DE60029986T2

DE60029986T2 - Kontrolle der post-transkriptionellen Genabschaltung (gene silencing) in Pflanzen

Info

Publication number: DE60029986T2
Application number: DE60029986T
Authority: DE
Inventors: Vicki Columbia VANCE
Original assignee: University of South Carolina
Current assignee: University of South Carolina
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 2000-11-09
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2020-11-10
Also published as: EP1228229A2; ATE335830T1; WO2001034822A3; AU784336B2; WO2001034822A2; CA2390049C; CA2390049A1; DE60029986D1; AU1602201A; EP1228229B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Bei der posttranskriptionalen Gen-Abschaltung (PTGS) handelt es sich um einen bekannten eukaryontischen Regulationsmechanismus (Bingham, 1997), der auf eine spezielle RNA-Sequenz abzielt und diese zerstört. Der Vorgang kann ausgelöst werden, wenn mehrfache Kopien eines Transgens (oder eines Transgens und eines homologen endogenen Gens) im gleichen Genom vorliegen (bezüglich neuerer Übersichtsartikel über PTGS wird verwiesen auf Depicker and Van Montagu, 1997; Grant, 1999). Doppelsträngige RNA induziert in zahlreichen Systemen PTGS (Metzlaff et al., 1997; Montgomery and Fire, 1998; Waterhouse et al., 1999), und in Pflanzen kann sie auch durch zytoplasmatisch replizierende Viren ausgelöst werden, von denen viele doppelsträngige RNA-Replikationszwischenprodukte erzeugen (Baulcombe, 1999; Kumagai et al., 1995; Ruiz et al., 1998). Nachdem der Mechanismus ausgelöst worden ist, wird etwaige homologe RNA abgebaut, unabhängig davon, ob sie aus dem Transgen, dem endogenen Gen oder aus der viralen RNA transkribiert worden ist. Die Tatsache, dass Pflanzenviren sowohl als Induktoren als auch als Ziele der posttranskriptionalen Gen-Abschaltung wirken können (A. J. Kaff et al., 1998; Matzke and Matzke, 1995; Ratcliff et al., 1997) hat zu der Vorstellung geführt, dass PTGS in Pflanzen als ein antiviraler Abwehrmechanismus entwickelt worden ist. Die verwandten Vorgänge in anderen eukaryontischen Organismen können eine ähnliche Funktion ausüben.
Wenn PTGS in Pflanzen einen antiviralen Abwehrmechanismus darstellt, dann ist es nicht überraschend, dass einige Pflanzenviren eine Gegenabwehr entwickelt haben. Neuere Arbeiten von uns und anderen Autoren haben ein pflanzenvirales Protein, HC-Pro, identifiziert, das die Induktion der posttranskriptionalen Gen-Abschaltung stört (Anandalakshmi et al., 1998; Brigneti et al., 1998; Kasschau and Carrington, 1998). Dieses Ergebnis stellt eine weitere Stütze für die Vorstellung dar, dass die PTGS mit natürlichen antiviralen Resistenzsystemen in Pflanzen verbunden sein kann, und öffnet den Zugang zu einem neuen Weg zum Verständnis der Gen-Abschaltung in Pflanzen.
Die Identifizierung eines viralen Suppressors von PTGS stammt aus Untersuchungen über synergistische virale Krankheiten, bei denen eine Coinfektion mit zwei heterologen Viren zu wesentlich ernsthafteren Symptomen führt, als dies bei einer Infektion mit einem Virus allein der Fall ist. Bei zahlreichen derartigen synergistischen Krankheiten ist ein Mitglied der Potyvirus-Gruppe von Pflanzenviren beteiligt (Vance, 1991; Vance et al., 1995). Früher wurde bereits festgestellt, dass transgene Pflanzen, die die 5'-proximale Region des Tabak-Ätz-Potyvirus (TEV)-Genoms (als P1/HC-Pro-Sequenz bezeichnet) exprimieren, eine synergistische Krankheit entwickeln, wenn sie mit einem beliebigen Virus aus einem breiten Bereich von Pflanzenviren infiziert werden (Pruss et al., 1997). Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, dass die P1/HC-Pro-Sequenz möglicherweise ein allgemeines antivirales System in Pflanzen stört, was es den Viren ermöglicht, sich über die normalen wirtsvermittelten Grenzen hinaus zu vermehren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass es sich beim allgemeinen antiviralen System um eine posttranskriptionale Gen-Abschaltung handelt (Pruss et al., 1997). Um diese Hypothese zu testen, wurde der Einfluss der P1/HC-Pro-Expression auf die posttranskriptionale Gen-Abschaltung in zwei verschiedenen Abschaltungssystemen getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass P1/HC-Pro als ein Suppressor sowohl der transgeninduzierten (Anandalakshmi et al., 1998; Kasschau and Carrington, 1998) als auch der virusinduzierten Gen-Abschaltung (Anandalakshmi et al., 1998; Brigneti et al., 1998) wirken. Weitere Experimente zeigten, dass die Suppression von PTGS durch das HC-Pro-Protein vermittelt wird, dass die RNA für die Suppression nicht ausreichend ist und dass das PI-Protein möglicherweise als nicht-essentielles Hilfsprotein bei der Suppression wirkt (Anandalakshmi et al., 1998; Brigneti et al., 1998).
Die Expression von P1/HC-Pro in transgenen Pflanzen führt zu einer Anzahl von Phänotypen, von denen einige nützlich und andere schädlich sind. Wie vorstehend erörtert, stört P1/HC-Pro die postranskriptionale Gen-Abschaltung. Dieser Phänotyp ist möglicherweise nützlich. PTGS begrenzt das Niveau der Expression von Transgenen und stellt ein ernsthaftes Problem bei zahlreichen biotechnologischen Anwendungen dar. HC-Pro kann als direktes Gegenmittel zu PTGS eingesetzt werden. Jedoch ist die Unterdrückung von PTGS nicht der einzige Vorgang, der durch HC-Pro beeinflusst wird. Die P1/HC-Pro-transgenen Pflanzen zeigen eine veränderte Reaktion auf virale Pflanzenpathogene (und möglicherweise auch auf andere Pathogene). Unsere anfänglichen Experimente zeigten, dass die P1/HC-Pro-exprimierenden transgenen Materialien auf eine Infektion durch Kartoffel-Virus X oder Tabak-Mosaikvirus mit einer systemischen Nekrose reagieren (Pruss et al., 1997). Jedoch gleicht in anderen Fällen die Reaktion dieser Pflanzen auf ein virales Pathogen einer systemisch erworbenen Resistenz (SAR). Unter Bedingungen, bei denen das N-Resistenz-Gen von Tabak aktiv ist, reagieren die Pflanzen auf TMV-Inokulation mit weniger und kleineren Läsionen als wilde Kontrollpflanzen (die klassische SAR-Reaktion). Die gleichen Linien sind vollständig resistent gegen eine Infektion mit Tomaten-Ringflecken- Nepovirus, obgleich die Kontrollpflanzen empfindlich sind. Der Mechanismus dieser induzierten Resistenz ist unbekannt. Eine Expression von P1/HC-Pro in transgenen Pflanzen verleiht ferner mehrere besondere Entwicklungscharakteristika. Die ersten Blätter der keimenden Pflanzen sind spitz statt abgerundet (der spitze Charakter ist ein Merkmal von reifen Blättern, während die abgerundete Form der unreifen Beschaffenheit entspricht). Die Pflanzen wachsen langsam unter verminderter Wurzelbiomasse und ein differenzierter Tumor entwickelt sich an der Verbindung zwischen Stängel und Wurzel. Schließlich zeigen die Blüten eine verzögerte und verringerte Pigmentierung. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass PTGS von Pflanzen als ein Aspekt der entwicklungsbedingten Gen-Regulation verwendet wird.
Um transgene Pflanzen vollständig auszunützen, müssen die Mechanismen, die hinter der Gen-Expression und -Suppression stehen, kontrolliert werden. Insbesondere besteht ein Bedürfnis nach Verfahren zur Modulation der Gen-Expression in Pflanzen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Es wurden Pflanzenproteine identifiziert, die mit HC-Pro im Hefe-Doppelhybridsystem in Wechselwirkung treten. Eines dieser Proteine stört, wie HC-Pro selbst, sowohl die Initiation als auch die Aufrechterhaltung von PTGS. Bei diesem Pflanzenregulator der Abschaltung handelt es sich um ein neuartiges, mit Calmodulin verwandtes Protein (nachstehend als "rgs-CaM" bezeichnet). Studien über seine Funktion sollten eine wichtige Rolle bei der Aufklärung anderer Stufen des Signalgebungswegs, der PTGS reguliert, darstellen.
Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung ein rgs-CaM-Polypeptid, wobei dieses Polypeptid folgendes umfasst:

(a) mindestens ein Fragment des Polypeptids von SEQ ID NO: 2; oder
(b) eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nucleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 1 kodiert wird.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Polynucleotid, das für rgs-CaM-Polypeptid kodiert, wobei dieses Polynucleotid folgendes umfasst:

(a) eine Nucleotidsequenz die zumindest für ein Fragment des Polypeptids von SEQ ID NO: 2 kodiert; oder
(b) eine Nucleotidsequenz mit einer mindestens 70%igen Identität zu SEQ ID NO: 1.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zum Exprimieren eines fremden Gens oder eines endogenen Pflanzengens, das in Pflanzenzellen, Pflanzenprotoplasten oder vollständige Pflanzen eingeführt worden ist, wobei das Verfahren das Versorgen der Pflanzenzellen, Pflanzenprotoplasten oder vollständigen Pflanzen mit einer Boostersequenz umfasst, die ein Polynucleotid gemäß der vorstehenden Definition umfasst.
Ein gewisser Teil der Boostersequenz kann entweder individuell exprimiert werden oder in Fusion mit anderen Sequenzen, einer modifizierten Version der Boostersequenz, einer verwandten Sequenz einer anderen Pflanze oder einem beliebigen Teil oder einer modifizierten Version dieser verwandten Sequenz, die ausreichen, für ein Polypeptid mit rgs-CaM-Aktivität zu kodieren, wobei die Expression entweder individuell oder unter Fusion mit einer anderen Sequenz erfolgt. Die Boostersequenz verstärkt die Expression von fremden Genen oder endogenen Pflanzengenen, die in die Pflanze unter Anwendung beliebiger bekannter Methoden eingeführt worden sind. Ein Beispiel für derartige bekannte Methoden sind die Expression von eingeführten Genen aus einer oder mehreren Kopien eines in stabiler Weise in das Pflanzengenom eingebauten Gens. Ein weiteres Beispiel für derartige bekannte Methoden ist die Expression von Genen, die über pflanzenvirale Expressionsvektoren eingeführt worden sind.
Das Verfahren zur Verstärkung der Genexpression kann in verschiedenen Formen durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Boostersequenz der Pflanze auf einer Vielzahl von Wegen zugeführt werden. Sie kann durch Infektion mit einem modifizierten, transgenen Virus zugeführt werden, das die Boostersequenz als ein virales Genprodukt während seines natürlichen Lebenszyklus exprimiert. Alternativ kann die Boostersequenz durch Verwendung einer transgenen Wirtspflanze zugeführt werden, die die Boostersequenz als ein zugeführtes Gen exprimiert. Die Boostersequenz kann auch unter Verwendung des gleichen viralen Expressionsvektors zugeführt werden, der zur Expression des zugeführten fremden oder endogenen Gens von Interesse verwendet wird. Ein vorübergehendes Expressionssystem kann verwendet werden, um zeitweilig die Boostersequenz zu exprimieren, oder es kann ein Zweikomponenten-Coinfektionssystem verwendet werden, bei dem zwei Viren für einen erfolgreichen Boosting-Vorgang der Genexpression erforderlich sind. Beim Zweikomponenten-Coinfektionssystem exprimiert ein Virus die Boostersequenz, während das andere Virus das eingeführte Gen von Interesse exprimiert.
Ferner kann die Boostersequenz zur Verstärkung der Expression von beliebigen eingeführten Genen verwendet werden, einschließlich fremder Gene oder endogener Pflanzengene. Die dem Boosting-Vorgang zu unterwerfenden Gene können in die Pflanze auf einer Vielzahl von Wegen eingeführt werden. Fremde oder endogene Gene können mittels einer stabilen Transformation in das Genom der Pflanze unter Anwendung beliebiger bekannter Techniken, die für diesen Vorgang eingesetzt werden, eingeführt werden. Alternativ können das fremde oder endogene Gen unter Verwendung beliebiger pflanzenviraler Expressionsvektoren eingeführt werden.
