CN109402077A

CN109402077A - 玉米3-磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH1及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

Info

Publication number: CN109402077A
Application number: CN201811523542.1A
Authority: CN
Inventors: 徐晶宇; 李佐同; 赵莹; 刘梦; 贺琳; 魏金鹏; 赵长江
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2038-12-13
Also published as: CN109402077B

Abstract

本发明公开了玉米3‑磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH1及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。本发明以玉米GPDH基因家族成员ZmGPDH1为研究对象，将其转入野生型拟南芥获得T3代纯合转化子。选取其中OE‑1和OE‑2两个转化子进行耐盐耐旱功能鉴定。以野生型拟南芥为对照，研究ZmGPDH1转基因拟南芥在盐和旱胁迫下的萌发率、根长和鲜重变化。结果表明：在盐胁迫处理条件下，ZmGPDH1转基因拟南芥的种子萌发率显著高于野生型拟南芥，且ZmGPDH1转基因拟南芥的根长、鲜重和长势显著优于对照。表明ZmGPDH1能显著提高转基因植物的耐盐和耐旱能力，ZmGPDH1作为耐逆基因可以被应用于培育玉米耐逆品种。

Description

玉米3-磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH1及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米3-磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH1及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。

背景技术

提高作物耐逆能力已成为当前农业及畜牧业领域技术研究的热点和难点，也是目前亟需解决的重大问题。近几年来，随着功能基因组学及分子生物学的发展，挖掘耐逆关键基因，利用基因工程技术培育具有良好耐逆性状的作物新品种已经成为有效提高作物耐逆能力的手段之一。

3-磷酸甘油(Glycerol-3-phosphate/G-3-P)是油脂代谢过程中的一个重要中间产物，参与植物体内多种生理生化过程。3-磷酸甘油可以通过3-磷酸甘油磷酸化酶(GPP)去磷酸化为甘油，还可作为甘油脂类(包括三酰甘油、甘油磷脂和甘油糖脂)的合成前体。3-磷酸甘油脱氢酶(Glycerol-3-phosphate Dehydrogenase，GPDH)催化3-磷酸甘油和磷酸二羟丙酮之间的可逆氧化还原反应，这类酶广泛存在于各种生物体中，且具有组织特异性和细胞定位特异性。目前除了模式植物拟南芥和一些藻类，GPDH家族在其他高等植物中研究报道的很少，尤其在玉米中尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了ZmGPDH1蛋白质的新用途。

本发明提供了ZmGPDH1蛋白质在调控植物耐逆性中的应用。

本发明还提供了ZmGPDH1蛋白质在调控植物根长和/或鲜重和/或萌发率中的应用。

上述应用中，所述ZmGPDH1蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了与ZmGPDH1蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与ZmGPDH1蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

本发明还提供了与ZmGPDH1蛋白质相关的生物材料在调控植物根长和/或鲜重和/或萌发率中的应用。

本发明还提供了与ZmGPDH1蛋白质相关的生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码ZmGPDH1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码ZmGPDH1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码ZmGPDH1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ZmGPDH1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码ZmGPDH1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ZmGPDH1蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，A2)所述的含有编码ZmGPDH1蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达ZmGPDH1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动ZmGPDH1转录的启动子，还可包括终止ZmGPDH1转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。

可用现有的表达载体构建含有所述ZmGPDH1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中ZmGPDH1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

进一步的，所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(3)中任一种：

(1)转基因植物的种子萌发率高于受体植物；

(2)转基因植物的根长长于受体植物；

(3)转基因植物的鲜重大于受体植物。

更进一步的，所述提高受体植物中ZmGPDH1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达ZmGPDH1蛋白质；所述过表达的方法为将ZmGPDH1蛋白质的编码基因导入受体植物；所述ZmGPDH1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。在本发明的具体实施例中，ZmGPDH1蛋白质的编码基因通过重组载体35S:ZmGPDH1-GFP导入受体植物中，所述重组载体35S:ZmGPDH1-GFP为将pBI121-GFP载体的XbaI和SalI酶切位点之间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的ZmGPDH1基因，且保持pBI121-GFP载体的其他序列不变后得到的载体。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述ZmGPDH1基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法或应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥；所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

本发明以玉米GPDH基因家族成员ZmGPDH1(GRMZM2G155348_T01)为研究对象，将其转入野生型拟南芥获得T3代纯合转化子。选取其中OE-1和OE-2两个转化子进行耐盐和耐旱功能鉴定。以野生型拟南芥为对照，研究ZmGPDH1转基因拟南芥在盐和旱胁迫下的萌发率、根长和鲜重变化。结果发现盐胁迫处理条件下，ZmGPDH1转基因拟南芥的种子萌发率显著高于野生型拟南芥，且转基因株系的根长、鲜重和长势显著优于对照。这些结果表明ZmGPDH1能显著提高转基因植物的耐盐和耐旱能力，ZmGPDH1作为耐逆基因可以被应用于培育玉米耐逆品种。

