CN104894141A - 棉花的固醇载体蛋白基因及其应用 - Google Patents
棉花的固醇载体蛋白基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104894141A CN104894141A CN201510254831.6A CN201510254831A CN104894141A CN 104894141 A CN104894141 A CN 104894141A CN 201510254831 A CN201510254831 A CN 201510254831A CN 104894141 A CN104894141 A CN 104894141A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- carrier protein
- cotton
- sterol carrier
- protein gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 title claims abstract description 45
- 108010058363 sterol carrier proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 18
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 17
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 abstract description 33
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 16
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 7
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 abstract description 5
- 235000009429 Gossypium barbadense Nutrition 0.000 abstract description 3
- 235000018322 upland cotton Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 32
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 16
- 101000821490 Arabidopsis thaliana Sterol carrier protein 2 Proteins 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 4
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 2
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N UNPD88870 Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)=CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 HZYXFRGVBOPPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 210000000630 fibrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N stigmasterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 HCXVJBMSMIARIN-PHZDYDNGSA-N 0.000 description 2
- 235000016831 stigmasterol Nutrition 0.000 description 2
- 229940032091 stigmasterol Drugs 0.000 description 2
- BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N stigmasterol Natural products CCC(C=CC(C)C1CCCC2C3CC=C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C BFDNMXAIBMJLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC OZSITQMWYBNPMW-GDLZYMKVSA-N 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 244000223072 Narcissus jonquilla Species 0.000 description 1