Speziell beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Exprimieren eines fremden Gens oder eines endogenen Pflanzengens, das in Pflanzenmaterial, das Pflanzenzellen, Pflanzenprotoplasten oder vollständige Pflanzen umfasst, eingeführt worden ist, wobei die Verbesserung das Versorgen des Pflanzenmaterials mit einer Boostersequenz, die ein Polynucleotid umfasst, das für mindestens ein Polypeptid mit rgs-CaM-Aktivität kodiert, in der Weise umfasst, dass die Expression des fremden Gens oder des endogenen Pflanzengens verstärkt wird. Beim Pflanzengen kann es sich um ein fremdes Gen handeln, das natürlicherweise im Pflanzenmaterial vor der Einführung nicht vorkommt, oder es kann sich um ein endogenes Pflanzengen handeln, das natürlicherweise im Pflanzenmaterial vorkommt, bevor es als eine weitere Kopie oder weitere Kopien des endogenen Gens zugeführt wird. Die zugeführte Boostersequenz kann die Kodierungsregion für rgs-CaM umfassen, und die Boostersequenz kann unabhängig oder in Fusion mit anderen Sequenzen exprimiert werden.
Das fremde oder endogene Gen kann in die Pflanze über einen viralen Expressionsvektor eingeführt werden, wobei die Boostersequenz durch Expression des gleichen viralen Vektors zugeführt wird; die Einführung kann über einen viralen Expressionsvektor erfolgen, wobei die Boostersequenz durch Expression von einer oder mehreren DNA-Kopien der Boostersequenz, die in stabiler Weise in das Pflanzengenom eingebaut worden ist, zugeführt wird; oder die Einführung kann über einen viralen Expressionsvektor erfolgen, wobei die Boostersequenz aus einem vorübergehenden Expressionssystem exprimiert wird, das eine oder mehrere DNA-Kopien dieser Boostersequenz enthält. Ein Zweikomponenten-Virusvektorsystem kann verwendet werden, wobei eine virale Komponente die Boostersequenz exprimiert und die andere virale Komponente das zugeführte Gen exprimiert. Beim zugeführten Gen kann es sich um ein fremdes Gen oder um ein endogenes Pflanzengen handeln, die über einen viralen Expressionsvektor zugeführt werden, wobei die Boostersequenz durch Coinfektion mit einem modifizierten oder transgenen Virus zugeführt wird, das die Boostersequenz exprimiert, oder die Zufuhr kann über einen viralen Expressionsvektor erfolgen, bei dem das Gen mit dem Strukturgen von Interesse des viralen Expressionsvektors fusioniert ist.
Ferner können das fremde Gen oder das endogene Pflanzengen in ein Pflanzengenom durch eine beliebige Art der stabilen Transformation von einer oder mehreren DNA-Kopien des zugeführten Gens eingeführt werden, wobei die Boostersequenz vor, während oder nach Einführung des fremden Gens oder des endogenen Pflanzengens über stabile Transformationsverfahren zugeführt wird, so dass sie entweder die Expression des zugeführten Genprodukts oder die Anzahl oder den Anteil von transformanten Pflanzen, die das eingeführte Genprodukt exprimieren, verstärkt bzw. erhöht. Diesbezüglich kann die Boostersequenz über eine Expression aus einer oder mehreren DNA-Kopien der Boostersequenz, die in stabiler Weise in das Pflanzengenom vor, während oder nach Transformation des Pflanzenmaterials mit dem eingeführten Genprodukt eingebaut worden ist, zugeführt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Northern-Blot-Analyse, die zeigt, dass die rgs-CaM-Botschaft in den Blättern von transgenen rgs-CaM-Linien stark überexprimiert wird (Bahn 2), verglichen mit nicht-transgenen Kontrollpflanzen (Bahn 1).
2. Stängel-Wurzel-Verbindungen mit einem Tumor in der transgenen P1/HC-Pro-Linie. (A) Normale Tabak-Kontrollpflanze; (B) Querschnittansicht zur Darstellung der zellulären Organisation in der normalen Kontrollpflanze; (C) transgene P1/HC-Pro-Tabakpflanze; (D) Querschnittansicht zur Darstellung der abweichenden Organisation im Tumor.
3. Stängel-Wurzel-Verbindungen mit einem Tumor in der transgenen rgs-CaM-Linie. (A) Normale N. benthamiana-Kontrollpflanze; (B) Tumor in der transgenen rgs-CaM-N. benthamiana-Pflanze,
4. transgene rgs-CaM-Linie mit einem Mangel an VIGS. (A) Transgenes GFP wird in der transgenen GFP-Linie abgeschaltet, wenn eine Infektion mit PVX-GFP erfolgt; (B) das GFP-Transgen wird in transgenen GFP- und rgs-CaM-Linien nicht abgeschaltet, wenn eine Infektion mit PVX-GFP erfolgt.
5. Umkehr von PTGS durch Infektion mit dem PVX-Vektor, der rgs-CaM exprimiert. (A) Die agroabgeschaltete, transgene GFP-Linie, die mit dem PVX-Kontrollvektor infiziert ist, bleibt abgeschaltet; (B) die agroabgeschaltete, transgene GFP-Linie, die mit PVX-rgs-CaM infiziert ist, zeigt eine Umkehr der GFP-Abschaltung.
Kurze Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID NO: 1 ist die cDNA-Sequenz für rgs-CaM.
SEQ ID NO: 2 ist die Aminosäuresequenz des rgs-CaM-Polypeptids, das durch SEQ ID NO: 1 kodiert wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die posttranskriptionale Gen-Abschaltung (PTGS) ist ein grundlegender Regulationsmechanismus, der in verschiedenen Typen von Organismen funktioniert. Obgleich PTGS die erste in Pflanzensystemen identifizierte Gen-Abschaltung war, scheinen ähnliche Wege in filamentösen Pilzen, Nematoden und verschiedenen tierischen Systemen zu funktionieren, wo sie als RNA-Interferenz bezeichnet werden (Fire, 1999; Sharp, 1999; Grant, 1999; Sharp and Zamore, 2000). Doppelsträngige RNA (dsRNA) induziert PTGS in zahlreichen Systemen (Montgomery and Fire, 1998; Wianny and Zernicka-Goetz, 2000; Waterhouse and Graham, 1998) und kann auch in Pflanzen durch zytoplasmatisch replizierende Viren ausgelöst werden, von denen viele dsRNA-Replikationszwischenprodukte erzeugen (Kumagai et al., 1995; Ratcliff et al., 1997). Nachdem der Mechanismus einmal aktiviert ist, wird jede beliebige homologe RNA abgebaut, unabhängig davon, ob sie aus dem Transgen, dem endogenen Gen oder der viralen RNA transkribiert wird. Die Tatsache, dass Pflanzenviren sowohl als Induktoren als auch als Ziele der posttranskriptionalen Gen-Abschaltung wirken können (Kumagai et al., 1995; Baulcombe, 1999), hat zu der Vorstellung geführt, dass PTGS als ein Abwehrmechanismus gegen Viren in Pflanzen entstanden ist. HC-Pro ist ein virales Protein, von dem gezeigt worden ist, dass es PTGS unterdrückt. Wir haben eine Anzahl von Proteinen identifiziert, die mit HC-Pro im Hefe-Doppelhybridsystem in Wechselwirkung treten. Eines dieser mit HC-Pro in Wechselwirkung tretenden Proteine stört, wie HC-Pro selbst, sowohl die Initiation als auch die Aufrechterhaltung von PTGS. Beim Pflanzenregulator der Abschaltung handelt es sich um ein neuartiges, mit Calmodulin verwandtes Protein, das als rgs-CaM bezeichnet wird. Hier werden Verfahren zur Ausnützung von rgs-CaM als Werkzeug zur Manipulation des PTGS-Wegs für biotechnologische Anwendungen beschrieben.
Die Manipulation des PTGS-Wegs stellt eine wirksame Maßnahme zur Modulation der Expression eines Gens von Interesse oder einer "Zielsequenz" in einer Pflanze dar. Dies bedeutet, dass die Expression der Zielsequenz verstärkt werden kann oder gegebenenfalls verringert werden kann oder seine Abschaltung aufrechterhalten werden kann. Im allgemeinen wird eine verstärkte Expression der Zielsequenz bewirkt. Unter dem Ausdruck "verstärkte Expression" ist zu verstehen, dass die Expression der Zielsequenz gegenüber der Expression erhöht ist, die in herkömmlichen transgenen Linien für heterologe Sequenzen beobachtet wird, sowie gegenüber endogenen Expressionsniveaus für homologe Sequenzen und insbesondere im Vergleich zur Expression in Systemen von beiden Typen, bei denen die Zielsequenz der PTGS unterliegt. Ein rgs-CaM-Polynucleotid, das die Fähigkeit behält, eine verstärkte Expression hervorzurufen, wird gelegentlich hier als "Boostersequenz" bezeichnet. Heterologe oder exogene Sequenzen umfassen Sequenzen, die in der Pflanze von Interesse in ihrem nativen Zustand nicht auftreten. Homologe oder endogene Sequenzen sind solche Sequenzen, die im Pflanzengenom im nativen Zustand vorkommen. Im allgemeinen ist die Expression der Zielsequenz um mindestens etwa 25–50%, vorzugsweise etwa 50–100% und insbesondere etwa 100–200% und mehr erhöht. Die erfindungsgemäßen Verfahren sorgen für eine erhebliche Verstärkung der Expression, wobei sich jedoch keine offensichtlichen negativen Auswirkungen auf die Pflanze ergeben.
Die Erfindung betrifft die Gen-Abschaltung, speziell die Suppression der Gen-Abschaltung in Pflanzen. Jedoch betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung die Aufrechterhaltung der Gen-Abschaltung in bestimmten Systemen, wo dies erwünscht ist. Der Ausdruck "Gen-Abschaltung" wird allgemein zur Bezeichnung der Suppression der Expression eines Gens verwendet. Der Grad der Verringerung kann partiell sein oder es kann sich um eine totale Verringerung der Erzeugung des kodierten Genprodukts handeln. Daher ist dieser Ausdruck nicht notwendigerweise als eine vollständige "Abschaltung" der Expression zu verstehen. Verfahren zur Gen-Abschaltung sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen eine Cosuppression und eine antisense-Suppression; vergl. beispielsweise PCT/GB-98/00442 und PCT/GB-98/02862, auf die hier durch Verweis Bezug genommen wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Modulation der Expression eines Zielgens oder einer Zielsequenz in Pflanzen. Die Zielsequenz kann endogenen oder exogenen Ursprungs sein. Für exogene Sequenzen weiß man, dass für eine Cosuppression oder Gen-Abschaltung im allgemeinen mehrfache Kopien der exogenen Sequenz in der Pflanzenzelle erforderlich sind. Mehrfache Kopien lassen sich durch mehrfache Insertionsereignisse aus dem gleichen Transformationsereignis, durch anschließende Transformation einer Pflanze, bei der die exogene Sequenz in das Pflanzengenom eingebaut ist, durch genetische Kreuzung und dergl. erhalten. Ferner kann eine exogene Sequenz als Teil eines viralen Replikons oder eines pflanzenviralen Expressionsvektors enthalten sein.
Die Zielsequenz umfasst beliebige Sequenzen von Interesse, unter Einschluss von Genen, regulatorischen Sequenzen und dergl. Gene von Interesse umfassen solche Gene, die für agronomische Merkmale, Insektenresistenz, Krankheitsresistenz, Herbizidresistenz, Sterilität, Korneigenschaften und dergl. kodieren. Die Gene können am Stoffwechsel von Ölen, Stärke, Kohlenhydraten, Nährstoffen und dergl. beteiligt sein. Gene oder Merkmale von Interesse umfassen (ohne Beschränkung hierauf) mit der Umwelt oder mit Stresszuständen im Zusammenhang stehende Merkmale, mit Krankheiten im Zusammenhang stehende Merkmale und Merkmale, die das agronomische Leistungsbild beeinflussen, Zielsequenzen können auch Gene umfassen, die für die Synthese von Proteinen, Peptiden, Fettsäuren, Lipiden, Wachsen, Ölen, Stärken, Zuckern, Kohlenhydraten, Aromastoffen, Geruchsstoffen, Toxinen, Carotinoiden, Hormonen, Polymeren, Flavonoiden, Lagerproteinen, phenolischen Säuren, Alkaloiden, Ligninen, Tanninen, Cellulosen, Glycoproteinen, Glycolipiden und dergl. verantwortlich sind.
Varianten oder Sequenzen mit einer wesentlichen Identität oder Homologie mit den Verstärkermolekülen können in der erfindungsgemäßen Praxis eingesetzt werden. Dies bedeutet, dass die Boostersequenz so modifiziert werden kann, dass sie immer noch die Fähigkeit behält, als ein Suppressor der posttranskriptionalen Gen-Abschaltung zu wirken. Im allgemeinen umfasst die Boostersequenz eine mindestens etwa 40–60%ige, vorzugsweise etwa 60–80%ige, insbesondere etwa 80–90%ige und ganz besonders etwa 90–95%ige Sequenzidentität mit der nativen Boostersequenz.
Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuren oder Polynucleotiden werden im allgemeinen als Sequenzidentität, als prozentualer Anteil der Sequenzidentität und als erhebliche Identität definiert; vergl. beispielsweise "Pedestrian Guide to Analyzing Sequence Data Bases" bei www.embl-heidelberg.de/-schneide/paper/springer96/springer.html. Bei der Bestimmung der Sequenzidentität wird eine "Referenzsequenz" als Grundlage für den Sequenzvergleich verwendet. Bei der Referenz kann es sich um einen Teil oder um die Gesamtheit einer bestimmten Sequenz handeln. Dies bedeutet, dass es sich bei der Referenzsequenz um eine Gensequenz von voller Länge oder um ein Segment der Gensequenz handeln kann.