附图说明

图1为ZmGPDH1基因的表达模式分析。

图2为盐及干旱胁迫处理第五天野生型拟南芥(CK)和转基因拟南芥(OE-1和OE-2)的萌发率统计。

图3为野生型拟南芥及转基因拟南芥的耐逆性检验。

图4为盐及干旱胁迫下野生型拟南芥和转基因拟南芥的根长统计。

图5为盐及干旱胁迫下野生型拟南芥和转基因拟南芥的根长比较。

图6为盐及干旱胁迫下野生型拟南芥和转基因拟南芥的鲜重统计。

图7为盐及干旱胁迫下野生型拟南芥和转基因拟南芥的鲜重比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的数据统计分析方法：利用SPSS16.0(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)软件进行统计分析。单因素方差分析比较不同株系(CK、OE-1和OE-2)在同一处理条件下差异是否具有显著性(P<0.05，one-way ANOVA)。

下述实施例中的pBI121-GFP载体是上海信裕生物科技有限公司的产品，产品目录号或货号为XY2117。

下述实施例中的EHA105农杆菌是上海唯地生物有限公司的产品，产品目录号或货号为AC1010S。

实施例1、盐和渗透胁迫下ZmGPDH1基因在玉米根中的表达模式

1、植物样品的处理

分别利用200mM NaCl和400mM甘露醇处理三叶一心时期玉米(玉米合344自交系)幼苗，于处理不同时间点(0、1、3、6、12及24h)对根系进行取样，液氮速冻，-80℃保存用于提取RNA。

2、RNA的提取及反转录

利用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总的RNA。使用ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA Remover(TOYOBO)反转录，得到cDNA。

3、实时定量PCR

使用Bio-Rad Chromo4real-time PCR系统进行实时定量PCR。玉米ZmGAPDH(XM_020551757)和ZmACTIN(XM_008656735.2)作为内参标准化数据。引物序列如表1所示。相对表达水平利用2^-△△CT方法计算。ZmGPDH1在0h根中的表达水平设为1，其它的处理相应进行计算。每一个样品进行三次独立的生物学重复，每次进行三次技术重复。

表1、实时定量PCR引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		ZmGPDH1-RT-F	5’-AAGGGAGAGTTGAGTCCTG-3’
ZmGPDH1-RT-R	5’-AGTATTCTGT AAAGCCTC-3’
		ZmGAPDH-F	5'-AAGGGAGAGTTGAGTCCTG-3'
ZmGAPDH-R	5'-AGTATTCTGTAAAGCCTC-3'
		ZmACTIN-F	5'-ATCCAGGCTGTTCTTTCGTT-3'
ZmACTIN-R	5'-CATTAGGTGGTCGGTGAGGT-3'

反应体系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)12.5μl，上游引物(0.5μM)，下游引物(0.5μM)，cDNA模板2μl(相当于100ng的RNA)，总体积为25μl。

反应条件如下：94℃，30s；45循环：94℃，12s；58℃，30s；72℃，30s。最后80℃，1s。

结果如图1所示。结果表明：在盐及干旱胁迫处理1h后，ZmGPDH1基因在根部呈显著上调表达。在盐及干旱胁迫处理3h时，ZmGPDH1基因的表达强度达到最大值。以上结果表明在根中ZmGPDH1能够不同程度地被盐和干旱诱导表达，说明ZmGPDH1是玉米根部适应非生物逆境过程中一个重要的调节因子。

实施例2、ZmGPDH1转基因拟南芥的获得及其耐逆性分析

一、ZmGPDH1转基因拟南芥的获得及鉴定

1、以玉米根部cDNA为模板，采用ZmGPDH1-GFP-F和ZmGPDH1-GFP-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下(下划线所示的序列为酶切识别位点)：

ZmGPDH1-GFP-F：5'-GCTCTAGAATGGTTGGGAGCGTGCACGTC-3'；

ZmGPDH1-GFP-R：5'-ACGCGTCGACTGGTTTTCCAAGGAGAGACG-3'。

2、用限制性内切酶XbaI和SalI对pBI121-GFP载体和步骤1获得的PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到重组质粒35S:ZmGPDH1-GFP。并对其进行测序验证。

