CN106350532A - 一种抗草甘膦融合基因、编码蛋白及其应用 - Google Patents

一种抗草甘膦融合基因、编码蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗草甘膦融合基因、编码蛋白及其应用，所述融合基因由EPSPS蛋白编码基因和草甘膦N‑乙酰转移酶或草甘膦氧化酶编码基因构成；所述EPSPS蛋白编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7或G10；所述草甘膦N‑乙酰转移酶编码基因为GAT，所述草甘膦氧化酶编码基因为GOX。本发明抗草甘膦蛋白相比具有如下优点：可以通过2中不同的耐受机制抗草甘膦；可以通过一个基因赋予转基因植物2种草甘膦耐受机制和高抗草甘膦特性。本发明提供的抗草甘膦融合蛋白可以应用于单子叶植物和双子叶植物的抗草甘膦方面，主要应用于抗除草剂抗虫玉米、水稻、大豆、小麦和油菜。

Description

一种抗草甘膦融合基因、编码蛋白及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种具有2种不同草甘膦耐受机制的抗草甘膦融合基因、该基因编码的融合蛋白，及该融合蛋白的应用。
(二)背景技术
杂草是农业生产中影响产量的最重要的生物因素。如何降低杂草的防治成本、提高防治效率、减少防治过程中给环境造成污染是农业科学研究最关键的问题。
杂草时伴随着人类的生产活动而产生的，它们的存在是长期适应气候、土壤、作物、耕作制度及社会因素与栽培作物竞争的结果。人类从开始从事农业生产就在防治杂草，但是当时的杂草防治仅仅是一种极为粗放的初级劳动。随着科学的发展，特别是近代生命科学的发展进步，人类可以通过基因工程的方法赋予农作物耐受各种除草剂的特性，通过喷施除草剂就可以很好的防治杂草，把人类从初级劳动中解放出来，极大的提高效率。
草甘膦(Glyphosate)是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的竞争类似物，通过植物地上绿色茎叶角质层吸收后，随光合作用产物从韧皮部快速传导至整个植株的各个部位，可防除单子叶和双子叶一年生和多年生草本和灌木等40多科的植物。因其本身广谱、内吸传导式、低毒、低残留、可混性强、价格合理、独特的靶标和作用机理等自身优点，自1971年问世以来，在全世界的销售额已多次位居农药品种的首位。随着转基因作物时代的到来，抗除草剂转基因作物也成为一种普遍的种植需求。1996年美国首先开发了抗草甘膦的转基因大豆，近年来抗草甘膦作物的品种和种植面积还在不断迅速增加。
能赋予农作物草甘膦抗性的基因很多，包括突变的对磷酸烯醇式丙酮酸具有高亲和性，而对草甘膦不敏感的EPSPS基因，例如CP4(Padgette,S.R,Kolacz,K.H,Delannay,X,et al.1995,Crop Science,35(5):1451-1461)、aroA(Comai L,Sen LC,Stalker DM.1983,Science,221(4608)：370-371)、G7(中国专利：200910098129.X)、G10(中国专利：201110009329.0)；草甘膦降解基因，为可以把草甘膦转化为氨甲基磷酸(AMPA)的草甘膦氧化还原酶基因(glyphosate oxidoreductase gene,GOX)(Kishore,G.M.,&Barry,G.F.1995,Glyphosate tolerant plants)；草甘膦解毒酶基因，为可以把草甘 膦转化为N－乙酰草甘膦的草甘膦乙酰转移酶编码基因(glyphosate N-Acetylation,GAT)(CastleLA；Siehl DL；Gorton R；Patten PA；Chen YH；Bertain S；Cho HJ；Duck N；Wong J；Liu D；Lassner MW.2004,Science,304(5674),1151-4；Castle,L.A.,Hong,C.Y.,Duck,N.B.,Giver,L.J.,Christina,I.,&Jeremy,M.,et al.2004,WO 2002036782A3；2002,WO2002036782A2；Green J M,Hazel C B,Raymond F D,et al.2008,Pest ManagementScience,64(4):332-9.)。
具有不同耐受机制的基因叠加，往往能增加基因的效果。为了获得对草甘膦抗性更高的转基因作物和提高抗草甘膦基因的多样性，生产中仍需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的转基因作物。提高转基因植物的抗性水平能够提高草甘膦的使用剂量，从而可以减缓抗性杂草的发生，同时还可以避免使用过程中由于剂量问题而造成药害。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种基因，这种基因能够通过2种不同草甘膦耐受机制赋予植物草甘膦抗性，可以用来生产高抗草甘膦植物。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种抗草甘膦融合基因，包括从5’-3’依次为编码N端连接叶绿体转运肽(CTP)的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶多肽(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate(EPSP)synthase：EPSPS)的核苷酸序列和编码一种草甘膦N-乙酰转移酶多肽或者草甘膦氧化酶多肽的核苷酸序列；且上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内；EPSPS多肽和草甘膦氧化酶多肽或者草甘膦氧化酶多肽可以为全长或者截断的活性多肽片段，具体所述融合基因由EPSPS蛋白编码基因和草甘膦N-乙酰转移酶构成或由EPSPS蛋白编码基因和草甘膦氧化酶编码基因构成；所述EPSPS蛋白编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7或G10；所述草甘膦N-乙酰转移酶编码基因为GAT，所述草甘膦氧化酶编码基因为GOX。
