser His Val Asn Glu Tyr Gin Val Ala 110 115 120 Pro Ala Val Glu Gin lie Ala Ala lie Pro Gly Leu Lys Trp Leu 1Z5 130 135 Gin Val Asn Leu Ser Asn Gly Ala Phe Gly Asp Arg Phe lie Val 140 145 150 Pro Val Pro Glu Val Glu Ala lie Asn Pro Asn Ser Ala Pro Asn 155 160 165 Ser Ser Ala Asp Leu Phe Asp Pro Ala Leu Pro Gly Asp Asp Leu 170 175 180 Phe Glu Gin lie Ala Leu Gly Leu Gin Ala Lys Gly lie Lys Val 185 190 195 Val Ala Tyr lie Ala Thr Gin Gly Pro Ala Met Leu Lys His Gly 200 205 210 Ala Glu Arg Ser Met Asp Phe Asp Asp Ser lie Val Asp Glu Ser 215 220 225 Asp Gly Ser Ala Cys Lys Ser Ser Arg Pro Val Val Ser Asp Pro 230 235 240 Asp Thr Gin Val Tyr Cys Ser Ala Asn Met Asn Arg Trp Arg Asp 245 250 255 Tyr Val Leu Gin Gin Tyr Pro Ser Thr Ser Leu His His Ser Phe 260 265 270 Gin Leu Gly Leu Val Asn lie Val Glu Thr Leu Ser Leu Arg Tyr 275 280 285 Gly Thr Leu lie Asp Gly Trp Trp Phe Asp His Ser lie Tyr Gly 290 ' 295 300 Asp Tyr Asn Leu Leu Pro Asp Ala Ala Arg Ala Gly Asn Ser Asn 305 310 315 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再
    經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570979 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Ala Ala Val Ser Leu Asn Leu Glu Gly Asp lie Phe Leu Ser Asn 320 325 330 Asn Pro Glu Val Met Glu Asp Phe Thr Gly Gly His Pro Thr Pro 335 340 345 lie Ala Arg Val Val Ser Ser Asp Asp Thr Asn Leu Pro Met Leu 350 355 360 Thr Ala lie Glu Asp Ala Pro Asn Gly lie Phe Thr Gly Thr Gly 365 370 375 Asp Asp Val Asp Ala Leu Gly His Met Phe Leu Pro Leu Gin Glu 380 385 390 Thr Trp Asn Gly Gly Thr Val Val Phe Ser Glu Ala Lys Gly Thr 395 400 405 Glu Trp Leu Asn Arg Val Thr Arg Ala Gly Gly Ala Leu Thr Trp 410 415 420 Ala Leu Ser His Glu Gly Ser Val Ser Gly Gly Glu Ala Met Leu 425 430 435 lie Ser Ala Pro Gin Ala Lys Met Leu Ala Arg Met Gin Leu Asn 440 445 450 lie Gly Lys Gin Leu Asp Met Asp Leu Asp Gly Ala Asp Gly Ala 455 460 465 Thr Ala Tyr Asp Asp Ser Val Asn Gin His Thr Ala Thr Val Thr 470 475 480 Gly Ala Thr Phe lie Asp Asp Val Thr Arg Glu Lys Val Ala Ser 485 490 495 Phe Thr Glu Thr Asp Leu lie Thr Leu Asn Asn Phe Thr Gly lie 500 505 510 Leu Gly Glu Ser Ala Arg Thr Thr Met Ala Trp lie Lys Thr Ser 515 520 525 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐）
    570979 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Asp Ser Asn Ala Asp Val lie Gin Trp Gly Lys Gin Glu Thr Ser 530 535 540 Glu Ala Trp Tyr Val Gly Leu Asp Asn Gly lie Leu Gin Leu Asn 545 550 555 lie Gin Gly Ser Thr Val lie Gly Ala Ser Val Leu Asn Asp Asp 560 565 570 Ser Trp His His lie Ala Val lie Ala Pro Asp Asn Ser lie Ala 575 580 585 Asn Thr Gin Val Tyr lie Asp Gly Val Leu Glu Thr Leu Thr Val 590 595 600 Asn Asp Gly Gly Ser Ser Thr Phe Asn Thr Val Ala Asp Thr Asn 605 610 615 Val Val lie Gly Gly Glu Phe Thr Gly Leu lie Asp Lys Thr Val 620 625 630 Val Tyr Asn Arg Ala Leu Glu Glu Ser Glu lie Asp Tyr lie Val 635 640 645 Asn Ser Ala Asp Ala Asp lie Asp Leu Gly lie Ser Leu Asp Val 650 655 660 Arg Phe Asp Glu Asp Ala Asn Ala Thr Thr Val Ala Asp Asn Ser 665 670 675 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Ala Tyr Glu Arg Ser Gly lie Asn Arg Gly Ala lie Thr Gly Val 680 685 690 Phe Asp Ala Thr Arg Asn Ser Asn Val Tyr Ser Leu Asp Gly Val 695 700 705 Asp Ser Gly Glu Asp Leu Asp Asp Leu lie Asp Ser Asp Tyr Glu 710 715 720 His Gin lie Val Met Thr Thr Asn Asn Lys Arg Asp Asn Lys Gly 725 730 735 _____ _9_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) a4規格（210X297公釐） 570979 t、申請專利範圍 Tyr Ser Gly Val Asn Gly Gly Asp Pro Arg Thr Val Met Ala Trp 740 745 750 lie Lys Thr Thr Phe Gly Gly Ala Val lie Ala Gin Trp Gly Asn 755 760 765 Lys Asp Ser Val Asp Gly Glu Gin Tyr Glu Val Arg Leu Lys Asn 770 775 780 Gly Glu Leu Arg Val Asp lie Thr Gly Gly Leu lie Lys Gly Thr 785 790 795 Thr Leu lie Asn Asp Gly Glu Trp His His lie Ala Val Val Ser 800 805 810 Pro Asp Asp Gin Leu Ala Asn Thr Lys Leu Tyr Val Asp Gly Val 815 820 825 Leu Glu Thr Thr Thr Thr Ser Gly Ser Gin Thr Thr lie Asp Thr 830 835 840 Leu Thr Leu Asn Gly Asp Ser Lys Asp Val lie He Gly Ser Thr 845 850 855 Phe Val Gly Glu Met Asp Asn Phe Val lie His Gin Arg Ala Leu 860 865 870 Lys Gin Phe Glu Val Lys Val Ala Ala Gly lie 875 880 10- 570979 ^、申請專利範圍 ⑵該多肽係組成自下述序列表序列編號3及4任一所 示胺基酸序列之多肽，或該序列中有一或多個胺基 酸序列經缺失、加成、插入、取代至少一種而與原 始序列機能上具同等活性之胺基酸序列，並且作用 於具下述理化性質之含岩藻糖硫酸多糖，使該含岩 藻糖硫酸多糖小分子化而游離出至少一種選自下述 式[I]、[II]、[III]及[IV]之化合物及多肽； (c) 構成糖：包含糖醛酸， (d) 經由黃桿菌 SA-0082(Flavobacterium sp. SA- 0082 )( CCRC第910069號）所生產之岩藻衣聚糖分 解酵素而被分解； -11- 570979 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 序列編號3 Met lie Lys Lys Tyr Asn Leu lie Lys Thr Gly Val lie Thr Phe 15 10 15 Leu Val Leu Phe Phe Gin Gin Thr Tyr Ala Gin Thr Thr Thr Val 20 25 30 Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Pro Tyr Leu Lys Gin Asp Asn Val 35 40 45 Asp Val Lys Leu Ala Pro Gly Thr Tyr Asn Val Asn Gly Phe Asp 50 55 60 Val Gly Glu Asp Arg Leu Phe Ser Thr Thr Pro Leu Phe Leu Phe 65 70 75 Glu Gly Ser Asn Ser Thr Tyr Asp Phe Thr Asp Val Lys Leu Asn 80 85 90 He Asn Thr Val Val Leu Thr Lys Phe Gly Asn Asn Glu Val Asn 95 100 105 Glu lie Gin lie Leu Gly Asn Asn Asn Val Leu Lys Asn Leu Lys 110 115 120 Leu Glu Asp He Gly Thr Thr Ala Pro Ser Asn Arg Ala Gin Ser 125 130 135 He Val lie Asp Gly Arg Asp Asn Arg lie Glu Gly Phe His Leu 140 145 150 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Thr He Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Gly Tyr Gly Asp Ala Phe Gly 155 160 165 Lys Gly Gly Gly