CN112251461A - 一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用。本发明提供了一种制备P2‑△VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：(1)将重组农杆菌甲侵染本生烟植株，培养植株；(2)取植株被侵染的组织，提取总蛋白；(3)从总蛋白中纯化得到P2‑△VP8*蛋白。本发明还保护P2‑△VP8*蛋白，为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；(a2)序列表的序列3所示的蛋白质。P2‑△VP8*蛋白可作为轮状病毒疫苗。本发明对于轮状病毒感染的防控具有重大的应用推广价值。

Description

一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
以植物为生物反应器生产人和动物疫苗，是一种正在极速发展的新型生物技术体系。与鸡胚、动物细胞、昆虫细胞体系相比，因其不被动物病原感染的特征，具备很高的生物安全性。植物易于培养和不需无菌操作等特征，使植物产品具备成本低、周期短、易于扩大规模等优势。
轮状病毒(Rotavirus)是引起婴幼儿重症腹泻的主要病因，每年造成约几十万病例婴幼儿死亡，接种疫苗是唯一有效的防控手段。通过两剂以上的免疫程序可获得持久性保护，避免重症腹泻的发生。目前上市的RV疫苗均为口服减毒活疫苗，因其潜在的肠套叠风险，被WHO列为“工艺需要改进的疫苗”。亚单位疫苗由病毒的主要抗原组成并通过注射接种，能有效避免肠套叠的发生。同时亚单位疫苗能实现对流行毒株的精准免疫，应对轮状病毒的变异。
轮状病毒主要的中和抗原为VP7(G蛋白)和VP4(P蛋白)，VP4在消化道被胰蛋白酶裂解为VP5*和VP8*两个片段，其中VP8*亚单位是病毒粒子识别宿主细胞的位点，在不同毒株之间变化很大，是实现精准免疫的主要抗原之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用。
本发明提供了一种制备P2-△VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将重组农杆菌甲侵染本生烟植株，培养植株；
(2)取植株被侵染的组织，提取总蛋白；
(3)从总蛋白中纯化得到P2-△VP8*蛋白。
本发明还提供了一种制备P2-△VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将重组农杆菌甲和重组农杆菌乙共侵染本生烟植株，培养植株；
(2)取植株被侵染的组织，提取总蛋白；
(3)从总蛋白中纯化得到P2-△VP8*蛋白。
本发明还提供了一种制备P2-△VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
采用本生烟植株作为生物反应器，植株叶片被注射重组农杆菌甲，然后培养4-7天，然后取所述叶片提取总蛋白，然后从总蛋白中纯化得到P2-△VP8*蛋白。
本发明还提供了一种制备P2-△VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
采用本生烟植株作为生物反应器，植株叶片被注射重组农杆菌甲和重组农杆菌乙，然后培养4-7天，然后取所述叶片提取总蛋白，然后从总蛋白中纯化得到P2-△VP8*蛋白。
以上任一所述P2-△VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质。
重组农杆菌甲是将表达P2-△VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；P2-△VP8*基因编码P2-△VP8*蛋白。
重组农杆菌乙是将表达P19基因的质粒导入农杆菌得到的；P19基因编码P19蛋白；P19蛋白为序列表的序列7所示的蛋白质。
P19基因来源于番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)。
以上任一所述P2-△VP8*基因为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子。
以上任一所述P19基因为编码区如序列表的序列6所示的DNA分子。
以上任一所述农杆菌为农杆菌EHA105。
以上任一所述培养植株为培养植株4-7天(例如，5天)。
以上任一所述总蛋白为可溶性总蛋白。
表达P2-△VP8*基因的质粒具体可为实施例1构建的重组质粒pAT-P2-△VP8*。
表达P19基因的质粒具体可为质粒pBin61-P19。
将重组农杆菌甲和重组农杆菌乙共侵染本生烟植株具体可为：30天苗龄的本生烟植株，在自下至上计的第5个叶片、第6个叶片和第7个叶片的背面注射侵染液。
植株叶片被注射重组农杆菌甲和重组农杆菌乙具体可为：30天苗龄的本生烟植株，在自下至上计的第5个叶片、第6个叶片和第7个叶片的背面注射侵染液。
侵染液的制备方法：①将重组质粒pAT-P2-△VP8*导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌甲；用MMA溶液重悬重组农杆菌甲，使体系OD600nm＝1.0，室温静置2-4小时；②将质粒pBin61-P19导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌乙；用MMA溶液重悬重组农杆菌乙，使体系OD600nm＝1.0，室温静置2-4小时；③将4体积份步骤①得到的农杆菌菌液和1体积份步骤②得到的农杆菌菌液混合，然后用MMA溶液稀释至体系OD600nm＝0.1，即为侵染液。
