CN110914437A

CN110914437A - 用于在植物中稳定产生特别是谷物胚乳中的完整重组抗体的蛋白质的表达载体及方法

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Publication number: CN110914437A
Application number: CN201880040003.4A
Authority: CN
Inventors: 斯特凡诺·马尔凯蒂; 塔玛拉·巴蒂
Original assignee: Transactiva SRL
Current assignee: Transactiva SRL
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2020-03-24
Also published as: EP3610024A1; JP2020519239A; US11624073B2; US20210214739A1; ZA201907556B; IT201700042052A1; WO2018189764A1

Abstract

一种用于在植物中稳定产生一蛋白质的表达载体，所述蛋白质特别是指在一谷物胚乳中的一完整重组抗体，所述表达载体包括：所述抗体的所述轻多肽链(L)的一表达盒以及所述抗体的所述重多肽链(H)的一表达盒，所述多个表达盒具有相同的方向以及相同的基因表达控制及调控元件。

Description

用于在植物中稳定产生特别是谷物胚乳中的完整重组抗体的蛋白质的表达载体及方法

技术领域

本文所述的多个实施例涉及旨在在植物中工业生产药物蛋白的基因工程操作，特别是在多种谷物种类的所述胚乳内的完整抗体的合成及积累。特别地，本文描述的多个实施例涉及用于在植物中稳定产生一蛋白质的一表达载体及方法，所述蛋白质可以是人类蛋白质或动物蛋白质，特别是谷物胚乳中的一完整重组抗体。

背景技术

众所周知，抗体与激素、细胞因子及疫苗一起使用是用于治疗及诊断用途的多种生物药物的所述主要类别中的一种。如果考虑仍处于开发阶段的所述生物药物，则抗体的整体意义甚至更重要。多种抗体或免疫球蛋白(IgG)是具有一四级结构的蛋白质，由四条多肽链组成，其中两条为重链(H)，两条为轻链(L)，并且彼此相同；在所述免疫系统的架构中，它们具有中和异物的功能，通过识别被称为抗原决定簇(antigenic determinants)或表位(epitopes)的大分子部分，可以中和病毒及细菌等异物。除了多种完整抗体之外，已经开发几种类抗体分子，包括Fab片段(抗原结合片段(fragment antigen binding)的缩写)、scFv(单链抗体(single chain fragment variable)的缩写)、scFv二聚体、微型抗体、单可变链的结构域。

由于所述抗体的多种特性，抗体被广泛用于预防、检测及治疗多种人类疾病(例如：关节炎、肿瘤、自身免疫性疾病、炎症状态)。所述重组抗体的开发已经为高危患者的被动免疫做好准备，如果我们考虑增加抗生素耐药菌菌株的频繁性及出现新病原体的话，这是一种有趣的治疗选择。

工业规模的重组抗体的生产基本上是基于在合适的生物反应器(bioreactors)中对基因转化的哺乳动物细胞的所述无菌培养。尤其是所述CHO系统(中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells)的缩写)是最广泛使用的系统，因为它能够产生正确组装的、具有一人类相容性糖基化图谱的完整抗体。然而，这种系统存在许多问题，包括：高昂的投资及运营成本、达到最终生产规模的速度缓慢以及培养物及产品被致病性微生物(细菌、病毒、支原体)、毒素及病毒污染的潜在风险。尽管在这个领域中的业界曾多次提出乐观的预测，但抗体的每毫克(mg)的价格在过去十年中几乎保持不变，使得所述意大利药品管理局及所述欧洲药品管理局一致呼吁为大规模生产开发替代系统(AIFA，2013年)。

植物在重组蛋白生产中提供的所述潜力已为人所知很长时间，并且已被广泛地记录(Giddings，2001年；Obembe等人，2011年；Stoeger等人，2014年)。尽管迄今为止尚没有从一植物中产生的重组抗体被用于临床，但是有大量实验证据表明植物物种对IgG的有效生产能力(Hiatt等人，1989年；During等人，1990年；Conrad及Fiedler，1994年；Ma等人，1998年；Ma等人，2003年；Nicholson等人，2005年；Stoeger等人，2005年；Ramessar等人，2008年；Villani等人，2009年；De Muynck等人，2010年；Vamvaka等人，2016年)。E.Torres等人(2001年)也描述了重组及非重组蛋白在植物中的所述积累。

在当前的现有技术中，就宿主细胞内的表达而言，所述轻多肽链L及重多肽链H是分开考虑的，因此带有与其合成有关的所述遗传信息的分子载体是独特的及/或控制所述编码序列的转录及翻译的所述多个元件彼此不一致。因此，尽管所述轻链L及重链H被认为是具有一四级结构的一分子的一部分，在现有技术中，独立地构建所述相应的分子表达盒以及用于所述植物的遗传转化的独立程序通常是用来表达两种在结构及功能上不相关的蛋白质的那些。图13显示用于编码所述多肽链L(CDS-L)及H(CDS-H)的所述序列的一般组成方案。

根据现有技术，在每个CDS(编码序列)的上游具有一启动子及一前导序列，而在下游具有一终止子。所述CDS表达的所述多个调控元件的所述性质及特定特征在所用的载体中是可变的，并且还取决于要制造的最终表达抗体的所述宿主植物及所述组织。多个表达盒被包含在质粒或病毒载体内部，所述质粒或病毒载体被用于通过物理或生物学方法来对植物进行遗传转化。所述寄主植物几乎总是以烟草亚种(Nicotiana spp.)为代表并且所述最终抗体在叶子中表达，特别是在叶肉的细胞中表达；所述重组抗体的所述亚细胞定位可以对应于所述内质网腔、所述质外体(apoplast)或所述液泡(vacuole)。

根据现有技术，通过共转化(即，通过联合使用不同的分子载体)或交替地，通过一条链或另一条链的所述分离表达(分子载体的分离使用)来获得在相同细胞中的轻链L及重链H的所述共存，然后在不同类型植物之间杂交。图14示出用于获得所述宿主细胞中所述H链及L链的所述组合存在的最广泛使用方案。这些步骤使得所述多个分子盒必然或潜在地处于一反式(trans)结构。

然而，无论使用何种程序，科学及技术文献通常都显示出阳性结果：重组抗体实际上是由所述转化植物产生的，并且能够识别并结合靶抗原。同样关于所述抗体产量，在所述植物中获得的所述数据被认为是令人满意的。

然而，需要显着提高从所述植物中获得的所述抗体的产量，从而获得一简化的所述生产线的所述选择程序以及可用于诊断或治疗目的的一更快速的抗体开发途径。

在现有技术中，使用不同的策略来获得植物中的完整抗体，每种策略都包括共同及特定类型的关键因子。为了显示所述关键因子，首先检验设想使用载体携带遗传信息的转化植物的方法，所述遗传信息用于在不同的初级转化子(primary transformants)中不连续合成每条多肽链(H，L)；为了获得完整的抗体，可通过杂交自受精或由所述初级转化子产生单倍体类型而产生的纯合子系(pure homozygous lines)来获得杂交体。即使在特定的单子叶植物及双子叶植物物种中广泛使用此方法，所述方法在以下几种状况则具有不同的反指示：1.选择所述初级转化子是比较困难的(而且由于需要对每条链采用不同的检测方法而变得复杂)；2.在没有证据证明能够产生正确组装并具有生物学活性的所述完整抗体的情况下，固定所述单个转基因的纯合子状态是负担的；3.执行受控的杂交以制造杂交体；4.进一步的选择干预旨在释放两种转基因的所述最终纯合子的生产线。

上述方法的一种变体需要通过杂交所述初级转化子来产生杂交体，并且随后通过检测所述完整抗体来选择后代(progenies)。如果仅从技术角度来看，所述工作是非常简化的，然而从一方法论的角度来看则并非如此，因为所述主要的转化子对于所述转基因而言总是半合子的(hemizygous)，并且如果存在多个基因组插入位点，则这种情况可能会是多重的。在缺乏对所述杂交亲本(crossing parents)的初步了解的情况下，必须大幅拓宽选择程序，因为：每个杂交亲本都会产生不同的配子(gametes)；配子的随机结合导致一非均质后代(dis-homogeneous progeny)的形成；由于以一独立或相关形式的转基因分离，这个后代又将产生一可变的后代。

一种用于在植物中产生抗体的第二策略提供了应用共转化方法以同时插入来自不同载体的转基因。相较于上述的变型，此过程可以节省一代的时间。然而，随着所述转基因在相同染色体位点上的频繁共整合，产生反向或直接串联结构，从而引发基因沉默过程的加剧，所述方法仍存在方法学上的局限性。(Meyer及Saedler，1996年；Ye及Signer，1996年；Muskens等人，2000年；Stam等人，2000年；Wang及Waterhouse，2000年；De Buck等人，2001年；Ma及Mitra，2002年；Lechtenberg等人；2003年；Fojtova等人，2006年；Skarn等人，2006年；Mlotshwa等人，2010年；Otagaki等人，2011年；Martinez De Alba等人，2013年；Ramkumar等人，2015年)。此外，更可能发生所述分子表达盒重组而丢失或获得片段(sections)的情况。这些事件只能通过完整的基因组测序来识别，并且由于缺乏必要的法规要求而导致所述生产线被放弃。特别地，为了开发可在一工业程度上用于抗体合成的生产线，基于物理试剂(生物弹道技术(biolistics)、电穿孔(electroporation))的所述共转化方法似乎非常不合适，因为所述方法经常决定在多个插入位点插入多个拷贝的转基因。在2008年，Rademacher等人描述了一种生物弹道技术的一例子。

综上所述，通过联合使用分子载体来用于结合表达所述H链及L链的所述的共转化可形成反式或顺式构型，但是在两种情况下，由于所述多条链的生产不平衡以及基因沉默现象的建立，所述完整抗体的表达及所述生产线的选择都将成为问题。

其他技术解决方案提供了利用病毒表达载体来生产IgG或者在用土壤杆菌(Agrobacterium)的工程菌株渗入叶组织后，所述抗体的瞬时合成。这些方法不仅存在产生的所述多肽链的生物安全性及真实性问题，而且目前的欧洲法规也未涵盖这些方法，所述法规仅能评估高等孢子体植物的稳定转化所固有的方法及生物技术产品的质量(被子植物及裸子植物)(EMA，2008年)。就工业适用性而言，这决定了上述方法的一基本不相关性。

Zhong Huang等人描述了用于在烟草(Nicotiana benthamiana)的叶片中瞬时表达的病毒表达载体。

基于这些前提，应当注意，所述最终生产线希望在相同的细胞室内表达高且基本上等摩尔量的两条多肽链H及L。事实上，两条链之间存在一强烈的定量差异，由于缺少两种组分(components)中的一种以及其中的组装可能会干扰异常分子(aberrant molecules)的产生，因此不可避免地导致抗体的所述最终产量的降低。能够确定所述H链及L链的一不同的表达程度的因素包括：所述转基因的所述插入位点(位置效应)、所述转基因的所述拷贝数、所述分子表达盒的所述特定组成。

图15示意性地显示位置效应的一个例子：由于增强子元件(E)、沉默子(S)及含甲基化DNA的区域(A)产生的干扰，带有所述L链及H链的所述合成信息的所述转基因表达不同。

如前文所述，在插入一个或两个转基因的多个拷贝后，重复使用外源DNA序列或其形成会导致所述插入的片段沉默，或者在稍微不利但仍为负面的情况下，导致所述转基因的表达的一减少及一不稳定。这些现象的发生与所述基因组中的所述插入位置无关，并且与反向但直接串联重复序列的产生有关。因此，在现有技术中，如果打算在植物中产生完整抗体，则将使用携带表达盒的载体，其特征为基因表达的多个控制元件的组成不同(启动子，5'-UTR，3'-UTR)。考虑到所述转基因的一有效表达，这种解决方案在现有技术中被认为是必需的，但是在获得具有高生产潜力的纯净及稳定的品系方面却存在一相当大的困难。实际上，已知所述分子盒的每个组分都能够以一不同且特定的方式影响一转基因的所述表达程度，因而导致编码的困难，甚至难以获得一当代(contemporary)及协调的H多肽链及L多肽链的表达。如果我们考量所述多个表达盒中的每一个由几个相互依存的成分组成并且随着获得所述抗体表达的所述植物或所述组织的生理条件的变化而具有不同的活性，则所述问题将变得更加明显。特别地，所述多种可诱导的启动子被一共同的诱导因子激活或被不同的诱导剂而不同地激活，所述组织特异性的启动子不显示相同的相位依赖性(phase-dependence)或相同的转录活性，而所述组成型的启动子根据器官、组织、发育阶段及植物的生长条件而显示一可变的转录强度。