Ser Val lie Asn His Arg Lys His Ser Gly Val 170 175 180 lie Arg Gly Leu Arg Asn His Leu Lys Asp Cys Thr lie lie 185 190 195 Arg Ser Tyr Gly His lie Val Phe Met Gin Ala Ala Ser Tyr 200 205 210 -12- 本纸張尺度— -—— 豕標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Pro Thr Val Glu Gly Cys Tyr Lie Glu Gly. Glu Met Arg Ser Thr 215 220 225 Asp Asp Met Leu Ala Glu Glu Gly Thr Gly Ser Pro Ala Asp Lys 230 235 240 Val Asp Phe Met Thr Val Trp Gly Tyr Lys Leu Pro Ala Gly Tyr 245 250 255 Met Met Ser Leu Gin Glu Gly Gly lie Arg Ala Tyr Asn Ala Gly 260 265 270 Thr Thr Tyr lie Asp Gly Val Glu lie Gin Arg Ala Thr Asp Asn 275 280 285 Pro Thr Val Leu Asn Cys Thr lie Lys Asn Ala Arg Thr Gly Val 290 295 300 Thr Leu Ala His Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Val Glu Gly Cys Thr 305 310 315 Val Leu Gly Cys Glu Asn Gly Tyr Ser lie Gly Ser Gly Thr Val 320 325 330 Val Asn Cys Gly Ala Asp Ala lie Tyr Gly Pro Val·Phe Lys Asn 335 340 345 Thr Tyr Gly Ser Asp Lys Gly Tyr Asn Ala Asp lie Thr lie Leu 350 355 360 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ~ Pro Pro Ser Asp Ala Tyr Tyr Asn Gly His Asp Ala Val Ala Tyr 365 370 375 lie Gly Gly Ser Asn His Asn Leu Thr Phe Arg Ser Glu lie Thr 380 385 390 Glu lie Pro Ser Asn Leu Lys lie Met Val Ser Gly Asp Leu Gin 395 400 405 Gly Leu Arg Val Leu His Gly Ser Asn Pro Ser Gin Asn Asn Phe 410 415 420 .-13- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：Z97公釐） ABCD 570979 六、申請專利範圍 ' Ala Gly Thr Asn lie Val Leu Arg Asn Leu Thr Asn Phe Pro Val 425 430 435 Asp Leu His Ser Asp Ser Ser Asn lie Thr Val Thr Ser Cys Asp 440 445 450 Thr Asp Asn lie Thr Asp Asn Gly Thr Asn Asn Ser lie Glu Ala 455 460 465 lie Asp Cys Asp Ser Asp Asn Leu Ala Leu Lys Gly Glu Ala Ser 470 475 480 Gin Ser Ser Ser Arg Pro Ser Asp Gly Phe Ala Ala Asn Ala lie 485 490 495 Asp Gly Asn Thr Asn Gly Ala Trp Ser Asn Asn Ser Val Ser His 500 505 510 Thr Gly Thr Glu Glu Asn Pro Trp Trp Gin Val Asp Leu Gly Thr 515 520 525 Asp Ala lie lie Gly Ser lie Asn lie Phe Asn Arg Thr Asp Gly 530 535 540 Cys Cys Lys Gly Arg Leu Asp Asn Phe Thr Val Tyr Val lie Asp 545 550 555 Lys Asp Asp Lys Val Thr Phe Ser Lys Thr Tyr Val Thr Val Pro 560 565 570 Asp Pro Ser lie Thr Val Asp Ala Gly Gly Val Asn Gly Lys lie 575 580 585 Val Lys lie Val Leu Asn Asn Ser Ser Gin Ala Leu Ala Leu Ala 590 595 600 Glu Val Glu Val Tyr Gly Thr Ser Leu Ser Asn Lys Glu Thr lie 605 610 615 Lys Asn Pro He His Phe Tyr Pro Asn Pro Val Glu Asp Glu Val 620 625 630 -14~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請 A 閱 讀 背 之 注 意 項 再
    經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ABCD 570979 六、申請專利範圍 Thr lie Ser Leu Glu Ser Ala Asp Leu Asn Leu Asn Glu Thr Arg 635 640 645 Val Val lie Tyr Asn lie Lys Gly Gin Lys lie Leu Glu Thr Thr 650 655 660 Pro Ser Asn Ser Thr Glu Val Asn Leu Asn Leu Ser His Leu Pro 665 670 675 Thr Gly Val Tyr Leu lie Arg Val Ser Asp Gin Asn Lys Asn lie 680 685 690
    lie Asn Lys lie Val Lys Leu 695 序列編號：4 訂 Met Lys Lys Tyr Ser lie Leu Lys lie Gly lie lie Ala Val lie 15 10 15 Met Leu Phe Val-Gin Gin Ser Tyr Ala Gin Thr Thr Thr Val Tyr 20 25 30 Ser Leu Glu Asp Leu Leu Pro Tyr Leu Lys Gin Asp Asn Val Asp 35 40 45 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Val Lys Leu Ala Pro Gly Thr Tyr Asn lie Asn Ala Phe Asp lie 50 55 60 Thr Gin Gly Lys Phe Ser Asn Pro Leu Phe Leu Phe Glu Gly Ser 65 70 75 I - Asn Asn Thr Phe Asp Phe Thr Asp Val Lys lie Asn lie Asn Thr 80 85 90 Leu Val Leu Thr Lys Phe Gly Asn Asn Glu Val Asn Glu lie Gin 95 100 105 -15 — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2〗0X 297公釐） 570979 ABCD 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 、申請專利範圍 lie Leu Gly Asn Asn Asn Val Leu Lys Asn Leu Lys Leu Glu Asp 110 115 120 lie Gly Thr Thr Ala Pro Ser Asn Arg Ala Gin Ser lie lie Met 125 130 135 Asp Gly Arg Asp Asn Arg lie Glu Gly Phe His Leu Thr lie Arg 140 145 150 Gly Ser Tyr Pro Tyr Gly Tyr Gly Asp Ala Phe Gly Lys Gly Gly 155 160 165 Gly Ser Val lie Asn His Arg Lys His Ser Gly Val Leu lie Arg 170 175 180 Gly Leu Arg Asn His Leu Lys Asp Cys Thr lie lie Ser Arg Ser 185 190 195 Tyr Gly His lie Val Phe Met Gin Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val 200 205 210 Glu Gly Cys Tyr lie Glu Gly Glu Met Arg Ser Thr Asp Asp Met 215 220 225 Leu Ala Glu Glu Gly Thr Gly Ser Pro Ala Asp Asn Val Asp Phe 230 235 240 Met Thr Val Trp Gly Tyr Lys Leu Pro Ala Gly Tyr Met Met Ser 245 250 255 Leu Gin Glu Gly Gly lie Arg Ala Tyr Asp Ala Gly Thr Thr Tyr 260 265 270 lie Asp Gly Glu Val lie Gin Arg Ala Thr Asp Asn Pro Thr Val 275 280 285 -16- 本纸張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -裝· 訂 線 570979 ABCD 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 Leu Asn Cys Thr lie Lys Asn Ala Arg Thr Gly Val Thr Leu Ala 290 295 300 His Ala Lys Gly Thr Lys His Val Glu Asn Val Lys Ala lie Gly 305 310 315 Cys Glu Gin Gly Tyr Ser lie Gly Ser Gly Thr Val Ser Asn Cys 320 325 330 Ser Gly Asp Ala Gin Tyr Gly Pro Leu Leu Ser Phe Ala Tyr Ser 335 340 345 Ser Asp Lys Asn Thr Asn lie Asp lie Glu Val Leu Pro Ala Glu 350 355 360 Asn Tyr Tyr Asn Gly Ser Glu Thr Ala Ala Tyr Val Gly Gly His 365 370 375 Ser His Asn lie Thr Leu Arg Gly Gly Asp Pro Asn Ala Asp Leu 380 385 390 Arg Val Gin Val Gly Gly Glu Lys Asn Asn Val Arg Leu Leu Gly 395 400 405 Val Thr Ser Asn Gin Asn Pro Leu Ser Ala Ser Asn Leu Glu Leu 410 415 420 Asn Asn Leu Thr Asn Phe Pro Val Val Leu Asp Glu Met Ser Ser 425 430 435 Asn lie lie Val Glu