所述取植株被侵染的组织，具体可为取被注射过的本叶片。
提取总蛋白的方法包括如下步骤：取被注射过的本叶片，在预冷的研钵中研磨成粉末，然后按照1g叶片(鲜重)配比2ml蛋白提取缓冲液的比例加入蛋白提取缓冲液，4℃振荡30分钟；然后4℃、15000g离心15分钟，收集上清液；取所述上清液，4℃、15000g离心15分钟，收集上清液。
从总蛋白中纯化得到P2-△VP8*蛋白包括如下步骤：取提取总蛋白得到的上清液，采用Ni-NTA Agarose进行纯化，然后采用孔径为3kDa超滤管进行浓缩，收集浓缩液，然后将缓冲体系更换为蛋白缓冲液，得到的溶液即为P2-△VP8*蛋白溶液。
采用Ni-NTA Agarose(Qiagen)进行纯化的具体参数可为：每5ml上清液配比1mlNi-NTA Agarose，4℃结合2小时；然后用3倍柱体积的Wash缓冲液洗涤；然后用3倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，以收集目标蛋白。
将缓冲体系更换为蛋白缓冲液采用ZebaTM Spin Desalting Columns。
以上任一所述方法制备得到的P2-△VP8*蛋白或P2-△VP8*蛋白溶液均属于本发明的保护范围。
本发明还保护P2-△VP8*蛋白，为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质。
本发明还保护P2-△VP8*基因，为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子。
本发明还保护用于制备P2-△VP8*蛋白的试剂盒，包括如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)或(c5)或(c6)：
(c1)P2-△VP8*基因；
(c2)质粒甲；所述质粒甲为表达P2-△VP8*基因的质粒；
(c3)重组农杆菌甲；重组农杆菌甲是将质粒甲导入农杆菌得到的重组农杆菌；
(c4)P2-△VP8*基因和P19基因；
(c5)质粒甲和质粒乙；所述质粒甲为表达P2-△VP8*基因的质粒；所述质粒乙为表达P19基因的质粒；
(c6)重组农杆菌甲和重组农杆菌乙；重组农杆菌甲是将质粒甲导入农杆菌得到的重组农杆菌；重组农杆菌乙是将质粒乙导入农杆菌得到的重组农杆菌。
P2-△VP8*基因编码P2-△VP8*蛋白。
P2-△VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质。
P2-△VP8*基因为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子。
P19基因编码P19蛋白；P19蛋白为序列表的序列7所示的蛋白质。
P19基因为编码区如序列表的序列6所示的DNA分子。
所述农杆菌为农杆菌EHA105。
所述试剂盒还包括本生烟。
(c1)或(c4)所述试剂盒，还包括植物病毒表达载体pAT-P2或质粒p35S-30B。
(c1)或(c4)所述试剂盒，还包括农杆菌。
(c2)或(c5)所述试剂盒，还包括农杆菌。
以上任一所述表达P2-△VP8*基因的质粒中具有如下元件：35S启动子、TMV的复制酶和运动蛋白、所述P2-△VP8*基因、TMV的3’末端非翻译区、35S终止子。
TMV即烟草花叶病毒。
以上任一所述表达P2-△VP8*基因的质粒是以植物病毒表达载体pAT-P2为出发载体，借助SalI和XhoI酶切位点插入外源DNA分子得到的。
植物病毒表达载体pAT-P2：将质粒p35S-30B用PacI和KpnI酶切，然后引入序列表的序列5所示的DNA分子。
本发明还保护以上任一所述P2-△VP8*蛋白或P2-△VP8*蛋白溶液在制备轮状病毒疫苗中的应用。
本发明还保护活性成分为以上任一所述P2-△VP8*蛋白或P2-△VP8*蛋白溶液的轮状病毒疫苗。
本发明还保护以上任一所述试剂盒在制备轮状病毒疫苗中的应用。
本氏烟，拉丁名为Nicotiana benthamiana。
以上任一所述轮状病毒具体为RF毒株。
以上任一所述轮状病毒具体为基因型G6P[1]的轮状病毒。
以上任一所述轮状病毒具体为基因型G6P[1]的RF毒株。
本发明通过农杆菌介导利用本氏烟作为生物反应器制备P2-△VP8*蛋白。农杆菌接种法适于自动化操作。与大肠杆菌相比，植物细胞不产生细菌毒素，且其蛋白修饰体系与动物细胞更为接近，因此植物具备生产更高安全性与有效性的疫苗产品的潜能。采用本发明的方法制备P2-△VP8*蛋白，P2-△VP8*蛋白占本氏烟总可溶蛋白的比例高达10％，可以满足工业化开发的需求。P2-△VP8*蛋白为结构均一的单体可溶蛋白。用P2-△VP8*蛋白免疫小鼠可以诱导强的中和抗体滴度，在轮状病毒攻毒试验中，中和抗体能保护64％乳鼠不产生腹泻，36％的乳鼠腹泻持续1-2天，所有乳鼠不发生重度腹泻的保护率大于98％。本发明为轮状病毒的精准防控提供一种了安全的候选疫苗，同时也为其他疾病的疫苗提供一种潜在的通过植物进行生产的技术体系。
本发明对于轮状病毒感染的防控具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为重组质粒pAT-P2-△VP8*的酶切鉴定结果。
图2为Western Blot结果图。
图3为P2-△VP8*蛋白溶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4为乳鼠腹泻情况的统计结果。
图5为粪便样本中腹泻情况的统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置五次重复实验，结果取平均值。