因此，需要完美的一表达载体及一方法，以稳定地生产一植物蛋白，特别是谷物胚乳中的一完整重组抗体，从而克服现有技术中的至少一个缺点。

特别地，本发明的一个目的是完善一种表达载体及一种用于在植物中工业生产一完整抗体的方法，特别是在一单子叶植物中，特别是在一谷物物种的所述胚乳内，参考所用载体的数量及类型、所述选择的载体系统，由于反向及直接串联结构中存在重复的DNA序列而导致的所述基因沉默、所述遗传转化方式以及控制用于合成轻多肽链L及重多肽链H的基因表达元件，所述方法改善在现有技术中的所述多种特征；这是为了获得所述相关抗体分子的一高表达以及一特定组织及亚组织的定位。

申请人已经设计、测试及实施了本发明，从而克服所述多种缺点并改善现有技术的所述特征，并且获得用于生产重组抗体的一更有效系统，所述重组抗体可在一工业程度上用于生产治疗性分子。

发明内容

在所述多个独立权利要求中阐述及表征了本发明，而所述多个从属权利要求描述了本发明的其他特征或主要发明构思的变型。

根据一些实施例，提供了一种表达载体，用于在植物中稳定产生可以是人类或动物的蛋白质，特别是一谷物胚乳中的一完整重组抗体。根据一个实施例，所述表达载体是一单载体，所述单载体包括：

所述抗体的所述轻多肽链(L)的一表达盒；

所述抗体的所述重多肽链(H)的一表达盒；

所述多个表达盒具有相同的方向及相同的基因表达调控元件。

根据一些实施例，所述轻多肽链(L)的表达盒及所述重多肽链(H)的表达盒：

(a)特别地，它们以相同的头尾方向在操作上被连接在完整插入一植物基因组的一DNA片段的内部；

(b)分别提供以下多个基因表达调控元件；

(i)天然或人工来源的一胚乳特异性启动子，

(ii)天然或人工来源的一前导序列(5’-UTR)；

(iii)天然或人工来源的一信号肽，所述信号肽在组成所述胚乳的所述多个细胞的所述内质网腔内运送所述重组多肽链；

(iv)天然或人工来源的一核苷酸序列，所述核甘酸序列编码所述多肽链的所述成熟形式，所述多肽链分别为所述抗体的轻多肽链(L)或重多肽链(H)；

(v)天然或人工来源的一拖尾序列(3’-UTR)；

其中在所述轻多肽链(L)的表达盒及所述重多肽链(H)的表达盒之间的所述多个基因表达调节元件(i)、(ii)、(iii)及(v)是相同的。

根据一些实施例，所述谷物是水稻。

此外，根据一些实施例，天然或人工来源的所述胚乳特异性启动子(i)是如SEQ IDNO:2所示的水稻谷蛋白4(GluB-4)的基因的启动子。

根据一些实施例，所述区域5’-UTR(ii)具有合成性质，并且其特征为重复的CAA三核苷酸元素以及用于识别所述翻译起始位点且如SEQ ID NO:3所示的一共有序列AGCCATGGC。

根据一些实施例，所述信号肽的所述核苷酸序列(iii)对应于SEQ ID NO：4所示的所述序列，所述序列编码用于在所述内质网内运送所述谷蛋白4的前体(PSGluB-4)。

根据一些实施例，所述拖尾序列3’-UTR(v)是所述NOS终止子，所述NOS终止子的序列被标示在SEQ ID NO：7；或者所述拖尾序列3’-UTR(v)是所述水稻GluB-4基因的所述终止子。

根据一些实施例，编码所述抗体的所述轻多肽链(L)或重多肽链(H)的所述成熟形式的所述核甘酸序列(iv)分别由编码所述利妥昔单抗抗体的所述轻多肽链(L)如SEQ IDNO：5所示的序列及所述重多肽链(H)如SEQ ID NO：6所示的序列加以代表。

根据一些实施例，通过使用优先选择的物种特异性同义密码子来优化编码所述抗体的所述轻多肽链(L)及重多肽链(H)的所述多个序列在植物中的表达。

根据一些实施例，所述表达载体包括能够允许选择所述转化植物的一基因，特别是一PMI(phospho-mannose isomerase)选择盒。

根据一些实施例，所述载体包含用于选择转化的植物细胞的一表达盒，所述表达盒包含：

天然或人工来源的一组成型启动子；

一编码序列，用于在其自然或人工同义形式中的所述选择的标记；

天然或人工来源的一终止子，适合用于一植物表达系统。

根据一些实施例，所述单表达载体具有SEQ ID NO：1所示的序列。

根据一些实施例，提供一种细菌菌株，其包含根据本说明书的一表达载体。在可能的实施方式中，所述细菌菌株是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)的一菌株。

根据一些实施例，提供一种由多种土壤杆菌介导转化的二元系统，所述二元系统由根据本说明书所述的一表达载体以及乘载所述毒性区的一互补载体所组成

根据其他实施例，通过根据本说明书的一表达载体来提供稳定转化的植物细胞、植物及植物种子。在可能的实施方式中，所述植物细胞、植物及植物种子直接或间接地用于治疗处理。

其他实施例涉及一种在一植物中稳定产生一蛋白的方法，特别是在一谷物胚乳中的一完整重组抗体，所述蛋白质可以是人类蛋白质或动物蛋白质，所述方法包括：

构建如本说明书所述的用于植物的遗传转化的一分子载体；

工业加工所述转化的种子；

提取及纯化感兴趣的所述抗体。

有利地，每千克胚乳稳定产生的完整重组抗体的产量可以大于0.6克，特别是大于约0.7克，更特别地大于约0.8克，甚至更特别地大于约0.9克。

所述表达“约”，是指比所示数值多20％或小于20％的可能变化。

所述抗体的可能的示例产量值是每千克胚乳含有例如：0.8、0.85、0.9、0.95、1、1.05、1.15、1.2、1.25、1.3克或更多的抗体。

有利地，就利妥昔单抗(Rituximab)而言，每千克胚乳的产量可以大于约0.9克利妥昔单抗。例如，利妥昔单抗的所述产量可介于每千克胚乳约0.9至约1.5克之间变化，特别是介于约0.95至约1.2克的利妥昔单抗之间。

参考以下描述、附图及所附权利要求书将更好地理解本公开的这些及其他方面、特征及优点。所述多个附图被整合并构成本说明书的一部分，所述多个附图示出了本发明的实施方式的某些形式，并且与说明书一起旨在描述本公开的原理。

在可能的情况下，本说明书中描述的各个方面及特征可以单独应用。这些单独的方面，例如在所附从属权利要求中描述的方面及特征，可以成为分案申请的标的。

应当理解，在专利申请过程中发现的任何已知方面或特征都不应被主张，并且应作为免责声明的目的。

图示说明

从以下一些实施例的描述中，本发明的这些及其他特征将变得显而易见，这些实施例是参照所述多个附图并且作为一非限制性示例示出的，其中：

图1a及图1b显示通过SignalP 3.0软件预测的GluB-4的PS与多肽链L(A部分)及H(B部分)之间的切割位点；

图2是用于所述利妥昔单抗抗体的胚乳特异性产生的所述最终pTRS利妥昔单抗的表达载体的一图；

图3显示利妥昔单抗的所述轻链(A)及重链(B)的氨基酸序列；所述GluB-4信号肽被标示；

图4a及图4b显示所述多个载体pUC18//GluB-4的所述图谱::轻链::NOS(A部份)及pUC18//(PmeI)GluB-4::重链::NOS(PmeI)(B部份)，包含用于利妥昔单抗的所述轻链及重链的所述多个表达盒；

图5示出在DAS-ELISA中获得的数据，所述数据用于检测从10种水稻初级转化子的粉末制备的两种独立的蛋白质提取物中的利妥昔单抗；

图6示出与蛋白A上进行的一亲和层析有关的UV吸光度及pH值的所述图表，所述亲和层析用于从转化的水稻的一蛋白提取物中纯化一批利妥昔单抗。在x轴上描绘的所述多个片段标示出所述多个收集的部分(fractions)(从1到11)，特别是那些对应于包含所述抗体分子的所述峰的部分(部分8及9)；

图7示出电泳分析的所述结果。特别是：

图7a示出针对3种转化水稻品系(54D、207S及10B)，在变性及非还原条件下，在经由蛋白A捕获所述抗体之后而获得的所述色谱洗脱液上进行的所述SDS-PAGE。使用作为一阳性对照组(CP)的

(Genentech-Roche)来上样不同量的蛋白质(0.5微克、1微克、2微克)；

图7b示出来自凝胶过滤的部分的所述SDS-PAGE；将所述多个样品中和，稀释至2％SDS、5％β-巯基乙醇的一最终浓度，并在95℃下变性5分钟。轨迹1：分子标记(SharpmassVII，Euroclone)；轨迹2：含有所述轻链的部分；轨迹3至5：含有所述重抗体链的多个部分；

图8示出与一凝胶过滤有关的UV吸光度及传导性的所述色谱图，通过利用4.2毫克的利妥昔单抗的PBS等度洗脱来执行所述凝胶过滤，所述利妥昔单抗是先前利用蛋白A而从水稻粉中纯化的。显示了两个洗脱峰，分别对应于所述抗体分子的所述二聚体(A)及所述单体(B)；

图9比较在两种转化水稻品系(207S及54D)的两个纯化的利妥昔单抗样品及用作一阳性对照组(cp)的

样品上进行的三种不同的凝胶过滤操作的所述UV色谱图；

图10示出在MALDI-TOF中记录的所述多个信号，所述多个信号与经由PNGase处理后的所述重链释放的所述多种糖型、单糖中的相应组成以及可能的结构的描述有关；

图11a及图11b分别显示：

图11a，细胞荧光分析(FACS)的结果为：A.500,000个MEC-1细胞；B.在市售利妥昔单抗存在下的MEC-1细胞；C.在RTX PBS(来自水稻的纯化抗体)存在下的MEC-1细胞；

图11b，由所述市售抗体利妥昔单抗以及从水稻中纯化的抗体所给出的所述平均荧光强度。FL1-H：荧光强度；

图12示出RTX PBS、市售利妥昔单抗及一非相关抗体(抗CD52，Campath)之间的所述竞争性测定的所述FACS分析，所述非相关抗体用作一阴性对照组。FL1-H：荧光强度；

图13示出用于在植物中表达的所述H链及L链的所述多个分子盒的所述总体组成图；图例-Pro1/2：1/2启动子；SP1/2：1/2信号肽的序列；Ter1/2：1/2终止子；CDS-L/H：编码L/H链的序列；V_L/H：L/H链的可变区；CDR_1/2/3：所述重链及轻链的高度变化区；CL：所述轻链的恒定区；CH1_1/2/3：所述重链的恒定区；

图14是用于在植物中表达完整抗体的最常用策略的一示意图。A：分开表达H链及L链的分子载体的不连贯使用(disjointed use)，然后用于转基因的纯合品系杂交；B：A的变体，其中在初级转化子的程度进行杂交；C：联合使用分子载体在初级转化子中联合表达H链及L链(共转化)；

图15示意性地示出位置效应的一例子：由于增强子元件(E)、沉默子(S)及含有甲基化DNA的区域(ME)产生的干扰，带有用于合成L链及H链的信息的所述转基因被不同地表达。

具体实施方式

现在，我们将详细参考本发明的各种实施例，在所述多个附图中示出了其中的一个或多个示例。每个示例都是通过举例说明本发明的方式来提供的，并且不应理解为对本发明的一限制。例如，由于它们是一个实施例的一部分，所述显示或描述的特征可以在其他实施例上或与其他实施例结合使用以产生另一实施例。应当理解，本发明将包括所有这样的修改及变型。

在描述这些实施例之前，必须阐明，本说明书的应用不限于如以下说明书中使用附图所描述的部件的构造及设置的细节。本发明的描述可以提供其他实施例，并且可以以各种其他方式获得或执行。必须阐明，此处使用的措词及术语仅出于描述目的，不能视为限制性的。

除非另有定义，否则此处及下文中使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域中具有普通经验的人员通常理解的含意相同的含义。即使可以在实践及在本发明的试验中使用与在此描述的方法或材料相似或等同的方法及材料，在下文中也以示例的方式描述所述多种方法及多种材料。在发生冲突的情况下，以本申请，包括其定义为准。所述多种材料、方法及实施例仅具有说明性目的，不应被限制性地理解。