- 235000013862 Narcissus jonquilla Nutrition 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- XLBIBBZXLMYSFF-UHFFFAOYSA-M Propantheline bromide Chemical compound [Br-].C1=CC=C2C(C(=O)OCC[N+](C)(C(C)C)C(C)C)C3=CC=CC=C3OC2=C1 XLBIBBZXLMYSFF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- 101710126903 Sterol carrier protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- LIQLLTGUOSHGKY-UHFFFAOYSA-N [B].[F] Chemical compound [B].[F] LIQLLTGUOSHGKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 150000008103 phosphatidic acids Chemical class 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229940099209 probanthine Drugs 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- SIARJEKBADXQJG-LFZQUHGESA-N stearoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 SIARJEKBADXQJG-LFZQUHGESA-N 0.000 description 1
- 102000005963 steroid binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020003178 steroid binding proteins Proteins 0.000 description 1
- -1 sterol glucoside Chemical class 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了棉花的固醇载体蛋白基因及其应用。固醇载体蛋白基因Gh SCP2D,该基因ORF序列为:SEQ ID NO.1;该基因基因组序列为SEQ ID NO.2。构建植物反义表达载体对陆地棉进行转基因研究,表达分析发现该基因的表达被显著抑制,转基因植株出现绒长变短的表型,蔗糖含量降低显著。说明本发明固醇载体蛋白基因Gh SCP2D可在改良棉花棉纤维发育过程中蔗糖运输和改良棉花纤维伸长中应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,涉及棉花的固醇载体蛋白基因及其应用。
技术背景
棉花作为世界性的重要经济作物,产生的天然纤维是重要的纺织工业原料。由于纺织工业发展的不断加快,要求适应各种需求的更整齐的棉纤维,再加上人们保健意识的增强和生活水平的提高,对棉纤维品质改良的要求愈加迫切。
近10年来,棉花育种从侧重外在品质转变为侧重内在品质。目前,国内外除了利用常规育种手段外,还逐步运用遗传工程对棉纤维品质进行遗传改良,而此项工作的展开首先依赖于对棉纤维发育相关基因及其调控元件的识别与分离。
棉纤维发育过程有几千个基因表达,其相关基因的分离鉴定以及调控研究起步较晚,但进展很快。自从John和Crow(1992)首次报道运用cDNA文库差异筛选方法克隆纤维特异表达基因E6后,先后有数十个纤维发育相关基因被分离出来。目前大部分的纤维发育相关基因主要是通过DNA或cDNA克隆的随机测序、文库差异筛选和mRNA差异显示等方法获得。从目前国内外的研究进展来看,已克隆的棉纤维发育相关基因有100多个,且多数是在纤维伸长阶段的纤维细胞中特异表达,利用分子生物学方法改良棉纤维的尽管有一定的进展,但是潜力还远没有发挥。
固醇载体蛋白(SCP2)是作为一个蛋白结构域,在体外能提高脂类在膜之间的转运。最初人们认为固醇载体蛋白只是一类固醇结合蛋白,但是最近的研究发现它也能结合磷脂、脂肪酸和脂酰CoA。动物和昆虫的固醇载体蛋白最初存在5个标准的β折叠和5个α螺旋。C-端的部分β折叠和4个α螺旋形成疏水通道,有利于与脂类结合(Choinowski et al.,2000;Haapalainen et al.,2001;Dyer et al.,2003)。尽管固醇载体蛋白在哺乳动物细胞中研究了很多,但是其生物学功能到现在还不是很清楚(Gallegos et al.,2001;Seedorf et al.,2000;Stolowich et al.,2002)。一种假说认为固醇载体蛋白参与胆固醇在细胞质中的转移,然而还有些人认为固醇载体蛋白参与脂肪酸的过氧化物酶体氧化。在其他真核生物中也发现了含有SCP2的多结构域蛋白。UNC-24线虫中的含有SCP2结构域的溴化丙胺太林基因(Barnes et al.,1996)。在丛枝菌根真菌中的DBP中发现了SCP2结构域(Requena et al.,1999)。在黄热病蚊子埃及伊蚊中发现在SCP-X基因中发现了非融合的SCP2结构域(Krebs and Lan,2003;Lan and Wessely,2004)。在植物(Edqvist et al.,2004),酵母(Szabo et al.,1989;Hwang et al.,1991),古菌(Kawashima et al.,2000)和细菌中,SCP2作为单独的一个基因存在。
Johan Edqvist等(2004)首先从拟南芥中克隆到第一个与哺乳动物具有高度相似的固醇载体蛋白,命名为AtSCP2。该蛋白与人类D型双功能蛋白(DBP)中的SCP2-like具有35%的相似度和56%相似性。与人类SCP2具有30%的相似度和54%相似性。通过研究AtSCP2晶体结构发现,它具有一个特别适合脂类结合的疏水性的配体结合位点。AtSCP2在体外具有转移氟硼二吡咯-卵磷脂(BODIPY-PC)的活性。但是这种转移活性被1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱或麦角甾醇完全抑制。而二肉豆蔻酰磷脂酸(Dimyristoyl phosphatidic acid)、豆甾醇(stigmasterol)、固醇葡糖苷(steryl glucoside)和胆固醇(cholesterol)对于这种转移能力的影响较弱。而单链棕榈酸(single chain palmitic acid)和硬脂酰辅酶A对转移没有影响。AtSCP2的mRNA在拟南芥的大部分组织中都积累。亚细胞定位结果显示该蛋白定位于过氧化物酶体(Edqvist et al.,2004)。