实施例中所用的轮状病毒RF毒株，基因型G6P[1]，记载于如下文献：James ERichards,Ulrich Desselberger*,Andrew M Lever*.Experimental pathways towardsdeveloping a rotavirus reverse genetics system:synthetic full lengthrotavirus ssRNAs are neither infectious nor translated in permissivecells.PLoS One.8(9):e74328,2013.。
质粒p35S-30B(即文献中的plasmid p35S-30B)，记载于如下文献：Hongge Jia,Yongqi Pang,Rongxiang Fang*.Agroinoculation as a simple way to deliver atobacco mosaic virus-based expression vector.Acta Botanica Sinica 45:770-773,2003。
质粒pBin61-P19表达序列表的序列6所示的P19基因，P19基因编码的蛋白质具有抑制外源基因沉默的作用。质粒pBin61-P19，记载于如下文献：Frank Sainsbury,EvaC.Thuenemann,George P.Lomonossoff*.pEAQ:versatile expression vectors for easyand quick transient expression of heterologous proteins in plants.PlantBiotechnology Journal 7(7):682-693,2009.。
本生烟(Nicotiana benthamiana)，记载于如下文献：Michael M.Goodin*,DavidZaitlin,Rayapati A.Naidu,and Steven A.Lommel.Nicotiana benthamiana:ItsHistory and Future as a Model for Plant–Pathogen Interactions.MolecularPlant-Microbe Interactions 21(8):1015–1026,2008。
实施例1、重组质粒pAT-P2-△VP8*的构建
1、取轮状病毒RF毒株，提取总RNA，反转录得到cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用AT-P2VP8-F和AT-P2VP8-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
Figure BDA0002737641620000061
Figure BDA0002737641620000062
引物中，下划线区域用于与载体进行同源重组，粗体为靶序列特异性序列，斜体为linker序列(编码Gly-Ser)。
3、将质粒p35S-30B用PacI和KpnI酶切，然后引入序列表的序列5所示的DNA分子，得到植物病毒表达载体pAT-P2。植物病毒表达载体pAT-P2中依次具有：35S启动子；TMV的复制酶和运动蛋白；His6标签编码序列、TEV蛋白酶识别位点编码序列、破伤风毒素的T细胞表位P2编码序列、SalI酶切识别序列(GTCGAC)、XhoI酶切识别序列(CTCGAG)；TMV的3’末端非翻译区；35S终止子。TMV即烟草花叶病毒。
4、取植物病毒表达载体pAT-P2，用限制性内切酶SalI和XhoI酶进行双酶切，回收载体骨架。
5、将步骤2得到的PCR扩增产物和步骤4得到的载体骨架进行同源重组，得到重组质粒pAT-P2-△VP8*。
重组质粒pAT-P2-△VP8*已进行测序验证。
重组质粒pAT-P2-△VP8*中，具有序列表的序列4所示的DNA分子，编码序列表的序列3所示的蛋白质(命名为P2-△VP8*蛋白)。
重组质粒pAT-P2-△VP8*的酶切鉴定结果见图1。图1中，M对应DNA Marker，泳道1对应重组质粒pAT-P2-△VP8*，泳道2对应重组质粒pAT-P2-△VP8*的NcoI和KpnI酶切产物。
实施例2、利用本氏烟作为生物反应器制备P2-△VP8*蛋白
MMA溶液(pH5.6)：含10mM MgCl2、10mM MES、100μM AS，溶剂为水。
蛋白提取缓冲液(pH7.5)：含50mM Tris、150mM NaCl、10％(体积百分含量)glycerol、20mM Imidazole、1×complete protease inhibitor cocktail，溶剂为水。
一、制备侵染液
1、将重组质粒pAT-P2-△VP8*导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌；用MMA溶液重悬重组农杆菌，使体系OD600nm＝1.0，室温静置2-4小时。
2、将质粒pBin61-P19导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌；用MMA溶液重悬重组农杆菌，使体系OD600nm＝1.0，室温静置2-4小时。
3、将4体积份步骤1得到的农杆菌菌液和1体积份步骤2得到的农杆菌菌液混合，然后用MMA溶液稀释至体系OD600nm＝0.1，即为侵染液。
二、制备P2-△VP8*重组蛋白
在温室培养本生烟植株。
1、30天苗龄的本生烟植株，在自下至上计的第5个叶片、第6个叶片和第7个叶片的背面注射步骤一制备的侵染液(使整个叶片注满，每个叶片约注射500μl)，然后继续培养5天(实际应用中，培养4-7天均可)，然后收获被注射过的本叶片。