除非另有说明，所有测量均在25℃以及大气压下进行。除非另有说明，否则所有温度均以摄氏温度表示。

除非另外指出，否则所有指示的百分比及比例均指所述总组合物的所述重量(w/w)。

这里描述的实施例涉及分子农业领域，并且特别涉及一种方法的开发，特别是在植物中建构一稳定表达的载体，用于在谷物胚乳(例如：水稻)中产生完整抗体。

本文所述的其他实施例涉及能够引导一抗体分子的两个结构组件(即所述轻多肽链(L)及重多肽链(H))的所述植物表达的一质粒载体。

根据一些实施例，制备所述表达载体以用于谷物种子中糖基化的完整抗体的所述胚乳特异性表达。特别地，为了制作所述载体，我们考虑了有关植物遗传转化的多个方面、所述基因表达的控制元件(启动子、前导区、终止子)、编码所述多肽链H及L的所述序列、编码所述信号肽的所述序列。

因此，本发明提出了一种方法，所述方法可以使植物中的完整抗体的所述产量显着提高、大幅简化所述生产线的所述选择程序，并且可以更快地开发出可用于诊断或治疗目的的抗体。

本发明是发明活动的成果，在某种程度上，本发明回答了以前从未确认的特定技术问题，所述问题也没有被分子农业领域的工作人员直接或间接地解决。

本发明是代表由申请人进行的实验测试的结果，并且计划在所述多肽链L及H的一共同定位及协调表达的观点下进行，根据本发明，所述多肽链L及H不再作为单独的前体元素，而是作为从细胞合成开始的密切相关的因子。

为了提供一种新的创造性技术解决方案来满足合成中相互依赖的需求，本申请人已经设计并实现了一种分子载体，其中与L及H链有关的所述多个分子盒：

(a)在操作上被连接在完整插入一植物基因组的一DNA片段的内部；

(b)提供相同的基因表达控制及调控元件：启动子、5’-UTR、终止子；

(c)具有相同的方向。

此外，有利地，为了解决与一植物基因组内部以串联存在的重复DNA序列有关的表达不稳定性及基因沉默的问题，申请人进一步进行了实验测试以鉴定其中不存在这些现象的一植物组织，从而确定以谷类植物胚乳内的合成作为代表的技术解决方案。

所述载体系统是从植物的一遗传转化的角度来选择的，可以通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)来实现；因此，构建了一个T-DNA载体(Transfer DNA的缩写)，所述载体被配置成与带有所述毒性区的一第二质粒互补以形成一二元转化系统。

在可能的多个实施例中，带有本发明的T-DNA的所述载体的特征为在大肠杆菌中具有一高拷贝数的一复制起点。

在可能的多个实施例中，带有根据本说明书的所述T-DNA的所述载体的特征为存在一复制起点，所述复制起点适于在土壤杆菌亚种(例如：pVS1)中赋予一高稳定性。

在可能的多个实施例中，根据本说明书的带有所述T-DNA的所述载体的特征为小尺寸(＜10kb)。

在可能的多个实施例中，根据本说明书的带有所述T-DNA的载体的特征为存在适合用于所述质粒的一模块修饰的多个限制性位点。

在可能的多个实施例中，根据本说明书的带有所述T-DNA的所述载体的特征为存在多个克隆位点。

在可能的多个实施例中，根据本说明书的带有所述T-DNA的所述载体的特征为存在能够选择所述转化细菌的一基因(例如：编码第II型的所述新霉素磷酸转移酶(neomycinphosphotransferase)的npt II，用于鉴定卡那霉素(kanamycin)的阳性菌落)。

在可能的多个实施例中，根据本说明书的带有所述T-DNA的所述载体的特征为存在能够选择所述转化植物的一基因(例如：编码磷酸甘露糖异构酶(phospho-mannoseisomerase)的PMI，用于鉴定甘露糖转化的胚性愈伤组织(embryogenic calli))。

在多个可能的实施例中，根据本说明书的带有所述T-DNA的所述载体的特征为T-DNA，即，所述质粒的一片段，所述转基因的表达盒位于所述片段中以将所述全部的转基因转移到所述寄主植物的基因组中。

在多个可能的实施例中，根据本说明书的带有所述T-DNA的所述载体的特征为分别在所述T-DNA的左边缘及右边缘处的重复序列LBR(左边界区)及RBR(右边界区)。

有利地，根据可能的多个实施例，所述表达载体的所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

关于所述基因表达的所述控制元件，根据本说明书的所述载体的所述T-DNA在其内部包含三个表达盒，其中一个与选择转化的植物或植物细胞有关，另外两个与构成所述抗体的所述多肽链H及L有关。

根据本说明书的一个或多个实施例，用于选择所述转化的植物或植物细胞的所述表达盒包括：提供适用于一植物表达系统的天然或人工来源的一组成型启动子、选择标记的天然形式或人工同义的一编码序列，以及天然或人工来源的一终止子。

根据一个有利的实施例，所述组成型启动子是CaMV的35S、编码所述标记的所述序列是与大肠杆菌的所述磷酸甘露糖异构酶有关的序列(基因库登录号M15380)以及所述终止子是CaMV的35Ster。

根据一个实施例，与所述抗体链有关的所述表达盒具有一相似的结构，并且具备以下多个基因表达的调控元件：(i)天然或人工来源的一胚乳特异性启动子；(ii)天然或人工来源的一前导序列(5’-UTR)；(iii)天然或人工来源的一信号肽，所述信号肽在组成所述胚乳的所述多个细胞的所述内质网腔内运送所述重组多肽链；(iv)天然或人工来源的多个核苷酸序列，每个所述核甘酸序列编码所述抗体的轻多肽链(L)及重多肽链(H)的所述成熟形式，分别为；(v)天然或人工来源的一拖尾序列(3’-UTR)。

根据本文所述的一些实施例，在所述轻多肽链(L)及所述重多肽链(H)的所述多个表达盒中的所述多个基因表达调节元件(i)、(ii)、(iii)及(v)是相同的。

根据一个实施例，所述启动子(i)是水稻谷蛋白4(GluB-4)的基因的启动子，所述启动子的序列如SEQ ID NO:2所示。

根据一有利实施例，所述前导序列5’-UTR(ii)具有一合成性质，并且其特征为重复的CAA三核苷酸元素以及用于识别所述翻译起始位点的一共有序列，例如：对于水稻具有特异性的(AGCCATGGC)，其序列如SEQ ID NO：3所示。

例如，所述前导序列5’-UTR可以包含一大量重复的CAA三核苷酸元件，特别是两个或多个CAA三核苷酸元件，更特别地为三个或更多个，甚至更特别地为四个或更多个。

根据其他实施例，所述元件的所述核苷酸序列(iii)对应于SEQ ID NO：4，所述序列编码用于所述水稻中的所述信号肽，从而运送所述内质网内的所述谷蛋白4的前体(PSGluB-4)。

根据其他实施例，元件的所述核甘酸序列(iv)由编码一抗体(例如:所述利妥昔单抗抗体)的所述轻多肽链如SEQ ID NO：5所示的序列及所述重多肽链如SEQ ID NO：6所示的序列加以代表。

根据本发明的一有利实施例，所述拖尾序列3’-UTR(v)是所述NOS终止子，所述NOS终止子的序列被标示在SEQ ID NO：7；或者所述拖尾序列3’-UTR(v)是所述水稻GluB-4基因的所述终止子。

所述三个表达盒由所述T-DNA的所述左右边缘(LBR及RBR)界定，并具有相同的头尾方向。

关于编码相关基因的所述序列，为了在所述DNA及RNA程度上实现有利于所述抗体在谷物胚乳中的高表达的结构背景，编码所述轻多肽链(L)及所述重多肽链(H)的序列已经使用所述密码子环境方法(codon context method)经由计算机模拟(in silico)而重新定义，即使用同义的物种特异性密码子；并且还进行最后的干预以消除所述序列内部的任何隐含的内含子(introns)以及与不稳定或不正确的转录及/或不需要的限制性位点有关的基序(motifs)。

根据一个实施例，所述表达载体被引入细菌菌株中，所述细菌菌株被直接或间接地用于所述植物的所述遗传转化。有利地，所述细菌菌株选自包括大肠杆菌、根癌土壤杆菌及发根土壤杆菌的一群组。优选地，所述转化的植物是谷物。根据一个优选的实施例，所述细菌菌株用于转化水稻的胚性愈伤组织(梗稻，变种CR W3)。它是稳定转化的一种形式，其中所述转基因明确整合到要在所述种子胚乳中表达的所述植物基因组中。

除了创建所述分子载体及所述植物遗传转化的多个步骤之外，本发明还包括所述转化种子的一工业加工步骤以及相关抗体的提取及纯化步骤。

根据一个可能的实施例，工业加工提供了将从所述转化的谷物植物中收获的所述成熟种子，在适当干燥后经受脱壳及增白的操作，从而去除纤维蛋白、胚芽及含有污染蛋白的所述糊粉层(aleuronic layer)。

根据另一个可能的实施例，所述提取步骤提供了在合适的一盐缓冲液中将所述种子粉均质化，随后通过过滤澄清并通过超滤来浓缩的步骤。例如，可以通过利用蛋白A的亲和层析然后进行凝胶过滤来进行所述纯化步骤。

根据本说明书的所述多个实施例，不同于现有技术中已知的技术，本发明的所述多个实施例显然是创新且有利的，因为它们允许通过稳定的遗传转化来获得转基因的谷类植物，特别是水稻，使用一单载体及用于所述两条链的基因表达的相同调控序列，能够在所述植物胚乳中产生及积累大量的完整抗体；所述抗体分子是正确组装的并且由带有所述编码化氨基酸序列且不含其他氨基酸残基的多肽链组成，这些残基对于定位、稳定性、生物学活性、补体激活及治疗领域的应用而言，即使无害也无用。对于本发明，所述抗体产量可以在每公斤胚乳含约1克或更多的范围内。我们认为，所述获得的产量与此处描述的技术的有利工业应用绝对相关，并且显着高于现有技术中报道的产量。

产生抗体所必需的所述分子表达盒根据正常的孟德尔模式有利地从所述后代继承，并且可以容易地以纯合性(homozygosity)摄取。

根据一有利的变体，产生的所述抗体是利妥昔单抗，所述利妥昔单抗是靶向所述表位CD20的一单克隆抗体。

除了用于构建所述表达盒的所述表达载体及所述核苷酸序列之外，本发明还涉及它们的互补序列。

此外，本发明还涉及与上述等同的序列，所述序列源自突变过程，而所述序列与突变的性质、诱因及位置无关。因此，本发明还涉及通过在所述载体、表达盒或与其互补的序列的任何区域中的一个或多个核苷酸的缺失、插入、转变、转化而获得的序列。

本发明包括编码所述轻多肽链L及重多肽链H的所述成熟形式的所述核苷酸序列与启动子元件及用于送入所述内质网的序列以及未翻译成5'及3'的区域的组合，所述组合适于获得在所述种子胚乳中起作用或具有与所述序列互补的核苷酸序列的一完整抗体分子的积累。

本发明还涉及上述元件(i)、(ii)、(iii)、(iv)及(v)与编码其他抗体的所述轻链L及重链H的序列的组合，或由与所述序列互补的核苷酸序列制成的组合。

本发明还涉及上述表达载体在一植物的所述转化中的用途，所述植物用于稳定产生一重组蛋白，特别是一完整的重组抗体。

本发明还包括上述表达载体的细菌菌株。

本发明还包括利用上述表达载体转化的植物细胞。根据本发明的一可能解决方案，所述细胞是谷物细胞，优选地属于所述栽培的水稻(Oryza sativa L.)。

本发明还包括在工业上开发用于提取及生产淀粉及其衍生物的蜡质类型的用途。

本发明的另一部分是使用如上所述的一表达载体而转化的一植物种子。根据本发明的一种解决方案，所述种子是属于所述谷物种类的一稳定转化的植物，优选地，所述稳定转化的植物属于水稻。

本发明的保护范围还包括用于表达一重组抗体的一稳定转化的植物，所述植物通过如上所述的一表达载体而稳定地转化。

如上文所述，本发明还包括通过自体受精或杂交育种或选自一植物的转化品系而获得的所述后代。本发明还涉及如上所述的直接或间接地用于治疗的一种子。

一些实施例的详细描述：

根据本说明书的多个具体实施例涉及一种在谷物胚乳中，特别是在水稻胚乳中产生一完整抗体的方法。所述方法基于一特定载体系统的所述构建而能够主导(host)具有独特组成及组装特性的基因表达盒。

所述方法的多个实施例使用一单表达载体来提供植物的所述稳定转化，所述单表达载体至少包含以下两个具有相同的头尾方向的基因盒；特别地，所述单表达载体包括：

所述抗体的所述轻多肽链(L)的表达盒；

所述抗体的所述重多肽链(H)的表达盒。

此外，在可能的实施方式中，所述表达载体还包含一第三盒，即用于选择所述转化植物细胞的一表达盒。

在可能的实施方案中，由于所述表达载体包括与一第二质粒相关的由土壤杆菌介导的二元转化系统，因此所述三个盒包含在一T-DNA区域中。所述表达载体中包含如SEQ IDNO：1所示的所述核苷酸序列。