进一步，所述融合基因由EPSPS蛋白编码基因和草甘膦N-乙酰转移酶编码基因构成；所述EPSPS蛋白编码基因为CP4，所述融合基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述融合基因由EPSPS蛋白编码基因和草甘膦氧化酶编码基因构成；所述EPSPS蛋白编码基因为CP4，所述融合基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种所述抗草甘膦融合基因编码蛋白，具体当所述EPSPS基因为CP4，所述的草甘膦N-乙酰转移酶基因为GAT时，所述编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.3；当所述EPSPS基因为CP4，所述的草甘膦氧化酶基因为GOX时，所述编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
此外，本发明还提供一种所述抗草甘膦融合基因编码蛋白在制备抗除草剂转基因作物中的应用，所述作物包括单子叶作物和双子叶作物，更优选所述作物为玉米、水稻、大豆、小麦或和油菜。
本发明设计的用N端连接CTP的EPSPS多肽和一种草甘膦N-乙酰转移酶多肽或者草甘膦氧化酶多肽融合成的人工蛋白质分子，与现有的抗草甘膦蛋白相比具有如下优点：可以通过2中不同的耐受机制抗草甘膦；可以通过一个基因赋予转基因植物2种草甘膦耐受机制和高抗草甘膦特性。
本发明提供的抗草甘膦融合蛋白可以应用于单子叶植物和双子叶植物的抗草甘膦方面，主要应用于抗除草剂抗虫玉米、水稻、大豆、小麦和油菜。
(四)附图说明
图1：抗草甘膦融合蛋白的结构示意图。融合蛋白中N端为N端连接CTP的EPSPS多肽，C端为编码一种草甘膦N-乙酰转移酶多肽或者草甘膦氧化酶多肽。
图2：融合蛋白表达载体T-DNA的结构示意图。pUBI为玉米泛素启动子，融合蛋白为抗草甘膦融合蛋白编码基因，p35S为花椰菜花叶病毒35S启动子，G10EPSPS为抗草甘膦基因。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Labortory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。
实施例1抗草甘膦融合蛋白表达载体的构建
EPSPS基因CP4和草甘膦N-乙酰转移酶基因GAT融合构成的融合基因被命名为CP4-GAT基因，编码的蛋白质多肽序列如SEQ ID NO：3所示。EPSPS基因CP4和草甘膦氧化酶基因GOX融合构成的融合基因被命名为CP4-GOX基因，编码的蛋白质 多肽序列如SEQ ID NO：4所示。
CP4-GAT基因(核苷酸序列如：SEQ ID NO：1中第224-2053个碱基所示)及其基因5’端的叶绿体转运肽CTP(核苷酸序列如：SEQ ID NO：1中第11-223个碱基所示)和3’端的终止子序列(SEQ ID NO：1中第2054-2259个碱基所示)，该基因通过人工合成，在5’端设置了BamHI酶切位点，在3’端设置了KpnI酶切位点，序列如SEQ ID NO：1所示。CP4-GOX基因(核苷酸序列如：SEQ ID NO：2中第224-2898个碱基所示)及其基因5’端的叶绿体转运肽CTP(核苷酸序列如：SEQ ID NO：2中第11-223个碱基所示)和3’端的终止子序列(SEQ ID NO：2中第2909-3114个碱基所示)，该基因通过人工合成，在5’端设置了BamHI酶切位点，在3’端设置了KpnI酶切位点，序列如SEQ ID NO：2所示。
pUBI为玉米泛素蛋白启动子，通过PCR获得。设计PCR引物pUBI-F(5’GAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCC)和pUBI-R(5’GGGTGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAAC)，以商业玉米品种郑单958的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得pUBI。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃2分钟，重复32个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2.0Kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，用HindIII和BamHI双酶切得到pUBI，并且DNA序列测定表明核苷酸序列正确(SEQ ID NO：5)。
G10EPSPS为抗草甘膦基因(中国专利：201110009329.0)。通过人工合成G10EPSPS基因(SEQ ID NO：6)。合成的基因5’端连接有玉米乙酰乳酸合成酶AHAS叶绿体转运信号肽且设置有XhoI酶切位点，3’端连接有终止子且设置有XhoI酶切位点。
农杆菌T-DNA载体的构建：双元载体pCambia1300-p35S-G10由载体pCambia1300修改而来，简单的说就是把pCambia1300载体中的抗潮霉素基因置换为抗草甘膦基因G10EPSPS。具体把pCambia1300载体经过XhoI酶切以后，去磷酸化处理，然后与经过XhoI酶切后获得的人工合成的含有叶绿体转运信号肽和终止子的G10EPSPS基因片段进行两端连接，转化，获得的载体即为pCambia1300-p35S-G10。
为了获得CP4-GAT基因表达载体，用HindIII和KpnI对之前构建好的pCambia1300-p35S-G10进行双酶切，回收获得载体；用HindIII和BamHI酶切含有pUBI启动子的质粒，获得pUBI片段；用BamHI和KpnI对含有人工合成的CP4-GAT基因及其终止子的质粒，回收得到CP4-GAT片段。然后，把上述酶切后的载体和两 个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-融合基因-终止子-启动子-G10EPSPS-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-pUBI-CP4-GAT–p35S-1174(图2)。