2、取步骤1得到的叶片，在预冷的研钵中研磨成粉末，然后按照1g叶片(鲜重)配比2ml蛋白提取缓冲液的比例加入蛋白提取缓冲液，4℃振荡30分钟；然后4℃、15000g离心15分钟，收集上清液；取所述上清液，4℃、15000g离心15分钟，收集上清液。上清液中，总蛋白浓度约为5μg/μl。
3、30天苗龄的本生烟植株，在自下至上计的第5个叶片、第6个叶片和第7个叶片的背面注射MMA溶液(使整个叶片注满，每个叶片约注射500μl)，然后继续培养5天，然后收获被注射过的本叶片。
4、取步骤3得到的叶片，在预冷的研钵中研磨成粉末，然后按照1g叶片(鲜重)配比2ml蛋白提取缓冲液的比例加入蛋白提取缓冲液，4℃振荡30分钟；然后4℃、15000g离心15分钟，收集上清液；取所述上清液，4℃、15000g离心15分钟，收集上清液。
5、取步骤2得到的上清液(含有总可溶性蛋白)或步骤4得到的上清液(含有总可溶性蛋白)，进行Western Blot。Western Blot采用His-tag抗体(Sigma-Aldrich公司，货号为SAB2702220)。结果见图2。图2中，泳道M对应蛋白marker，泳道1对应步骤4得到的上清液(蛋白上样量为40μg)，泳道2对应步骤2得到的上清液(蛋白上样量为40μg)。箭头表示P2-△VP8*蛋白，分子量为22kDa。
6、取步骤2得到的上清液，采用Ni-NTA Agarose(Qiagen)进行纯化。具体参数：每5ml上清液配比1ml Ni-NTA Agarose，4℃结合2小时；然后用3倍柱体积的Wash缓冲液洗涤；然后用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱，以收集目标蛋白。
Wash缓冲液(pH7.4)：含50mM Tris、150mM NaCl、10％(体积百分含量)glycerol，40mM Imidazole，溶剂为水。
洗脱缓冲液(pH7.4)：含50mM Tris、150mM NaCl、10％(体积百分含量)glycerol，200mM Imidazole，溶剂为水。
7、取步骤6得到的过柱后溶液，采用孔径为3kDa超滤管(Millipore)进行浓缩，收集浓缩液。
8、取步骤7得到的浓缩液，采用ZebaTM Spin Desalting Columns将缓冲体系更换为蛋白缓冲液，得到的溶液即为P2-△VP8*蛋白溶液。
蛋白缓冲液(pH7.4)：含50mM Tris、150mM NaCl、10％(体积百分含量)glycerol，溶剂为水。
9、取P2-△VP8*蛋白溶液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳图见图3。图3中，M对应蛋白marker，泳道1对应P2-△VP8*蛋白溶液。经过灰度扫描，P2-△VP8*蛋白溶液中P2-△VP8*蛋白的纯度为80％。
检测P2-△VP8*蛋白溶液的总蛋白浓度，按照80％纯度换算P2-△VP8*蛋白的浓度，再与步骤2的总蛋白浓度进行参比，P2-△VP8*重组蛋白占本氏烟总可溶蛋白的比例高达10％。
实施例3、P2-△VP8*蛋白作为疫苗的应用
试验动物：5-6周龄Balb/c雌性小鼠。
佐剂为
Figure BDA0002737641620000081
Alum佐剂，Thermo Fisher Scientific，货号为77161。
蛋白缓冲液(pH7.4)：含50mM Tris、150mM NaCl、10％(体积百分含量)glycerol，溶剂为水。
免疫过程：试验第1天，进行第1次免疫；试验第15天进行第2次免疫；试验第29天进行第3次免疫。
疫苗组：将实施例2制备的P2-△VP8*蛋白溶液用蛋白缓冲液稀释，然后和佐剂等体积混匀并乳化，然后免疫试验动物；单只试验动物的单次免疫体积为100μl；单只试验动物的P2-△VP8*蛋白的单次免疫剂量为2μg。P2-△VP8*蛋白的量＝P2-△VP8*蛋白溶液的总蛋白量×80％。
无疫苗组：将蛋白缓冲液和佐剂等体积混匀并乳化，然后免疫试验动物；单只试验动物的单次免疫体积为100μl。
一、检测中和抗体效价
疫苗组的10只试验动物，试验第43天和试验第57天取眼眶血，分离血清，即为供试血清。检测供试血清的中和抗体滴度。
1、将MA104细胞传代至96孔板中，培养16-20小时。
2、取供试血清，60℃水浴30min以灭活补体，然后采用含2μg/ml胰酶的MEM培养基进行4倍梯度稀释，得到各个血清稀释液。
3、取轮状病毒RF毒株，加入无EDTA胰酶并使其浓度为10μg/ml，然后37℃孵育1小时，然后用含2μg/ml胰酶的MEM培养基稀释至200TCID50。
4、将步骤2得到的血清稀释液和步骤3得到的病毒液等体积混合，37℃孵育1小时。
5、完成步骤1后，用MEM培养基清洗细胞3遍，然后每孔加入20μl步骤4得到的混合液，37℃孵育1h。
6、完成步骤5后，吸弃上清，加入含2μg/ml胰酶的MEM培养基，37℃培养3天。
7、完成步骤6后，观察细胞病变情况，计算血清中和抗体效价。
Figure BDA0002737641620000091
lg(TCID50)＝高于50％血清稀释度的对数-距离比×稀释系数的对数＝n
TCID50＝10n,20μl
10n＝1:m，即1:m的血清可保护细胞不病变，即为该份血清的中和抗体效价。
试验第43天中和抗体滴度达到1:301，试验第57天中和抗体滴度达到1:500。
二、动物保护试验
试验第50天的试验动物和Balb/c雄性小鼠合笼，雌鼠自然受孕，分娩后获得乳鼠。
