CN111269913A - 组织特异性启动子及其应用和包含启动子的载体与转化子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种驱动基因在植物韧皮部表达的启动子及其应用，含有该启动子的表达载体及转基因植物材料，还涉及相关载体及转基因植物材料在植物基因功能研究中的应用。本发明从普通烟草基因组中获得了一段基因的启动子，随后构建了由该启动子驱动报告基因β‑葡萄糖苷酸酶基因表达的重组载体，将构建的重组载体转化普通烟草，经过多代抗性筛选，获得单拷贝插入的转基因纯合株系；对所获得的转基因纯合植株进行GUS组织化学染色实验，该启动子驱动GUS报告基因只在烟草的茎和叶脉的韧皮部中特异表达。该发明可应用于植物基因韧皮部定位表达、诱导目的基因在韧皮部中特异高效表达等相关基因功能研究。

Description

组织特异性启动子及其应用和包含启动子的载体与转化子

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，特别是指一种组织特异性启动子及包含该启动子的载体和转化子。

背景技术

随着分子生物学的不断发展，转基因技术已经成为研究基因功能不可或缺的手段。转基因技术是将人工分离和修饰过的外源基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改变生物性状的目的。自从1980年代首次获得转基因植物以来，在解决人类面临的粮食、能源和环境危机等方面植物基因工程发挥了重要作用，并展现出了良好的前景。但是在基因工程技术的发展过程中难免会遇到问题，例如：对靶标基因表达的时间(发育阶段的特异性)和空间(组织器官的特异性)的控制不够精确，或者由于启动子对目的基因表达的诱导作用过大，导致目的基因表达量过高，从而影响植物的生长发育。而且，由于启动子序列的高同源性，在多基因转化过程中重复使用相同的启动子则可能会导致基因沉默。

基因表达需要激活剂，其激活剂就是启动子。启动子决定了目的基因表达的时间、空间以及表达量，是转基因工程中的关键因素。启动子是可以被RNA聚合酶识别并与之结合的一段DNA序列，能够起始基因的转录过程。它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，位于结构基因5'端上游区域，启动子本身不被转录。启动子一般由两部分组成：一部分是核心启动区，是形成普遍性转录结构所必须的，包括转录起始点及邻近的TATA框；另一部分是决定基因转录特异性和活性的区域，由许多保守序列组成，这些保守序列之间存在着较大的差异。最早广泛使用的一类启动子属于组成型启动子，这类启动子在所有的组织中都启动基因表达，具有持续性，没有时空特异性从而很难达到定向改变植物形状的目的，往往会产生一些意料之外的结果，甚至会造成一些负面影响。另外，组成型启动子在时空上的持续表达，也会造成植物营养的浪费。

现有技术中，有关韧皮部特异表达启动子的相关研究甚少，因此分离克隆到这样的启动子，提供一种在转基因烟草韧皮部中特异表达外源基因的方法，对于现代转基因技术具有十分重要的意义。

发明内容

本发明提出一种，本发明所要解决的技术问题是针对现有的技术中，植物转基因技术中的启动子诱导外源基因的表达没有器官和组织特异性的缺点，提供一种能够特异诱导外源基因在植物韧皮部表达的启动子，该启动子序列能够诱导外源目的基因在植物韧皮部中的高水平表达。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种组织特异性启动子，所述启动子驱动基因在植物韧皮部表达，所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

进一步，所述启动子驱动烟草类钙调神经素B亚基蛋白5(NtabCBL5)基因在植物韧皮部表达，所述启动子为ProNtabCBL5。

进一步，植物韧皮部为植物茎和叶脉韧皮部。

一种植物表达载体，所述的启动子。

进一步，所述植物表达载体为pBI101-ProNtabCBL5::GUS。

一种转化子，所述的启动子或包含所述的植物表达载体或包含述启动子的宿主或包含所述植物表达载体的宿主。

进一步，所述转化子为细胞系或愈伤组织或转基因植株。

进一步，所述宿主为根癌农杆菌。

一种包含所述的启动子的应用，将所述启动子插入靶标基因后转化植物，使得靶标基因在植物茎和叶脉韧皮部中特异性表达。

本发明的有益效果为：本发明的启动子具有时空特异性的启动子：组织特异性启动子，有时也称为器官特异性启动子。外源基因在这类启动子的驱动下，其表达只限于某些特定的器官或组织部位，并表现出时空特异性。组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。

韧皮部是由筛管和伴胞、筛分子韧皮纤维以及韧皮薄壁细胞等组成的一种输导组织，其主要功能是将叶片中光合作用的产物运输到其它各处。韧皮部与木质部成束状排列共同形成维管束组织，广泛分布在植物体内。本发明的组织特异性启动子能够调控基因在植物韧皮部中特异表达，将该启动子应用于转基因烟草，就可以诱导功能基因在烟草韧皮部中特异性表达。