Zheng等人(2010)研究拟南芥中固醇载体蛋白(AtSCP2)的突变体时发现,AtSCP2对于拟南芥的种子发育和幼苗的建成具有重要的作用。他们在不添加蔗糖培养基上,AtSCP2突变体与野生型相比,根和下胚轴明显变短,子叶莲座直径也明显变小。而在添加蔗糖的情况下,AtSCP2突变体与野生型相比生长情况几乎没有差别。他们还发现AtSCP2在拟南芥中的表达部位主要有胚乳、胚、48小时子叶的维管束,莲座叶的绒毛、花托、萼片和花瓣的维管束、心皮的柱头和雌蕊、花丝和花粉,并且这个基因在幼苗时期受蔗糖诱导表达。但该基因在棉花纤维中的作用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供棉花的固醇载体蛋白基因。
本发明的另一目的是提供该基因的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现:
固醇载体蛋白基因Gh SCP2D,该基因ORF序列为:SEQ ID NO.1;该基因基因组序列为SEQ ID NO.2。
含有本发明所述的固醇载体蛋白基因Gh SCP2D的重组表达载体。
本发明所述的固醇载体蛋白基因Gh SCP2D在改良棉花棉纤维发育过程中蔗糖运输中的应用。
本发明所述的固醇载体蛋白基因Gh SCP2D在改良棉花纤维伸长中的应用。
有益效果:
(1)本发明所克隆的基因编码固醇载体蛋白,固醇载体蛋白与棉纤维伸长时期的蔗糖运输密切相关,是碳运输途径中的关键基因。这样本发明所克隆的基因与棉纤维的品质有着直接的联系。由于蔗糖是在纤维伸长时期是维持细胞膨压的可溶性糖来源,又是合成细胞壁的原料。因此,过量表达该基因理论上可使纤维素含量增加,纤维品质得到改变,打破传统的产量品质相关性。通过过表达该基因可以提高纤维细胞中的蔗糖含量,可促进棉纤维伸长。由此推断,以本发明棉花固醇载体蛋白基因作为靶基因进行转基因研究,有望改善棉纤维品质。
(2)本发明基因组全长序列是PCR(TAIL-PCR)技术获得的,该技术具有起始模板量小,试验步骤简单易行而且灵敏度高的优点。
(3)本发明所克隆的基因从结构上来看更类似于拟南芥的固醇载体蛋白基因,在棉花中前人还未探讨过其功能。
(4)定量RT-PCR结果表明该基因在纤维发育特异表达,在不同时期表达量有差异,该基因在根,茎,叶,子叶和花器官中不表达,在纤维起始时期即开始表达,在纤维快速伸长时期表达量最高(5、10天),但是到了纤维快速伸长和次生壁增厚时期表达量逐渐下降(15、20和25天),这一结果证明了该基因与纤维发育过程密切相关。
(5)构建植物反义表达载体对陆地棉进行转基因研究,表达分析发现该基因的表达被显著抑制,转基因植株出现绒长变短的表型,反义转基因植株纤维平均比对照短2.7mm,使该基因与棉纤维发育相关的功能得到直接验证。
(6)总糖和各种糖含量测定发现,转基因植株中的总糖含量,葡萄糖,果糖和蔗糖含量都明显降低,特别是蔗糖含量降低显著,说明这个基因与蔗糖运输的密切相关,使该基因参与蔗糖运输的功能得到直接验证。
附图说明
图1 28k_178_A11和AtSCP2的氨基酸序列比对和分析,说明GhSCP2D属于固醇载体蛋白家族基因。
AtSCP2(NC_003076.8)为拟南芥固醇载体蛋白基因,固醇载体蛋白(SCP)结构域和过氧化物酶体信号肽1(PTS1)分别使用蓝色和红色框标注。
图2组织表达分析,定量RT-PCR检测棉花固醇载体基因(GhSCP2D)在棉花不同组织表达特点。
1-5分别为棉花根、茎、叶、子叶和花器官;6-10分别为棉花5、10、15、20、25DPA的纤维;11-16分别为0、5、10、15、20、25DPA的胚珠,平均值和标准差根据三个重复计算。
图3转基因植株PCR检测,卡那和目的基因的双重检测初步表明该基因反义载体已导入棉花。
NPT-II基因为卡那抗性标记基因;M、P、C分别为分子量Marker、质粒阳性对照、受体阴性对照;1-6是以35S为启动子的反义表达载体的转基因植株。
图4GhSCP2D在转基因棉花中的表达分析。
受体W0为对照,103,108和150分别为转基因纯合株系。1-4分别为0DPA胚珠、5DPA纤维、10DPA纤维和15DPA纤维。平均值和标准差根据三个重复计算,**表示在0.01水平的显著差异。
图5转基因植株和受体W0的纤维长度比较,表明反义转基因植株的纤维长度变短。
103,108和150分别是三个转基因纯合株系,NPTⅡ和W0分别表示转pBI121空质粒的转基因植株和非转基因受体W0。
具体实施方式
实施例1 棉花固醇载体蛋白全长序列的获得:
本实验利用SAM(Significant Analysis of Microarray)软件的multiclass方法对28k棉花芯片上10,902个基因不同时期的信号强度分析,得到了6,186个时期差异表达基因(q-value≤5%)。对6,186个时期差异表达基因的11个时期平均最高信号强度值和次之信号值利用t-test方法(P<0.05)和1.5倍差异标准筛选,最终得到了192个时期特异表达的基因。其中有一个CDS序列28k_178_A11,在纤维不同发育时期差异表达异常显著。根据这个CDS序列,我们设计引物,从陆地棉中分别扩增该基因的ORF全长和基因组序列。扩增所用引物见表1。
表1:扩增所用引物
实施例2 棉花固醇载体蛋白的生物信息学初步分析
生物信息学的初步分析发现28k_178_A11的ORF推断氨基酸序列经BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比较,发现其与拟南芥固醇载体蛋白基因(AtSCP2)氨基酸序列具有很高同源性(77%),命名为GhSCP2D。纤维发育的研究表明糖的运输和代谢在纤维发育中起着至关重要的作用。据此,我们推测棉花中的固醇载体蛋白基因GhSCP2D与棉纤维发育密切相关。