疫苗组试验动物获得的8天龄乳鼠分为两组，一组作为疫苗-攻毒组(30只)，另一组作为疫苗-对照组(30只)。无疫苗组试验动物获得的8天龄乳鼠，作为无疫苗-攻毒组(30只)。
攻毒组：攻毒当天，将母鼠与乳鼠分离，乳鼠饥饿处理1h，并称重记录；采用轮状病毒RF毒株病毒液进行灌胃攻毒，病毒液的TCID50为10-6.5/ml，每只乳鼠灌胃100μl病毒液。对照组：用等体积pH7.4的PBS缓冲液代替病毒液，其他同攻毒组。
攻毒后0-7天，每天观察乳鼠精神状态、腹泻情况根据粪便的颜色、软硬、数量等对乳鼠腹泻进行评分(0-4)。具体评分标准：无0，棕色成形1，棕色软2，黄色软3，黄色稀水样4，肛周粪便污染4。大于2认为腹泻。3为轻度腹泻，4为重度腹泻。将乳鼠的腹泻情况进行记录。
无疫苗保护时，腹泻从攻毒后一天开始，持续4-6天；疫苗保护后，腹泻从攻毒第3天开始，持续1-2天。见图4(**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001)。结果表明，P2-△VP8*免疫使乳鼠不腹泻或腹泻时长大大缩短。
在1-6天收集的所有粪便样本中，88.5％的样本表现为不腹泻。见图5。乳鼠攻毒后，64％的乳鼠表现为不发生腹泻，其余36％的乳鼠轻度腹泻持续1-2天，基本不产生重度腹泻。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 植链（上海）生物科技有限公司
<120> 一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用
<130> GNCYX202606
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Val Ser
20 25 30
Tyr Trp Met Leu Leu Ala Pro Thr Asn Ala Gly Val Val Val Glu Gly
35 40 45
Thr Asn Asn Thr Asn Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn
50 55 60
Val Gln Gln Val Glu Arg Thr Tyr Thr Leu Phe Gly Gln Gln Val Gln
65 70 75 80
Ile Thr Val Ser Asn Asn Ser Gln Thr Lys Trp Lys Phe Val Asp Leu
85 90 95
Ser Lys Arg Thr Gln Asp Gly Asn Tyr Ser Gln His Gly Ser Leu Leu
100 105 110
Ser Thr Pro Lys Leu Tyr Gly Val Met Lys His Gly Gly Lys Ile Tyr
115 120 125
Thr Tyr Asn Gly Glu Thr Pro Asn Ala Thr Thr Asp Tyr Tyr Ser Thr
130 135 140
Thr Asn Phe Asp Thr Val Asn Met Thr Ala Tyr Cys Asp Phe Tyr Ile
145 150 155 160
Ile Pro Leu Ala Gln Glu Ala Lys Cys Thr Lys Tyr Ile Asn Asn Gly
165 170 175
Leu
<210> 2
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caatacatca aggctaattc taagttcatt ggtatcaccg agcttggttc acttgatgga 60
ccatatcaac caacgacttt taatccacct gtaagttatt ggatgttgtt agcaccaacg 120
aacgcggggg tagtagttga aggtacgaac aatacaaaca gatggttagc gacaatatta 180
attgaaccaa atgtacagca agttgagcga acatatacat tatttgggca acaagttcaa 240
ataacagtat caaataattc acagacaaag tggaaatttg tggatctaag taagcggaca 300
caagatggta attattcaca acacggttct ctactgtcaa caccgaaact gtatggagtg 360
atgaaacatg gaggtaaaat ttacacttat aatggagaga caccgaacgc aactactgat 420
tactactcta caactaactt tgacactgta aacatgacag catattgtga tttttatata 480
attccattag cacaagaagc aaaatgcact aaatacataa ataatggatt ataa 534
<210> 3
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser Gly Glu Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile
20 25 30
Gly Ile Thr Glu Leu Gly Ser Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr
35 40 45
Phe Asn Pro Pro Val Ser Tyr Trp Met Leu Leu Ala Pro Thr Asn Ala
50 55 60