Ser Cys Gly Glu Val Thr Asn Asn Gly Ser 440 445 450 Asn Asn Ser lie Thr Asp Cys Pro Asp Gly Pro lie Ser Phe Pro 455 460 465 Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Arg Leu Gly Asn Asn Arg Phe Thr Phe 470 475 480 Trp Val Ala Ala Asn Gly Gly Asp His Ala Tyr Ser lie Lys Tyr 485 490 495 ____-17- _；__ 本纸張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項^:^^本頁) •裝· '1T 線 570979 ABCD 經濟部中央操準局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 Asn Asp Gly \\e ger Gly Asn lie Asn Asp Tyr Glu Asp Leu Phe 500 505 510 Pro Glu Gly Glu Glu Ser Phe Trp Val Phe Thr Pro Val Glu Gly 515 520 525 Arg Asp Gly Tyr Phe Phe Val Asp Cys Val Gly Gly Gly Asp Lys 530 535 540 Gin Arg Leu Ser Ala Thr Thr Asp Ser Gly Leu Pro Val Met Val 545 550 555 Ser Lys Thr lie Thr Ser Ala Ser Val Gin Trp Ser Val Val Gin 560 565 570 Pro Glu Gly Arg Asp Thr Phe His lie Thr Asn Asp Tyr Ala Arg 575 580 585 Met Val Gly Ala Asn Thr Thr Thr Asn Gin Thr lie Leu Ser Thr 590 595 600 Val Gly Asn Thr Ser Asn Gin Ser Arg Phe Glu Val Leu Glu Val 605 610 615 Ser Asn Tyr Ser Leu Ser lie Lys Asn Asp lie Leu Asn Asn Asn 620 625 630 lie Thr Val Phe Pro lie Pro Thr Ser Asp lie Leu Asn lie Asn 635 640 645 Leu Lys Asn Met Glu Ser Val Thr Val Glu Leu Tyr Asn Ser lie 650 655 660 Gly Gin Lys lie Leu Ser Lys Glu lie Lys Gin Gly Glu Asn Thr 665 670 675 Leu Asn Leu Ser Gly lie Tyr Thr Gly Val Tyr Leu Leu Lys Leu 680 685 690 Asn Asp Gly Gin Asn Ser Tyr Thr Lys Arg lie lie Met Lys 695 700 -1 8 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -裝. 訂- 線 570979 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
    570979 t、申請專利範圍 -〇
    〇 II C-OH
    CIIO
    OH • 〔IV〕
    OH OH -20- 570979 六、申請專利範圍 以及具有下述序列表序列編號5至8中任一所不之 DNA序列，或具有DNA序列可在6xSSC、1%SDS、100 #g/ml鮭魚精子DNA、5x丹哈氏溶液（5xDenhardt’s solu t 1〇n)、65t之嚴格條件下雜交到具有下述序列 表序列編號5至8中任一所示之DNA序列； 序列編號：5 ATGAAAATAC GTAATGTTTG TCGTAGTGCG GTGCTTTTAG GCTTGATGTC TTTAAATACA 60 TACGCAGAAA CAAMGCTGA TTGGATGCAA GGTAACTGGG GGATCAGTTA TCGAATACCT 120 GGAGGAGATA TTAATTACTC AGGTAGTCAT GTTGCAGAAT ACAATGTAAG AGCCGCAGTT 180 GAACAAATCT CAGCAATTCC TGGTTTGAAG TGGGTACAAA TTAATTTAAC CAACGGTGCA 240 TCTGGTGATC GTTTTATAGT CCCTGTAACA GAAGTTGAAG CCATTAATCC TTTATCCGCT 300 CCTAACAGTA TTAATGACTT ATACGATCCT ACTTTACCTG GGCGAGATCT TTTTGAGCAA 360 CTGGCATTAG CCTTCAAAGC TAAAGGCATA AGAGTTGTTG CTTATATTGC GACTCAAGGG 420 CCTGGCATGC TCAAGCATGG TGCTGAAAAC TCGATGGATG AAGATGACTC CATTACTGAC 480 TGTAAATCGT CTAAGCCATT AGTAACCGAT CTTGATACAC AAGTTTACTG TTCAGCAAAT 540 ATGAATCGCT GGAGAGATTA CGTTTTAGAA CAATACCCAT CAACCAGTCT TTATAGAAGT 600 TTTGAATTGG CAATGGTCAA TATTGTAGAA ACATTATCAC TGCGTTATGG AAGTACAATT 660 GATGGCTGGT. GGTTTGATCA TTCAGGTTTT GGTGACAGTG AATTACTTCA TGCTGCGGCT 720 CTAGCTGGAA ATAATGATGC GGCAGTAGCC TTTAATGAAG GCGATAAAGT TCCTTTGGTA 780 AATAACCCAG AGACATTAGA CGATTACACC TTTGGTCATC CAACACCTAT AGGTAGTGAG 840 GTTTCTTCTG ATGATAAAM CCTACCTATG TTAACGTCTA TAGAAGCTAC TTTAGATGGT 900 ATTTTAACTG GTTCAGGTGA TGATGTAGGC TCTGTGGGAC ATATGTTTAT GCCACTTCAA 960 GAAAGTTGGA ATGGTGGCAC TGTTGTATTT TCTGMGCGA AAGGATCTGA CTGGCTTAAT 10Z0 CGAGCATTAA AAGCCGGAGG TGCATTTACA TGGGCACTAA GCCAAGACAG TAATGATGAG 1080 -21 - 570979 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 TTAGGTGGTG GCGGAGCAAG ATTAATTTCA GAACCGCAGG TAAAAATGCT TGAACGTATG 1140 AGTTTTAATA TAGGTAAACA ATTACATATG AATCTAGATG GTTCAGATGG TGATACTGCT 1200 TATGATGACT CCGTCAACCA ATATACCGCT ACTGTAMCG GTGCTAATTT TGTTGATGAT 1260 GTTACAAGAG GAAAAGTTGC AAGTTTTACT GAAGACGACC AGTTAGAACT AGACAATTAT 1320 CAAGGTATTT CAGGTGGAAA TGCGCGTACA ACCAT-GGCTT GGATAAAAAC TTCAGACAGC 1380 AAAGGCGATA TTATTGATTG GGGTAATAAC ACAACAAGCG AACGTTGGTG GTTACGTTTA 1440 GTTGACGGTA AATTTAAACT GATATTAAAA GGTCCTAATC TTACAGGAAC TACAACACTT 1500 ：AATGACGACC AATGGCACCA TATTGCTGTT GTAGCTTCTG ATAACGTAGT TGCTAATATC 1560 AAAGTATACA TTGATGGTGT TTTAGAAACT GTTGCTGTAA ATGACAATGC TTCAACTACC 1620 TTCGATACAA CCTTAGGTGG CAATATACAA ATAGGTGGGG CCTACACCGG ACTTATC-GAT 1680 AAAGTGCTTG TGCATGATAG AGCATTAGAT GAAAGCGAGA TTGAGTATGT TGTTAATTCA 1740 I TCCAATGCTG ATCTTGATTT AGAGGTTGCA TTAGATGTGC GTTTTGAAGA GTCAGCAAAC 1800 ί TCAACTAAAG TMCCGATAA TTCTATATAT GGACGTCATG GCACAAATCG AGGTGCTATT 1860 I · · · ί ACTGGCGTGT TTGATGCAGA ACGTAACAGC AATGTGTACT CACTTGATGG TGTTGATAGT 1920 I · ；GGCGAAGATA TAAATGATTT AAAAGATAGC GACTACGAAC ATGAAGTTGT AATGACAACA 1980 :GATAATTCTA AAGACTCAAA AGGTTATAGT GGAGTTAATG GTGCAGGTCC GCGTACTGTA 2040 ATGGCATGGA TAAAAACAAC TTTTGGCGGT GCTGTTATTG CCCAATGGGG ΤΑΑΤΑΑΑΑΑΤ 2100 TCAGTTGATG GCGAACAATA TGAAGTTCGT TTAAAAAATG GTGCACTGAG ATTAGATATT 2160 ACAGGTGGCA TTATTAAAGG CACAACATCA ATTAATGATG GCGAGTGGCA TCATATTGCT 2220 GTGGTTTCAC CTGATGAACA GTTAGCTAAT ACTAAATTGT ATGTTGATGG TGTACTAGAA Ζ280 ACAGCAACCA CTTCGGGTTC TCAAGCAACG ATTGATACTA AAACTCTTAA TGGCGATAGC 2340 AAAGACGTAA TAATTGGTAG TACGTTTGTT GGCGAGATGG ACGATTTTAT TATTCATCAA 2400 CGCGCTTTAA GACAGTTTGA AGTGAAAAAC TCAGCAGGAC TC 2442 -22- 本紙張尺度適用中國國家禚準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) b 、言· I 570979 A8 B8 C8 - D8 六、申請專利範圍 序列編號：6 ATGAAAATAC GTAATATGTG TTGTACTGCT TTAATCGTAA GTTTAATGGG CTGCGGTGGT 60 TCTGGTTCAG AAGCTAGTTC TCCTGMGTA GAAGTTGATA ATGGAGTAGA AATTCAACCT 120 GAACCAGAAG TTGAACCTGA GCCAGAAGTT GAACCTGAAC CAGAAGTTGA ACCTGAACCA 180 GAAGTTGAAC CTGAACCAGA AGTTGAACCT .GAGCCAGAAG TTGAGCCTGA. ACCAGAAGTT 240 GAACCTGAAC CAGAAGATAT AAGAGCCTCA TGGATGCAAG GTAACTGGGG AATCAGCTTC 300 AGMTTTCTG GTGGTGACAT CAGTCAAAAT GAAAGTCATG TAAATGAATA CCAAGTAGCA 360 CCAGCTGTTG AGCAAATAGC CGCAATTCCT GGATTAAAGT GGTTACAAGT TAATTTAAGT 420 