为了获得CP4-GOX基因表达载体，用HindIII和KpnI对之前构建好的pCambia1300-p35S-G10进行双酶切，回收获得载体；用HindIII和BamHI酶切含有pUBI启动子的质粒，获得pUBI片段；用BamHI和KpnI对含有人工合成的CP4-GOX基因及其终止子的质粒，回收得到CP4-GOX片段。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-融合基因-终止子-启动子-G10EPSPS-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-CP4-GOX-pat–p35S-1174(图2)。
最后，通过电转的方法把上述2个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例2、水稻的转化
转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取实施例1中构建的载体pCambia1300-pUBI-CP4-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-GOX–p35S-1174的农杆菌划板。挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6左右的农杆菌菌液中(农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种至培养基，28℃培养至OD为0.6左右；培养基组成：3g/L K2HPO4、1g/LNaH2PO4、1g/LNH4Cl、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl2、0.0025g/L FeSO4·7H2O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，28℃共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，28℃筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+1mg/L NAA+5mg/L 6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite) 上，28℃培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。分别获得含上述转化载体和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株。
实施例3、融合蛋白转基因水稻草甘膦抗性分析
将实施例2方法制备的转基因水稻植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因水稻植株和非转基因受体对照植株“秀水-134”的抗除草剂性能进行比较分析。我们对获得的201个转pCambia1300-pUBI-CP4-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为CGAT)和230个转pCambia1300-pUBI-CP4-GOX–p35S-1174载体的转基因株系(命名为CGOX)进行不同浓度草甘膦抗性测定，抗性效果如表1所示：
表1*：
2x 4x 6x
CGAT抗性转化事件个数 201 178 92
CGOX抗性转化事件个数 230 211 118
*注：表1为对播种后15天的水稻植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草甘膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。2x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:150稀释，4x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:75稀释，6x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:50稀释。
实施例4、玉米的转化
玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:Vladimir Sidorov&David Duncan(in M.Paul Scott(ed.),Methods in MolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei&Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediatedtransformation of maize.Nature Protocols 2:1614-1622。基本方法如下：取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将实施例1中制备的含有T-DNA载体pCambia1300-pUBI-CP4-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-GOX–p35S-1174的农杆菌与未成熟胚在共培养培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+5mg/L AgNO3+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L kinetin+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。分别获得含转化载体pCambia1300-pUBI-CP4-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-GOX–p35S-1174的转基因玉米植株。
实施例5、融合蛋白转基因玉米草甘膦抗性分析
将实施例4制备的转基因玉米植株的T0代植株移栽到温室中，用商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)的花粉进行授粉，收获T0代种子。然后将这些品系与商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)进行回交转育，获得Z58近等位基因系。再对这些近等位基因系的除草剂抗性进行比较分析。