Gly Val Val Val Glu Gly Thr Asn Asn Thr Asn Arg Trp Leu Ala Thr
65 70 75 80
Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val Gln Gln Val Glu Arg Thr Tyr Thr Leu
85 90 95
Phe Gly Gln Gln Val Gln Ile Thr Val Ser Asn Asn Ser Gln Thr Lys
100 105 110
Trp Lys Phe Val Asp Leu Ser Lys Arg Thr Gln Asp Gly Asn Tyr Ser
115 120 125
Gln His Gly Ser Leu Leu Ser Thr Pro Lys Leu Tyr Gly Val Met Lys
130 135 140
His Gly Gly Lys Ile Tyr Thr Tyr Asn Gly Glu Thr Pro Asn Ala Thr
145 150 155 160
Thr Asp Tyr Tyr Ser Thr Thr Asn Phe Asp Thr Val Asn Met Thr Ala
165 170 175
Tyr Cys Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Leu Ala Gln Glu Ala Lys Cys Thr
180 185 190
Lys Tyr Ile Asn Asn Gly Leu
195
<210> 4
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtctggtt ctcatcacca tcaccatcac ggttctagcg gcgagaacct ctacttccaa 60
tccggccaat acatcaaggc taattctaag ttcattggta tcaccgagct tggttcactt 120
gatggaccat atcaaccaac gacttttaat ccacctgtaa gttattggat gttgttagca 180
ccaacgaacg cgggggtagt agttgaaggt acgaacaata caaacagatg gttagcgaca 240
atattaattg aaccaaatgt acagcaagtt gagcgaacat atacattatt tgggcaacaa 300
gttcaaataa cagtatcaaa taattcacag acaaagtgga aatttgtgga tctaagtaag 360
cggacacaag atggtaatta ttcacaacac ggttctctac tgtcaacacc gaaactgtat 420
ggagtgatga aacatggagg taaaatttac acttataatg gagagacacc gaacgcaact 480
actgattact actctacaac taactttgac actgtaaaca tgacagcata ttgtgatttt 540
tatataattc cattagcaca agaagcaaaa tgcactaaat acataaataa tggattataa 600
<210> 5
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtctggtt ctcatcacca tcaccatcac ggttctagcg gcgagaacct ctacttccaa 60
tccggccaat acatcaaggc taattctaag ttcattggta tcaccgagct tgtcgacctc 120
gagggtcctg caacttgagg tagtcaagat gcataataaa taacggattg tgtccgtaat 180
cacacgtggt gcgtacgata acgcatagtg tttttccctc cacttaaatc gaagggttgt 240
gtcttggatc gcgcgggtca aatgtatatg gttcatatac atccgcaggc acgtaataaa 300
gcgaggggtt cgaatccccc cgttaccccc ggtaggggcc ca 342
<210> 6
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggaacgag ctatacaagg aaacgacgct agggaacaag ctaacagtga acgttgggat 60
ggaggatcag gaggtaccac ttctcccttc aaacttcctg acgaaagtcc gagttggact 120
gagtggcggc tacataacga tgagacgaat tcgaatcaag ataatcccct tggtttcaag 180
gaaagctggg gtttcgggaa agttgtattt aagagatatc tcagatacga caggacggaa 240
gcttcactgc acagagtcct tggatcttgg acgggagatt cggttaacta tgcagcatct 300
cgatttttcg gtttcgacca gatcggatgt acctatagta ttcggtttcg aggagttagt 360
atcaccgttt ctggagggtc gcgaactctt cagcatctct gtgagatggc aattcggtct 420