AACGGGGCTT TTGGCGACCG TTTTATTGTA CCTGTACCTG AAGTAGAAGC TATTAATCCA 480 AATTCAGCGG CAAACAGCTC GGCAGATTTA TTTGATCCTG CATTACCTGG CGATGACTTA 540 TTTGAACAM TAGCACTAGG ACTTCAAGCC AAAGGCATAA AAGTAGTAGC ATATATTGCG 600 ACTCAAGGTC CTGCAATGCT GAAACATGGC GCAGAMGAT CGATGGATTT TGATGATTCT 660 ATTGTTGATG AATCAGATGG CAGTGCTTGT AAATCTTCAA GACCTGTCGT TTCTGATCCT 720 GATACGCAAG TTTATTGTTC AGCAAATATG AATCGCTGGA GAGATTATGT GTTACAGCAA 780 TACCCATCAA CAAGTTTGCA TCATAGTTTT CAATTGGGAC TCGTCAATAT TGTAGAAACT 840 TTATCACTAC GTTACGGCAC TCTGATTGAT GGTTGGTGGT TTGATCATTC TATTTACGGT 900 GACTACAACT TACTTCCTGA TGCTGCAAGA GCGGGAAATA GCAATGCTGC GGTTTCTCTT 960 AATTTAGAAG GGGATATTTT CTTAAGTAAT AACCCAGAAG TGATGGAGGA TTTTACCGGC 1020 GGACATCCM CACCGATTGC TCGAGTTGTT TCATCTGATG ATACCAATTT ACCCATGTTA 1080 ACGGCTATAG AAGATGCTCC AAACGGTATT TTTACAGGAA CAGGTGATGA TGTAGATGCT 1140 TTAGGGCACA TGTTTTTACC GCTGCAAGAA ACCTGGAATG GCGGAACTGT AGTATTTTCA 1200 GAAGCCAAAG GAACTGAGTG GCTTAACAGA GTTACTCGAG CTGGCGGCGC ATTAACTTGG 1260 GCATTAAGCC ATGAAGGCAG TGTTTCTGGT GGTGAGGCTA TGTTGATTTC TGCACCACAA 1320 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 、τ* 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製’ ABCD 570979 六、申請專利範圍 GCAAAAATGC TTGCACGTAT GCAGCTAMT ATTGGTMAC AACTCGATAT GGATTTAGAT 1380 GGTGCCGATG GCGCTACGGC TTATGATGAT TCTGTCAATC AACATACAGC TACGGTTACA 1440 GGTGCGACAT TTATAGATGA TGTTACTCGT GAAAAAGTGG CAAGCTTTAC TGMACAGAT 1500 .CTGATTACGT TAAACAATTT TACTGGTATT TTAGGCGAAA GTGCTCGTAC AACAATGGCT 1560 ；TGGATAAAAA CATCAGACAG TAACGCAGAT GTTATTCAAT GGGGTAAACA AGAGACGAGT 1620 :GAAGCTTGGT ATGTGGGCTT AGACAATGGA ATACTTCAAT TAAATATTCA AGGTTCTACG 1680 I I GTTATTGGCG CAAGTGTACT TAACGATGAT AGTTGGCATC ATATTGCTGT TATCGCGCCT 1740 ! . GATAATTCAA TTGCCAATAC TCAAGTCTAT ATCGATGGTG TTTTAGAAAC ACTTACCGTG 1800 AATGATGGTG GTTCATCTAC ATTTAATACA GTGGCAGACA CCAACGTTGT AATAGGAGGA 1860 GAGTTTACTG GCCTTATAGA TAAAACCGTT GTGTATMCA GAGCATTAGA AGAAAGCGAG 1920 ATTGATTATA TTGTTAATTC AGCTGACGCA GATATTGATT TAGGTATTTC ACTTGATGTG 1980 AGGTTTGATG MGATGCTAA TGCAACAACA GTAGCTGATA ATTCTGCCTA TGAACGTTCA 2040 GGTATAAATC GAGGTGCCAT TACGGGCGTT TTTGATGCAA CACGTAACAG CAATGTTTAT 2100 TCACTTGATG GTGTTGATAG CGGCGAAGAT CTAGATGATT TAATAGATAG TGATTATGAG 2160 CATCAMTTG TTATGACAAC CAATAACAAA AGAGATAACA AAGGTTATAG TGGCGTGAAT 2220 GGCGGTGATC CTCGAACTGT TATGGCATGG ATAAAAACAA CCTTTGGTGG TGCTGTTATT 2280 GCTCAATGGG GTAATAAAGA TTCAGTCGAT GGCGAACAAT ATGAAGTGCG CTTGAAAMT 2340 GGCGAACTTA GAGTCGATAT CACTGGCGGG CTTATTAAAG GAACAACATT AATAAACGAT 2400 GGCGAATGGC ATCATATTGC TGTTGTATCT CCTGATGATC AATTAGCTAA CACTAAACTT 2460 TATGTTGATG GTGTTCTAGA AACGACCACC ACCTCCGGCT CTCAAACAAC AATAGATACG 2520 TTAACCCTTA ACGGTGACAG CAAAGACGTA ATCATTGGAA GTACTTTTGT TGGCGAGATG 2580 GATAACTTTG TTATTCATCA ACGTGCTTTA AAACAATTTG AAGTAAAAGT CGCCGCAGGT 2640 ATT. 2643 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) —裝· 太 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570979 ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製· 六、申請專利範圍 序列編號：7 ATGATAAAAA AATACAATTT AATTAAAACA GGAGTTATTA CATTTCTAGT TTTGTTTTTT 60 CAGCAAACTT ACGCACAAAC AACCACAGTA TATTCTTTAG AAGACTTACT ACCCTATTTA 120 AAACAGGATA ATGTAGATGT TAAATTAGCC CCAGGAACTT ATAATGTTAA TGGTTTTGAT 180 ；GTAGGTGAAG ACAGGTTGTT TTCCACTACT CCACTTTTTT TGTTTGAAGG GTCTAACAGT 240 ；ACTTATGACT TTACAGATGT AAAGCTTAAC ATCAATACGG TTGTGTTAAC CAAGTTTGGA 300 ! AATAATGAGG TTAATGAAAT TCAGATTTTA GGAMTAACA ATGTTCTTM AAACTTAAAA 360 I CTAGAAGATA TTGGAACAAC AGCTCCTTCT AACAGAGCTC AGTCTATTGT TATAGATGGG 420 CGAGACAATA GAATAGMGG TTTTCATTTA ACCATTAGAG GATCTTACCC TTATGGATAT 480 GGAGATGCTT TTGGAAAAGG AGGAGGTTCC GTAATTAATC ACCGAAAACA TTCAGGTGTT 540 TTAATAAGAG GATTACGTAA TCACCTAAAA GATTGTACCA TTATTTCTCG TTCTTATGGG 600 :CATATAGTAT TCATGCMGC AGCAAGTTAC CCAACTGTGG AAGGTTGTTA TATTGAAGGT 660 1 ^ GAAATGCGTT CAACCGATGA TATGTTGGCA GAAGAAGGAA CAGGTTCTCC AGCAGATAAA 720 GTAGATTTTA TGACGGTTTG GGGATATAAG TTACCAGCTG GTTATATGAT GAGTTTACAA 780 GAAGGAGGAA TTAGAGCATA TAATGCAGGA ACCACTTATA TTGATGGAGT AGAGATTCAA 840 1 CGAGCAACAG ACAACCCTAC CGTTCTAAAT TGTACTATTA AAAATGCAAG AACAGGAGTA 900 ACATTAGCAC ATGCAAATGG AACAAAATAT GTTGAGGGTT GTACTGTTTT AGGATGTGAA 960 AATGGATACT CCATAGGAAG TGGAACTGTA GTAAACTGTG GAGCAGATGC TATTTATGGA 1020 CCTGTATTTA AAAATACATA CGGAAGCGAT AAAGGGTACA ATGCAGACAT TACCATTTTG 1080 CCACCTAGTG ATGCTTACTA CAACGGACAT GATGCTGTAG CATACATTGG AGGATCAAAT 1140 CATAACCTTA CTTTTAGAAG TGAAATAACA GAAATTCCAA GCAATTTAAA AATTATGGTC 1200 TCTGGAGATT TACAAGGATT AAGAGTATTG CATGGAAGTA ATC.CTAGTCA GAATAATTTT 1260 .GCTGGAACCA ACATTGTTTT AAGAAATTTA ACAAACTTTC CTGTAGACTT ACATTCAGAC 1320 (請先閲讀背面之注意事項异本頁) .裝· -口· 線 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 570979 A8 B8 C8 D8 經* 濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 AGTTCTAATA TMCTGTTAC TTCTTGTGAT ACGGATMTA TTACAGACAA TGGTACAAAT 1380 AATAGTATTG AAGCTATAGA TTGCGATTCG GATAATTTAG CTTTAAAAGG AGAAGCTAGT 1440 CAATCATCCT CTCGTCCAAG TGATGGTTTT GCAGCAAATG CCATTGATGG AAATACAAAT 1500 GGGGCATGGT CAAACAATTC TGTTTCTCAT ACGGGTACAG AAGAAAATCC ATGGTGGCAA 1560 GTAGATTTAG GAACAGATGC TATTATAGGT AGCATCAATA TTTTTAACAG AACAGATGGT 1620 TGTTGTAAAG GTAGATTAGA TAATTTTACT GTTTACGTGA TAGATAAAGA TGATAAGGTT 1680 ACATTTTCTA AAACCTATGT TACCGTTCCA GATCCGTCTA TAACTGTTGA TGCAGGTGGT 1740 GTGAATGGAA AAATTGTAAA AATTGTTTTG AATAACAGTT CACAGGCTTT GGCTTTAGCA 1800 GAGGTAGAAG TGTACGGAAC GTCTTTGTCT AATAAAGAAA CTATAAAGAA TCCTATTCAT 1860 TTTTATCCTA ACCCGGTAGA AGATGAGGTA ACTATTTCTT TAGAGTCAGC CGATTTAAAT 1920 TTAAACGAGA CTCGAGTTGT TATTTATAAT ATAAAAGGTC AAAAAATACT AGAAACAACT 1980 CCAAGTAATT CCACGGAAGT TAATTTAAAC TTATCTCACT TACCAACAGG AGTTTATTTA 2040 ATAAGAGTAA GCGATCAAAA TAAAAATATC ATAAATAAAA TTGTAAAATT A 2091 序列編號：8 ATGAAAAAAT ATTCTATCCT AAAAATAGGA ATTATAGCTG TTATAATGTT GTTTGTTCAG 60 CAGTCTTACG CACAAACAAC CACAGTATAT TCTTTAGAAG ACTTACTACC CTATTTAAAA 120 CAGGATAATG TAGATGTTAA ATTAGCCCCA GGAACTTATA ATATCAATGC ATTTGACATT 180 ACTCAAGGAA AATTTTCGAA CCCCTTATTT CTTTTTGAAG GGTCTAATAA TACTTTTGAT 240 (請先閎讀背面之·事項再本頁) ’裝. 