Verfahren zur Ausrichtung von Sequenzen für Vergleichszwecke sind aus dem Stand der Technik bekannt; vergl. beispielsweise Smith et al., Adv. Appl. Math., Bd. 2 (1981), S. 482; Needleman et al., J. Mol. Biol., Bd. 48 (1970), S. 443; Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 85 (1988), S. 2444; CLUSTAL in PC/Gene Program by Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA. Bevorzugte Computer-Ausrichtungsverfahren umfassen auch die BLASTP-, BLASTN- und BLASTX-Algorithmen; vergl. Altschul et al., J. Mol. Biol., Bd. 215 (1990), S. 403–410.
Die Ausdrücke "Sequenzidentität" oder "Identität" im Zusammenhang mit Nucleinsäure- oder Polypeptidsequenzen beziehen sich auf Nucleinsäurebasen oder -reste in den beiden Sequenzen, die gleich sind, wenn sie für eine maximale Übereinstimmung über ein bestimmtes Vergleichsfenster hinweg ausgerichtet sind. Der Ausdruck "prozentualer Anteil der Sequenzidentität" bezieht sich auf den Wert, der durch Vergleich von zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster hinweg bestimmt worden ist, wobei der Bereich der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen im Vergleich zum Referenzfenster umfassen kann, um eine optimale Ausrichtung der beiden Sequenzen zu gewährleisten. Der prozentuale Anteil wird berechnet, indem man die Anzahl an Positionen bestimmt, an denen die identischen Nucleinsäurebasen oder Aminosäurereste in beiden Sequenzen auftreten, wodurch man die Anzahl an übereinstimmenden Positionen erhält, wonach die Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die gesamte Anzahl der Positionen im Vergleichsfenster dividiert wird und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, wodurch man den prozentualen Anteil der Sequenzidentität erhält.
Bei Polynucleotidsequenzen mit einer "erheblichen Identität" handelt es sich um Sequenzen, die eine mindestens etwa 50–60%ige Sequenzidentität, im allgemeinen eine mindestens 70%ige Sequenzidentität, vorzugsweise eine mindestens 80%ige, insbesondere eine mindestens 90%ige und ganz besonders eine mindestens 95%ige Sequenzidentität aufweisen, verglichen mit einer Referenzsequenz, wobei man sich eines der vorstehend beschriebenen Ausrichtungsprogramme bedient. Vorzugsweise wird die Sequenzidentität unter Anwendung der Default-Parameter, die vom Programm festgelegt werden, bestimmt. Eine erhebliche Identität der Aminosäuresequenz bedeutet im allgemeinen eine Sequenzidentität von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70, 80 und 90% und insbesondere von mindestens etwa 95%.
Nucleotidsequenzen sind im allgemeinen im wesentlichen identisch, wenn die beiden Moleküle miteinander unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie eine Temperatur umfassen, die etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt für die spezielle Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert liegt. Nucleinsäuremoleküle, die miteinander unter stringenten Bedingungen nicht hybridisieren, können immer noch im wesentlichen identisch sein, wenn die Polypeptide, für die sie kodieren, im wesentlichen identisch sind. Dies kann beispielsweise der Fall sein, wenn eine Kopie einer Nucleinsäure unter Einsatz der maximalen Codon-Degeneration, die vom genetischen Code erlaubt wird, erzeugt wird.
Wie vorstehend erwähnt, kann die Hybridisierung von Sequenzen unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Unter "stringenten Bedingungen" sind Bedingungen zu verstehen, unter denen eine Sonde mit ihrer Zielsequenz in nachweisbar stärkerem Maße als mit anderen Sequenzen hybridisiert. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umständen unterschiedlich. Typischerweise handelt es sich bei stringenten Bedingungen um solche Bedingungen, bei denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,5 M Natriumionen beträgt, wobei die Natriumionenkonzentration (oder die Konzentration anderer Salze) typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3 beträgt und die Temperatur mindestens etwa 30°C für kurze Sonden (z. B. 10 bis 50 Nucleotide) und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (z. B. größer als 50 Nucleotide) beträgt. Stringente Bedingungen können auch unter Zugabe von destabilisierenden Mitteln, wie Formamid, erreicht werden. Zu beispielhaften stringenten Bedingungen gehören eine Hybridisierung mit einer Pufferlösung mit 30 bis 35% Formamid, 1,0 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und ein Waschvorgang in 1 × bis 2 × SSC (20 × SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Man weiß, dass die Temperatur-, Salz- und Waschbedingungen verändert werden können, um die Stringenzbedingungen zu verstärken oder zu schwächen. Für Waschvorgänge nach der Hybridisierung handelt es sich bei den kritischen Faktoren um die Ionenstärke und Temperatur der letzten Waschlösung; vergl. Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., Bd. 138 (1984), S. 267–284.
Wie vorstehend erwähnt, fallen unter die Erfindung auch Fragmente und Varianten der Nucleotidsequenzen. Unter dem Ausdruck "Fragment" ist ein Teil der Nucleotidsequenz zu verstehen. Fragmente lassen sich durch eine Anzahl von bekannten Verfahren erzeugen, z. B. durch Verwendung von handelsüblichen Restriktionsenzymen, Exonucleasen, wie Bal31, oder durch chemische Synthese. Fragmente der Boostersequenz kodieren im allgemeinen für Polypeptide, bei denen eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten des nativen Proteins erhalten bleiben. Aktivitäten können gemäß den in den nachstehenden Beispielen aufgeführten Angaben getestet und bestätigt werden. Alternativ können Fragmente der Polynucleotidsequenzen ihre biologische Aktivität behalten oder nicht. Derartige Sequenzen können sich als Hybridisierungssonden, z. B. als antisense-Konstrukte, oder als Cosuppressionssequenzen eignen. Somit können Fragmente von Nucleotidsequenzen eine Länge von mindestens etwa 15–20 Nucleotiden, von etwa 50 Nucleotiden, von etwa 100 Nucleotiden und bis zur vollen Länge der Nucleotidsequenz des speziellen Polynucleotids von Interesse aufweisen.
Unter "Varianten" sind im wesentlichen ähnliche Sequenzen zu verstehen. Beispielsweise umfassen bei Nucleotidsequenzen konservative Varianten solche Sequenzen, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes für die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Boosters kodieren. Variante Nucleotidsequenzen umfassen synthetisch abgeleitete Sequenzen, z. B. solche, die unter Anwendung der positionsgerichteten Mutagenese erzeugt worden sind. Im allgemeinen weisen erfindungsgemäße Nucleotidsequenz-Varianten mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, im allgemeinen 80%, vorzugsweise 85%, 90% und bis zu 95% oder mehr Sequenzidentität mit ihrer entsprechenden nativen Nucleotidsequenz auf. Somit kann es sich bei einigen Fragmenten auch um Varianten handeln.
Im Zusammenhang mit Proteinen bedeutet eine "Variante" ein Protein, das von einem nativen Protein durch Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren am N-terminalen und/oder am C-terminalen Ende des Proteins abgeleitet ist; das durch Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen des nativen Proteins abgeleitet ist; oder das durch Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein abgeleitet ist. Derartige Varianten können sich beispielsweise als Folge des genetischen Polymorphismus oder aufgrund von humaner Manipulation ergeben. Konservative Aminosäuresubstitutionen führen im allgemeinen zu Varianten, die ihre biologische Funktion behalten. Variante Proteine, die eine angestrebte biologische Aktivität behalten, fallen unter den Gegenstand der Erfindung. Variante Proteine der Erfindung können solche umfassen, die auf verschiedene Weise, einschließlich durch Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen, -Schneidevorgänge und -Insertionen, verändert worden sind. Verfahren für derartige Manipulationen sind aus dem Stand der Technik bekannt; vergl. beispielsweise Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 488–492; Kunkel et al., Methods of Enzymol., Bd. 154 (1987), S. 367–382; und die dort genannten Literaturstellen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich in Situationen, in denen eine erhöhte Expression einer Nucleotidsequenz angestrebt wird. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich zur Erhöhung der Expression sowohl von endogenen als auch von exogenen Sequenzen. Beispielsweise kann für exogene Sequenzen die Boostersequenz zur Verstärkung der Expression einer transgeninduzierten Gen-Abschaltung herangezogen werden. Daher kann es sich bei der Zielsequenz um eine beliebige Nucleotidsequenz von Interesse handeln. In einer Ausführungsform können die Verfahren zur Herstellung von Peptiden oder Proteinen verwendet werden, die nicht in wirksamer Weise auf kommerziellen Wegen durch existierende Expressionssysteme erzeugt werden können. Beispielsweise können einige Proteine in Säugetiersystemen nicht exprimiert werden, da das Protein die Zelllebensfähigkeit, die Zellproliferation, die zelluläre Differenzierung oder den Proteinaufbau in Säugetierzellen stört. Zu derartigen Proteinen gehören (ohne Beschränkung hierauf) das Retinoblastomprotein, p53, Angiostatin und Leptin. Gleichermaßen können die erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Säugetier-Regulationsproteinen verwendet werden. Zu weiteren Sequenzen von Interesse gehören Proteine, Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytokine, vorzugsweise Insulin, Wachstumshormon, insbesondere humanes Wachstumshormon, Interferon, insbesondere α-Interferon, β-Glucocerebrosidase, Serumalbumin, insbesondere humanes Serumalbumin, Hämoglobin, Collagen und dergl. In derartigen Fällen wird im allgemeinen die Boostersequenz funktionell mit einem konstitutiven Promotor verknüpft. In anderen Fällen können induzierbare Promotoren verwendet werden. In einer Ausführungsform können die Verfahren zur Expression von Krankheitsresistenz- und Insektenresistenz-Genen in der Pflanze verwendet werden. Auf diese Weise können Verstärkersequenzen in funktioneller Weise mit einem pathogeninduzierbaren Promotor für eine verstärkte Krankheitsresistenz in einer Pflanze verknüpft werden. Man weiß, dass eine gewisse Pflanzenresistenz auf einer posttranskriptionalen Gen-Abschaltung beruht und dass derartige Mechanismen möglicherweise in der vorliegenden Erfindung nicht funktionieren. Jedoch sind Resistenzmechanaismen, die auf Proteinen beruhen, für die Pflanzen von Vorteil.
Die Insektenresistenz kann durch Expression der Boostersequenz zusammen mit einem wundinduzierbaren Promotor verstärkt werden, so dass die Resistenzgene, wie Bacillus-Toxine, an der Stelle der Insekteninvasion exprimiert werden. Es ist bekannt, dass die Pathogenresistenz- und Insektenresistenz-Zielsequenzen durch konstitutive Promotoren exprimiert werden können. Jedoch kann die Verwendung eines induzierbaren Promotors, der die Boostersequenz steuert, im Hinblick auf Ausbeute und Wachstum für die Pflanze von Vorteil sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von transgenen Samen und Samenprodukten verwendet werden. Dabei können die Zielsequenzen oder Gene von Interesse oder alternativ die Boostersequenz funktionell mit einem in Bezug auf Samen bevorzugten oder Endosperm-Promotor verknüpft werden. Derartige Samenproteine von Interesse umfassen (ohne Beschränkung hierauf) Stärken, Lagerproteine, Proteine mit verstärktem Nährwert, spezielle Öle, Carotinoide und dergl.
Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen Verfahren für eine verstärkte Expression beliebiger Zielgene oder Zielsequenzen von Interesse verwendet werden, unter Einschluss von therapeutischen oder immunogenen Peptiden und Proteinen, Nucleinsäuren zur Steuerung der Genexpression, Genen zur Reproduktion von enzymatischen Wegen für die chemische Synthese, Genen zur Überbrückung eines enzymatischen Wegs für eine verstärkte Expression eines speziellen Zwischenprodukts oder Endprodukts, gewerblichen Verfahren und dergl.
Es ist ersichtlich, dass die erfindungsgemäßen Verfahren für eine verstärkte Expression in transformierten Pflanzen, Pflanzenzellen und -geweben, Samen und dergl. verwendet werden können. Somit kann es bei einigen Ausführungsformen günstig sein, die Verfahren in einem Pflanzenkultursystem zur Erzeugung von Peptiden oder Proteinen von Interesse bereitzustellen.
Wie vorstehend erörtert, können in der erfindungsgemäßen Praxis eine Reihe von Promotoren verwendet werden. Die Promotoren können auf der Grundlage des angestrebten Ergebnisses ausgewählt werden. Im allgemeinen kann die Boostersequenz mit Promotoren der Wahl kombiniert werden, um eine erhöhte Expression der Zielsequenzen im Gewebe oder Organ der Wahl zu erzielen. Jedoch kann in einigen Fällen die Zielsequenz einen Gewebe-, Entwicklungs- oder Induktionspromotor für die Cosuppression und die anschließende verstärkte Expression der Zielsequenz in bestimmten Geweben, Organen oder Entwicklungsstufen der Pflanze umfassen. Somit können die Boostersequenzen mit konstitutiven, gewebespezifischen, induzierbaren, entwicklungsbezogenen oder anderen Promotoren für die Expression in Pflanzen kombiniert werden, und zwar je nach dem angestrebten Ergebnis.