根据一个可能的实施例，与选择转化的植物或植物细胞有关的所述表达盒包括：适用于植物表达系统的天然或人工来源的一组成型启动子、编码其同义天然或人工形式的所述标记的一序列以及天然或人工来源的一终止子。

根据一个有利的实施例，所述组成型启动子是CaMV的35S，编码所述标记的所述序列是与大肠杆菌的所述磷酸甘露糖异构酶有关的序列(基因库登录号M15380)以及所述终止子是CaMV的35Ster。

根据一个实施例，与所述抗体的所述轻多肽链(L)及重多肽链(H)有关的所述多个表达盒具有一相似的结构。每一个表达盒都具有以下控制元件：(i)天然或人工来源的一胚乳特异性启动子，(ii)天然或人工来源的一前导序列(5’-UTR)；(iii)天然或人工来源的一信号肽，所述信号肽用于处理包含所述胚乳的所述细胞的内质网腔内的所述重组多肽链以及其组织积累；(iv)天然或人工来源的一核苷酸序列，所述核甘酸序列编码所述抗体的所述多肽链(轻链或重链)的所述成熟形式；(v)天然或人工来源的一拖尾序列(3’-UTR)。

根据可能的实施方式，特别是在谷类及水稻物种的可能的胚乳特异性启动子中，可以有利地使用水稻谷蛋白4(GluB-4)的所述基因启动子，其序列如SEQ ID NO：2所示。有利地，相较于除了GluB-4以外所述水稻胚乳中存在的的其他存储蛋白(例如：球蛋白、醇溶蛋白(prolamins)及谷蛋白)，所述启动子具有一更高的转录活性。

通过PCR从所述蜡质品种CR W3(Ente Nazionale Risi，意大利米兰)及所述前导区一起分离出所述启动子GluB-4。然而，所述后者似乎较短并且无法提供能够增强基因表达的多个元件。因此，它被一合成的前导序列5'-UTR(如SEQ ID NO.3所示)取代，其特征为一大量的三核苷酸元件CAA(即，能够提高所述TMV前导Ω的翻译效率的多个元件；Gallie及Walbot,1992年)以及通过水稻的典型ATG的一共有识别序列(AGCCATGGC；Rangan等人，2008年)。所述GluB-4信号肽(缩写为PSGluB-4)由SEQ ID NO：4中报告的所述核苷酸序列来进行编码；有利地，所述后者被置于编码所述轻多肽链(L)及重多肽链(H)的所述序列之前。PSGluB-4用于在所述内质网腔内传递两条链。

为了确定所述PSGluB-4/L及PSGluB-4/H复合物的最可能的蛋白水解切割位点(proteolytic cleavage site)，使用了所述SignalP 3.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。这个位点恰好位于PS及L/H之间(PS-L：MATIAFSRLSIYFCVLLLCHGSMA//QIVLSQSPAI...；PS-H：MATIAFSRLSIYFCVLLLCHGSMA//QVQLQQPGAE...)(图1)。所述利妥昔单抗抗体的所述轻链(L)及重链(H)的所述氨基酸序列由美国专利A-5,736,137推论得出。鉴于水稻中的一高表达，通过选择所述单个密码子(密码子环境方法)来人工合成用于编码上述链的所述核苷酸序列以及PSGluB-4。因此，这些序列与上述专利中报道的序列不同，但仍与其完全同义(图3)。

所述轻链L及重链H的所述核苷酸序列分别在SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6中报道。

在两个表达盒中使用的所述聚腺苷酸化信号是NOS终止子，即，根癌土壤杆菌的所述基因编码胭脂碱合酶(gene encoding nopaline synthase)的所述终止子。NOS终止子的所述序列在SEQ ID NO：7中示出。

然后，通过利用多个特异性限制位点来连续连接上述元件，从而构成所述抗体的每条轻链(L)及重链(H)的所述表达盒。

将所述盒引入所述最终表达载体中，所述最终表达载体因此是被称为pTRS的一单载体，所述单载体由申请人开发并且已经在所述T-DNA内部配有所述PMI(磷酸-甘露糖异构酶)选择盒。在验证了用于构建被称为pTRS利妥昔单抗(图2)的所述最终表达载体的所有序列后(所述pTRS利妥昔单抗的整个序列在SEQ ID NO：1中示出)，通过电穿孔将其引入根癌土壤杆菌菌株EHA 105中。在合适的对照之后，将所述工程菌株用于转化水稻胚性愈伤组织(梗稻，品种CR W3)。

规律地在一选择性基质上进行幼苗(seedlings)转化及再生的整个过程。获得180个初级转化子；一旦所述幼苗成熟，就收集其各自的种子以用于随后的分析中，这些分析既涉及所述抗体的存在及其表达程度的验证，还涉及用于识别最佳表达子的选择、用于所述后代的创造及所述生产线的建立。

如同所述初级转化子，所述后代也正常发育并生产含有感兴趣的所述重组抗体的种子。

通过DAS-ELISA证实了所述转化的水稻粉中的所述抗体的存在(图5)。相同的免疫分析方法也被用于选择以单个T-DNA插入事件为特征的初级转化子，从而发现高产纯合品系的发育。

申请人使用所述转化植物产生的所述种子，并且开发用于处理所述种子本身，获得粗蛋白提取物以及所述重组抗体的所述提取/纯化的多个方案。后面的过程主要基于对蛋白A进行亲和层析的一捕获步骤以及通过凝胶过滤来进行的一最终纯化步骤。事实证明，处理所述种子(脱壳及增白)对于去除大多数污染蛋白而言是极为有用的。从处理及纯化的水稻粉中使用蛋白A提取的利妥昔单抗显示出一较高的纯度，超过95％(图7)。

在变性及非还原条件下进行的SDS-PAGE中，所述纯化的蛋白质显示出的一迁移率完全可与所述市售标准

(Genentech-Roche)相比，所述纯化的蛋白质的一表观分子量约为150kDa；这个重量对应于由两条轻链(各约25kDa)及两条重链(各约50kDa)所组成的所述完整抗体的预期重量。

进行凝胶过滤的所述相同的纯化样品显示两个洗脱峰(图8)。一第一劣势峰包含所述抗体分子的所述二聚体，以及一第二峰(明显占优势)对应于所述单体，所述单体被正确地组装并具有可与市售利妥昔单抗(

)重叠的一保留体积(图9)。

基于MALDI-TOF中肽图的分析，进一步的生化分析旨在测试水稻胚乳中产生的所述抗体的所述完整性以及所述后者与其市售对应物之间的所述氨基酸序列的完全相同性。对于从水稻粉中纯化的抗体的胰蛋白酶消化物进行的重复MALDI-MS分析还证实，两条链上均不存在所述信号肽，而所述重链上仅存在如预期的位于Asn 325的水平处的一单个N-糖基化位点。这个位点被占据并且所述糖基化图谱归因于具有一岩藻糖基化核心(fucosylated core)且具有及不具有一木糖残基(xylose residue)的所述寡甘露醣(paucimannose)类型(图10)。

根据本说明书获得的所述纯化的重组抗体相对于其市售对应物具有一功能上的生物等效性：实际上，所述测试的样品证明可识别所述CD20表位并能与

有效竞争。此外，观察到相同的所述表位/抗体键的所述共定位。事实上，在活的及未聚集的MEC-1细胞的所述体外测试(示例9)中(图11a，A部份)，FACS分析表明

识别98.91％的MEC-1细胞(图11a，B部分)，而水稻种子中产生的一种(RTX PBS)为98.33％(图11a，C部分)。这个数据以及所述平均荧光强度(图11b)显示两种抗体具有相同的结合所述CD20抗原的能力。在存在

或一无关抗体(但能够识别接近CD20(阿仑单抗注射剂(Campath))的所述CD52表位)的MEC-1细胞上进行的所述竞争性分析中，也有可能表示所述

抗体及RTX PBS对于相同位点的特异性竞争(图12)。

根据在与进行所述FACS分析具有相同的饱和条件下培养的MEC-1细胞上进行的所述免疫荧光分析，还可以确定所述水稻衍生的RTX PBS抗体具有与

的所述抗原/抗体键相同的定位：事实上，由于与被用于标记所述膜的CD20抗原FastDil相比，由所述荧光标记的抗CD20抗体(

RTX PBS)提供的所述信号的所述共定位使得所述CD20抗原的所述浓度在一单膜区域中相对突出(示例9)；当使用结合FITC的RTX PBS所观察到的直接免疫荧光时，所述结果似乎更加明显。

多个示例：

示例1：所述最终表达载体pTRS_RITUXIMAB的生产

作为示例，在下文中提供了一种方法，所述方法能够产生一表达载体，所述表达载体可用于水稻的遗传转化中，从而根据本文所述的可能的实施方案来进行所述利妥昔单抗抗体的所述胚乳特异性表达。可以使用类似的程序来获得其他抗体或制备所述构建体(construct)的多个变体，其特征为存在其他胚乳特异性启动子及/或靶向所述内质网及/或终止子的序列。

人工合成的编码序列：

通过在所述密码子程度上优化的一核苷酸序列(密码子环境方法)，从而在水稻中表达了构成所述利妥昔单抗抗体的每条链(轻链及重链，分别缩写为L及H)。编码所述轻多肽链(L)及重多肽链(H)的两个序列是人工合成的，从而插入所述表达盒中。根据在计算机上计划的所述分子生物学步骤，发现所述人工合成的片段包含：所述GluB-4启动子的一部分(从核苷酸位点906开始，总共525个碱基对)、一前导序列(5'-UTR)约为70个碱基对，以及考虑的编码所述多肽链的所述完整序列(轻链L的714个碱基对、重链H的1428碱基对)。为了促进在质粒中的克隆操作，将所述多个限制性位点Spe I及Sac I分别置于末端5'及3'。一旦合成，这两个程序化的片段，分别称为1315碱基对的轻链及2029碱基对的重链都被克隆到一特定载体中。

分子表达盒的生产：

使用所述中间载体pUC18(ThermoScientific)来制作每个利妥昔单抗链的所述表达盒。更具体地说，使用所述载体pUC18//GluB-4::NOS；这种载体先前是由所述申请人以提供所述GluB-4水稻启动子(基因库登录号AY427571)以及所述根癌土壤杆菌的所述胭脂碱合酶终止子(NOS，基因库登录号AF485783)的方式来生产的。通过一定向克隆、利用所述限制性位点Spe I及Sac I来将所述轻链片段插入pUC18//GluB-4::NOS。

所述重链片段插入一第二个pUC18//GluB-4::NOS也通过定向克隆、利用限制性位点Spe I及Sac I来进行；然而，在这种情况下，在最后步骤之前，进行修改所述载体pUC18//GluB-4::NOS的一工作是有必要的。特别地，为了促进所述表达盒在所述最终载体中的所述转移(参见下一段)，替换同时存在于所述GluB-4启动子的5'末端的所述限制性位点Eco RI以及位于所述NOS终止子的3'处的所述位点为Pme I是有必要的。通过具有一特定连接子(specific linker)设计的PCR来进行这种替换，所述连接子设计允许通过一些中间分子生物学步骤并通过测序来控制获得所述载体pUC18//(Pme I)GluB-4::NOS(Pme I)。然后使用所述最后的载体插入所述重链片段。以此方式，构建了两个载体，其带有与每个轻及重利妥昔单抗链有关的所述表达盒，即：pUC18//GluB-4::轻链::NOS及pUC18//(Pme I)GluB-4：：重链::NOS(Pme I)(图4)。

最终表达载体的构建：

为此目的，使用了由所述申请人开发的一质粒载体pTRS，其特征为所述表达盒的所述分子操作所必需的以下功能元件：1.基因npt II(存在于载体骨架层级处)，所述基因在所述选择的转化细菌菌株中赋予卡那霉素抗性。卡那霉素用于选择转化的细菌菌株；2.PMI基因(位于所述T-DNA内部)，所述PMI基因编码所述磷酸-甘露糖异构酶并且在所述转化植物的所述早期鉴定中用作一阳性选择剂。所述pTRS载体用作与利妥昔单抗的所述轻链及重链有关的两个表达盒的一受体。分别地，通过所述限制性位点Eco RI及Pme I来依次克隆所述两个表达盒。然后，在通过电穿孔插入根癌土壤杆菌EHA 105菌株之前，将所述最终表达载体(图2)进行序列验证。土壤杆菌的所述工程菌株最终被用于转化埂稻，变种CR W3。