、τ· 線 -26- 本紙張適用中國國家榇準（CNS ) 210X297公釐） 570979 A8 B8 C8 ^ D8 六、申請專利範圍 ：,. TTTACAGATG TTAAAATAAA CATCAATACT CTGGTGTTAA CAAAGTTTGG GAATMTGAA 300 GTCMTGAM TTCAGATTTT AGGAAATAAC AATGTTCTTA AAMCTTAAA ACTAGAAGAT 360 ATTGGAACAA CAGCTCCTTC TAACAGAGCC CAGTCAATTA TAATGGATGG GCGAGACAAT 420 AGMTAGAAG GCTTTCATTT AACCATTAGA GGATCTTATC CTTATGGATA TGGAGATGCT 480 TTTGGAAAAG GAGGAGGTTC CGTAATTAAT CACCGAAAAC ATTCAGGTGT TTTAATAAGA 540 GGATTACGTA ATCACCTAAA AGATTGTACT ATTATTTCTC GTTCTTATGG GCATATAGTA 600 TTTATGCAAG CAGCAAGTTA CCCAACTGTA GAAGGTTGTT ATATTGAAGG TGAAATGCGT 660 TCAACCGATG ATATGTTGGC AGAAGAAGGA ACAGGTTCTC CAGCGGATAA TGTAGATTTT 720 ATGACGGTTT GGGGATATAA GTTACCAGCT GGTTATATGA TGAGTTTACA AGMGGAGGA 780 ATTAGAGCTT ATGATGCTGG TACCACTTAT ATTGATGGAG AAGTAATCCA AAGAGCAACA 840 GATAACCCTA CCGTTCTAAA TTGTACCATT AAAAATGCAA GAACAGGAGT GACTTTAGCA 900 CATGCTAAAG GAACAAAACA CGTAGAAAAT GTTAAGGCTA TTGGGTGTGA GCAAGGATAT 960 TCAATTGGTA GTGGTACAGT GAGTAATTGT AGTGGTGATG CTCAGTATGG TCCGTTGTTA 1020 AGTTTTGCTT ATTCTAGTGA TAAAAATACG MTATAGACA TAGAAGTTTT GCCTGCAGAA 1080 AATTATTATA ACGGTAGTGA AACTGCTGCT TACGTTGGAG GACATTCTCA TAATATTACA 1140 CTAAGAGGAG GTGATCCTAA TGCGGATCTT AGAGTTCAGG TAGGGGGAGA AAAAAATAAC 1200 GTTAGGTTGC TTGGAGTTAC TTCTAATCAA AATCCACTTT CTGCTTCAAA TTTGGAACTG 1260 AATAATTTAA CTAATTTTCC TGTAGTGTTA GATGAAATGA GTTCTAATAT TATTGTGGAG 1320 TCATGTGGGG AGGTTACCAA TAACGGAAGT AATAATAGTA TTACTGACTG CCCAGATGGA 1380 CCAATTAGCT TTCCAGATTC AAGCAAAGCG TATCGTTTAG GAAATAATAG ATTTACATTT 1440 TGGGTTGCGG CCAATGGAGG AGATCATGCT TATTCTATAA AGTATAATGA TGGTATTAGT 1500 GGTAACATTA ATGATTATGA GGATTTGTTT CCAGAAGGAG AAGAGTCTTT TTGGGTTTTT 1560 ACTCCAGTAG AGGGAAGAGA CGGATACTTT TTTGTTGATT GTGTTGGTGG TGGTGATAAA 1620 CAAAGATTGT CAGCTACTAC AGATAGTGGC TTGCCAGTAA TGGTGTCAAA AACCATTACA 1680 AGTGCATCTG TTCAATGGTC TGTAGTGCAA CCAGAAGGAA GAGATACTTT CCATATAACG 1740 AATGATTATG CTAGAATGGT AGGAGCTAAT ACAACTACTA ATCAAACCAT TTTGTCTACT 1800 GTTGGGAACA CCTCAAACCA ATCTCGTTTT GAAGTTCTTG MGTTTCTAA CTATTCTTTA 1860 AGTATTAAAA ACGACATCTT AMCAATAAT ATTACGGTTT TTCCTATTCC AACATCTGAC 1920 ______.-27- . . 、_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 裝· 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570979 六、申請專利範圍 ATTCTTMTA-TAAATTTAAA AAATATGGAG TCTGTTACTG TTGAATTATA CMCTCAATA 1980 GGTCAAAAM TATTATCAAA AGAMTTAAA CAAGGTGAM ATACCCTAM CTTGTCTGGT 2040 ATTTATACAG GAGTTTATTT GTTMMTTG AACGATGGAC AAMTTCTTA TACAAAAAGA 2100 ATTATTATGA AA 2112 。 2 ·如申請專利範圍第1項之基因，其中多肽係來自交 替單胞屬（A 1 t e r 〇 m ο n a s )細菌。 3 .如申請專利範圍第1項之基因，其中多肽係來自黃 桿菌屬（A 1 t e r 〇 m ο n a s )細菌。 4 · 一種具有選自下述含岩藻糖硫酸多糖分解活性之多 肽， ⑴其係組成自下述序列表序列編號1及2任一所示 月女基酸序列’或e亥序列中有一或多個胺基酸序列 經缺失、加成、插入、取代至少一種而與原始序 列機能上具同等活性之胺基酸序列，並且具有分 解活性使具下述理化性質之含岩藻糖硫酸多糖小 分子化之多肽； -28- 570979 、申請專利範圍 (a )構成糖：實質上不含糖醛酸， (b)經由頁桿囷3六-〇〇82^18\^〇5&(：161^1111180.3八-00 82 )(CCRC第91〇〇69號）所生產之岩藻衣聚糖 分解酵素’實質上不被小分子化； 序列編5虎· 1 Met Lys lie Arg Asn Val Cys Arg Ser Ala Val Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Met Ser Leu Asn. Thr Tyr Ala Glu Thr Lys Ala Asp Trp Met Gin 20 25 30 Gly Asn Trp Gly lie Ser Tyr Arg lie Pro Gly Gly Asp lie Asn 35 40 45 Tyr*Ser Gly Ser His Val Ala Glu Tyr Asn Val Arg Ala Ala Val 5〇 55 60 Glu Gin lie Ser Ala lie Pro Gly Leu Lys Trp Val Gin lie Asn 65 70 75 Leu Thr Asn Gly Ala Ser Gly Asp Arg Phe lie Val Pro. Val Thr 80 85 90 Glu Val Glu Ala lie Asn Pro Leu Ser Ala Pro Asn Ser lie Asn 95 100 105 Asp. Leu Tyr Asp Pro Thr Leu Pro Gly Arg Asp Leu Phe Glu Gin 110 115 120 Leu Ala Leu Ala Phe Lys Ala Lys Gly lie Arg Val Val Ala Tyr 1Z5 130 135 lie Ala Thr Gin Gly Pro Gly Met Leu Lys His Gly Ala Glu Asn 140 145 150 -29 - 570979 ABCD 經濟部智1·財產局員工消費合作社印製 七、申請專利範圍 Ser Met Asp Glu Asp Asp Ser' lie Thr Asp Cys Lys Ser Ser Lys 155 160 165 Pro Leu Val Thr Asp Leu Asp Thr Gin Val Tyr Cys Ser Ala Asn 170 175 180 Met Asn Arg Trp Arg Asp Tyr Val Leu Glu Gin Tyr Pro Ser Thr .185 190 195 Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Glu Leu Ala Met Val Asn lie Val Glu 200 205 210 Thr Leu Ser Leu Arg Tyr Gly Ser Thr lie Asp Gly Trp Trp Phe 215 220 225 Asp His Ser Gly Phe Gly Asp Ser Glu Leu Leu His Ala Ala Ala 230 235 240 Leu Ala Gly Asn Asn Asp Ala Ala Val Ala Phe Asn Glu Gly Asp 245, 250 . 