测序结果表明：重组载体35S:ZmGPDH1-GFP为将pBI121-GFP载体的XbaI和SalI酶切位点之间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的ZmGPDH1基因，且保持pBI121-GFP载体的其他序列不变后得到的载体。重组载体35S:ZmGPDH1-GFP表达序列2所示的ZmGPDH1蛋白质。

3、采用冻融法将重组载体35S:ZmGPDH1-GFP转化EHA105受体菌中，经PCR鉴定得到阳性转化子，用于侵染拟南芥植株。

4、采用蘸花法将含有重组质粒35S:ZmGPDH1-GFP的农杆菌侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。收获T₁代种子并于含50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上筛选。对筛选得到的幼苗产生的下一代再进行PCR筛选，如此重复，最终获得T₃代ZmGPDH1转基因拟南芥纯合株系。

5、提取T₃代ZmGPDH1转基因拟南芥纯合株系的总RNA，通过RT-PCR方法定性检测ZmGPDH1基因的相对表达量，同时以拟南芥基因Actin2(AT5G18780)和UBQ1(AT4G05320)作为内参基因，引物序列如下：

Actin2-F：5′-TTACCCGATGGGCAAGTC-3′；

Actin2-R：5′-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3′；

UBQ1-F：5′-GGCCTTGTATAATCCCTGATGAA-3′；

UBQ1-R：5′-AGAAGTCGACTTGTCATTAGAAAGAA-3′。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明：野生型拟南芥植株的RT-PCR无扩增产物，而ZmGPDH1转基因拟南芥纯合株系OE-1和OE-2均可以扩增出大小为1377bp的目的条带，表明外源基因ZmGPDH1不但已顺利整合到拟南芥的基因组上，而且能够在转基因拟南芥中正常转录表达。选取T₃代ZmGPDH1转基因拟南芥纯合株系OE-1和OE-2用于下一步的耐逆性分析。

二、ZmGPDH1转基因拟南芥的耐逆性分析

1、萌发率实验

1)种子消毒：将野生型拟南芥(WT)和ZmGPDH1转基因拟南芥株系(OE-1和OE-2)种子置于2mL离心管中，先在离心管中加入75％无水乙醇消毒1min，期间不断摇晃振荡，使消毒均匀。瞬时离心10s，沉淀拟南芥种子，弃上清，用无菌水清洗3-5次。然后用10％的NaClO消毒10min，用枪头吸掉上层杂质，用无菌水清洗8-10次，直至无色无味。

2)盐及旱处理：将消毒后的种子分别播种于含100mM NaCl或200mM甘露醇的1/2MS培养基上，置于22±2℃，光照强度80-100μmol·m^-2·s^-1，光照周期为8h黑暗、16h光照的人工气候室中培养。同时以在正常1/2MS培养基中培养作为对照。每次实验使用45-50粒种子，在处理的第三天和第五天分别统计不同株系在NaCl及甘露醇处理条件下的萌发率，并于第7天拍照观察表型。实验进行三次独立的生物学重复。

结果如图2和图3所示。结果表明：在1/2MS(0mM NaCl)对照平板上，ZmGPDH1转基因拟南芥株系的种子萌发率与对照野生型拟南芥株系相比无显著差异。第三天统计结果中，ZmGPDH1转基因拟南芥株系在不同盐浓度下的种子萌发率均显著高于对照野生型拟南芥株系。第五天统计结果中，在NaCl浓度为100mM及甘露醇浓度为200mM的培养基上，ZmGPDH1转基因拟南芥株系的萌发率显著高于对照野生型拟南芥株系(图2)，且长势明显优于对照野生型拟南芥株系(图3)。上述结果表明ZmGPDH1参与拟南芥萌发对盐及干旱胁迫的应答，过表达ZmGPDH1提高了转基因拟南芥对盐及干旱胁迫的抗性。

2、根长实验

将野生型拟南芥(WT)和ZmGPDH1转基因拟南芥株系(OE-1和OE-2)种子消毒(方法同上)处理后播种于1/2MS培养基上，7天以后将长势一致的不同株系的幼苗分别转移到含有150mM NaCl或300mM甘露醇的1/2MS培养基上竖直培养。同时以在正常1/2MS培养基中培养作为对照。每个株系每种胁迫包含45-50株植物。培养条件同上。在胁迫处理的第7天对各株系NaCl及甘露醇处理条件下的根长进行拍照和测定。实验进行三次独立的生物学重复。