示例2：通过土壤杆菌对水稻进行遗传转化

对于水稻的所述遗传转化，使用Hiei等人的试验方案(1994年)，由Hoge(莱顿大学植物科学研究所水稻研究组)及Guiderdoni(Biotrop计画、Cirad、蒙彼利埃，法国)修改，直到获得所述转化的愈伤组织。对于所述转化植物组织的所述后续选择步骤，应用所述Datta及Datta的试验方案(2006年)，所述方案利用所述磷酸-甘露糖异构酶作为一标记系统，并且与所述培养基中甘露糖的浓度增加有关。在下文中简要描述执行的主要步骤。

水稻胚子叶(rice scutellum)的胚性愈伤组织的制备与开发：

水稻的所述转化发生在源自胚子叶的胚性愈伤组织上。为了从胚子叶组织中诱导所述愈伤组织的增殖，使用了以下操作规程：

对500粒水稻种子进行脱壳(机械去除颖片(glumes))；

为了消除潜在的病原体及污染腐生物，消毒脱壳的种子；

第一次消毒处理使所述脱壳的种子在一70％的乙醇溶液中停留2分钟；

随后，将所述脱壳的种子转移至含有2滴Tween-20去污剂的一5％次氯酸钠溶液中，并在其中缓慢搅拌30分钟；

为了消除次氯酸钠的所有痕量，用无菌水洗涤3次，每次持续15分钟；

在最后一次洗涤之后，在无菌薄纸上干燥所述去壳的种子；

在所述愈伤组织诱导培养基(CIM)的所述表面上，在培养皿(

毫米)中以25毫升的体积分配，每盘放置12个脱壳的种子，；

将以此方式获得的所述多个板在黑暗中于28℃的温度下培养21天；诱导1周后，去除所述胚乳及所述胚根，从而促进来自所述胚子叶的所述愈伤组织的发育(所述胚子叶以其紧密的团块被识别，部分地被包含在所述黄色胚乳中)；

诱导3周后，将所述愈伤组织转移到一更新的CIM上，然后按照自然存在于所述愈伤组织上的所述多条分段线，在不使用解剖刀的情况下使所述愈伤组织团块破碎；

继代培养(sub-culture)持续10天，从而发展出所述胚性愈伤组织并使所述胚性愈伤组织适合用于转化。

愈伤组织与根癌土攘杆菌的共培养：

为了获得足够量的转化根癌土攘杆菌，带有所述二元表达系统的所述菌落α在LB培养基中生长；然后将所述细菌悬浮液铺在含有琼脂-卡那霉素LB(agar-kanamycin LB)的培养皿中；

在30℃下培养3天后，去除所述细菌铜绿(bacterial patina)并将其悬浮在所述共培养液(CCML)中，直到获得一O.D.600约为1.0，相当于3至510⁹个细胞/毫升；

将所述最好的愈伤组织，即一直径约2毫米、致密且增白(whitish)的那些愈伤组织转移到装有35毫升的细菌悬浮液的一培养皿中，并且浸泡15分钟；

然后利用无菌薄纸来干燥所述愈伤组织；

每个含有所述共培养的培养基固体(CCMS)的高边缘培养皿(Sarstedt)最多放置20个愈伤组织；

然后将所述愈伤组织在黑暗中于25℃的温度下培养3天。

使用所述PMI系统来选择转化的愈伤组织：

在所述水稻的胚性愈伤组织与土攘杆菌共培养之后，利用在果糖6-磷酸中的所述甘露糖-6-磷酸的所述转化能力来选择所述转化组织，所述果糖6-磷酸通过插入用于编码大肠杆菌的所述磷酸甘露糖异构酶而获得。用于此目的的所述过程如下：

将来自共培养的所述愈伤组织转移到含3％蔗糖的一不含甘露糖底物上；在黑暗中以28℃培养1周；

将所述愈伤组织转移到含有2％蔗糖及1.5％甘露糖的SMII选择底物上，并且在黑暗中以28℃培养2周；

将所述愈伤组织转移至含有1％蔗糖及2％甘露糖的SMII选择底物中，并且在黑暗中以28°培养2周；

将所述愈伤组织转移至含有0.5％蔗糖及2.5％甘露糖的PRM(预再生培养基)中，并在黑暗中以28℃培养2周。

从转化愈伤组织再生水稻幼苗：

将未褐变的愈伤组织转移到含有所述无甘露糖再生培养基(RM)的高边缘培养皿中；

48小时之后，将装有所选愈伤组织的所述培养皿暴露在光照下；

当发现所述幼苗大到足以与所述愈伤组织分离(高度≥3公分)时，将所述幼苗转移到含有所述生根培养基(rm)的培养管中；

管内的所述继代培养持续约3周，并且总是在28℃的光照下进行；

在所述再生过程结束时，将所述植物转移到泥炭中并在温室中生长。

下表显示了水稻遗传转化方案中使用的各种底物的组成。

图例、CIM:愈伤组织诱导培养基；CCML：共培养培养基的液体；CCMS：共培养培养基的固体；PSM：预选培养基；SMI：选择培养基I；SMII：选择培养基II；PRM：预再生培养基；RM：再生培养基；rm：生根培养基。

示例3：从稻米粉中提取总蛋白

首先将转化的稻米种子脱壳并用Satake TO-92增白设备(日本Satake公司)来增白所述转化的稻米种子。使用一台式转子磨机(德国Retsch公司)来研磨所述抛光的种子、使用一0.5毫米的筛子；然后将得到的粉末在提取缓冲液(50毫摩尔的磷酸钠，500毫摩尔的氯化钠，pH值7.2)中均质化，所述缓冲液的体积(毫升)与粉末重量(克)的比例等于5：1。在4℃下搅拌1小时后，在3000xg下离心10分钟。在回收上清液之后，对所述残余的颗粒进行两次的进一步提取，并进行以下修改：第二次提取时，提取缓冲液与粉末的比例为5:1、第三次提取时为4:1。冰培育仅10分钟；在这些步骤之后，始终在3000xg下离心10分钟。然后将这三种上清液组合成一个用于纯化试验的一单样品。

示例4：检测所述植物源性的利妥昔单抗抗体的DAS-ELISA

建立检测水稻种子中所述抗体含量的方法。所述方法不仅用于验证所述重组分子在多批转化生物质(biomass)中的存在，而且还用于初级转化子的筛选。

在2毫摩尔的磷酸钠及30毫摩尔的氯化钠且pH值为7.2的一缓冲液中将一山羊抗人类IgG(Fc)(Millipore)抗体稀释至浓度为0.5微克/毫升，并且涂覆在一96孔平底聚苯乙烯板(Costar)上；将100微升的所述溶液分配到每个孔中。在室温下搅拌的情况下于20分钟内完成所述涂覆过程。

去除所述涂覆溶液之后，利用PBS中的250微升/孔的一1％BSA(Sigma)溶液(添加0.01％叠氮化钠)来封闭所述板20分钟。

去除所述封闭溶液之后，在每个孔中种下50微升的样品，并在新鲜制备的PBS、1％BSA、0.1％Tween-20(Sigma)中进行适当稀释。所述样品在搅拌下于37℃培育20分钟。

取出所述样品之后，利用新鲜制备的300微升的PBS、0.1％Tween-20来洗涤3次所述多个孔。

将50微升与HRP(Millipore)偶联的抗人类IgG(Fc)在PBS、1％BSA、0.1％Tween-20中稀释至0.25微克/毫升的一浓度，然后加入每个孔中。在搅拌下于37℃培育20分钟。

去除所述偶联的抗体溶液后，将所述孔用新鲜制备的300微升的PBS、0.1％Tween-20洗涤四次。

在每个孔中添加100微升的TMB(KPL)。在搅拌下于37℃在约5分钟内显影。

利用100微升/孔的1摩尔的盐酸来终止所述显影。在450纳米的波长下读取所述样品的吸光度。

为了构建测定中使用的所述参考曲线，使用所述药物利妥昔单抗(

Genentech-Roche)；使用的浓度范围为0.3125至5皮克/微升。然后，所述测定能够对介于2至40纳克/毫升范围的利妥昔单抗的浓度产生一线性响应。为了更好地评估所述初级转化子中的所述抗体含量，使用了从所述经处理的种子粉中获得的所述总蛋白提取物的一1：600稀释液。

示例5：用于鉴定所述利妥昔单抗抗体的180个初级转化子的分析

为了检测存在于所述转化水稻样品中的利妥昔单抗抗体，根据以下试验方案，对每个初级转化子产生的40个种子进行一总蛋白提取：

利用一Retsch MM的200数字研磨机以15赫兹的一速度研磨每个样品1分钟；

在带有一特定识别码的一微量离心型试管(Eppendorf-type test tube)中回收所述粉末；

经由取样获得70毫克的所述粉末；

在带有一特定识别码的一微量离心型试管中用1毫升的提取缓冲液来对所述粉末进行均质化；

将所述悬浮液转移至装有7毫升的提取缓冲液的一标记的Falcon管中；

在搅拌下将所述多根试管在冰中培育1小时；

将1毫升的提取物转移到一标记的微量离心试管中，并在4℃下以16,000xg离心40分钟；

回收所述上清液并将其转移到一新标记的微量离心试管中；

将所述剩余的提取物储存在-20℃下。

所述方法与示例3中报道的方法的不同之处在于存在一单提取干预。凭借其更大的简便性，所述方法非常适合分析大量样品，尤其是通过自受精从初级转化子中分离出的的后代。尽管所述程序需要部分提取所述抗体，但所述程序允许以很高的准确性来评估基因沉默现象的所述实体，所述基因沉默现象可归因于重复序列的存在。免疫学分析(DAS-ELISA，如示例4中所示)表明，在180个(0.56％)中只有1个不可能检测到所述重组抗体的存在。这表明本发明非常有效地解决了现有技术的问题及局限性。为了获得一更高的数据稳定性，对每个样品的一第二次提取物重复进行免疫分析，结果相同。举例来说，图5显示在与10个初级转化子有关的所述蛋白质提取物中所重复获得的数值。

重复自受精并选择纯合品系之后，通过DAS-ELISA(如示例4)来测定提取物中所述利妥昔单抗的含量，所述提取物是通过示例3所述的完整方法来获得的。在3个独立的品系中，其特征为T-DNA中的单插入事件，所述利妥昔单抗的含量如下：0.950克/公斤、1.072克/公斤、0.923克/公斤。这些数值证明本发明不仅允许在没有沉默现象的情况下简化所述转化品系的所述转化及选择程序，而且还获得了绝对适合工业应用的抗体产量。

示例6：植物来源的利妥昔单抗抗体的纯化

为了纯化所述利妥昔单抗抗体，应用了基于蛋白质A的一实验方案；所有所述色谱步骤均使用AktaPurifier UPC-100(GE Healthcare)的色谱仪来进行操作。

在纯化之前，将从所述提取物中获得的所述上清液通过具有1微米的一孔隙率的Polycap 36HD滤芯(Whatman)来进行过滤。依次使用具有一UFP-50-C-4MA滤芯的一QX-Stand切向系统(GE Healthcare)来对所述过滤物进行超滤，直至达到原始体积的1/10。然后，使用孔隙率为0.45微米的一25毫米的GD/XP聚醚砜滤芯(Whatman)来将所述渗余物重新过滤。然后将所述过滤物上样到蛋白质A琼脂糖凝胶FF(GE Healthcare)色谱柱中；上样后，在pH值为7.4的PBS中洗涤。然后在柠檬酸盐缓冲液(50毫摩尔的柠檬酸钠，pH值为3.0)中洗脱，并且部分收集所述峰(图6)。利用pH值为8.8的3摩尔的Tris-HCl缓冲液来中和所述收集的部分，并用pH值为8.0的0.4摩尔的精氨酸来稳定储存。由此获得的所述纯化的样品既用于所述抗体分子的一生化表征(H及L链的所述结构研究)，又用于识别所述抗原的一体外药理试验。

示例7：用于识别所述抗原的制备性过滤凝胶的体外药理学试验

在蛋白A上通过色谱法纯化而在转基因水稻的胚乳中产生的一批利妥昔单抗(参见示例6)，并且获得一纯度高于所述总蛋白95％以上的一制剂(图7)。通过凝胶过滤Superdex 200 10/300GL(GE Healthcare)将250微升的蛋白质浓度为17毫克/毫升的制剂上样到所述色谱柱中，并且利用PBS缓冲液以0.5毫升/分钟的流速来进行洗脱。所述凝胶过滤分为几个部分收集；所述植物来源的抗体分子显示出在2个峰中持续洗脱(图8)。所述第一个较小的峰位于一保留体积9.5毫升处，所述第二个较大的峰接近一保留体积12.1毫升。所述第一个峰包含所述抗体二聚体；相反地，所述第二个峰由所述正确组装的单体组成。因此，为证明这一点，所述植物来源的抗体及所述市售利妥昔单抗(