255 Lys Val Pro Leu Val Asn Asn Pro Glu Thr Leu Asp Asp Tyr Thr 260 .265 270 Phe Gly His Pro Thr Pro lie Gly Ser Glu Val Ser Ser Asp Asp 275 280 285 Lys Asn Leu Pro Met Leu Thr Ser lie Glu Ala Thr Leu Asp Gly 290 295 300 He Leu Thr Gly Ser Gly Asp Asp Val Gly Ser Val Gly His.Met 305 310 315 Phe Met Pro Leu Gin Glu Ser Trp Asn Gly Gly Thr Val Val Phe 320 325 330 Ser Glu Ala Lys Gly Ser Asp Trp Leu Asn Arg Ala Leu Lys Ala 335 340 345 Gly Gly Ala Phe Thr Trp Ala Leu Ser Gin Asp Ser Asn Asp Glu 350 355 360 -30- 請先閱讀背面之事項再 本頁) -裝· -· 線 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210 X29<7公釐） 570979 A8 B8 C8 _ _ D8 -------- 六、申請專利範圍 Leu Gly Gly (jiy Ala Arg Leu lie Ser Glu Pro Gin Val Lys 365 370 375 Met Leu Glu Arg Met Ser Phe Asn lie Gly Lys Gin Leu His Met 380 385 390 Asn Leu Asp Gly Ser Asp Gly Asp Thr Ala Tyr Asp Asp Ser Val 395 400 405 Asn Gin Tyr Thr Ala Thr Val Asn Gly Ala Asn Phe Val Asp Asp 410 415 420 Val Thr Arg Gly Lys Val Ala Ser Phe Thr Glu Asp Asp Gin Leu 425 430 435 Glu. Leu Asp Asn Tyr Gin Gly He Ser Gly Gly Asn Ala Arg Thr 440 445 450 Thr Met Ala Trp lie Lys Thr Ser Asp Ser Lys Gly Asp lie lie 455 460 465 Asp Trp Gly Asn Asn Thr Thr Ser Glu Arg Trp Trp Leu Arg Leu 470 475 480 Val Asp Gly Lys Phe Lys Leu lie Leu Lys Gly Pro Asn Leu Thr 485 490 495 Gly Thr Thr Thr Leu Asn Asp Asp Gin Trp His His lie Ala Val 500 505 510 Val Ala Ser Asp Asn Val Val Ala Asn lie Lys Val Tyr lie Asp 515 520 525 Gly Val Leu Glu Thr Val Ala Val Asn Asp Asn Ala Ser Thr Thr 530 535 540 Phe Asp Thr Thr Leu Gly Gly Asn lie Gin lie Gly Gly Ala Tyr 545 550 555 Thr Gly Leu lie Asp Lys Val Leu Val His Asp Arg Ala Leu Asp 560 565 570 • -3K · (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -裝· 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） ABCD 570979 六、申請專利範圍 Glu Ser Glu lie Glu Tyr Val Val Asn Ser Ser Asn Ala Asp Leu 575 580 585 Asp Leu Glu Val Ala Leu Asp Val Arg Phe Glu Glu Ser Ala Asn 590 595 600 Ser Thr Lys Val Thr Asp Asn Ser lie Tyr Gly Arg His Gly Thr 605 610 615 Asn Arg Gly Ala lie Thr Gly Val Phe Asp Ala Glu Arg Asn Ser 620 625 630 Asn Val Tyr Ser Leu Asp Gly Val Asp Ser Gly Glu Asp lie Asn 635 640 645 Asp Leu Lys Asp Ser Asp Tyr Glu His Glu Val Val Met Thr Thr 650 655 660 Asp Asn Ser Lys Asp Ser Lys Gly Tyr Ser Gly Val Asn Gly Ala 665 670 675 Gly Pro Arg Thr Val Met Ala Trp lie Lys Thr Thr Phe Gly Gly 680 685 690 Ala Val lie Ala Gin Trp Gly Asn Lys Asn Ser Val Asp Gly Glu 695 700 705 Gin Tyr Glu Val Arg Leu Lys Asn Gly Ala Leu Arg Leu Asp lie 710 715 720 Thr Gly Gly He lie Lys Gly Thr Thr Ser lie Asn Asp Gly Glu 7Z5 730 735 Trp. His His lie Ala Val Val Ser Pro Asp Glu Gin Leu Ala Asn 740 745 . 750 'Thr Lys Leu Tyr Val Asp Gly Val Leu Glu Thr Ala Thr Thr Ser 755 760 765 Gly Ser Gin Ala Thr lie 人sp Thr Lys Thr Leu Asn Gly Asp Ser 770 775 780 . —_ -32- 本纸張Λ度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注*^事\^再I^本育) 裝· 、ν*τ».. 經濟部智慧財產局員工消費合作.社印製 570979 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Lys Asp Val lie lie Gly Ser Thr Phe..Val Gly Glu Met Asp Asp 785 790 795 Phe lie lie His Gin Arg Ala Leu Arg Gin Phe Glu Val Lys Asn 800 805 810 Ser Ala Gly Leu 序列編號：2 Met Lys lie Arg Asn Met Cys Cys Thr Ala Leu lie Val Ser Leu 15 10 15 Met Gly Cys Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Ser Ser Pro Glu Val 20 25 30 Glu Val Asp Asn Gly Val Glu lie Gin Pro Glu Pro Glu Val Glu 35 40 . 4.5 Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro 50 55 60 Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu 65 70 75 Pro Glu Pro Glu Val Glu Pro Glu Pro Glu Asp lie Arg Ala Ser 80 85 90 Trp Met Gin Gly Asn Trp Gly lie Ser Phe Arg lie Ser Gly Gly 95 100 105 . -33: 本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A4規格（2丨0X_29?公釐） ---------裝-- (請先閱讀背面之注事項再本夏) 、-· 線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570979 ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍. Asp lie Ser Gin Asn Glu Ser His Val Asn Glu Tyr Gin Val Ala 110 115 120 Pro Ala Val Glu Gin lie Ala Ala lie Pro Gly Leu Lys Trp Leu • 125 130 135 Gin Val Asn Leu Ser Asn Gly Ala Phe Gly Asp Arg Phe lie Val 140 145 150 Pro Val Pro Glu Val Glu Ala lie Asn Pro Asn Ser Ala Pro Asn 155 160 165 Ser Ser Ala Asp Leu Phe Asp Pro Ala Leu Pro Gly Asp Asp Leu 170 175 180 Phe Glu Gin lie Ala Leu Gly Leu Gin Ala Lys Gly lie Lys Val 185 190 195 Val Ala Tyr lie Ala Thr Gin Gly Pro Ala Met Leu Lys His Gly 200 205 210 Ala Glu Arg Ser Met Asp Phe Asp Asp Ser lie Val Asp Glu Ser .215 220* 225 Asp Gly Ser Ala Cys Lys Ser Ser Arg Pro Val Val Ser Asp Pro 230 235 240 Asp Thr Gin Val Tyr Cys Ser Ala Asn Met Asn Arg Trp Arg Asp 245 250 255 Tyr Val Leu Gin Gin Tyr Pro Ser Thr Ser Leu His His Ser Phe 260 265 270 Gin Leu Gly Leu Val Asn lie Val Glu Thr Leu Ser Leu Arg Tyr 275 280. 285 ；Gly Thr Leu lie Asp Gly Trp Trp Phe Asp His Ser lie Tyr Gly 290 295 300 Asp Tyr Asn Leu Leu Pro Asp Ala Ala Arg Ala Gly Asn Ser Asn 305 310 315 -34 - · . (請先閱讀背面之注意事項再Uf本頁) •裝· 4· 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇X297公釐） ： 570979 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Ala Ala Val Ser Leu Asn Leu Glu Gly Asp lie Phe Leu Ser Asn 320 325 330 Asn Pro Glu Val Met Glu Asp Phe Thr Gly Gly His Pro Thr Pro 335 340 345 . · · - . lie Ala Arg Val Val Ser Ser Asp Asp Thr Asn Leu Pro Met Leu 350 355 360 Thr Ala lie Glu Asp Ala Pro Asn Gly He Phe Thr Gly Thr Gly 365 370 375 Asp Asp Val Asp Ala Leu Gly His Met Phe Leu Pro Leu Gin Glu •380 385 390 Thr Trp Asn Gly Gly Thr Val Val Phe Ser Glu Ala Lys Gly Thr 395 400 405 Glu Trp Leu Asn Arg Val Thr Arg Ala Gly Gly Ala Leu Thr Trp 410 415- 420 Ala Leu Ser His Glu Gly Ser Val Ser Gly Gly Glu Ala Met Leu 425 430 435 lie Ser Ala Pro Gin Ala Lys Met Leu Ala Arg Met Gin Leu Asn 440 445 450 lie Gly Lys Gin Leu Asp Met Asp Leu Asp Gly Ala Asp Gly Ala 455 460 465 Thr Ala Tyr Asp Asp Ser Val Asn Gin His Thr Ala Thr Val Thr 470 475 480 Gly Ala Thr Phe lie Asp Asp Val Thr 人rg Glu Lys Val Ala Ser 485 490 495 Phe Thr Glu Thr Asp Leu lie Thr Leu Asn Asn Phe Thr Gly lie • 500 505 510 Leu Gly Glu Ser Ala Arg Thr Thr Met Ala Trp lie Lys Thr Ser 515 520 525 ._ -35- ϋ張尺度適用中國國家禚準（CNS ) A4規格（2][0><297公瘦) '— (請先閱讀背面之注意事項再本頁) .