结果如图4和图5所示。结果表明：在正常条件下，ZmGPDH1转基因拟南芥株系和对照野生型拟南芥株系根的生长未见差异，然而，在NaCl和甘露醇胁迫条件下，ZmGPDH1转基因拟南芥株系的根长显著长于对照野生型拟南芥株系(图4)，且长势明显优于对照野生型拟南芥株系(图5)。说明ZmGPDH1参与调控盐及干旱胁迫下植物根的生长，根长实验进一步表明ZmGPDH1能够提高拟南芥对盐及干旱胁迫的耐受性。

3、鲜重实验

将野生型拟南芥(WT)和ZmGPDH1转基因拟南芥株系(OE-1和OE-2)种子消毒(方法同上)处理后播种于1/2MS培养基上，春化2天，后于温度为22℃的培养室中培养一周后移植于土壤中(蛭石：珍珠岩：黑土＝1:1:3)，培养3周后，分别用水(对照)、200mM NaCl和400mM甘露醇进行浇灌处理，连续浇灌处理12天后观察苗的表型，并且统计不同株系的鲜重。每个株系每种胁迫包含45-50株植物。实验进行三次独立的生物学重复。

结果如图6和图7所示。结果表明：在正常条件下，ZmGPDH1转基因拟南芥和对照野生型拟南芥株系的鲜重未见差异，然而，在NaCl和甘露醇胁迫条件下，ZmGPDH1转基因拟南芥的鲜重显著大于对照野生型拟南芥株系(图6)，且长势明显优于对照野生型拟南芥株系(图7)。说明ZmGPDH1基因的过表达提高了拟南芥在幼苗生长阶段对盐及旱的耐受性。

通过对ZmGPDH1转基因拟南芥的种子萌发率、根长及鲜重进行统计分析和表型观察，发现ZmGPDH1能显著提高转基因植物的耐盐和耐旱能力，为进一步利用转基因手段培育玉米耐盐耐旱品种提供了理论基础和基因准备。

序列表

<110>黑龙江八一农垦大学

<120>玉米3-磷酸甘油脱氢酶ZmGPDH1及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1377

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggttggga gcgtgcacgt caatggatcg gtccacggcg gcaatggcac ggccacggag 60

gagcggctgg acgagctgcg ccggctgctc ggcaagtcgg agggggacct tctcaagatc 120

gtcagcgtcg gcgccggcgc gtggggcagc gtcttcgccg cgctactaca ggacgcgtac 180

ggccatttcc gggacaaggt gcagataagg atctggcgtc gcccgggccg gacggtggac 240

cgctccaccg cggagcacct gttcgaggtg atcaactcca gggaggacgt gctcaggcgc 300

ctcatccgcc gctgcgccta cctcaagtac gtcgaggcgc ggctcggaga ccgcacgctg 360

tatgccgacg agatactcaa ggacggcttc tgcctgaaca tgatcgagac gccgctctgc 420

cctctcaagg tcgtcactaa cctgcaggag gccgtctggg atgccgacat cgtcgtgaat 480

ggggtgccgt ccaccgagac gagggaggtg tttgatgaga tcagcgagta ttggaaggag 540

aggattagtg tcccggtgat aatttccctc gccaagggaa ttgaggcctc gttggatcca 600

atacctcgta tcattacacc tactcaaatg attagctctg caactggagt tccaactgaa 660

aatatactct atcttggagg accaaacatc gcctcggaaa tttataacaa agaatatgca 720

aacgctcgaa tctgtggatc caacaagtgg aggaagcctc ttgctaagtt tttgaggcag 780

ccacatttca ttgtctggga caacagtgat cttgtcaccc atgaggtgat gggtggcctg 840

aagaatgtct atgcaatcgg tgctggaatg gtggcagctt taacaaacga gagtgcaaca 900

agcaaatctg tatattttgc tcattgcacg tcagagatga tattcattac tcatttgctg 960

acagagcaac ctgagaaact cgctggtcct ctgctggctg acacgtatgt aactctctta 1020

aaaggtcgca atgcatggta tgggcaaatg cttgccaagg gagagttgag tcctgacatg 1080

ggtgatagta tcaaggggaa gggaatgatt cagggtatct ctgcagttgg tgcatttttt 1140

gagctgctta gtcaacccag cttaagtgtg cagcacccag aagaaaacaa gcaggttgct 1200

ccagctgagc tatgcccaat cctgaagagg ctttacagaa tactgataaa aagggagctc 1260

ccagcaaggg acattcttca agccctgagg gacgaaacga tgaatgatcc tcgggaaagg 1320

attgagatgg cacaaagcca tgcattctac cgcccgtctc tccttggaaa accatga 1377

<210>2

<211>458

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Val Gly Ser Val His Val Asn Gly Ser Val His Gly Gly Asn Gly