GeNeTeRo-RoCH)所记录的峰值与所述保留体积完全重叠(图9)。

将500微升的含有所述单体的所述洗脱部分(称为RTX PBS)用于所述细胞荧光法实验，其旨在确认相较于所述市售对应物

在识别所述CD20表位的方面上，在水稻中产生的利妥昔单抗的等效性(示例9)。

示例8：通过MALDI-MS在水稻胚乳中产生的利妥昔单抗的多肽链L及H的生物化学分析

将来自水稻的一纯化利妥昔单抗样品进行最终的凝胶过滤(示例7)，利用DTT来还原、利用碘乙酰胺来进行烷基化，并且通过RP-HPLC来脱盐。

浓缩通过HPLC而手动收集的所述部分，然后利用胰蛋白酶来进行水解；。将由此产生的所述肽混合物的一等分试样进行MALDI-MS分析。

随后，为了鉴定所述N-糖基化位点的存在，将所述样品的所述胰蛋白酶混合物与PNGase A一起培育，并将所述产生的混合物的一等分试样再次进行MALDI-MS分析。

对所述两条链的所述肽混合物进行MALDI-MS分析所获得的所述光谱的研究可以构建其“肽图”。因此证实了所述两条链(轻链及重链)的所述氨基酸序列，覆盖所述轻链序列的97％及所述重链序列的78.9％。所述重链序列的部分覆盖是由于以下事实：Δ[176-238]区域对于胰蛋白酶或其他特定酶或化学试剂而言，不具有水解位点。对于两条链，发现了所述信号肽的正确去除及N末端位置的所述Gln残基的所述部分环化。此外，可能将Asn325鉴定为N-糖基化的一位点。

关于糖型的研究，与PNGase A温育之后，通过Sep-Pak色谱法从所述肽组分中分离出所述寡糖，进行浓缩，然后在MALDI-MS中进行分析。这种分析可以检测到可归因于所述糖型存在的一系列信号的存在(图10)。对于在植物中表达的蛋白质而言，所述糖基化图谱是预期的，即具有一岩藻糖基化核心且具有或不具有一木糖残基的所述低聚甘露糖类型。

示例9：关于抗原/抗体连接的接合、竞争及共定位的体外药理学试验

所述RTX PBS部分(示例7)用于细胞荧光实验，从而评估其与市售利妥昔单抗(

)相比的结合活性。

为了进行所述细胞荧光分析(FACS)，使用了MEC-1细胞；MEC-1对应于B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的一人类细胞系，所述细胞系能够表达CD20，这是利妥昔单抗识别的所述表位。所述实验的所述第一阶段包括筛选在其上确定所述抗体键的所述MEC-1细胞，从而仅在活的B淋巴细胞上操作，而没有由于细胞凋亡(apoptosis)引起的细胞聚集及碎片。在

及从水稻种子中纯化的所述类似的重组体(RTX-PBS)的存在下，对分离及收集的所述细胞群进行所述荧光强度(FLH-1)分析(图11a，A部分中的多边形突出标示)；特别地，在37℃下用5纳克/微升的

或使用等量的RTX-PBS来培育500000个MEC-1细胞。再利用抗人类IgG的所述第二抗体FITC培育后进行FACS分析。通过这一分析，可以证明

能识别98.91％(图11a，部分B)的MEC-1细胞，而RTX-PBS识别98.33％(图11a，部分C)。在图11a中，部分B及C表示由无关的第二抗体提供的所述荧光贡献。所述数据以及平均荧光强度(图11b)表明这两种抗体具有相同的结合CD20抗原的能力。所述RTX PBS抗体证实即使直接用荧光素标记后也能识别CD20，以致99.15％的MEC-1细胞均为阳性。

为了鉴定所述抗原-抗体键的位置，在显微镜下对通过FACS分析的相同细胞进行了一免疫荧光分析；将所述MEC-1细胞粘附在一载玻片上，并且用DAPI(Sigma，1微克/微升)标记以显示所述细胞核，利用FastDil(Invitrogen，1微克/微升)标记以显示所述细胞膜。所述

及RTX PBS抗体分别由FITC抗人类IgG第二抗体显示，或者在只有所述RTXPBS抗体的情况下，通过与所述FITC分子(荧光素5-异硫氰酸酯)直接偶联来显示。如文献中已知，CD20是存在于整个细胞表面上的一4结构域跨膜分子；然而，与利妥昔单抗结合后，它倾向于集中在富含胆固醇的脂质结构(称为脂质筏(lipid rafts))中。这种特征允许所述利妥昔单抗分子将自身定位在所述细胞表面的一受限区域中，使所述Fc部分更靠近在一起，从而能够结合所述C1q因子并激活所述互补级联(complementary cascade)或诱导细胞凋亡。根据所述免疫荧光分析，由于所述荧光素抗体与FastDil信号的共同定位，因此可以确定所述CD20抗原在一单膜区域的所述浓度。直接与FITC偶联的RTX PBS可以更清楚地看到这一证据。

为了进行所述竞争性分析(图12)，在25微升的

(100微克/微升)或一对照抗体(抗CD52、Campath-1 100微克/毫升)中将MEC-1细胞培育10分钟。然后，以10微克/毫升的一浓度添加25微升的FITC标记的RTX抗体。在37℃下培育1小时，并且通过洗涤来消除未结合的抗体部分后，对所述细胞进行细胞荧光分析。在竞争性分析中，如果

或Campath-1识别的表位与RTX PBS相同，则RTX-PBS与抗原的结合可能会减少，因为所涉及的位点已经被占据。因此，作为竞争性的指标，应考虑荧光强度低的细胞(介于10⁰及10²之间)。在具有标记的RTX PBS(不存在其他抗体)的情况下显示低荧光的细胞仅为7.18％(图12A)。相反地，在与

的竞争性测定中，超过97％的细胞显示出低荧光强度(图12C)，表示

及RTX PBS竞争相同的位点。在存在Campath的情况下，只有10.36％的细胞进入低荧光范围内(图12B)，证明RTX PBS及Campath可以识别不同的表位。

显然地，在不脱离本发明的领域及范围的情况下，可以对如上所述用于稳定地生产植物蛋白，特别是谷物胚乳中的一完整重组抗体的方法进行修改及/或添加。

应当理解，尽管已经参考一些具体实施例来描述本发明，但是本领域技术人员当然能够获得许多其他等效形式的方法来稳定地生产一植物蛋白，特别是在一谷物胚乳中具有如权利要求中所述的特征的一完整重组抗体，因此都在本发明所限定的保护范围内。

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SEQUENCE LISTING

<110> 创思阿克第瓦有限公司

马尔凯蒂,斯特凡诺

巴蒂,塔玛拉

<120> 用于在植物中稳定产生特别是谷物胚乳中的完整重组抗体的蛋白质的表达载体及方法

<130> H5-3133

<150> IT102017000042052

<151> 2017-04-14

<160> 7

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 15521

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> CDS

<222> (1)..(15521)

<223> pTRS_利妥昔单抗表达载体

<400> 1

gaattcccga tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg 60

ctatattttg ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac 120

ccatctcata aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa 180

cagaaattat atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta 240

ttgccaaatg tttgaacgat cggggaaatt cgagctctca gcactcgcca cggttgaagg 300

acttggtcac cgggctggac aggccctggt gggtcacctc gcacgcatac actttgtgct 360

tctcatagtc ggctttggag agcgtgaggg tggaggacag ggagtaggtg gagtctttgg 420

agtcctgctc ggtcacggac tcctgggagt tgccggactg cagcgcattg tcaactttcc 480

actgcacttt ggcctcccga gggtagaagt tgttgagcag gcacacaacg gacgcggtgc 540

cggacttgag ctgctcatcg gagggaggga agatgaacac ggagggcgcg gcaacggtcc 600

gcttgatctc cagcttggtg ccgccgccga aggtgggagg gttggaggtc cactgctggc 660

agtagtaggt ggcggcatcc tcggcctcaa cccgggagat ggtgagggag taggaggtgc 720

cggagccgga gccggagaac cgcaccggca cgccggacgc caggttggag gtggcataga 780

tccagggctt tgggctggag cccggcttct gctggaacca atggatgtag gacacggagg 840

aggacgcccg gcaggtcatg gtcactttct cgcccgggct cgcggacagg atggccgggc 900

tctgggacag cacaatctgg gccatggagc cgtggcacag cagcagcacg cagaagtaga 960

tggacagccg ggagaacgca atggtggcca tggcttctag aagctttgtt gttgttgttg 1020

ttgttgttgt tgttgttgtt gttgttggaa acttgatgtg agttcaatga cagggaagcc 1080

aacttatata gtgaagaaaa gaatcttcag atatgacgta gggatagagt ttgttgacat 1140

gtatagataa tatctagcct ataatgcgaa aagtataata gaaaaaaggt agctttgcaa 1200

tgttgagata tacacactat gactcatgga tgacatgtct tgcgctttag gggtaataca 1260

aacaatgctt gttggtaaat gtatatccaa agccttaaga tgttcctttg ccttatggat 1320

aaatttcctt ttgtgcaata aagtttctct agtatgttat cattttgtgc ggtatgtcat 1380

agatgataag ttaggcgctc cttaaatttg ttggtttgtt gtcagttttg cgtggcacac 1440

tatgcttgat aagttagcgg aacttttaaa ataagaaact tgtaagcttg ttgtcatttt 1500

ctttgacata ctatcctctc ccatatgtaa agtaaacaaa ttgatgaaat atatggaggt 1560

tagatgattt tgcatatcca actagtactt ccaagtttat accaaaaaat agaaaatgtt 1620

ggatttaatt tttaaaaaag tagaagcaat ggacttatgt atcttttctt ttttttatca 1680

ttatattttc tggcgtgcat ttattaggca gtttattact gtgacataaa tttatttaac 1740

tcgccggtaa taaaatatgc catatgtttg ttagtcctca ctgtcgacca tatcatacaa 1800

gacattaatc aaatcgtctt gtctaaaatg accacaatgt ccctgcgtgg tgtggactat 1860

gatttctttt cattcatggt tagaactact gccggtccat gaaaggttaa actataaaat 1920

gccatctgaa aaaaaaaagg taaacagaca agtactcgcc ctcgcaatta aattgttcaa 1980

taataataga aatggaagga tttgtcgtgt gtgtgtacat atatacaaga aaatatcagg 2040

aaagcatgta tgttatttta cacaccgaaa gaataaacgc acaacgaaac ttatatacaa 2100

tcatatgttt gctaggcaac cagagatgtt actcccaaaa gaaacgctcc ggtatcaatt 2160

caggcttctc ctctcacttg aactgcagct tgcttgcaaa tgtctggcca aacttccatc 2220

ctggtggcac gacgttggtg aagacgagcg tttggtcatc tgtgttggtg accctaaagg 2280

atagaccttg accggtgagg taggccagtg agtgccattg ggcgccccag ttacgtgcca 2340

tcggcatcca atccgctgtg ttggaaccca taacctccat ggacttgatt gaccctgccg 2400

ccgcgacgtt ggtcaccagt actagctgga agtagtcgtg accgttaatg gtgaaccgca 2460

ggccaccctt cttcacgcaa ggaaccctgt agaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc 2520

tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 2580

gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 2640

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 2700

gcgaatgcta gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac 2760

ccgatctagt aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat 2820

tttgttttct atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct 2880

cataaataac gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa 2940

ttatatgata atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca 3000

aatgtttgaa cgatcgggga aattcgagct ctcacttgcc cgggctcagg gacagggact 3060

tctgggtgta atggttgtgc agcgcctcat gcatcacgga gcaggagaac acattgccct 3120

gctgccaccg ggacttgtca acggtgagct tggagtacag gaagaaggag ccatcggagt 3180

ccagcaccgg aggcgtggtc ttgtagttgt tctccggctg gccattggac tcccactcaa 3240

cggcaatgtc ggagggatag aagcctttca ccaggcaggt gagggacacc tggttcttgg 3300

tcagctcatc ccgggaggga ggcagggtgt acacctgagg ctcccgaggc tggcctttgg 3360

ctttggagat ggtcttctca atgggcgccg gcagcgcttt gttggacact ttgcacttgt 3420

actctttgcc attgagccag tcctggtgca gcacggtgag cacggacaca acccggtagg 3480

tggagttgta ctgctcctcc cgaggcttgg tcttggcatt gtgcacctcc acgccatcaa 3540

cataccagtt gaacttcacc tccgggtcct catgggacac atcaacaaca acgcaggtca 3600

cctccggcgt ccgggagatc atgagggtgt ctttgggctt gggagggaac aggaacacgg 3660

agggcccgcc cagcagctcc ggcgccgggc agggagggca ggtgtgggtc ttgtcgcagg 3720

acttgggctc ggctttcttg tcaactttgg tgttggaggg cttgtggttc acattgcaga 3780

tgtaggtctg ggtgcccagg gaggaggagg gcacggtcac aacggaggac agggagtaca 3840

ggccggagga ctgcagcacg gccgggaagg tgtgcacgcc ggaggtgagc gcgccggagt 3900

tccaggacac ggtcaccggc tccgggaagt agtctttcac caggcagccc agcgcggcgg 3960

tgccgccgga ggtggacttg gaggagggcg ccagagggaa cacggagggc cctttggtgg 4020

acgcggcgga cacggtcacg gtggtgccgg cgccccacac attgaagtac cagtcgccgc 4080

catagtaggt ggaccgcgcg cagtagtaca cggcggagtc ctcggaggtg agggaggaca 4140

gctgcatgta cgcggtggag gaggacttgt cggcggtgag ggtggctttg cctttgaact 4200

tctggttgta ggaggtgtcg ccattgcccg ggtagatggc gccaatccac tccaggccac 4260

ggcccggcgt ctgcttcacc caatgcatgt tgtaggaggt gaaggtgtag ccggacgctt 4320

tgcaggacat cttcacggac gcgcccggct tcaccagctc ggcgcccggc tgctgcagct 4380

gcacctgggc catggagccg tggcacagca gcagcacgca gaagtagatg gacagccggg 4440

agaacgcaat ggtggccatg gcttctagaa gctttgttgt tgttgttgtt gttgttgttg 4500

ttgttgttgt tgttggaaac ttgatgtgag ttcaatgaca gggaagccaa cttatatagt 4560

gaagaaaaga atcttcagat atgacgtagg gatagagttt gttgacatgt atagataata 4620

tctagcctat aatgcgaaaa gtataataga aaaaaggtag ctttgcaatg ttgagatata 4680

cacactatga ctcatggatg acatgtcttg cgctttaggg gtaatacaaa caatgcttgt 4740

tggtaaatgt atatccaaag ccttaagatg ttcctttgcc ttatggataa atttcctttt 4800

gtgcaataaa gtttctctag tatgttatca ttttgtgcgg tatgtcatag atgataagtt 4860

aggcgctcct taaatttgtt ggtttgttgt cagttttgcg tggcacacta tgcttgataa 4920

gttagcggaa cttttaaaat aagaaacttg taagcttgtt gtcattttct ttgacatact 4980

atcctctccc atatgtaaag taaacaaatt gatgaaatat atggaggtta gatgattttg 5040

catatccaac tagtacttcc aagtttatac caaaaaatag aaaatgttgg atttaatttt 5100

taaaaaagta gaagcaatgg acttatgtat cttttctttt ttttatcatt atattttctg 5160

gcgtgcattt attaggcagt ttattactgt gacataaatt tatttaactc gccggtaata 5220

aaatatgcca tatgtttgtt agtcctcact gtcgaccata tcatacaaga cattaatcaa 5280

atcgtcttgt ctaaaatgac cacaatgtcc ctgcgtggtg tggactatga tttcttttca 5340

ttcatggtta gaactactgc cggtccatga aaggttaaac tataaaatgc catctgaaaa 5400

aaaaaaggta aacagacaag tactcgccct cgcaattaaa ttgttcaata ataatagaaa 5460

tggaaggatt tgtcgtgtgt gtgtacatat atacaagaaa atatcaggaa agcatgtatg 5520

ttattttaca caccgaaaga ataaacgcac aacgaaactt atatacaatc atatgtttgc 5580

taggcaacca gagatgttac tcccaaaaga aacgctccgg tatcaattca ggcttctcct 5640

ctcacttgaa ctgcagcttg cttgcaaatg tctggccaaa cttccatcct ggtggcacga 5700

cgttggtgaa gacgagcgtt tggtcatctg tgttggtgac cctaaaggat agaccttgac 5760

cggtgaggta ggccagtgag tgccattggg cgccccagtt acgtgccatc ggcatccaat 5820

ccgctgtgtt ggaacccata acctccatgg acttgattga ccctgccgcc gcgacgttgg 5880

tcaccagtac tagctggaag tagtcgtgac cgttaatggt gaaccgcagg ccacccttct 5940

tcacgcaagg aaccctgtag tttaaactat cagtgtttga caggatatat tggcgggtaa 6000

acctaagaga aaagagcgtt tattagaata acggatattt aaaagggcgt gaaaaggttt 6060

atccgttcgt ccatttgtat gtgcatgcca accacagggt tcccctcggg atcaaagtac 6120

tttgatccaa cccctccgct gctatagtgc agtcggcttc tgacgttcag tgcagccgtc 6180

ttctgaaaac gacatgtcgc acaagtccta agttacgcga caggctgccg ccctgccctt 6240

ttcctggcgt tttcttgtcg cgtgttttag tcgcataaag tagaatactt gcgactagaa 6300

ccggagacat tacgccatga acaagagcgc cgccgctggc ctgctgggct atgcccgcgt 6360

cagcaccgac gaccaggact tgaccaacca acgggccgaa ctgcacgcgg ccggctgcac 6420

caagctgttt tccgagaaga tcaccggcac caggcgcgac cgcccggagc tggccaggat 6480

gcttgaccac ctacgccctg gcgacgttgt gacagtgacc aggctagacc gcctggcccg 6540

cagcacccgc gacctactgg acattgccga gcgcatccag gaggccggcg cgggcctgcg 6600

tagcctggca gagccgtggg ccgacaccac cacgccggcc ggccgcatgg tgttgaccgt 6660

gttcgccggc attgccgagt tcgagcgttc cctaatcatc gaccgcaccc ggagcgggcg 6720

cgaggccgcc aaggcccgag gcgtgaagtt tggcccccgc cctaccctca ccccggcaca 6780

gatcgcgcac gcccgcgagc tgatcgacca ggaaggccgc accgtgaaag aggcggctgc 6840

actgcttggc gtgcatcgct cgaccctgta ccgcgcactt gagcgcagcg aggaagtgac 6900

gcccaccgag gccaggcggc gcggtgcctt ccgtgaggac gcattgaccg aggccgacgc 6960

cctggcggcc gccgagaatg aacgccaaga ggaacaagca tgaaaccgca ccaggacggc 7020

caggacgaac cgtttttcat taccgaagag atcgaggcgg agatgatcgc ggccgggtac 7080

gtgttcgagc cgcccgcgca cgtctcaacc gtgcggctgc atgaaatcct ggccggtttg 7140

tctgatgcca agctggcggc ctggccggcc agcttggccg ctgaagaaac cgagcgccgc 7200

cgtctaaaaa ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc gtcatgcggt cgctgcgtat 7260

atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg catgaaggtt atcgctgtac 7320

ttaaccagaa aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc cgcgccctgc 7380

aactcgccgg ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt gcccgcgatt 7440

gggcggccgt gcgggaagat caaccgctaa ccgttgtcgg catcgaccgc ccgacgattg 7500

accgcgacgt gaaggccatc ggccggcgcg acttcgtagt gatcgacgga gcgccccagg 7560

cggcggactt ggctgtgtcc gcgatcaagg cagccgactt cgtgctgatt ccggtgcagc 7620

caagccctta cgacatatgg gccaccgccg acctggtgga gctggttaag cagcgcattg 7680

aggtcacgga tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc aaaggcacgc 7740

gcatcggcgg tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt cttgagtccc 7800

gtatcacgca gcgcgtgagc tacccaggca ctgccgccgc cggcacaacc gttcttgaat 7860

cagaacccga gggcgacgct gcccgcgagg tccaggcgct ggccgctgaa attaaatcaa 7920

aactcatttg agttaatgag gtaaagagaa aatgagcaaa agcacaaaca cgctaagtgc 7980

cggccgtccg agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg cagacacgcc 8040

agccatgaag cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc tgaagatgta 8100

cgcggtacgc caaggcaaga ccattaccga gctgctatct gaatacatcg cgcagctacc 8160

agagtaaatg agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa ggaggcggca 8220

tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt ggaggaacgg 8280

gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc actggaaccc 8340

ccaagcccga ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg 8400

gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc 8460

atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa 8520

gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac 8580

gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc 8640

atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc 8700

cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt 8760

gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga 8820

taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta 8880

ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc 8940

attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc 9000

ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa 9060

accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca 9120

gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc 9180

atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg 9240

ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc 9300

accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg 9360

gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc 9420

gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt 9480

cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg 9540

aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa 9600

gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt 9660

aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag 9720

ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg 9780

cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg 9840

cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg caccctgcct 9900

cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 9960

agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 10020

tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg 10080

cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 10140

ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact 10200

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 10260

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 10320

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 10380

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 10440

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 10500

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 10560

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 10620

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 10680

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aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 10800

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 10860

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 10920

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 10980

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcattc taggtatcag 11040

aagaactcgt caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg 11100

taaagcacga ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta 11160

gccaacgcta tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca 11220

gaaaagcggc cattttccac catgatattc ggcaagcagg catcgccatg ggtcacgacg 11280

agatcctcgc cgtcgggcat gcgcgccttg agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc 11340

ccctgatgct cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt 11400

gctcgctcga tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta 11460

tgcagccgcc gcattgcatc agccatgatg gatactttct cggcaggagc aaggtgagat 11520

gacaggagat cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg 11580

acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct 11640

gcctcgtcct gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg 11700

cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc 11760

cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag aacctgcgtg caatccatct 11820

tgttcaatca tttattattt ccttcctctt ttcggtgatg ctgccaactt actgatttag 11880

tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct gtccctcctg 11940

ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc agcgctatct 12000

ctgctctcac tgccgtaaaa catggcaact gcagttcact tacaccgctt ctcaacccgg 12060

tacgcaccag aaaatcattg atatggccat gaatggcgtt ggatgccggg caacagcccg 12120

cattatgggc gttggcctca acacgatttt acgtcactta aaaaactcag gccgcagtcg 12180

gtaacctcgc gcatacagcc gggcagtgac gtcatcgtct gcgcggaaat ggacgaacag 12240

tggggctatg tcggggctaa atcgcgccag cgctggctgt tttacgcgta tgacagtctc 12300

cggaagacgg ttgttgcgca cgtattcggt gaacgcacta tggcgacgct ggggcgtctt 12360

atgagcctgc tgtcaccctt tgacgtggtg atatggatga cggatggctg gccgctgtat 12420

gaatcccgcc tgaagggaaa gctgcacgta atcagcaagc gatatacgca gcgaattgag 12480

cggcataacc tgaatctgag gcagcacctg gcacggctgg gacggaagtc gctgtcgttc 12540

tcaaaatcgg tggagctgca tgacaaagtc atcgggcatt atctgaacat aaaacactat 12600

caataagttg gagtcattac ccctcttttc tacagtattt aaagataccc caagaagcta 12660

attataacaa gacgaactcc aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga 12720

aaacagcttt ttcaaagttg ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg acggagccga 12780