Zu konstitutiven Promotoren gehören beispielsweise der CaMV 35S-Promotor (Odell et al., Nature, Bd. 313 (1985), S. 810–812; Reis-Actin (McElroy et al., Plant Cell, Bd. 2 (1990), S. 163–171); Ubiquitin (Christensen et al. Plant Mol. Biol., Bd. 12 (1989), S. 619–632, und Christensen et al., Plant Mol. Biol., Bd. 18 (1992), S. 675–689); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet., Bd. 81 (1991), S. 581–588); MAS (Velten et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 2723–2730); ALS-Promotor (US-Patentanmeldung SN 08/409,297) und dergl. Zu weiteren konstitutiven Promotoren gehören die in den folgenden US-Patenten erwähnten Promotoren: 5 608 149; 5 608 144; 5 604 121: 5 569 597; 5 466 785; 5 399 680; 5 268 463; und 5 608 142.
Aus dem Stand der Technik sind eine Reihe von induzierbaren Promotoren bekannt. Für Resistenzgene kann ein Pathogen-induzierbarer Promotor verwendet werden. Derartige Promotoren umfassen solche aus Pathogenese-bezogenen Proteinen (PR-Proteine), die im Anschluss an eine Infektion durch ein Pathogen induziert werden, z. B. PR-Proteine, SAR-Proteine, beta-1,3-Glucanase, Chitinase und dergl.; vergl. z. B. Redolfi et al., Neth. J. Plant Pathol., Bd. 89 (1983), S. 245–254; Uknes et al., Plant Cell, Bd. 4 (1992), S. 645–656; und Van Loon, Plant Mol. Virol., Bd. 4 (1985), S. 111–116. Von besonderem Interesse sind Promotoren, die lokal an der Stelle der Pathogeninfektion oder in der Nähe davon exprimiert werden; vergl. beispielsweise Marineau et al., Plant Mol. Biol., Bd. 9 (1987), S. 335–342; Matton et al., Molecular Plant-Microbe Interactions, Bd. 2 (1989), S. 325–331; Somsisch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986), S. 2427–2430; Somsisch et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 2 (1988), S. 93–98; und Yang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 93 (1996), S. 14972–14977. Verwiesen wird auch auf Chen et al., Plant J., Bd. 10 (1996), S. 955–966; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91 (1994), S. 2507–2511; Warner et al., Plant J., Bd. 3 (1993), S. 191–201; Siebertz et al., Plant Cell, Bd. 1 (1989), S. 961–968; US-Patent 5 750 386; Cordero et al., Physiol. Mol. Plant Path., Bd. 41 (1992), S. 189–200; und die dort genannten Druckschriften.
Da ferner Pathogene über Wunden oder Insektenschädigungen Zutritt zu Pflanzen finden, kann ein wundinduzierbarer Promotor in den erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten verwendet werden. Zu derartigen wundinduzierbaren Promotoren gehören das Kartoffel-Proteinase-Inhibitor (pinII)-Gen (Ryan Ann. Rev. Phytopath., Bd. 28 (1990), S. 425–449; Duan et al., Nature Biotechnology, Bd. 14 (1996), S. 494–498; wun1 und wun2, US-Patent 5 428 148; win1 und win2 (Stanford et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 215 (1989), S. 200–208); Systemin (McGurl et al., Science, Bd. 225 (1992), S. 1570–1573); WIP1 (Rohmeier et al., Plant Mol. Biol., Bd. 22 (1993), S. 783–792; Eckelkamp et al., FEBS Letters, Bd. 323 (1993), S. 73–76); MPI-Gen (Corderok et al., Plant J., Bd. 6 (2) (1994), S. 141–150; und dergl. Diese Druckschriften werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.
Chemisch regulierte Promotoren können zur Modulation der Expression eines Gens in einer Pflanze durch Anwendung eines exogenen chemischen Regulators verwendet werden. Je nach Ziel kann es sich beim Promotor um einen chemisch induzierbaren Promotor, bei dem die Anwendung der Chemikalie die Genexpression induziert; oder einen chemisch reprimierbaren Promotor, bei dem die Anwendung der Chemikalie die Genexpression reprimiert, handeln. Chemisch induzierbare Promotoren sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen (ohne Beschränkung hierauf) den Mais-In2-2-Promotor, der durch Benzolsulfonamid-Herbizid-Schutzmittel aktiviert wird; den Mais-GST-Promotor, der durch hydrophobe, elektrophile Verbindungen, die als Vorauflauf-Herbizide verwendet werden, aktiviert wird; und den Tabak-PR-1a-Promotor, der durch Salicylsäure aktiviert wird. Zu weiteren, chemisch regulierten Promotoren von Interesse gehören Steroid-reaktive Promotoren (vergl. z. B. den Glucocorticoid-induzierbaren Promotor gemäß Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88 (1991), S. 10421–10425 und McNellis et al., Plant J., Bd. 14 (2) (1998), S. 247–257) und Tetracyclin-induzierbare und Tetracyclin-reprimierbare Promotoren (vergl. beispielsweise Gatz et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 227 (1991), S. 229–237; und die US-Patente 5 814 618 und 5 789 156), wobei diese Druckschriften durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht werden.
Wenn eine verstärkte Expression in bestimmten Geweben angestrebt wird, können gewebespezifische Promotoren verwendet werden. Zu gewebespezifischen Promotoren gehören die von folgenden Autoren beschriebenen Promotoren: Yamamoto et al., (1997) Plant J., Bd. 12 (2) (1997), S. 255–265; Kawamata et al., Plant Cell Physiol., Bd. 38 (7) (1997), S. 792–803; Hansen et al., Mol. Gen Genet., Bd. 254 (3) (1997), S. 337–343; Russel et al. Transgenic Res., Bd. 6 (2) (1997), S. 157–168; Rinehart et al., Plant Physiol., Bd. 112 (3) (1996), S. 1331–1341; Van Camp et al., Plant Physiol., Bd. 112 (2) (1996), S. 525–535; Canevascini et al., Plant Physiol., Bd. 112 (2) (1996), S. 513–524; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol., Bd. 35 (5) (1994), S. 773–778; Lam, Results Probl. Cell Differ., Bd. 20 (1994), S. 181–196; Orozco et al., Plant Mol. Biol., Bd. 23 (6) (1993), S. 1129–1138; Matsuoka et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90 (20) (1993), S. 9586–9590; und Guevara-Garcia et al., Plant J., Bd. 4 (3) (1993), S. 495–505.
Blattspezifische Promotoren können gegebenenfalls gleichermaßen verwendet werden. Sie werden beispielsweise in folgenden Druckschriften beschrieben: Yamamoto et al., Plant J., Bd. 12 (2) (1997), S. 255–265; Kawamata et al., Plant Cell Physiol., Bd. 38 (7) (1997), S. 792–803; Hansen et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 254 (3) (1997), S. 337–343; Russel et al., Transgenic Res., Bd. 6 (2) (1997), S. 157–168; Rinehart et al., Plant Physiol., Bd. 112 (3) (1996), S. 1331–1341; Van Camp et al., Plant Physiol., Bd. 112 (2) (1996), S. 525–535; Canevascini et al., Plant Physiol., Bd. 112 (2) (1996), S. 513–524; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol., Bd. 35 (5) (1994), S. 773–778; Lam, Results Probl. Cell Differ., Bd. 20 (1994), S. 181–196; Orozco et al., Plant Mol. Biol., Bd. 23 (6) (1993), S. 1129–1138; Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, Bd. 90 (20) (1993), S. 9586–9590; und Guevara-Garcia et al. Plant J., Bd. 4 (3) (1993), S. 495–505.
Wurzelspezifische Promotoren sind bekannt und können unter den zahlreichen Promotoren, die in der Literatur verfügbar sind, ausgewählt werden; vergl. beispielsweise Hire et al., Plant Mol. Biol., Bd. 20 (2) (1992), S. 207–218 (Sojabohnen-Wurzel-spezifisches Glutamin-synthetase-Gen); Keller und Baumgartner, Plant Cell, Bd. 3 (10) (1991), S. 1051–1061 (wurzelspezifisches Kontrollelement im GRP1.8-Gen der grünen Bohne); Sanger et al., Plant Mol. Biol., Bd. 14 (3) (1990), S. 433–443 (wurzelspezifischer Promotor des Mannopin synthase (MAS)-Gens von Agrobacterium tumefaciens); Miao et al., Plant Cell, Bd. 3 (1) (1991), S. 11–22 (cDNA-Clon von voller Länge, der für Cytosol-Glutaminsynthetase (GS) kodiert, die in Wurzeln und Wurzelknötchen der Sojabohne exprimiert wird); Bogusz et al., Plant Cell, Bd. 2 (7) (1990), S. 633–641 (wurzelspezifische Promotoren aus Hämoglobin-Genen der stickstofffixierenden Nicht-Leguminose Parasponia andersonii und der verwandten nicht-stickstofffixierenden Nicht-Leguminose Trema tomeniosa; Leach und Aoyagi, Plant Science (Limerick), Bd. 79 (1) (1991) S. 69–76 (rolC- und rolD-wurzeleinschließende Gene von Agrobacterium rhizogenes); Teeri et al., EMBO J., Bd. 8 (2) (1989), S. 343–350 (Octopin-synthase und TR2'-Gen); (VfENOD-GRP3-Gen-Promotor); Kuster et al., Plant Mol. Biol., Bd. 29 (4) (1995), S. 759–772 und Capana et al., Plant Mol. Biol., Bd. 25 (4) (1994), S. 681–691 (rolB-Promotor). Verwiesen wird auch auf die US-Patente 5 837 876; 5 750 386; 5 633 363; 5 459 252; 5 401 836; 5 110 732; und 5 023 179.
Zu "Samen-bevorzugten" Promotoren gehören sowohl "Samen-spezifische" Promotoren (Promotoren, die während der Samenentwicklung aktiv sind, z. B. Promotoren von Samenlagerproteinen), sowie "Samen-keimende" Promotoren (Promotoren, die während der Samenkeimung aktiv sind); vergl. Thompson et al., Bioassays, Bd. 10 (1989), S. 108 (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Zu derartigen Samen-bevorzugten Promotoren gehören (ohne Beschränkung hierauf) Cim1 (Cytokinin-induzierte Botschaft); cZ10B1 (Mais 19 kDa-Zein); CelA (Cellulose-synthase); gamma-Zein; Glob-1; Bohnen-β-Phaseolin; Napin; β-Conglycinin; Sojabohnen-Lectin; Cruciferin; Mais 15 kDa-Zein; 22 kDa-Zein; 27 kDa-Zein; g-Zein; wachsartig; geschrumpft 1; geschrumpft 2; Globulin 1; und dergl.
Die erfindungsgemäßen Boostersequenzen können in DNA-Konstrukten oder Expressionskassetten für die Expression in der Pflanze von Interesse bereitgestellt werden. Die Kassette umfasst 5'- und 3'-Regulationssequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer erfindungsgemäßen Boostersequenz. Unter "funktionell verknüpft" ist eine funktionelle Verknüpfung zwischen einem Promotor und einer zweiten Sequenz zu verstehen, wobei die Promotorsequenz die Transkription der DNA-Sequenz entsprechend der zweiten Sequenz initiiert und vermittelt. Im allgemeinen bedeutet eine funktionelle Verknüpfung, dass die Nucleinsäuresequenzen benachbart sind und, sofern es erforderlich ist, zwei Protein-Kodierungsregionen zu verbinden, benachbart sind und sich im gleichen Leseraster befinden.
Die Expressionskassette kann zusätzlich mindestens ein weiteres Gen enthalten, das zur Cotransformation in den Organismus bestimmt ist. Alternativ können das oder die zusätzlichen Gene an mehrfachen Expressionskassetten bereitgestellt werden.
Eine derartige Expressionskassette wird mit einer Mehrzahl von Restriktionsstellen für die Insertion der erfindungsgemäßen Sequenzen unter der transkriptionalen Regulation der Regulationsbereiche bereitgestellt. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Markergene enthalten.
Die Expressionskassette enthält in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine transkriptionale und translationale Initiationsregion, eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz und eine transkriptionale und translationale Terminationsregion, die in Pflanzen funktionsfähig ist. Die transkriptionale Initiationsregion, der Promotor, kann nativ oder analog oder fremd oder heterolog zur Wirtspflanze sein. Zusätzlich kann es sich beim Promotor um die natürliche Sequenz oder alternativ um eine synthetische Sequenz handeln. Unter dem Ausdruck "fremd" ist zu verstehen, dass die transkriptionale Initiationsregion in der nativen Pflanze, in der die transkriptionale Initiationsregion eingeführt wird, nicht auftritt. Der hier verwendete Ausdruck "ein chimäres Gen" umfasst eine Kodierungssequenz, die funktionell mit einer transkriptionalen Initiationsregion, die zur Kodierungssequenz heterolog ist, verknüpft ist.