aagcaagaac tgctacagct tgccccaatc gaagtggaaa gtaatgtatc aagaggatgc 480
cctgaaggta ctgagacctt cgaaaaagaa agcgagtaa 519
<210> 7
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Glu Arg Ala Ile Gln Gly Asn Asp Ala Arg Glu Gln Ala Asn Ser
1 5 10 15
Glu Arg Trp Asp Gly Gly Ser Gly Gly Thr Thr Ser Pro Phe Lys Leu
20 25 30
Pro Asp Glu Ser Pro Ser Trp Thr Glu Trp Arg Leu His Asn Asp Glu
35 40 45
Thr Asn Ser Asn Gln Asp Asn Pro Leu Gly Phe Lys Glu Ser Trp Gly
50 55 60
Phe Gly Lys Val Val Phe Lys Arg Tyr Leu Arg Tyr Asp Arg Thr Glu
65 70 75 80
Ala Ser Leu His Arg Val Leu Gly Ser Trp Thr Gly Asp Ser Val Asn
85 90 95
Tyr Ala Ala Ser Arg Phe Phe Gly Phe Asp Gln Ile Gly Cys Thr Tyr
100 105 110
Ser Ile Arg Phe Arg Gly Val Ser Ile Thr Val Ser Gly Gly Ser Arg
115 120 125
Thr Leu Gln His Leu Cys Glu Met Ala Ile Arg Ser Lys Gln Glu Leu
130 135 140
Leu Gln Leu Ala Pro Ile Glu Val Glu Ser Asn Val Ser Arg Gly Cys
145 150 155 160
Pro Glu Gly Thr Glu Thr Phe Glu Lys Glu Ser Glu
165 170

Claims (10)

1.一种制备P2-△VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将重组农杆菌甲侵染本生烟植株，培养植株；
(2)取植株被侵染的组织，提取总蛋白；
(3)从总蛋白中纯化得到P2-△VP8*蛋白；
重组农杆菌甲是将表达P2-△VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；
P2-△VP8*基因编码P2-△VP8*蛋白；
P2-△VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质。
2.一种制备P2-△VP8*重组蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将重组农杆菌甲和重组农杆菌乙共侵染本生烟植株，培养植株；
(2)取植株被侵染的组织，提取总蛋白；
(3)从总蛋白中纯化得到P2-△VP8*重组蛋白；
重组农杆菌甲是将表达P2-△VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；
P2-△VP8*基因编码P2-△VP8*蛋白；P2-△VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质；
重组农杆菌乙是将表达P19基因的质粒导入农杆菌得到的；
P19基因编码P19蛋白；P19蛋白如序列表的序列7所示。
3.一种制备P2-△VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
采用本生烟植株作为生物反应器，植株叶片被注射重组农杆菌甲，然后培养4-7天，然后取所述叶片提取总蛋白，然后从总蛋白中纯化得到P2-△VP8*蛋白；
重组农杆菌甲是将表达P2-△VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；
P2-△VP8*基因编码P2-△VP8*蛋白；
P2-△VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质。
4.一种制备P2-△VP8*蛋白的方法，包括如下步骤：
采用本生烟植株作为生物反应器，植株叶片被注射重组农杆菌甲和重组农杆菌乙，然后培养4-7天，然后取所述叶片提取总蛋白，然后从总蛋白中纯化得到P2-△VP8*蛋白；
重组农杆菌甲是将表达P2-△VP8*基因的质粒导入农杆菌得到的；
P2-△VP8*基因编码P2-△VP8*蛋白；P2-△VP8*蛋白为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质；
重组农杆菌乙是将表达P19基因的质粒导入农杆菌得到的；
P19基因编码P19蛋白；P19蛋白如序列表的序列7所示。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：
P2-△VP8*基因为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子。
6.权利要求1至5中任一所述方法制备得到的P2-△VP8*蛋白或P2-△VP8*蛋白溶液。
7.P2-△VP8*蛋白，为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质。