在NCBI网站CD Search中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对该基因的保守结构域预测发现,GhSCP2D具有完整的固醇载体蛋白结构域。在过氧化物酶体信号肽预测网站预测其信号肽(http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.jsp)发现,该基因具有过氧化物酶体信号肽1(PTS1)。
实施例3 棉花固醇载体蛋白基因的定量RT-PCR分析
设计特异引物:
F2:5’-AAGGAGATGTTATCAAAGGTGAAT-3’(SEQ ID NO.5)
R2:5’-AACCCCTCATAAAAGCAACC-3’(SEQ ID NO.6)
进行定量RT-PCR检测,结果表明该基因在根,茎,叶,子叶和花器官不表达,在纤维发育各不同时期差异表达(图1),在纤维起始即开始表达(开花前3天),随后表达量逐渐提高,在纤维快速伸长期(开花后5和10天)表达量最高,随后表达量逐渐下降。
实施例4 棉花固醇载体蛋白基因的转基因功能验证
pBI121是一种传统的植物双元表达载体,其启动子为35S启动子。以此为基础构建了35S启动子的反义双元载体,反义片段的插入位置为35S-P(启动子)与Nos-T(终止子)之间。
以本发明基因SEQ NO ID.1序列全长片段构建反义植物表达载体,具体过程如下:
1.含有366bp目的片段的克隆载体经BamH I,SacI酶切,回收片段;pBI121表达载体经BamH I,SacI酶切,切除Gus基因,回收大片段(约13kb)。由于BamH I和SmaI均为平末端,366bp目的片段和经酶切回收的pBI121表达载体大片段连接就将反义片段构建到了pBI121载体上。
2.通过农杆菌介导法转化棉花进行功能验证,获得35S启动子反义转基因植株。反义转基因植株均已通过PCR鉴定:35S启动子反义转基因植株扩增得到289bp阳性条带,(图4)。表达分析发现在转基因植株中该基因的表达被显著抑制,纤维长度变短,反义转基因植株纤维平均比对照短3.7mm,使该基因与棉纤维发育相关的功能得到直接验证(图5)。
实施例5 棉花固醇载体蛋白基因的转基因植株中糖含量测定
取转基因植株和受体的开花后5天和10天的纤维,参照Xiang等人(2008)的方法,测定转基因植株中的糖含量,发现转基因植株中的总糖含量,葡萄糖,果糖和蔗糖含量都明显降低, 特别是蔗糖含量降低显著,在三个转基因株系中分别降低25.11%,26.06%和29.98%,说明这个基因与蔗糖运输的密切相关(表2)。
表2
Claims (5)
1.固醇载体蛋白基因Gh SCP2D,其特征在于该基因ORF序列为:SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1固醇载体蛋白基因Gh SCP2D,其特征在于该基因基因组序列为SEQ ID NO.2。
3.含有权利要求1所述的固醇载体蛋白基因Gh SCP2D的重组表达载体。
4.权利要求1所述的固醇载体蛋白基因Gh SCP2D在改良棉花棉纤维发育过程中蔗糖运输中的应用。
5.权利要求1所述的固醇载体蛋白基因Gh SCP2D在改良棉花纤维伸长中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510254831.6A CN104894141B (zh) | 2015-05-18 | 2015-05-18 | 棉花的固醇载体蛋白基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510254831.6A CN104894141B (zh) | 2015-05-18 | 2015-05-18 | 棉花的固醇载体蛋白基因及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104894141A true CN104894141A (zh) | 2015-09-09 |
CN104894141B CN104894141B (zh) | 2017-08-11 |
Family
ID=54027100
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510254831.6A Expired - Fee Related CN104894141B (zh) | 2015-05-18 | 2015-05-18 | 棉花的固醇载体蛋白基因及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104894141B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101503690A (zh) * | 2008-02-04 | 2009-08-12 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 用rdl1基因促进植物种子增大和棉纤维增长的方法 |
CN101633934A (zh) * | 2008-07-25 | 2010-01-27 | 西南大学 | 表达生长素合成相关基因的植物表达载体及其在棉花纤维性状改良的应用 |
-
2015
- 2015-05-18 CN CN201510254831.6A patent/CN104894141B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101503690A (zh) * | 2008-02-04 | 2009-08-12 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 用rdl1基因促进植物种子增大和棉纤维增长的方法 |