Die Terminationsregion kann nativ zur transkriptionalen Initiationsregion sein, sie kann nativ in Bezug zur funktionell verknüpften DNA-Sequenz von Interesse sein oder sie kann sich aus einer anderen Quelle ableiten. Zweckmäßige Terminationsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens verfügbar, z. B. die Octopin-synthase- und Nopalin-synthase-Terminationsregionen; vergl. auch Guerineau et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 262 (1991), S. 141–144; Proudfoot, Cell, Bd. 64 (1991), S. 671–674; Sanfacon et al., Genes Dev., Bd. 5 (1991), S. 141–149; Mogen et al. Plant Cell, Bd. 2 (1990), S. 1261–1272; Munroe et al., Gene, Bd. 91 (1990), S. 151–158; Ballas et al., Nucleic Acids Res., Bd. 17 (1989), S. 7891–7903; und Joshi et al., Nucleic Acid Res., Bd. 15 (1987), S. 9627–9639.
Gegebenenfalls können das oder die Gene, deren Expression zu verstärken ist, für die Expression in der transformierten Pflanze optimiert werden. Dies bedeutet, dass die Gene unter Verwendung von von Pflanzen bevorzugten Codons, die der Pflanze von Interesse entsprechen, synthetisiert werden können. Aus dem Stand der Technik sind Verfahren zur Synthese der von Pflanzen bevorzugten Gene bekannt; vergl. beispielsweise die US-Patente 5 380 831 und 5 436 391, sowie Murray et al., Nucleic Acids Res., Bd. 17 (1989), S. 477–498, die durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht werden.
Die Expressionskassetten können zusätzlich 5'-Leadersequenzen im Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Derartige Leadersequenzen können eine Verstärkung der Translation bewirken. Translationsleader sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, z. B. EMCV-Leader (Encephalomyocarditis-5'-Nichtkodierungsregion), Elroy-Stein et al., PNAS USA, Bd. 86 (1989), S. 6126–6130; Potyvirus-Leader, z. B. TEV-Leader (Tabak-Ätzvirus), Allison et al., MDMV-Leader (Mais-Verzwergungsmosaikvirus), Virology, Bd. 154 (1986), S. 9–20: Humanimmunoglobulin-schwere-Ketten-Bindungsprotein (BiP), Macejak et al., Nature, Bd. 353 (1991), S. 90–94; untranslatierter Leader aus der Hüllprotein-mRNA von Alfalfa-Mosaikvirus (AMV RNA 4), Jobling et al., Nature, Bd. 325 (1987), S. 622–625; Tabak-Mosaikvirus-Leader (TMV), Gallie et al., Molecular Biology of RNA, Hrsg. Cech (Liss, New York) (1989), S. 237–256; und Mais-Chlorose-Mottle-Virus-Leader (MCMV), Lommel et al., Virology, Bd. 81 (1991), S. 382–385; verwiesen wird auch auf Della-Cioppa et al., Plant Physiol., Bd. 84 (1987), S. 965–968. Weitere Verfahren, von denen bekannt ist, dass sie die Translation verstärken, können ebenfalls herangezogen werden, z. B. Introns und dergl.
Bei der Herstellung der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente manipuliert werden, um DNA-Sequenzen in der richtigen Orientierung und gegebenenfalls im richtigen Leseraster bereitzustellen. Zu diesem Zweck können Adapter oder Linker verwendet werden, um die DNA-Fragmente zu verbinden, oder es können andere Manipulationen vorgenommen werden, um zweckmäßige Restriktionsstellen bereitzustellen, überflüssige DNA zu entfernen, Restriktionsstellen zu entfernen oder dergl. Zu diesem Zweck können eine in vitro-Mutagenese, eine Primerreparatur, eine Restriktion, ein Annealing, Resubstitutionen, z. B. Übergänge und Transversionen, herangezogen werden.
Mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt transformierte Pflanzen können durch übliche Techniken, die auf dem Gebiet der genetischen Manipulation von Pflanzen bekannt sind, erzeugt werden. DNA kann in Pflanzenzellen unter Anwendung beliebiger geeigneter Techniken transformiert werden, z. B.: ein unschädlich gemachter Ti-Plasmidvektor, der von Agrobacterium getragen wird, unter Ausnützen von dessen natürlicher Gen-Übertragbarkeit (EP-A-270355; EP-A-0116718; NAR, Bd. 12 (22) (1984), S. 87211–87215; Townsend et al., US-Patent 5 563 055); Partikel- oder Mikroprojektil-Bombardement (US-Patent 5 100 792; EP-A-444882; EP-A-434616; Sanford et al., US-Patent 4 945 050; Tomes et al., "Direct DNA Transfer Into Plant Cells via Microprojectile Bombardment", Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips (Springer-Verlag, Berlin) (1995); und McCabe et al., Biotechnology, Bd. 6 (1988), S. 923–926); Mikroinjektion (WO-92/09696; WO-94/00583; EP-331083; EP-175966; Green et al., Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press (1987); Crossway et al., Biotechniques, Bd. 4 (1986), S. 320–334); Elektroporation (EP-290395; WO-87/06614; Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986), S. 5602–5606; D'Halluin, Plant Cell, Bd. 4 (1992), S. 1495–1505); weitere Formen der direkten DNA-Aufnahme (DE-4005152; WO-90/12096; US-Patent 4 684 611; Paszkowski et al., EMBO J., Bd. 3 (1984), S. 2717–2722): liposomenvermittelte DNA-Aufnahme (z. B. Freeman et al., Plant Cell Physiol., Bd. 29 (1984), S. 1353); oder das Wirbel-Verfahren (z. B. Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci USA, Bd. 87 (1990), S. 1228). Ein Übersichtsartikel über physikalische Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen stammt von Oard, Biotech. Adv., Bd. 9 (1991), S. 1–11. Allgemein verwiesen wird auf Weissinger et al., Ann. Rev. Genet., Bd. 22 (1988), S. 421–477; Sanford et al. Particulate Science and Technology, Bd. 5 (1987), S. 27–37; Christou et al., Plant Physiol., Bd. 87 (1988), S. 671–674; McCabe et al., Bio/Technology, Bd. 6 (1988), S. 923–926; Finer und McMullen, In Vitro Cell Dev. Biol., Bd. 27 (1991), S. 175–182; Singh et al., Theor. Appl. Genet., Bd. 96 (1998), S. 319–324: Datta et al., Biotechnology, Bd. 8 (1990), S. 736–740; Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S. 4305–4309; Klein et al., Biotechnology, Bd. 6 (1988), S. 559–563; Tomes, US-Patent 5 240 855; Buising et al., US-Patente 5 322 783 und 5 324 646; Klein et al., Plant Physiol., Bd. 91 (1988), S. 440–444; Fromm et al., Biotechnology, Bd. 8 (1990), S. 833–839; Hooykaas-Van Slogteren et al., Nature (London), Bd. 311 (1984), S. 763–764; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 5345–5349; De Wet et al., The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Hrsg. Chapman et al. (Longman, New York) (1985), S. 197–209; Kaeppler et al., Plant Cell Reports, Bd. 9 (1990), S. 415–418; und Kaeppler et al., Theor. Appl. Genet., Bd. 84 (1992), S. 560–566; Li et al., Plant Cell Reports, Bd. 12 (1993), S. 250–255; Christou and Ford, Annals of Botany, Bd. 75 (1995), S. 407–413; und Osjoda et al., Nature Biotechnology, Bd. 14 (1996), S. 745–750. Alle diese Druckschriften werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.
Die Agrobacterium-Transformation wird in der Fachwelt in breitem Umfang zur Transformation von zweikeimblättrigen Spezies verwendet. In letzter Zeit wurden erhebliche Fortschritte in Bezug auf eine routinemäßige Erzeugung von stabilen, fruchtbaren, transgenen Pflanzen bei fast allen einkeimblättrigen Pflanzen von wirtschaftlicher Bedeutung gemacht (Toriyama et al., Bio/Technology, Bd. 6 (1988), S. 1072–1074; Zhang, et al., Plant Cell Rep., Bd. 7 (1988), S. 379–384; Zhang et al., Theor. Appl. Genet., Bd. 76 (1988), S. 835–840; Shimamoto et al., Nature, Bd. 338 (1989), S. 274–276; Datta et al., Bio/Technology, Bd. 8 (1990), S. 736–740; Christou et al., Biotechnology, Bd. 9 (1991), S. 957–962: Peng et al., International Rice Research Institute, Manila, Philippinen (1991), S. 563–574; Cao et al., Plant Cell Rep., Bd. 11 (1992), S. 585–591; Li et al., Plant Cell Rep., Bd. 12 (1993), S. 250–255; Rathore et al., Plant Mol. Biol., Bd. 21 (1993), S. 871–884; Fromm et al., Bio/Technology, Bd. 8 (1990), S. 833–839; Gordon-Kamm et al., Plant Cell, Bd. 2 (1990), S. 603–618; D'Halluin et al., Plant Cell, Bd. 4 (1992), S. 1495–1505; Walters et al., Plant Mol. Biol., Bd. 18 (1992), S. 189–200; Koziel et al., Biotechnology, Bd. 11 (1993), S. 194–200; I. K. Vasil, Plant Mol. Biol., Bd. 25 (1994), S. 925–937; Weeks et al., Plant Physiol., Bd. 102 (1993), S. 1077–1084; Somers et al., Bio/Technology, Bd. 10 (1992), S. 1589–1594; WO-92/14828). Insbesondere hat sich die durch Agrobacterium vermittelte Transformation auch als hochwirksames Transformationsverfahren bei einkeimblättrigen Spezies entwickelt (Hiei et al., The Plant Journal, Bd. 6 (1994), S. 271–282). Verwiesen wird auch auf K. Shimamoto, Current Opinion in Biotechnology, Bd. 5 (1994), S. 158–162; Vasil et al., Bio/Technology, Bd. 10 (1992), S. 667–674; Vain et al., Biotechnology Advances, Bd. 13 (4) (1995), S. 653–671; Vasil et al., Nature Biotechnology, Bd. 14 (1996), S. 702.
Das Mikroprojektil-Bombardement, die Elektroporation und die direkte DNA-Aufnahme werden bevorzugt, wenn Agrobacterium unwirksam oder ineffektiv ist. Alternativ kann eine Kombination von verschiedenen Techniken herangezogen werden, um den Wirkungsgrad des Transformationsvorgangs zu verstärken, z. B. ein Bombardement mit Agrobacterium-beschichteten Mikropartikeln (EP-A-486234) oder ein Mikroprojektil-Bombardement zur Einleitung einer Wundbildung unter anschließender gemeinsamer Züchtung mit Agrobacterium (EP-A-486233).
Im Anschluss an die Transformation kann eine Pflanze regeneriert werden, z. B. aus einzelnen Zellen, Callus-Gewebe oder Blattscheiben, wie es im Stand der Technik üblich ist. Fast alle Pflanzen lassen sich vollständig aus Zellen, Geweben und Organen der Pflanze regenerieren. Ein Überblick über verfügbare Techniken findet sich bei Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Bd. I, II und III (1984), Laboratory Procedures and Their Applications (Academic Press); und Weissbach et al., Methods for Plant Mol. Biol., (1989).
Die transformierten Pflanzen können sodann gezüchtet werden und entweder mit dem gleichen transformierten Stamm oder mit unterschiedlichen Stämmen bestäubt werden, wonach das erhaltene Hybrid, das die angestrebte phänotypische Eigenschaft exprimiert, identifiziert wird. Zwei oder mehr Generationen können gezüchtet werden, um zu gewährleisten, dass die Expression der angestrebten phänotypischen Eigenschaften in stabiler Weise aufrechterhalten und vererbt wird. Anschließend werden Samen geerntet, um zu gewährleisten, dass die Expression der angestrebten phänotypischen Eigenschaften erreicht worden ist.
Die spezielle Wahl einer Transformationstechnik wird aufgrund von deren Wirkungsgrad zur Transformation bestimmter Pflanzenspezies sowie aufgrund der Erfahrung und der Vorliebe der die Erfindung ausführenden Personen in Bezug auf bestimmte Methoden der Wahl festgelegt. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die spezielle Wahl eines Transformationssystems zur Einführung von Nucleinsäure in Pflanzenzellen für die Erfindung nicht wesentlich ist und keine Beschränkung darstellt, was auch für die Wahl der Technik der Pflanzenregeneration gilt.
Ferner wird erfindungsgemäß eine Pflanzenzelle mit den erfindungsgemäßen Konstrukten bereitgestellt. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Pflanzenzelle bereitgestellt, das die Einführung eines Vektors, der das Konstrukt umfasst, in eine Pflanzenzelle beinhaltet. Für die Integration des Konstrukts in das Pflanzengenom schließt sich an eine derartige Einführung eine Rekombination zwischen dem Vektor und dem Pflanzenzellgenom an, um die Sequenz von Nucleotiden in das Genom einzuführen. Die RNA, die durch das eingeführte Nucleinsäurekonstrukt kodiert wird, kann sodann in der Zelle und in deren Abkömmlingen transkribiert werden, einschließlich in Zellen von Pflanzen, die aus dem transformierten Material regeneriert worden sind. Ein Gen, das in stabiler Weise in das Genom einer Pflanze eingebaut worden ist, wird von Generation zu Generation auf Abkömmlinge der Pflanze übertragen, so dass die Abkömmlinge den angestrebten Phänotyp zeigen.