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catcggtaac atgagcaaag tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg 12960

gactgatggg ctgcctgtat cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg 13020

ttggctggct ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa 13080

taacacattg cggacgtttt taatgtactg aattaacgcc gaattaattc gggggatctg 13140

gattttagta ctggattttg gttttaggaa ttagaaattt tattgataga agtattttac 13200

aaatacaaat acatactaag ggtttcttat atgctcaaca catgagcgaa accctatagg 13260

aaccctaatt cccttatctg ggaactactc acacattatt atggagaaac tcgagttaca 13320

gcttgttgta aacacgcgct aaacggccgt ggcctttgac agtcaccggt gattcgttgg 13380

cggcaataaa cgctgattca cccggtttaa gctgtaactg ctgagaacct ttccacaacg 13440

ttgcatcgcc ttcgacgcag aacaaaatgg cggcactctg ctggctaatg gtggtttctt 13500

tatcactaag gtcatgcagc gagaaggcaa aatcatccac tggaatcggg aagtccagtt 13560

ctgcaccttg tttcaccggc tgggtcaaca actggttagc cggtttggct tcgaatttca 13620

cattggcaac cagttccgga atatcaatgt atttaggcgt cagacccgca cgcagcacgt 13680

tatcggagtt tgccatcact tccagcgcca cgccttgcag gtaagcgtgc ggtgtttcag 13740

cgaacaggaa catcgcttcg ccagggttca atttcaccac attcagcaat agcggggaga 13800

acagaccgct gtcttccggg taaaattcag aaattaaacg aatcgtttgc cacggttcac 13860

cctgctggct atcgagggcc gattttaaaa tcgccagcgc gcgggatttt tcttcaccct 13920

gcatattcaa caggctggcg aacagttcgc ttaaacgttc ggcatcaggc tgttgtaaaa 13980

agtgagcaat cgccggatgt gcacctgcga ccggctggag tagggagaca atctcggaaa 14040

attcacgaaa cgcgttcatc gcaaggaaag gcgtcagcgc aaaaaccagc tccggcttgt 14100

ggttaggatc tttatagtta cgctcggcgg catccatcgg gatacctgcg gcattttctt 14160

tggcaaaacc gatttcagaa ttgtgtttgt ttggatgaac ctgaatggag agtggctgtg 14220

ctgcgcataa tactttgaac aggaaaggca gttcgccaaa gcgtttggca acggcctctc 14280

cgagcagagt cgatttatca ctctcaatca catcacgcag tgaaacgatg tctccggcgg 14340

cattctgcac tcgtgaactg cttttcggat gtgcgcccat ccacagctcg gccatcggct 14400

ggctggacgg attttccata ccataaagtt cagtcaacgc cgttttgctg ccccaggcat 14460

agttttgcac tgagttaatg agtttttgca tctcgagaga gatagatttg tagagagaga 14520

ctggtgattt cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag aggaaggtct 14580

tgcgaaggat agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc 14640

acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg 14700

ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg 14760

caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat gaagtgacag 14820

atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca 14880

atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg 14940

tgctccacca tgttatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct 15000

ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca 15060

tcttgaacga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggtgcc accttccttt 15120

tctactgtcc ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc 15180

gatattaccc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg 15240

atattcttgg agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tggcaagctg ctctagccaa 15300

tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 15360

ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 15420

aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg 15480

gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta c 15521

<210> 2

<211> 1430

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220> Promoter

<222> (1)..(1430)

<223> GluB-4启动子

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ttccagctag tactggtgac caacgtcgcg gcggcagggt caatcaagtc catggaggtt 120

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tcactggcct acctcaccgg tcaaggtcta tcctttaggg tcaccaacac agatgaccaa 240

acgctcgtct tcaccaacgt cgtgccacca ggatggaagt ttggccagac atttgcaagc 300

aagctgcagt tcaagtgaga ggagaagcct gaattgatac cggagcgttt cttttgggag 360

taacatctct ggttgcctag caaacatatg attgtatata agtttcgttg tgcgtttatt 420

ctttcggtgt gtaaaataac atacatgctt tcctgatatt ttcttgtata tatgtacaca 480

cacacgacaa atccttccat ttctattatt attgaacaat ttaattgcga gggcgagtac 540

ttgtctgttt accttttttt tttcagatgg cattttatag tttaaccttt catggaccgg 600

cagtagttct aaccatgaat gaaaagaaat catagtccac accacgcagg gacattgtgg 660

tcattttaga caagacgatt tgattaatgt cttgtatgat atggtcgaca gtgaggacta 720

acaaacatat ggcatatttt attaccggcg agttaaataa atttatgtca cagtaataaa 780

ctgcctaata aatgcacgcc agaaaatata atgataaaaa aaagaaaaga tacataagtc 840

cattgcttct acttttttaa aaattaaatc caacattttc tattttttgg tataaacttg 900

gaagtactag ttggatatgc aaaatcatct aacctccata tatttcatca atttgtttac 960

tttacatatg ggagaggata gtatgtcaaa gaaaatgaca acaagcttac aagtttctta 1020

ttttaaaagt tccgctaact tatcaagcat agtgtgccac gcaaaactga caacaaacca 1080

acaaatttaa ggagcgccta acttatcatc tatgacatac cgcacaaaat gataacatac 1140

tagagaaact ttattgcaca aaaggaaatt tatccataag gcaaaggaac atcttaaggc 1200

tttggatata catttaccaa caagcattgt ttgtattacc cctaaagcgc aagacatgtc 1260

atccatgagt catagtgtgt atatctcaac attgcaaagc tacctttttt ctattatact 1320

tttcgcatta taggctagat attatctata catgtcaaca aactctatcc ctacgtcata 1380

tctgaagatt cttttcttca ctatataagt tggcttccct gtcattgaac 1430

<210> 3

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> Precursor_RNA

<222> (1)..(70)

<223> 5'UTR

<400> 3

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tctagaagcc 70

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> sig_peptide

<222> (1)..(72)

<223> 信号多肽

<400> 4

atggccacca ttgcgttctc ccggctgtcc atctacttct gcgtgctgct gctgtgccac 60

ggctccatgg cc 72

<210> 5

<211> 642

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> CDS

<222> (1)..(642)

<223> 利妥昔单抗的轻链的CDS

<400> 5

cagattgtgc tgtcccagag cccggccatc ctgtccgcga gcccgggcga gaaagtgacc 60

atgacctgcc gggcgtcctc ctccgtgtcc tacatccatt ggttccagca gaagccgggc 120

tccagcccaa agccctggat ctatgccacc tccaacctgg cgtccggcgt gccggtgcgg 180

ttctccggct ccggctccgg cacctcctac tccctcacca tctcccgggt tgaggccgag 240

gatgccgcca cctactactg ccagcagtgg acctccaacc ctcccacctt cggcggcggc 300

accaagctgg agatcaagcg gaccgttgcc gcgccctccg tgttcatctt ccctccctcc 360

gatgagcagc tcaagtccgg caccgcgtcc gttgtgtgcc tgctcaacaa cttctaccct 420

cgggaggcca aagtgcagtg gaaagttgac aatgcgctgc agtccggcaa ctcccaggag 480

tccgtgaccg agcaggactc caaagactcc acctactccc tgtcctccac cctcacgctc 540

tccaaagccg actatgagaa gcacaaagtg tatgcgtgcg aggtgaccca ccagggcctg 600

tccagcccgg tgaccaagtc cttcaaccgt ggcgagtgct ga 642

<210> 6

<211> 1356

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> CDS

<222> (1)..(1356)

<223> 利妥昔单抗的重链的CDS

<400> 6

caggtgcagc tgcagcagcc gggcgccgag ctggtgaagc cgggcgcgtc cgtgaagatg 60

tcctgcaaag cgtccggcta caccttcacc tcctacaaca tgcattgggt gaagcagacg 120

ccgggccgtg gcctggagtg gattggcgcc atctacccgg gcaatggcga cacctcctac 180

aaccagaagt tcaaaggcaa agccaccctc accgccgaca agtcctcctc caccgcgtac 240

atgcagctgt cctccctcac ctccgaggac tccgccgtgt actactgcgc gcggtccacc 300

tactatggcg gcgactggta cttcaatgtg tggggcgccg gcaccaccgt gaccgtgtcc 360

gccgcgtcca ccaaagggcc ctccgtgttc cctctggcgc cctcctccaa gtccacctcc 420

ggcggcaccg ccgcgctggg ctgcctggtg aaagactact tcccggagcc ggtgaccgtg 480

tcctggaact ccggcgcgct cacctccggc gtgcacacct tcccggccgt gctgcagtcc 540

tccggcctgt actccctgtc ctccgttgtg accgtgccct cctcctccct gggcacccag 600

acctacatct gcaatgtgaa ccacaagccc tccaacacca aagttgacaa gaaagccgag 660

cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgc cctccctgcc cggcgccgga gctgctgggc 720

gggccctccg tgttcctgtt ccctcccaag cccaaagaca ccctcatgat ctcccggacg 780

ccggaggtga cctgcgttgt tgttgatgtg tcccatgagg acccggaggt gaagttcaac 840

tggtatgttg atggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agcctcggga ggagcagtac 900

aactccacct accgggttgt gtccgtgctc accgtgctgc accaggactg gctcaatggc 960

aaagagtaca agtgcaaagt gtccaacaaa gcgctgccgg cgcccattga gaagaccatc 1020

tccaaagcca aaggccagcc tcgggagcct caggtgtaca ccctgcctcc ctcccgggat 1080

gagctgacca agaaccaggt gtccctcacc tgcctggtga aaggcttcta tccctccgac 1140

attgccgttg agtgggagtc caatggccag ccggagaaca actacaagac cacgcctccg 1200

gtgctggact ccgatggctc cttcttcctg tactccaagc tcaccgttga caagtcccgg 1260

tggcagcagg gcaatgtgtt ctcctgctcc gtgatgcatg aggcgctgca caaccattac 1320

acccagaagt ccctgtccct gagcccgggc aagtga 1356

<210> 7

<211> 265

<212> DNA

<213> Agrobacterium tumefaciens

<220> terminator

<222> (1)..(265)

<223> NOS终止子

<400> 7

gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 60

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 120

catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 180

catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 240

ggtgtcatct atgttactag atcgg 265

Claims

1.一种用于在一谷物胚乳中稳定产生一完整重组抗体的表达载体，其特征在于：所述表达载体是一单载体，所述单载体包括：

所述抗体的所述轻多肽链(L)的一表达盒；

所述抗体的所述重多肽链(H)的一表达盒；

所述多个表达盒具有相同的方向及相同的基因表达调控元件，其中所述轻多肽链(L)的表达盒及所述重多肽链(H)的表达盒：

(b)分别提供以下多个基因表达调控元件；

(i)天然或人工来源的一胚乳特异性启动子，

(ii)天然或人工来源的一前导序列(5’-UTR)；

(v)天然或人工来源的一拖尾序列(3’-UTR)；

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述谷物是水稻。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于：天然或人工来源的所述胚乳特异性启动子(i)是如SEQ ID NO:2所示的水稻谷蛋白4(GluB-4)的基因的启动子。

4.如权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于：所述前导序列5’-UTR(ii)具有合成性质，并且其特征为重复的CAA三核苷酸元素以及用于识别所述翻译起始位点且如SEQ IDNO:3所示的一共有序列AGCCATGGC。

5.如权利要求2、3或4所述的表达载体，其特征在于：所述信号肽的所述核苷酸序列(iii)对应于SEQ ID NO：4，所述序列编码用于所述水稻中的所述信号肽，从而靶向所述内质网内的所述谷蛋白4的前体(PSGluB-4)。

6.如权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于：所述拖尾序列3’-UTR(v)是所述NOS终止子，所述NOS终止子的序列被标示在SEQ ID NO：7；或者所述拖尾序列3’-UTR(v)是所述水稻GluB-4基因的所述终止子。

7.如权利要求2至6任一项所述的表达载体，其特征在于：编码所述抗体的所述轻多肽链(L)或重多肽链(H)的所述成熟形式的所述核甘酸序列(iv)分别由编码所述利妥昔单抗抗体的所述轻多肽链(L)如SEQ ID NO：5所示的序列及所述重多肽链(H)如SEQ ID NO：6所示的序列加以代表。

8.如权利要求1至7任一项所述的表达载体，其特征在于：所述载体包括能够允许选择所述转化植物的一另一表达盒。

9.如权利要求1至8任一项所述的表达载体，其特征在于：通过使用优先选择的物种特异性同义密码子来优化编码所述抗体的所述轻多肽链(L)及重多肽链(H)的所述多个序列在多种谷物中的表达。

10.如权利要求1至9任一项所述的表达载体，其特征在于：所述载体包括用于选择转化的植物细胞的一表达盒，所述表达盒包含：

天然或人工来源的一组成型启动子；

天然或人工来源的一终止子，适合用于一植物表达系统。

11.如权利要求1至10所述的表达载体，其特征在于：所述单表达载体具有SEQ ID NO：1所示的序列。

12.一种细菌菌株，其特征在于：包括如权利要求1至11任一项所述的一表达载体。

13.一种由多种土壤杆菌介导转化的二元系统，其特征在于：所述二元系统由如权利要求1至11任一项所述的一表达载体以及承载所述毒性区的一互补载体所组成。

14.一种由如权利要求1至11任一项所述的一表达载体加以转化的植物细胞、植物及植物种子。

15.如权利要求14所述的转化的植物细胞、植物及植物种子，其特征在于：所述转化的植物细胞、植物及植物种子直接或间接地用于治疗处理。

16.一种在一谷物胚乳中稳定产生一完整重组抗体的方法，其特征在于：所述方法包括：

构建如权利要求1至11任一项所述的用于植物的遗传转化的一分子载体；

工业加工所述转化的种子；

提取及纯化感兴趣的所述抗体。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于：稳定产生的所述完整重组抗体的产率为每千克胚乳含有大于0.6克的抗体。