CN101633934A (zh) * | 2008-07-25 | 2010-01-27 | 西南大学 | 表达生长素合成相关基因的植物表达载体及其在棉花纤维性状改良的应用 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
BAKKER,E.等: "Arabidopsis lyrata subsp. lyrata sterol carrier protein 2 (SCP-2) family protein, mRNA,Accession No:XM_002863679.1", 《GENBANK》 * |
BINGSONG ZHENG等: "Arabidopsis sterol carrier protein-2 is required for normal development of seeds and seedlings", 《JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY》 * |
PATERSON A.H.等: ""EMBL ID:KJB63834"", 《EMBL》 * |
SWARBRECK,D.等: "Arabidopsis thaliana sterol carrier protein 2 mRNA,complete cds,Accession No:NM_123654.3", 《GENBANK》 * |
楚璞等: "甘蓝型油菜固醇载体蛋白2基因BnSCP-2的克隆与表达", 《中国油料作物学报》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104894141B (zh) | 2017-08-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fichtner et al. | Regulation of shoot branching in Arabidopsis by trehalose 6‐phosphate | |
CN103282377B (zh) | 成熟叶特异性启动子 | |
CN101663398A (zh) | 控制植物的开花时间的svp基因 | |
KR20080083145A (ko) | 구성적 식물 프로모터 | |
CN103695438A (zh) | 拟南芥MYB家族转录因子AtMYB17基因、编码序列及其应用 | |
Sanagi et al. | Sugar-responsive transcription factor bZIP3 affects leaf shape in Arabidopsis plants | |
CN108192920A (zh) | 一种利用ndr1基因提高植物抗病性的方法 | |
CN102202493B (zh) | 植物的耐盐性 | |
EP2195432B1 (en) | Plants having increased biomass | |
JP2022075843A (ja) | 植物調節エレメント及びその使用 | |
Mao et al. | The C-terminal sequence and PI motif of the orchid (Oncidium Gower Ramsey) PISTILLATA (PI) ortholog determine its ability to bind AP3 orthologs and enter the nucleus to regulate downstream genes controlling petal and stamen formation | |
Sun et al. | A conserved RNA recognition motif (RRM) domain of Brassica napus FCA improves cotton fiber quality and yield by regulating cell size | |
CN102482683B (zh) | 能够提供热耐受性的转录调节因子的表达 | |
CN103667317B (zh) | 一种大豆MYB类转录因子GmMYB181的应用 | |
WO2023011487A1 (zh) | 果胶甲酯酶抑制因子基因GhPMEI39及其编码蛋白的应用 | |
CN110612022B (zh) | 产生碳水化合物的植物材料 | |
CN102373224A (zh) | 一种水稻生长素运输蛋白基因及其应用 | |
CN107058341B (zh) | 一种与棉纤维发育相关的wrky转录因子基因及其应用 | |
CN104080915B (zh) | 在遗传修饰的植物中使用酰基辅酶a结合蛋白增强干旱耐受性的方法 | |
Fichtner et al. | The role of trehalose 6-phosphate in shoot branching–local and non-local effects on axillary bud outgrowth in Arabidopsis rosettes | |
WO2021051883A1 (zh) | 陆地棉纤维强度基因GhUBX及其应用 | |
CN104894141A (zh) | 棉花的固醇载体蛋白基因及其应用 | |
CN109234290B (zh) | 甘蓝型油菜BnKAT2基因及其启动子和应用 | |
CN103224552B (zh) | Cpn20蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | |
CN103298829B (zh) | 参与光合组织中基因表达调控的dna |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170811 |