Erfindungsgemäß wird ferner eine Pflanze bereitgestellt, die eine Pflanzenzelle gemäß der hier gegebenen Offenbarung umfasst. Ferner fallen unter die Erfindung transformierte Samen und Pflanzenteile.
Zusätzlich zu einer Pflanze werden erfindungsgemäß beliebige Klone einer derartigen Pflanze, eines Samens, eines selbstbestäubten oder hybriden Abkömmlings und beliebige Teile von allen diesen Produkten, wie Stecklinge oder Samen, bereitgestellt. Die Erfindung stellt ferner beliebige Pflanzenvermehrungsprodukte bereit, d. h. beliebige Teile, die bei der Reproduktion oder Vermehrung (sexuell oder asexuell) verwendet werden können, einschließlich Schnittprodukte, Samen und dergl. Unter die Erfindung fällt ferner eine Pflanze, bei der es sich um einen sexuell oder asexuell vermehrten Abkömmling, Klon oder Nachkommen einer derartigen Pflanze; oder einen beliebigen Teil oder ein Vermehrungsprodukt einer derartigen Pflanze, eines Nachkommens, eines Klons oder eines Abkömmlings handelt. Ferner werden Pflanzenextrakte und Pflanzenderivate bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung kann zur Transformation beliebiger Pflanzenspezies, unter Einschluss (ohne Beschränkung hierauf) folgender Pflanzen verwendet werden: Mais (Zea mays), Canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), Luzerne (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Sonnenblume (Helianthus annuus), Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnuss (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Maniok (Manihot esculenta), Kaffee (Cofea ssp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Citrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guava (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashew (Anacardium occidental), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrübe (Beta vulgaris), Hafer, Gerste, Gemüsepflanzen, Zierpflanzen und Koniferen.
Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Pflanzen um landwirtschaftlich genutzte Pflanzen (z. B. Cerealien und Hülsenfrüchte, Mais, Weizen, Kartoffel, Tapioca, Reis, Sorghum, Hirse, Maniok, Gerste, Erbsen und andere Wurzel-, Hülsen- oder Saatfrüchte. Zu wichtigen Saatgutarten gehören Ölsaatraps, Zuckerrübe, Mais, Sonnenblume, Sojabohne und Sorghum. Zu Gartenpflanzen, auf die die Erfindung angewandt werden kann, gehören Lattich; Endivie; und Brassica-Gemüsesorten, einschließlich Kohl, Broccoli und Blumenkohl; sowie Nelken und Geranien. Die vorliegende Erfindung kann auf Tabak, Kürbis, Karotten, Erdbeeren, Sonnenblumen, Tomaten, Pfeffer, Chrysanthemen, Pappeln, Eucalyptus und Pinien angewandt werden.
Zu Körnerpflanzen, die Samen von Interesse bereitstellen, gehören Ölsaatpflanzen und Leguminosepflanzen. Zu Samen von Interesse gehören Getreidesamen, wie Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sorghum, Roggen und dergl. Zu Ölsaatpflanzen gehören Baumwolle, Sojabohne, Safflordistel, Sonnenblume, Brassica, Mais, Luzerne, Palme, Kokosnuss und dergl. Zu Leguminosenpflanzen gehören Bohnen und Erbsen. Bohnen umfassen Guar, Johannisbrot, Fenugreek (Bockshornklee), Sojabohne, Gartenbohne, Langbohne, Mungobohne, Limabohne, Saubohne, Linsen, Kichererbsen und dergl.
Da der Einfluss von HC-Pro auf die Suppression von PTGS klar proteinvermittelt und nicht RNA-vermittelt ist (Anandalakshmi et al., 1998; Brigneti et al., 1998), verwendeten wir Protein-Protein-Wechselwirkungstests, um nach Pflanzenproteinen zu suchen, die mit HC-Pro in Wechselwirkung treten. Unter Verwendung von HC-Pro als Köder in einem Hefe-Doppelhybridsystem fanden wir vier mit HC-Pro in Wechselwirkung tretende Pflanzenproteine. Unsere Gesamtstrategie bestand darin, eine Überexpression oder eine Störung der Expression dieser Proteine herbeizuführen und anschließend den Einfluss der Manipulationen auf die Gen-Abschaltung und deren Modulation durch HC-Pro zu bestimmen. Diese Verfahren haben bereits in erfolgreicher Weise einen der HC-Pro-Interaktoren als Pflanzenregulator der Gen-Abschaltung identifiziert. Beim Pflanzenregulator der Gen-Abschaltung handelt es sich um ein neuartiges, mit Calmodulin verwandtes Protein (rgs-CaM). Dieses zelluläre Protein kehrt (wie HC-Pro selbst (Brigneti et al., 1998)) die PTGS bei Expression aus einem viralen Vektor um und stört die Initiation der virusinduzierten Gen-Abschaltung bei ektopischer Expression in transgenen Pflanzen.
Die Abschaltungs-Suppressor-Aktivität von HC-Pro kann von seinem schädlichen Entwicklungsphänotyp getrennt werden. Zwei Beobachtungen zeigen, dass dies der Fall ist. Mehrere transgene Tabaklinien, die mutante Versionen von P1/HC-Pro exprimieren, stehen zur Verfügung. Eine dieser mutanten Linien weist nicht den üblichen "HC-Pro"-Entwicklungsphänotyp auf. Sie schaut vollständig normal aus und wächst mit normaler Geschwindigkeit. Bei Kreuzung mit einer GUS-abgeschalteten Linie wurde festgestellt, dass das mutante P1/HC-Pro nicht die GUS-Abschaltung im vaskulären Gewebe der Nachkommenschaft hervorrufen konnte, während dies im sämtlichen übrigen Gewebe der Pflanze der Fall war. Somit kann eine gewebespezifische Expression von HC-Pro oder rgs-CaM zu Pflanzen führen, die PTGS unterdrücken, jedoch phänotypisch normal sind.
Die Rolle von rgs-CaM bei der Regulation von PTGS erlaubt eine Manipulation dieses Wegs, was in zweierlei Weise ausgenützt werden kann. 1) Eine Unterdrückung des Wegs (beispielsweise durch Überexpression von rgs-CaM) ermöglicht eine stabile hochgradige Expression von günstigen Transgenen in Pflanzen. 2) In einigen Fällen wird PTGS dazu herangezogen, die Expression von schädlichen oder unerwünschten Genen auszuschalten. In einigen Fällen ist es möglich, rgs-CaM zur Verstärkung von PTGS einzusetzen und damit den abgeschalteten Phänotyp, der bei diesen Anwendungen erwünscht ist, zu stabilisieren. HC-Pro ist ein multifunktionelles Protein, das einen Einfluss auf Stoffwechselwege ausübt, die sowohl Entwicklungswege als auch Abwehrwege in Pflanzen beeinflussen. Da diese Wirkungen von HC-Pro auf die Abwehr und Entwicklung von Pflanzen durch Wechselwirkung mit zellulären Proteinen vermittelt werden, die normalerweise diese Prozesse regulieren, ist es möglich, die mit HC-Pro in Wechselwirkung tretenden Proteine, wie rgs-CaM, dazu einzusetzen, Pflanzen so zu manipulieren, dass sie nur einen Aspekt des "HC-Pro"-Phänotyps exprimieren.
Durch Klonierung von mutanten Versionen von rgs-CaM in einen PVX-Vektor und Testen der Fähigkeit des Konstrukts zur Umkehrung von PTGS kann man die Aktivität von rgs-CaM-Varianten testen. Diese Umkehr des Gen-Abschaltungstests wird derzeit im Laboratorium angewandt und wurde dazu herangezogen, den Nachweis zu erbringen, dass rgs-CaM ein Regulator von PTGS ist.
Nachstehend finden sich Beispiele, die Verfahren zur praktischen Durchführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sind nicht als Beschränkung anzusehen. Sämtliche Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht und sämtliche Verhältnisangaben für Lösungsmittelgemische beziehen sich auf das Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1 – Isolierung von cDNAs, die für HC-Pro kodieren, die mit Proteinen aus Tabak in Wechselwirkung treten.
Um mit HC-Pro in Wechselwirkung tretende Pflanzenproteine zu identifizieren, unterzogen wir eine Hefe-Doppelhybrid-Tabak-cDNA-Bibliothek (freundlicherweise von Dr. Chris Mau, UG Davis, zur Verfügung gestellt) einem Screening unter Verwendung des Tabak-Ätzvirus-HC-Pro als Köder. 2 Millionen cDNAs wurden einem Screening unterzogen und 16 mit mit HCPro in Wechselwirkung tretende Tabak-cDNAs wurden auf der Grundlage der Fähigkeit zum Wachstum in Abwesenheit von Histidin und zur Aktivierung des lacZ-Gens isoliert. 8 dieser Tabak-cDNAs erfüllten die folgenden Kriterien. Sie traten nicht in Wechselwirkung mit leeren Köderplasmiden oder negativen Kontroll-(Lamin)-plasmiden in Wechselwirkung und traten bei Klonierung in das DNA-Bindungsdomänen-Fusionsplasmid in positive Wechselwirkung mit HC-Pro im Aktivierungsdomänen-Fusionsplasmid (reziprok positive Ergebnisse). Diese cDNAs für diese 8 mutmaßlichen, mit HC-Pro in Wechselwirkung tretenden Proteine wurden sequenziert und vergleichende Sequenzanalysen wurden unter Verwendung der Programme BLAST und FASTA durchgeführt. Die für rgs-CaM kodierende cDNA wurde identifiziert (SEQ ID NO: 1). Auf der Grundlage dieser Sequenz wurden rgs-CaM-Homologe von anderen Spezies identifiziert. Sie lassen sich gemäß der hier gegebenen Lehre verwenden. Es handelt sich um Tomate (GENBANK Hinterlegungsnummer AI487362], Sojabohnen (GENBANK Hinterlegungsnummer AW350323) und Arabidopsis (GENBANK Hinterlegungsnummer AB016888, Translation der Nucleotide 22076 bis 21546).
Das mit HC-Pro in Wechselwirkung tretende Protein B-3 (rgs-CaM) (SEQ ID NO: 2) zeigt eine hochgradige Homologie mit Calmodulinen und verwandten, Calcium bindenden Proteinen an seinem C-Terminus, wobei jedoch eine Erweiterung mit 50 Aminosäuren am N-Terminus vorliegt. Anschließende Experimente mit B-3 führten zu der Feststellung, dass es als Regulator der Gen-Abschaltung wirkt und diese Ergebnisse werden in den folgenden Beispielen ausführlicher erörtert. Da das B-3-Protein ein neuartiges, mit Calmodulin verwandtes Protein ist und es die Gen-Abschaltung reguliert, bezeichneten wir es als rgs-CaM, und zwar für Regulator der Gen-Abschaltung (rgs) und mit Calmodulin verwandtes Protein (CaM).
Calmodulin (CaM) ist ein wichtiger intrazellulärer Rezeptor für den zweiten Messenger Ca²⁺ und wird in fast allen Zellen sämtlicher Eukaryonten exprimiert (Rudd and Franklin-Tong, 1999; Snedden and Hillel, 1999). Es handelt sich um ein signalgebendes Molekül, das selbst keine enzymatische Aktivität aufweist, jedoch an Ca²⁺ bindet und seine Konformation verändert, so dass es an spezifische Zielproteine binden kann und deren Aktivität verändert. Im allgemeinen bindet CaM an eine selbsthemmende Domäne am Zielprotein und maskiert diese, wodurch es zu einer Aktivierung kommt. Offensichtlich weisen sämtliche Pflanzen Calmoduline auf, die Ähnlichkeit mit Säugetier-Calmodulin besitzen. Jedoch haben neuere Studien eine Familie von mit Calmodulin verwandten Proteinen in Pflanzen identifiziert, die sich vom allgemeinen Calmodulin in Säugern unterscheiden. Alle diese CaM- und CaM-artigen Moleküle enthalten ein gemeinsames Strukturmotiv mit der Bezeichnung "EF-Hand", eine Helix-Schleifen-Helix-Struktur, die an ein einzelnes Ca²⁺-Ion bindet. Säugetier-CaM weist vier EF-Hände auf, während CaM-verwandte Proteine von Pflanzen dieses Motiv in unterschiedlicher Anzahl von 3 bis 6 besitzen und viele davon entweder C- oder N-terminale Erweiterungen im Vergleich zu CaM aufweisen. Mit Pflanzen-CaM verwandte Proteine unterscheiden sich offensichtlich in ihrer Fähigkeit zur Aktivierung von bekannten CaM-Zielen und es wird angenommen, dass es eine Zielspezifität für unterschiedliche Mitglieder der Pflanzen-CaM-Oberfamilie gibt. Natives rgs-CaM von voller Länge weist 3 EF-Hände und eine N-terminale Erweiterung mit etwa 40–50 Aminosäuren auf, die möglicherweise die intrazelluläre Position oder regulatorische Eigenschaften von rgs-CaM spezifizieren. Die folgenden Beispiele beschreiben eine Vielzahl von biochemischen und genetischen Herangehensweisen zum Nachweis der Aktivität des Proteins und der Art und Weise, wie es ein Signal transduziert, das die Gen-Abschaltung beeinflusst.