1 5 10 15

Thr Ala Thr Glu Glu Arg Leu Asp Glu Leu Arg Arg Leu Leu Gly Lys

20 25 30

Ser Glu Gly Asp Leu Leu Lys Ile Val Ser Val Gly Ala Gly Ala Trp

35 40 45

Gly Ser Val Phe Ala Ala Leu Leu Gln Asp Ala Tyr Gly His Phe Arg

50 55 60

Asp Lys Val Gln Ile Arg Ile Trp Arg Arg Pro Gly Arg Thr Val Asp

65 70 75 80

Arg Ser Thr Ala Glu His Leu Phe Glu Val Ile Asn Ser Arg Glu Asp

85 90 95

Val Leu Arg Arg Leu Ile Arg Arg Cys Ala Tyr Leu Lys Tyr Val Glu

100 105 110

Ala Arg Leu Gly Asp Arg Thr Leu Tyr Ala Asp Glu Ile Leu Lys Asp

115 120 125

Gly Phe Cys Leu Asn Met Ile Glu Thr Pro Leu Cys Pro Leu Lys Val

130 135 140

Val Thr Asn Leu Gln Glu Ala Val Trp Asp Ala Asp Ile Val Val Asn

145 150 155 160

Gly Val Pro Ser Thr Glu Thr Arg Glu Val Phe Asp Glu Ile Ser Glu

165 170 175

Tyr Trp Lys Glu Arg Ile Ser Val Pro Val Ile Ile Ser Leu Ala Lys

180 185 190

Gly Ile Glu Ala Ser Leu Asp Pro Ile Pro Arg Ile Ile Thr Pro Thr

195 200 205

Gln Met Ile Ser Ser Ala Thr Gly Val Pro Thr Glu Asn Ile Leu Tyr

210 215 220

Leu Gly Gly Pro Asn Ile Ala Ser Glu Ile Tyr Asn Lys Glu Tyr Ala

225 230 235 240

Asn Ala Arg Ile Cys Gly Ser Asn Lys Trp Arg Lys Pro Leu Ala Lys

245 250 255

Phe Leu Arg Gln Pro His Phe Ile Val Trp Asp Asn Ser Asp Leu Val

260 265 270

Thr His Glu Val Met Gly Gly Leu Lys Asn Val Tyr Ala Ile Gly Ala

275 280 285

Gly Met Val Ala Ala Leu Thr Asn Glu Ser Ala Thr Ser Lys Ser Val

290 295 300

Tyr Phe Ala His Cys Thr Ser Glu Met Ile Phe Ile Thr His Leu Leu

305 310 315 320

Thr Glu Gln Pro Glu Lys Leu Ala Gly Pro Leu Leu Ala Asp Thr Tyr

325 330 335

Val Thr Leu Leu Lys Gly Arg Asn Ala Trp Tyr Gly Gln Met Leu Ala

340 345 350

Lys Gly Glu Leu Ser Pro Asp Met Gly Asp Ser Ile Lys Gly Lys Gly

355 360 365

Met Ile Gln Gly Ile Ser Ala Val Gly Ala Phe Phe Glu Leu Leu Ser

370 375 380

Gln Pro Ser Leu Ser Val Gln His Pro Glu Glu Asn Lys Gln Val Ala

385 390 395 400

Pro Ala Glu Leu Cys Pro Ile Leu Lys Arg Leu Tyr Arg Ile Leu Ile

405 410 415

Lys Arg Glu Leu Pro Ala Arg Asp Ile Leu Gln Ala Leu Arg Asp Glu

420 425 430

Thr Met Asn Asp Pro Arg Glu Arg Ile Glu Met Ala Gln Ser His Ala

435 440 445

Phe Tyr Arg Pro Ser Leu Leu Gly Lys Pro

450 455

Claims

1.ZmGPDH1蛋白质在调控植物耐逆性中的应用；

或，ZmGPDH1蛋白质在调控植物根长和/或鲜重和/或萌发率中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述ZmGPDH1蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

3.与ZmGPDH1蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

或，与ZmGPDH1蛋白质相关的生物材料在调控植物根长和/或鲜重和/或萌发率中的应用；

或，与ZmGPDH1蛋白质相关的生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码ZmGPDH1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

7.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中ZmGPDH1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性；

(1)转基因植物的种子萌发率高于受体植物；

(2)转基因植物的根长长于受体植物；

(3)转基因植物的鲜重大于受体植物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中ZmGPDH1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达ZmGPDH1蛋白质；

或，所述过表达的方法为将ZmGPDH1蛋白质的编码基因导入受体植物；

或，所述ZmGPDH1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

10.根据权利要求1-6任一所述的应用或权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。