8.P2-△VP8*基因，为如下(b1)或(b2)：
(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表的序列4所示的DNA分子。
9.用于制备P2-△VP8*蛋白的试剂盒，包括如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)或(c5)或(c6)：
(c1)P2-△VP8*基因；
(c2)质粒甲；所述质粒甲为表达P2-△VP8*基因的质粒；
(c3)重组农杆菌甲；重组农杆菌甲是将质粒甲导入农杆菌得到的重组农杆菌；
(c4)P2-△VP8*基因和P19基因；
(c5)质粒甲和质粒乙；所述质粒甲为表达P2-△VP8*基因的质粒；所述质粒乙为表达P19基因的质粒；
(c6)重组农杆菌甲和重组农杆菌乙；重组农杆菌甲是将质粒甲导入农杆菌得到的重组农杆菌；重组农杆菌乙是将质粒乙导入农杆菌得到的重组农杆菌；
P2-△VP8*基因编码P2-△VP8*蛋白；
P2-△VP8*蛋白，为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的蛋白质；
(a2)序列表的序列3所示的蛋白质；
P19基因编码P19蛋白；P19蛋白如序列表的序列7所示。
10.应用或疫苗；
所述应用为如下(d1)、(d2)、(d3)或(d4)：
(d1)权利要求6所述P2-△VP8*蛋白或P2-△VP8*蛋白溶液在制备轮状病毒疫苗中的应用；
(d2)权利要求7所述P2-△VP8*蛋白在制备轮状病毒疫苗中的应用；
(d3)权利要求8所述P2-△VP8*基因在制备轮状病毒疫苗中的应用；
(d4)权利要求9所述试剂盒在制备轮状病毒疫苗中的应用；
所述疫苗为如下(e1)或(e2)：
(e1)活性成分为权利要求6所述P2-△VP8*蛋白或P2-△VP8*蛋白溶液的轮状病毒疫苗；
(e2)活性成分为权利要求7所述P2-△VP8*蛋白的轮状病毒疫苗。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN86108975A (zh) * 1985-12-26 1988-01-06 萨斯喀彻温大学 相应于轮状病毒的主要中和蛋白质的抗原和免疫决定子的肽
CN103304642A (zh) * 2013-06-06 2013-09-18 黑龙江八一农垦大学 猪轮状病毒δvp8*亚单位重组蛋白及其应用
CN103319604A (zh) * 2013-06-18 2013-09-25 黑龙江八一农垦大学 一种人轮状病毒△vp8*亚单位重组蛋白及其应用
CA2872803A1 (en) * 2012-05-11 2013-11-14 Medicago Inc. Rotavirus-like particle production in plants
CN103403170A (zh) * 2011-01-17 2013-11-20 菲利普莫里斯生产公司 植物中的蛋白质表达
CN106795510A (zh) * 2014-07-11 2017-05-31 莫迪卡戈公司 改进植物中的蛋白产生
CN107208072A (zh) * 2015-01-23 2017-09-26 莫迪卡戈公司 在植物中产生轮状病毒样颗粒

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN86108975A (zh) * 1985-12-26 1988-01-06 萨斯喀彻温大学 相应于轮状病毒的主要中和蛋白质的抗原和免疫决定子的肽
CN103403170A (zh) * 2011-01-17 2013-11-20 菲利普莫里斯生产公司 植物中的蛋白质表达
CA2872803A1 (en) * 2012-05-11 2013-11-14 Medicago Inc. Rotavirus-like particle production in plants
CN103304642A (zh) * 2013-06-06 2013-09-18 黑龙江八一农垦大学 猪轮状病毒δvp8*亚单位重组蛋白及其应用
CN103319604A (zh) * 2013-06-18 2013-09-25 黑龙江八一农垦大学 一种人轮状病毒△vp8*亚单位重组蛋白及其应用
CN106795510A (zh) * 2014-07-11 2017-05-31 莫迪卡戈公司 改进植物中的蛋白产生
CN107208072A (zh) * 2015-01-23 2017-09-26 莫迪卡戈公司 在植物中产生轮状病毒样颗粒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANCISCO ET AL.: "Engineering and expression of a human rotavirus candidate vaccine in Nicotiana benthamiana", 《VIROL J》 *
FRANK ET AL.: "pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants", 《PLANT BIOTECHNOL J》 *
GENBANK: "BAM74365.1", 《GENBANK》 *
UNIPROT: "Q96802", 《UNIPROT》 *
李志英等: "Zera标签蛋白微粒在本氏烟中的表达及纯化", 《农业生物技术学报》 *

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