Beispiel 2 – Stabile Transformationsexperimente unter Verwendung der rgs-CaM-cDNAs
Zum Nachweis der Rolle von rgs-CaM bewirken wir eine Überexpression oder Störung der Expression von rgs-CaM-cDNAs unter Anwendung stabiler Transformationstechniken. Ein alternativer Weg unter Verwendung von Kartoffelvirus X (PVX) als Vektor zur Expression hoher Konzentrationen an rgs-CaM wurde gleichzeitig eingeschlagen.
Anfängliche stabile Transformationsexperimente verwenden cDNAs für rgs-CaM unter Kontrolle des starken Blumenkohl-Mosaikvirus 35S-Promotors für eine stabile Transformation sowohl von Nicotiana tabacum (Tabak) als auch von N. benthamiana (eine mit Tabak verwandte Spezies, die gut für Experimente unter Verwendung von viralen Vektoren geeignet ist. Mehr als 30 individuelle primäre Transformanten in beiden Tabakspezies werden erhalten. Die ersten Transformanten werden einer Selbstbestäubung unterzogen und auf eine Segregation des Transgens (anfänglich erkannt durch Selektion an Kanamycin) analysiert. Linien, die einer Segregation von 3:1 für Kanamycin-Resistenz unterliegen und die auch einen sichtbaren Phänotyp aufweisen, werden für weitere Studien ausgewählt. Die ausgewählten Linien werden durch Southern-Blot-Analyse analysiert, um die Anzahl an Transgenen festzustellen, durch Northern-Blot-Analyse, um den Grad der Expression des Transgens festzustellen (und somit festzustellen, ob das Transgen überexprimiert oder abgeschaltet wird) und auf Veränderungen in den Gen-Abschaltungseigenschaften unter Anwendung einer Anzahl von Tests.
Interessanterweise verleihen rgs-CaM-cDNAs bei einer Anzahl der primären N. benthamiana-Transformanten einen charakteristischen Phänotyp. Die Phänotypen dieser transgenen Linien könnten entweder durch eine erhöhte Expression oder durch eine verringerte Expression des speziellen Transgens herbeigeführt werden. Eine verringerte Expression eines Transgens erfolgt im allgemeinen in einer bestimmten Fraktion von transgenen Linien aufgrund entweder einer transkriptionalen oder einer posttranskriptionalen Gen-Abschaltung. Der Phänotyp von primären rgs-CaM-Transformanten in N. benthamiana ist von besonderem Interesse, da er den Phänotyp von mit HC-Pro transformierten Pflanzen nachahmt. Von diesen transgenen rgs-CaM-Pflanzen wurde festgestellt, dass sie in starkem Maße rgs-CaM in RNA überexprimieren, verglichen mit nicht-transgenen Kontrollen; vergl. 1, Bahnen 1 und 2. Dies stellt einen Hinweis dafür dar, dass rgs-CaM ein Pflanzensuppressor von PTGS ist.
Beispiel 3 – rgs-CaM ist ein Pflanzenregulator der posttranskriptionalen Gen-Abschaltung
Es wurde festgestellt, dass der Phänotyp einer Anzahl von unabhängigen, rgs-CaM-exprimierenden, transgenen Linien den Phänotyp nachahmt, der in transgenen P1/HC-Pro-Linien auftritt. Dieser überraschende Befund zeigt, dass rgs-CaM, wie P1/HC-Pro, als Regulator der Abschaltung wirkt. Wir verwenden zwei verschiedene Tests, um direkt nachzuweisen, dass dieses Protein die Fähigkeit besitzt, die Gen-Abschaltung zu beeinflussen. Es gibt vier Wege zum Nachweis, dass rgs-CaM PTGS reguliert. Diese Wege werden nachstehend beschrieben.

1) Der Phänotyp von transgenen rgs-CaM-Linien ahmt den Phänotyp von transgenen Pflanzen nach, die den HC-Pro-Suppressor der Abschaltung exprimieren. Die Expression von P1/HC-Pro in transgenen Pflanzen verleiht mehrere einzigartige Entwicklungseigenschaften, von denen die auffallendste ein langsames Wachstum bei verringerter Wurzelbiomasse und die Entwicklung eines Tumors an der Verbindung zwischen Stängel und Wurzel darstellt (vergl. den Tumor in 2C mit der normalen Stängel/Wurzel-Verbindung in 2A). Der mit der Expression von P1/HC-Pro verbundene Tumor weist eine differenzierte Zytologie auf (d. h. es sind alle entsprechenden differenzierten Zelltypen vorhanden, wobei die Zelltypen aber nicht richtig angeordnet sind) (vergl. die fehlerhafte Organisation von Zellen in 2D mit der in 2B dargestellten normalen Organisation). Mehrere der primären N. benthamiana-rgs-CaM-Transformanten entwickeln einen Phänotyp, der an den Phänotyp erinnert, der in N. tabacum-Pflanzen auftritt, die den potyviralen P1/HC-Pro-Suppressor der Gen-Abschaltung exprimieren. Sie wachsen langsam und weisen ein Tumorwachstum auf, das sich an der Verbindung zwischen Stängel und Wurzel entwickelt (3). Wie die transgenen HC-Pro-Linien sind diese rgs-CaM-Tumoren aus differenzierten Zellen zusammengesetzt, die aber fehlerhaft angeordnet sind (Daten nicht aufgeführt). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die posttranskriptionale Gen-Abschaltung während der normalen Pflanzenentwicklung verwendet wird und dass die Suppression dieses Mechanismus zu Entwicklungsanomalien führt. Die Tatsache, dass transgene rgs-CaM-Linien einen Phänotyp aufweisen, der ähnlich dem Phänotyp ist, der in Transgenen auftritt, die den viralen Suppressor exprimieren, zeigt, dass rgs-CaM ein zellulärer Regulator von PTGS ist und dass dieses Protein zumindest teilweise eine Vermittlung der Suppressoraktivität von HC-Pro vermittelt.
2) Eine transgene rgs-CaM-Linie ist nicht zur virusinduzierten Gen-Abschaltung befähigt. Um direkt zu testen, ob die transgene rgs-CaM-Linie bezüglich der Regulation der posttranskriptionalen Gen-Abschaltung verändert ist, wenden wir einen virusinduzierten Gen-Abschaltungstest (VIGS) an. Dieser Test ist anerkannt (Baulcombe, 1999; Jones et al., 1998; Ruiz et al., 1998) und wurde in unserem Laboratorium in erfolgreicher Weise eingesetzt (Anandalakshmi et al., 1998). Bei diesem Test wird eine transgene Pflanzenlinie, die GFP in hohen Konzentrationen exprimiert, mit einem PVX-Vektor, der die GFP-Sequenz exprimiert, infiziert (andere Reportergene könnten ebenfalls verwendet werden, sofern es sich bei dem Gen in der transgenen Linie und im viralen Vektor um das gleiche Gen handelt). Das PVX-GFP unterliegt einer Replikation und bewegt sich systemisch durch die Pflanze, die hohe Konzentrationen an GFP in Blättern, die bei der Infektion eine frühe Invasion erfahren haben, exprimiert. Der Infektionsvorgang löst VIGS aus, eine Art von posttranskriptionaler Gen-Abschaltung. Zunächst wird das GFP-Transgen lokal abgeschaltet und anschließend im gesamten oberen Teil der Pflanze. Schließlich wird im sehr späten Stadium der Infektion der virale Vektor (PVX-GFP) abgeschaltet und von der Pflanze eliminiert. Zu diesem Zeitpunkt wird in Abwesenheit des viralen Auslösers das GFP-Transgen wieder angeschaltet. Wir haben früher gezeigt, dass P1/HC-Pro in diesem System VIGS stört (Anandalakshmi et al., 1998). Um die Wirkung von rgs-CaM im gleichen System nachzuweisen, kreuzen wir eine rgs-CaM-exprimierende Linie (Linie 19, eine rgs-CaM-Linie mit einem ausgeprägten Phänotyp, eine primäre Transformante gemäß Beschreibung in Beispiel 2) mit einer Linie, die hohe Konzentrationen an GFP exprimiert (Linie 16C, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von D. Baulcombe, Sainsbury Labs, Norwich, UK), um Pflanzen zu erzeugen, die sowohl in Bezug auf das GFP- als auch auf das rgs-CaM-Transgen hämizygot sind. Pflanzen von beiden Linien werden mit PVX-GFP infiziert und sind befähigt, die Replikation zu unterstützen und verteilen dieses Virus auf der Grundlage von lokalen Infektionsherden und systemischen Symptomen. Die hämizygoten 16C-GFP-Pflanzen (ohne das rgs-CaM-Transgen) unterliegen einer vollständigen Abschaltung in Bezug auf das GFP-Transgen etwa 10 Tage nach der Inokulation mit PVX-GFP (und daher zeigt der obere Teil der Pflanze unter UV-Licht eine rote Fluoreszenz aufgrund der Anwesenheit von Chlorophyll, anstelle einer grünen Fluoreszenz, wie es in Anwesenheit von GFP der Fall ist; 4A) sowie einer drastischen Verringerung sowohl an GFP-Transgen-RNA als auch an PVX-GFP-Virus-RNA (Daten nicht aufgeführt). Im Gegensatz dazu erfolgt bei Pflanzen, die sowohl in Bezug auf GFP- als auch auf rgs-CaM-Transgene hämizygot sind, keine Abschaltung bei Infektion mit PVX-GFP, und diese Pflanzen zeigen weiterhin unter langwelligem UV-Licht eine grüne Fluoreszenz (4B). Dies stellt einen direkten Beweis dafür dar, dass die transgene rgs-CaM-Linie einen PTGS-Defekt aufweist.
3) rgs-CaM kehrt die Gen-Abschaltung bei Expression aus einem PVX-Vektor um. Um einen zusätzlichen Nachweis für die Rolle von rgs-CaM bei der Regulierung der Gen-Abschaltung zu erbringen, kehren wir den Abschaltungstest gemäß Brigneti et al. (1998) um. Bei dieser Verfahrensweise wird eine transgene N. benthamiana-Linie (Linie 16C), die hohe Konzentrationen an grün fluoreszierendem Protein (GFP) exprimiert, posttranskriptional abgeschaltet, indem die Blätter mit Agrobacterium tumefaciens infiltriert werden, das einen Vektor trägt, der auch GFP exprimiert. Das Agrobacterium bewegt sich nicht vom inokulierten Blatt weg, induziert aber PTGS des GFP-Transgens in lokaler Weise, und anschließend breitet sich die GFP-Abschaltung systemisch durch die Pflanze aus, bis eine vollständige Abschaltung erfolgt ist. Die GFP-Abschaltung in diesen Pflanzen kann durch Infektion mit einem PVX-Vektor umgekehrt werden, der einen viralen Suppressor der Abschaltung exprimiert, z. B. das potyvirale HC-Pro oder das Gurken-Mosaikvirus-2a-Genprodukt (Brigneti et al., 1998). Wir schalten die GFP-Pflanzen durch Agroinfiltration ab und infizieren sie sodann mit Kartoffelvirus X, der entweder Wildtyp-HC-Pro (PVX-HC), eine mutante, inaktive Version von HC-Pro (PVX-noHC) oder die rgs-CaM-cDNA-Sequenz (PVX-rgs-CaM) trägt. Pflanzen, die jeweils mit diesen Viren infiziert sind, entwickeln Symptome, die typisch für den speziellen PVX-Vektor sind (ein leichtes Mosaikmuster an Blättern für PVX-rgs-CaM und PVX-noHC; eine systemische Nekrose für PVX-HC). Die mit PVX-noHC infizierten Pflanzen bleiben in Bezug auf das GFP-Transgen abgeschaltet (und bleiben daher unter UV-Licht rot; 5A). Im Gegensatz dazu zeigen mit PVX-rgs-CaM infizierte Pflanzen eine Umkehr der GFP-Abschaltung im systemisch infizierten Teil der vorher abgeschalteten Pflanze (grüne Bereiche vor rotem Hintergrund, 5B). Diese Umkehr der Abschaltung ist typisch für virale Suppressoren der Abschaltung, die von PVX exprimiert werden (Brigneti et al., 1998) und wird in Bereichen von abgeschalteten Pflanzen beobachtet, die systemisch mit PVX-HC infiziert sind (Daten nicht aufgeführt). Dieses Ergebnis stimmt mit dem vorstehend beschriebenen VIGS-Experiment überein und bestätigt, dass rgs-CaM ein zellulärer Regulator von PTGS ist.