我们对获得的84个转pCambia1300-pUBI-CP4-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为CGAT)和66个转pCambia1300-pUBI-CP4-GOX–p35S-1174载体的转基因株系(命名为CGOX)进行不同浓度草甘膦抗性测定，抗性效果如表2所示：
表2*：
2x 4x 6x
CGAT抗性转化事件个数 79 67 43
CGOX抗性转化事件个数 55 40 29
*注：表2为对播种后15天的水稻植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草甘膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株“Z58”没有显著差异的株系为抗性转化事件。2x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:150稀释，4x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:75稀释，6x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:50稀释。
实施例6.大豆转化
这里使用的获得转基因大豆的步骤来自于已有的技术(Deng et al.,1998,PlantPhysiology Communications 34:381-387；Ma et al.,2008,ScientiaAgriculturaSinica 41:661-668；Zhou et al.,2001,Journal of NortheastAgricultural University 32:313-319)。选取健康、饱满、成熟的“天隆1号”大豆，用80％乙醇消毒2分钟，再用无菌水清洗，然后放置在充满氯气(由50mlNaClO与2ml浓HCl反应生成)的干燥器中灭菌4-6个小时。灭菌后的大豆在超净工作台里被播撒到B5培养基中，25℃条件下培养5天，同时光密度在90-150μmol光子/m2·s水平。当子叶变绿并顶破种皮，无菌的豆芽就会长出。去掉了下胚轴的豆芽在长度上被切成五五开，使得两片外植体都具有子叶和上胚轴。在子叶和上胚轴的节点处切外植体大约7-8处，即可用作被侵染的目标组织。
分别含有载体pCambia1300-pUBI-CP4-GAT-p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-GOX-p35S-1174的单克隆农杆菌被分开培养待用。准备好的外植体浸没在农杆菌悬浮液中共培养30分钟左右。然后，将侵染的组织上多余的细胞悬浮液用吸水纸吸收干净，再转移到1/10B5共培养培养基里25℃暗培养3-5天。
共培养的植物组织用B5液体培养基清洗，以除去多余的农杆菌，然后放置到B5固体培养基中25℃下培养5天，待其发芽。诱导发生的胚芽组织转移到含有0.1-0.5mM草甘膦的B5筛选培养基中，25℃光照培养4周，期间每两周更换一次培养基。筛选出来的胚芽组织再转移到固体培养基中，25℃培养，待其长成小苗。随后，将转基因植株苗转移到1/2B5培养基中进行生根诱导。最后，长成的小植株经清洗去除琼脂后栽种在温室中。
实施例7、融合蛋白转基因大豆草甘膦抗性分析
将实施例6方法制备的转基因水稻植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因水稻植株和非转基因受体对照植株“天隆1号”的抗除草剂性能进行比较分析。我们对获得的39个转pCambia1300-pUBI-CP4-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为CGAT)和42个转pCambia1300-pUBI-CP4-GOX–p35S-1174载体的转基因株系(命名为CGOX)进行不同浓度草甘膦抗性测定，抗性效果如表3所示：
表3*：
*注：表3为对播种后15天的水稻植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草甘膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。2x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:150稀释，4x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:75稀释，6x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:50稀释。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗草甘膦融合基因，其特征在于所述融合基因由EPSPS蛋白编码基因和草甘膦N-乙酰转移酶构成或由EPSPS蛋白编码基因和草甘膦氧化酶编码基因构成；所述EPSPS蛋白编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7或G10；所述草甘膦N-乙酰转移酶编码基因为GAT，所述草甘膦氧化酶编码基因为GOX。
2.如权利要求1所述抗草甘膦融合基因，其特征在于所述融合基因由EPSPS蛋白编码基因和草甘膦N-乙酰转移酶编码基因构成；所述EPSPS蛋白编码基因为CP4。
3.如权利要求2所述抗草甘膦融合基因，其特征在于所述融合基因核苷酸序列为SEQID NO.1所示。
4.如权利要求1所述抗草甘膦融合基因，其特征在于所述融合基因由EPSPS蛋白编码基因和草甘膦氧化酶编码基因构成；所述EPSPS蛋白编码基因为CP4。
5.如权利要求2所述抗草甘膦融合基因，其特征在于所述融合基因核苷酸序列为SEQID NO.2所示。
6.一种权利要求1所述抗草甘膦融合基因编码蛋白。
7.如权利要求6所述编码蛋白，其特征在于所述编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
8.一种利用权利要求6所述抗草甘膦融合基因编码蛋白在制备抗除草剂转基因作物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述作物包括单子叶作物和双子叶作物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述作物为玉米、水稻、大豆、小麦或和油菜。
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