裝· 、\u· 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570979 A8 B8 C8 D8 穴、申請專利範圍 AsP Ser Asn Ala Asp Val lie Gin Trp Gly Lys Gin Glu Thr Ser 530 535 540 Glu Ala Trp Tyr Val Gly Leu Asp Asn Gly lie Leu Gin Leu Asn ----------- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 5.45 550 555 . * . * · . . . He Gin Gly Ser Thr Val lie Gly Ala.Ser Val Leu Asn Asp Asp 560 565 570 Ser Trp His His lie Ala Val lie Ala Pro Asp Asn Ser lie Ala 575 580 585 Asn Thr Gin Val Tyr lie Asp Gly Val Leu Glu Thr Leu Thr Val 590 . 595 600 Asn Asp Gly Gly Ser Ser Thr Phe Asn Thr Val Ala Asp Thr Asn 605 610 615 Val Val lie Gly Gly Glu Phe Thr Gly Leu lie Asp Lys .Thr Val 620 625 630 Val Tyr Asn Arg Ala Leu Glu Glu Ser Glu lie Asp Tyr lie Val 635 640 645 Asn Ser Ala Asp Ala Asp lie Asp Leu Gly lie Ser Leu Asp Val 線 650 655 660 Arg Phe Asp Glu Asp Ala Asn 人la Thr Thr Val Ala Asp Asn Ser 665 670 675 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Ala Tyr Glu Arg Ser Gly lie Asn Arg Gly Ala lie Thr Gly Val · - * .· . 680 685 690 Phe Asp Ala Thr Arg Asn Ser Asn Val Tyr Ser Leu Asp Gly Val 695 700 705 Asp Ser Gly Glu Asp Leu Asp Asp Leu lie Asp Ser Asp Tyr Glu 710 715 720 His Gin lie Val Met Thr Thr Asn Asn Lys Arg Asp Asn Lys Gly 725 730 735 . -36- . · >紙張尺度適用中國國家$ ( CNS ) A4規格（210X297公釐) 570979 六、申請專利範圍 Tyr Ser Gly Val Asn Gly Gly Asp Pro Arg Thr Val Met Ala Trp 740 745 750 lie Lys Thr Thr Phe Gly Gly Ala Val lie Ala Gin Trp Gly Asn 755 760 765 Lys Asp Ser Val Asp Gly Glu Gin Tyr Glu Val Arg Leu Lys· Asn 770 775 780 Gly Glu Leu Arg Val Asp Ιΐέ Thr Gly Gly Leu He Lys Gly Thr 785 790 795 Thr Leu lie Asn Asp Gly Glu Trp .His His lie Ala Val Val Ser 800 805 810 Pro Asp Asp Gin Leu Ala Asn Thr Lys Leu Tyr Val Asp Gly Val 815 820 825 Leu Glu Thr Thr Thr Thr Ser Gly Ser Gin Thr Thr lie Asp Thr 830 835 840 Leu Thr Leu Asn Gly Asp Ser Lys Asp Val He lie Gly Ser Thr 845 850 855 Phe Val Gly Glu· Met Asp Asn Phe Val lie His Gin Arg Ala Leu 860 865 870 Lys Gin Phe Glu Val Lys Val Ala Ala Gly lie 875 880 ⑵其係組成自下述序列表序列編號3及4任一所示胺基 酸序列，或該序列中有一或多個胺基酸序列經缺失、 加成、插入、取代至少一種而與原序列機能上具同等 活性之胺基酸序列，並且作用於具下述理化性質之含 岩藻糖硫酸多糖，使該含岩藻糖硫酸多糖小分子化而 游離出至少一種選自下述式[I]、[II]、[III]及[IV] 之化合物之多肽； (c) 構成糖：包含糖醛酸， (d) 經由黃桿菌3六-0082(?1”〇匕2(：16 1-1111118?.3八-0082 HCCRC第9 1 0069號）所生產之岩藻衣聚糖分解 酵素而被分解； -37- 570979 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8申請專利範圍 序列編號：3 Wet He Lys Lys Tyr Asn Leu lie Lys Thr Gly Val lie Thr Phe 1 5 10 15 Leu Val Leu Phe Phe. Gin Gin Thr Tyr Ala Gin Thr Thr Thr Val * * . * . · · 20 25 30 Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Leu Pro Tyr Leu Lys Gin Asp Asn Val 35 40 45 Asp Val Lys Leu Ala Pro Gly Thr Tyr Asn Val Asn Gly Phe Asp 50 55 60 Val Gly Glu Asp Arg Leu Phe Ser Thr Thr Pro Leu Phe Leu Phe 65 70 75 Glu Gly Ser Asn Ser Thr Tyr Asp Phe Thr Asp Val Lys Leu Asn 80 85 90 lie Asn Thr Val Val Leu Thr Lys Phe Gly Asn Asn Glu Val Asn 95 100 105 Glu lie Gin lie Leu Gly Asn Asn Asn Val Leu Lys Asn Leu Lys 110 115 120 Leu Glu Asp He Gly Thr Thr Ala Pro Ser Asn Arg Ala Gin Ser 125 130 135 lie Val lie Asp Gly Arg Asp Asn Arg lie Glu Gly Phe His Leu 140 145 150 Thr lie Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Gly Tyr.Gly Asp Ala Phe Gly 155 160 165 Lys Gly Gly Gly Ser Val lie Asn His Arg Lys His Ser Gly Val 170 175 180 Leu lie Arg Gly Leu Arg Asn His Leu Lys Asp Cys Thr lie lie 185 190 195 Ser Arg Ser Tyr Gly His lie Val Phe Met Gin Ala Ala Ser Tyr 200 205 210 (請先閱讀背面之注意事項再 •裝· 頁) -· 線 -38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 Pro Thr Val Glu Gly Cys Tyr Lie Glu Gly Glu Met Arg Ser Thr 215 220 225 Asp Asp Met Leu Ala Glu Glu Gly Thr Gly Ser Pro Ala Asp Lys 230 235 240 Val Asp Phe Met Thr Val Trp Gly Tyr Lys Leu Pro Ala Gly Tyr 245 250 255 Met Met Ser Leu Gin Glu Gly Gly lie Arg Ala Tyr Asn Ala Gly 260 265 270 Thr Thr Tyr lie Asp Gly Val Glu lie Gin Arg Ala Thr Asp Asn 275 280 285 Pro Thr Val Leu Asn Cys Thr lie Lys Asn Ala Arg Thr Gly Val 290 295 300 Thr Leu Ala His Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Val Glu Gly Cys Thr .305 310 315 Val Leu Gly Cys Glu Asn Gly Tyr Ser lie Gly Ser Gly Thr Val 320 325 330 Val Asn Cys Gly Ala Asp Ala lie Tyr Gly Pro Val Phe Lys Asn 335 340 345 Thr Tyr Gly Ser Asp Lys Gly Tyr Asn Ala Asp lie Thr lie Leu 350 355 360 Pro Pro Ser Asp Ala Tyr Tyr Asn Gly His Asp Ala Val Ala Tyr 365 370 375 lie Gly Gly Ser Asn His Asn Leu Thr Phe Arg Ser Glu lie Thr 380 385 390 Glu lie Pro Ser Asn Leu Lys lie Met Val Ser Gly Asp Leu Gin 395 400 405 Gly Leu Arg Val Leu His Gly Ser Asn Pro Ser Gin Asn Asn Phe 410 415 420 —_ .-39—: 本紙中國國 (CNS) A4 規格（210x297：^ :—^ (請先閲讀背面之注意事項再ίϋΡ本頁) •裝· 、·!'· 線 570979 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Ala Gly Thr Asn He Val Leu Arg Asn Leu Thr Asn Phe Pro Val 425 430 435 人sp Leu His Ser Asp Ser Ser Asn lie Thr Val Thr Ser Cys Asp 440 445 450. .Thr Asp Asn lie Thr Asp Asn Gly Thr Asn Asn Ser lie Glu Ala 455 460 465 lie Asp Cys Asp Ser Asp Asn Leu Ala Leu Lys Gly Glu Ala Ser 470 475 480 Gin Ser Ser Ser Arg Pro Ser Asp Gly Phe Ala Ala Asn Ala lie 485 490 495 Asp Gly Asn Thr Asn Gly Ala Trp Ser Asn Asn Ser Val Ser His 500 505 510 •Thr Gly Thr Glu Glu Asn Pro Trp Trp Glii Val Asp Leu Gly Thr 515 520 525 Asp Ala lie lie Gly Ser lie Asn lie Phe Asn Arg Thr Asp Gly 530 535 540 ,Cys Cys Lys Gly Arg Leu Asp Asn Phe Thr Val Tyr Val lie Asp 545 550 555 Lys Asp Asp Lys Val Thr Phe Ser Lys Thr Tyr Val Thr Val Pro 560 565 570 Asp Pro Ser lie Thr Val Asp Ala Gly Gly Val Asn Gly Lys lie 575 580 585 Val Lys lie Val Leu Asn Asn Ser Ser Gin Ala Leu Ala Leu Ala 590 595 600 Glu Val Glu Val Tyr Gly Thr Ser Leu Ser Asn Lys Glu Thr lie 605 610 615 Lys Asn Pro He His Phe Tyr Pro Asn Pro Val Glu Asp Glu Val 620 625 630 ____ -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ： ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 、\=口. 