含有该启动子的表达载体及转化子在植物基因功能研究中的应用。包含启动子的重组载体能够驱动报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因表达，将构建的重组载体转化普通烟草，经过多代抗性筛选，获得转基因纯合株系；对所获得的转基因纯合植株进行GUS组织化学染色实验，该启动子驱动GUS报告基因只在烟草的茎和叶脉的韧皮部中特异表达。该发明可应用于植物基因韧皮部定位表达、诱导目的基因在韧皮部中特异高效表达等相关基因功能研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

附图1为本发明构建的表达载体pBI101-ProNtabCBL5::GUS。

附图2中A、B、C、D和E分别为ProNtabCBL5驱动GUS基因在烟草叶片、叶脉、茎纵切、叶脉横切和茎横切面中的GUS组织化学染色情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

获得烟草类钙调神经素B亚基蛋白5基因(NtabCBL5)的启动子ProNtabCBL5诱导GUS基因在烟草韧皮部中特异表达的转基因植株的过程如下：

将ProNtabCBL5序列连接到表达载体pBI101，获得重组表达载体pBI101-ProNtabCBL5::GUS(如附图1)，利用农杆菌转化法，将该重组质粒转化根癌农杆菌菌株，然后用农杆菌介导的方法进行烟草的转化，得到转基因烟草植株。

对获得的转基因烟草进行组织化学检测，发现转基因植株整体上的GUS基因表达仅在韧皮部处显蓝色，从而证明ProNtabCBL5序列具有驱动目的基因表达的活性，而且该启动子驱动的GUS基因在烟草韧皮部中特异性表达。

下述实施例中的实验方法，如果没有特殊说明，均为常规实验方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

具体操作如下：

1.载体构建

以pBI101双元载体为主骨架，利用烟草类钙调神经素B亚基蛋白5基因(NtabCBL5)的启动子ProNtabCBL5代替载体中原来启动子连接报告基因GUS，构建诱导表达载体pBI101-ProNtabCBL5::GUS(如附图1所示)。

2.遗传转化

遗传转化以烟草为转化受体，利用农杆菌叶盘转化法将所构建的诱导表达载体pBI101-ProNtabCBL5::GUS导入植物受体材料烟草，经过共培养、筛选培养、生根培养、植株移栽、阳性检测、阳性植株自交、抗性筛选等步骤，最终得到单拷贝插入的转基因纯合材料。

3.GUS活性测定

GUS活性的荧光检测参照Jefferson方法。将要染色的组织抽真空，然后浸入到染色液中，37℃下染色8小时。在37℃条件下用95％乙醇处理进行脱色处理，直至阴性对照材料呈现白色。检测转基因烟草植株中GUS的表达活性，结果只在烟草叶脉和茎的韧皮部显示出蓝色(如附图2)，表明本发明的启动子能够诱导GUS基因在烟草的韧皮部上特异表达，能够在植物个体内诱导目的基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 组织特异性启动子及其应用和包含启动子的载体与转化子

<130> 20200208

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2780

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

gttagatttg tccctccgtg ttaatttatg tagcatagtt tgattaggca cgaaatttaa 60

gaactaaata aaaaaaaatt gaaatttgtc atcttgaatg tgtcataaga tttcctaaag 120

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ttattgttga aatctctaaa atttttgtgt cgagggtctt tcggaaacag cctattttcg 2040

gggcaggggt aaggtttgca taaacactac tctccgcaga cccgacatgt gggattatac 2100

tgggttgttg ttgttgttat tgttgaaatc tctaaatacc tttaatagaa tgtacacttt 2160

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tgtagaagaa gtaacattaa cctatatatc cagtataatt ttacgttagc tattgcttcg 2280

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cacaaaaata ttactataaa 2780

Claims (9)

1.一种组织特异性启动子，其特征在于：所述启动子驱动基因在植物韧皮部表达，所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于：所述启动子驱动烟草类钙调神经素B亚基蛋白5(NtabCBL5)基因在植物韧皮部表达，所述启动子为ProNtabCBL5。

3.如权利要求1或2所述的启动子，其特征在于：植物韧皮部为植物茎和叶脉韧皮部。

4.一种植物表达载体，其特征在于：含有权利要求1或2所述的启动子。

5.如权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体为pBI101-ProNtabCBL5::GUS。

6.一种转化子，其特征在于：包含权利要求1或2所述的启动子或包含权利要求4或5所述的植物表达载体或包含权利要求1或2所述启动子的宿主或包含权利要求4或5所述植物表达载体的宿主。

7.如权利要求6所述的转化子，其特征在于：所述转化子为细胞系或愈伤组织或转基因植株。

8.如权利要求6或7所述的转化子，其特征在于：所述宿主为根癌农杆菌。

9.一种包含如权利要求1或2所述的启动子的应用，其特征在于：将所述启动子插入靶标基因后转化植物，使得靶标基因在植物茎和叶脉韧皮部中特异性表达。

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