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570979 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 Thr lie Ser Leu Glu Ser Ala Asp Leu Asn Leu Asn Glu Thr Arg 635 640 645 • Val Val lie Tyr Asn lie Lys Gly Gin Lys lie Leu Glu Thr Thr 650 655 660 Pro Ser Asn Ser Thr Glu Val Asn Leu Asn Leu Ser His Leu Pro 665 670 675 Thr Gly Val Tyr Leu lie Arg Val Ser Asp Gin Asn Lys Asn lie 680 685 690 lie Asn Lys lie Val Lys Leu 695 序列編號· 4 Met Lys Lys Tyr Ser lie Leu Lys lie Gly lie lie Ala Val lie 1 5 10 15 Met Leu Phe Val-Gin Gin Ser Tyr Ala Gin Thr Thr Thr Val Tyr 2〇 25 30 Ser Leu Glu Asp Leu Leu Pro Tyr Leu Lys Gin Asp Asn Val Asp 、 35 40 45 Val Lys Leu Ala Pro Gly Thr Tyr Asn He Asn Ala Phe Asp He 50 55 60 Thr Gin Gly Lys Phe Ser Asn Pro Leu Phe Leu Phe Glu Gly Ser 65 70 75 (請先閲讀背面之注意事項再I®本頁) •裝. 、\=口_ 線 -4l· 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570979 A8 B8 C8 D8 六、申讀專利範圍 Asn Asn Thr Phe Asp Phe Thr Asp Val Lys lie Asn lie Asn Thr 80 85 90 Leu Val Leu Thr Lys Phe Gly Asn Asn Glii Val Asn Glu He Gin 95 100 . 105 lie Leu Gly Asn Asn Asn Val Leu Lys Asn Leu Lys Leu Glu Asp 110 115 120 lie Gly Thr Thr Ala Pro Ser Asn Arg Ala Gin Ser lie lie Met 125 130 135 Asp Gly Arg Asp Asn Arg lie Glu Gly Phe His Leu Thr lie Arg 140 145 150 Gly Ser Tyr Pro Tyr Gly Tyr Gly Asp Ala Phe Gly Lys Gly Gly 155 160 165 Gly Ser Val lie Asn His Arg Lys His Ser Gly Val Leu lie Arg 170 175 180 Gly Leu Arg Asn His Leu Lys Asp Cys Thr lie lie Ser Arg Ser 185 190 195 Tyr Gly His lie Val Phe Met Gin Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val 200 205 210 Glu Gly Cys Tyr lie Glu Gly Glu Met Arg Ser Thr Asp Asp Met 215 220 225 Leu Ala Glu Glu Gly Thr Gly Ser Pro Ala Asp Asn Val Asp Phe 230 235 240 Met Thr Val Trp Gly Tyr Lys Leu Pro Ala Gly Tyr Met Met Ser 245 250 255 Leu Gin Glu Gly Gly lie Arg Ala Tyr Asp Ala Gly Thr Thr Tyr 260 265 270 lie Asp Gly Glu Val lie Gin Arg 人la Thr Asp Asn Pro Thr Val 275 280 285 -42- 本紙張尺度適用中國國( CNS ) A私見格（210X297公釐） ^ ~ — ----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再本頁) -一口· 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 570979 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Leu Asn Cys Thr lie Lys Asn Ala Arg Thr Gly Val Thr Leu Ala 290 295 300 ' His Ala Lys Gly Thr Lys His Val Glu Asn Val Lys Ala lie Gly 305 310 315 . " ....-.. · ·· _ · Cys Glu Gin Gly Tyr Ser lie Gly Ser Gly Thr Val Ser Asn Cys 320 325 330 Ser Gly Asp Ala Gin Tyr Gly Pro Leu Leu Ser Phe Ala Tyr Ser 335 340 345 Ser Asp Lys Asn Thr Asn lie Asp lie Glu Val Leu Pro Ala Glu 350 355 360 Asn Tyr Tyr Asn Gly Ser Glu Thr Ala Ala Tyr Val Gly Gly His 365 .370 375 Ser His Asn lie Thr Leu Arg Gly Gly Asp Pro Asn Ala Asp Leu .380 . 385 · 390 _ . · · - Arg Val Gin Val Gly Gly Glu Lys Asn Asn Val Arg Leu Leu Gly 395 400 405 Val Thr Ser Asn Gin Asn Pro Leu Ser Ala Ser Asn Leu Glu Leu 410 415 420 Asn Asn Leu Thr Asn Phe Pro Val Val Leu Asp Glu Met Ser Ser 425 430 435 Asn lie lie Val Glu Ser Cys Gly Glu Val Thr Asn Asn Gly Ser 440 445 450 Asn Asn Ser lie Thr Asp Cys Pro Asp Gly Pro lie Ser Phe Pro 455 460 465 Asp Ser Ser Lys Ala Tyr Arg Leu Gly Asn Asn Arg Phe Thr Phe 470 475 480 Trp Val Ala Ala Asn Gly Gly Asp His Ala Tyr Ser lie Lys Tyr 485 490 495 ____ 、43- · . ' 本紙張尺度適用中國國家;^ ( CNS ) A4说格（210 X 297公釐） " ---------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 1T- 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製， 570979 ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 Asn Asp Gly He Ser Gly Asn lie Asn Asp Tyr Glu Asp Leu Phe 500 505 510 Pro Glu Gly Glu Glu Ser Phe Trp Val Phe Thr Pro Val Glu Gly 515 520 525 • . . . . · · * Arg Asp Gly Tyr Phe Phe Val Asp Cys Val Gly Gly Gly Asp Lys 530 535 540 Gin Arg Leu Ser Ala Thr Thr Asp Ser Gly Leu Pro Val Met Val 545 550 555 Ser Lys Thr lie Thr Ser Ala Ser Val Gin Trp Ser Val Val Gin 560 565 570 Pro Glu Gly Arg Asp Thr Phe His He Thr Asn Asp Tyr Ala Arg 575 580 585 Met Val Gly Ala Asn .Thr Thr Thr Asn Gin Thr lie Leu Ser Thr 590 . 595 . 600 Val Gly Asn Thr Ser Asn Gin Ser Arg Phe Glu Val Leu Glu Val 605 610 615 Ser Asn Tyr Ser Leu Ser lie Lys Asn Asp lie Leu Asn Asn Asn 620 625 ' 630 lie Thr Val Phe Pro lie Pro Thr Ser Asp lie Leu Asn lie Asn 635 640 645 Leu Lys Asn Met Glu Ser Val Thr Val Glu Leu Tyr Asn Ser lie 650 655 660 Gly Gin Lys lie Leu Ser Lys Glu lie Lys Gin Gly Glu Asn Thr 665 670 675 Leu Asn Leu Ser Gly lie Tyr Thr Gly Val Tyr Leu Leu Lys Leu 680 685 690 Asn Asp Gly Gin Asn Ser Tyr Thr Lys Arg lie lie Met Lys 695 700 •_— :·44 一 ϋ張Z度適用中國國A4規格（210x297公董i ' (請先閲讀背面之注意事項再 裝· 頁) 、τ· 線 570979 8 8 8 8 ABCD 申請專利範圍
    OH 〔I〕.
    〇n=S =0 I 0H OH I 〇=S=〇
    OH 〔II〕 (請先閎讀背面之注意事項再 .裝- 頁) 線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
    〇nrS =〇 I OH 45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） 570979 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍
    OH
    o ns no (請先閱讀背面之注意事項再 裝· 頁) 經濟部智慧沐產局員工消費合作社印製
    OH l j 〇H OH -46 - IV 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐）
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