Beispiel 4
Die Fähigkeit von rgs-CaM-überexprimierenden, transgenen Pflanzen zur Suppression der transgeninduzierten Gen-Abschaltung wird in Agrobacterium-Infiltrationsstudien nachgewiesen. Eine transgene Nicotiana benthamiana-Linie, die sowohl rgs-CaM als auch grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert, oder eine Kontrolllinie, die nur das GFP-Transgen exprimiert, werden mit einer Kultur von Agrobacterium infiltriert, die auch das GFP-Transgen exprimiert. Die Abschaltung des GFP-Transgens in Kontrollpflanzen wird im Bereich der lokalen Infiltration innerhalb einiger Tage erkennbar. Innerhalb von 2 Wochen bewegt sich diese transgeninduzierte Genabschaltung durch den oberen Teil der Pflanze, wodurch sich eine vollständige systemische Abschaltung der Pflanze ergibt. Im Gegensatz dazu erfolgt bei den rgs-CaM-exprimierenden Pflanzen keine Abschaltung in Reaktion auf eine Infiltration mit Agrobacterium, oder die Abschaltung erfolgt anfänglich nur in einem kleinen lokalen Bereich, kann sich aber nicht in wirksamer Weise ausbreiten. Dieses Ergebnis zeigt, dass rgs-CaM ein Suppressor der transgeninduzierten Genabschaltung ist.
Beispiel 5
Um festzustellen, ob die Boostersequenz eine Verstärkung der Expression eines in stabiler Weise eingebauten Transgens bewirkt, kann das vorliegende Beispiel ausgeführt werden. Eine Pflanze wird zunächst durch eine beliebige Art der stabilen Transformation mit einem endogenen Pflanzengen exprimiert, um dieses spezielle Gen einer Überexpression zuzuführen. Ein Teil der Transformanten unterliegt einer Cosuppression in Bezug auf das eingeführte Gen und exprimiert das Genprodukt nicht. Diese cosupprimierten Pflanzen werden sodann mit einer Pflanze. die in stabiler Weise mit der Boostersequenz transformiert ist, gekreuzt, z. B. mit den in Beispiel 2 beschriebenen Transformanten. Die Nachkommen dieser Kreuzung exprimieren das vorher abgeschaltete (cosupprimierte), eingeführte, endogene Gen.
Beispiel 6
Das folgende Beispiel beschreibt das vorliegende Verfahren zur Anwendung bei der Expression hoher Konzentrationen eines endogenen Genprodukts. Eine Pflanze, die in stabiler Weise mit einer oder mehreren Kopien der Boostersequenz transformiert worden ist, z. B. die in Beispiel 2 beschriebenen, rgs-CaM-transformierten Pflanzen, wird anschließend mit einer zusätzlichen Kopie oder mit zusätzlichen Kopien eines endogenen Gens transformiert, um dieses Genprodukt einer Überexpression zuzuführen. Die Transformanten zeigen eine hochgradige Expression des eingeführten Genprodukts und/oder eine verringerte Anzahl an cosupprimierten Nachkommen, die das Genprodukt nicht exprimieren.
Es gibt mehrere weitere Beispiele für eine transgeninduzierte, posttranskriptionale Abschaltung, bei denen zu erwarten ist, dass die Boostersequenz die Gen-Abschaltung stört und dadurch die Expression verstärkt. Zwei Beispiele für derartige Linien werden derzeit untersucht, indem man eine Kreuzung mit den P1/HC-Pro-exprimierenden transgenen Linien vornimmt und einen Test auf die Umkehrung der Gen-Abschaltung durchführt. Diese abgeschalteten Linien wurden in Frankreich im INRS im Laboratorium von Herve Vaucheret konstruiert.
Bei der transgenen Linie 475-2.1 handelt es sich um eine transgene Tabaklinie, die posttranskriptional sowohl in Bezug auf das kodierte Transgen als auch auf die endogenen Nitrit-Reduktase (Nii)-Gene abgeschaltet ist und in der Literatur beschrieben worden ist (J. C. Palauqui, T. Elmayan, F. Dorlhac de Borne, P. Crete, C. Charles und H. Vaucheret, "Frequencies, Timing and Spatial Patterns of Co-suppression of Nitrate Reductase and Nitrite Reductase in Transgenic Tobacco Plants", Plant Physiol., Bd. 112 (1996), S. 1447–1456).
Bei der transgenen Linie 30-18.9 handelt es sich um eine transgene Tabaklinie, die posttranskriptional sowohl in Bezug auf das kodierte Transgen als auch in Bezug auf die endogenen Nitrat-reductase (Nia)-Gene abgeschaltet worden ist und in der Literatur beschrieben worden ist (J. C. Palauqui und H. Vaucheret "Field Trial Analysis of Nitrate Reductase Co-suppression: A Comparative Study of 38 Combinations of Transgene Loci", Plant Mol. Biol., Bd. 29 (1995), S. 149–159).
Beispiel 7
Transgene Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum), die die rgs-CaM-Sequenz exprimieren, und Kontroll-Tabakpflanzen der gleichen Varietät werden mit transgenen Tabakpflanzen gekreuzt, die eine replizierende RNA exprimieren, die einen Teil der genomischen RNA von Kartoffelvirus X (PVX) umfassen, wobei das uidA-Reportergen anstelle des PVS-Hüllprotein-Gens inseriert ist (transgene Linie 155; beschrieben von Angell, EMBO J., Bd. 12 (1997), S. 3675–3684). Die Expression von beta-Glucuronidase (GUS), die durch das uidA-Gen in der 155-Linie kodiert wird, wird in den Kreuzungen jeweils durch histochemische Färbung gemäß Anandalakshmi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 95 (1998), S. 13079–13084, überwacht. Die Nachkommen der Kreuzung zwischen der Linie 155 und den nicht-transformierten Kontrollpflanzen zeigen nur eine geringe Blaufärbung, die durch die GUS-Aktivität in diesem Test hervorgerufen wird, was darauf hinweist, dass die Pflanzen im hämizygoten Zustand abgeschaltet bleiben. Im Gegensatz dazu zeigen die Nachkommen der Kreuzung von Linie 155 und den rgs-CaM-transformierten Linien eine intensive Blaufärbung nach nur kurzzeitiger Inkubation. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Abschaltung von PVS-GUS in Gegenwart von rgs-CaM-Expression umgekehrt wird, und lässt darauf schließen, dass der Expressionsgrad, der durch die Kombination der beiden Transgene erreicht wird, unerwartet hoch ist. Die GUS-Aktivitätsgrade werden in den Nachkommen durch einen quantitativen fluorimetrischen Enzymtest gemäß den Angaben von Jefferson, Plant Molecular Biology Reporter, Bd. 5 (1987), S. 387–405, gemessen. Die GUS-Aktivität in Nachkommen der Kreuzung von Linie 155 und den nicht-transformierten Kontrollpflanzen ist gering. Im Gegensatz dazu ist die GUS-Aktivität in den Nachkommen der Kreuzung von Linie 155 und den rgs-CaM-Transformanten überraschend hoch, verglichen mit der Aktivität in Nachkommen der Kontrollkreuzung oder in herkömmlichen GUS-exprimierenden, transgenen Linien, wie der Linie T19 (beschrieben von English et al., Plant Cell, Bd. 8 (1996), S. 179–188). Die GUS-Aktivitätsgrade in der Kombination aus Linie 155/rgs-CaM sind mindestens etwa 2 Größenordnungen höher als sie vorher in transgenen Pflanzen beschrieben worden sind.
Beispiel 8
In diesem Beispiel wird die Fähigkeit der rgs-CaM-Sequenz zur Umkehr von PTGS und zur Erzeugung einer verstärkten Expression in einer weiteren Linie getestet (Linie 163: umfassend das PVX-Genom mit dem uidA-Reportergen, das strangaufwärts vom PVX-Hüllprotein-Gen und unter der Kontrolle eines subgenomischen Hüllprotein-Wiederholungspromotors gemäß den Angaben von Angell und Baulcombe (1997) inseriert ist. Die Linie 163 unterscheidet sich von der Linie 155 in mehreren Aspekten: 1) die Linie 163 enthält das Hüllprotein-Gen und erzeugt Hüllprotein, während bei der Linie 155 uidA anstelle des Hüllprotein-Gens inseriert ist und diese Linie daher kein Hüllprotein erzeugt; 2) die 25K-Dreifachblock-Bewegungsprotein-Kodierungsregion der Linie 163 weist eine Deletion auf, die bewirkt, dass die RNA sich nicht von Zelle zu Zelle bewegen kann, während diese Region in der Linie 155 als Wildtyp vorliegt. Da sowohl die Dreifachblock-Proteine als auch das Hüllprotein von PVX für die Bewegung der viralen RNA von Zelle zu Zelle erforderlich sind, sind beide RNAs auf die Zelle beschränkt, wo sie exprimiert werden, jedoch aus unterschiedlichen Gründen; 3) der Grad der GUS-Expression in der Linie 163 ist signifikant geringer als in der Linie 155, wie von Angell und Baulcombe (1997) gezeigt worden ist. Der geringere Grad der GUS-Aktivität in der Linie 163 kann auf eine Expression des Transgens aus einem subgenomischen Wiederholungspromotor, auf die Erzeugung von Hüllprotein, das als Suppressor der viralen Replikation dienen kann, oder auf eine verstärkte Auslösung der Abschaltung durch die 163-Linie zurückzuführen sein.
Die Linie 163 wird mit rgs-CaM-transgenen Pflanzen und mit nicht-transformierten Kontrollpflanzen des gleichen genetischen Hintergrunds gekreuzt. Die Nachkommen der Kreuzung zwischen der Linie 163 und den untransformierten Kontrollpflanzen zeigen bei diesem Test eine geringe, durch GUS-Aktivität hervorgerufene Blaufärbung, was zeigt, dass die Pflanzen im hämizygoten Zustand abgeschaltet bleiben. Im Gegensatz dazu zeigen die Nachkommen der Kreuzung der Linie 163 mit den rgs-CaM-Transformanten eine intensive Blaufärbung nach nur kurzzeitiger Inkubation, was zeigt, dass die Abschaltung von PVS-GUS in Gegenwart der viralen Sequenz umgekehrt wird. Der Grad der GUS-Aktivität wird wie in Beispiel 1 gemessen.
Beispiel 9
In diesem Beispiel wird eine transgene Linie erzeugt, die einen Replikationsbereich des PVX-Genoms ähnlich zu Linie 155 umfasst, wobei aber ein endogenes Pflanzengen, wie Phytoin-desaturase, anstelle des Hüllprotein-Gens vorliegt (anstelle des für GUS kodierenden Reportergens wie in Linie 155). Diese PVX-Phytoin-desaturase-Pflanze wird mit der transgenen rgs-CaM-Linie gekreuzt, die den rgs-CaM-Suppressor der Abschaltung exprimiert. Die Nachkommen zeigen eine Umkehr der PVX-Phytoin-desaturase-Abschaltung und eine verstärkte Expression des Phytoin-desaturase-Genprodukts im Vergleich zu Kontrollen.
Weitere endogene Pflanzengene lassen sich in ähnlicher Weise in erhöhten Konzentrationen durch dieses Verfahren exprimieren.
Beispiel 10
Das vorliegende Beispiel beschreibt ein beispielhaftes Verfahren zur Verstärkung der Expression eines endogenen Pflanzengens oder eines fremden Gens (oder eines Teils eines fremden oder endogenen Gens), das in eine Pflanze eingeführt worden ist, als ein Fusionsprodukt mit einem viralen Protein, das von einem viralen Vektor exprimiert worden ist. Ein viraler Vektor, der ein fremdes Gen oder eine endogene Pflanzensequenz in Form eines Fusionsprodukts mit dem Hüllprotein des Virus exprimiert, wie der von Sugiyama. Hamamoto, Takemoto, Watanabe, Okada, "Systematic Production of Foreign Peptides on the Particle Surface of Tobacco Mosaic Virus", FEBS Lett., Bd. 359 (1995), S. 247–250, beschriebene Vektor, ist ein derartiges Beispiel. Der virale Vektor kann zur Infektion eines transgenen Pflanzenwirts verwendet werden, der die Boostersequenz über eine Expression aus in stabiler Weise eingebauten DNA-Kopien dieser Boostersequenz liefert, z. B. die hier beschriebenen, transgenen rgs-CaM-Tabakpflanzen (Beispiel 2). Die Expression der fremden Peptide in Fusion mit dem viralen Hüllprotein wird im Vergleich zur Expression der fremden Peptide in Pflanzen, die die rgs-CaM-Boostersequenz nicht umfassen, verstärkt.
Weitere Genprodukt erzeugende Vektoren, denen die hier beschriebene Boostersequenz zugeführt werden kann, sind die von Hamamoto et al., Bio/Technology, Bd. 11 (1993), S. 930–932, und von Takamatsu et al., FEBS Lett., Bd. 269 (1990), S. 73–76, beschriebenen Vektoren.
Beispiel 11
Der Einfluss der rgs-CaM-Expression auf die transgeninduzierte Gen-Abschaltung wird ferner unter Verwendung einer weiteren transgenen Linie, die einen Phänotyp der Gen-Abschaltung aufweist, geprüft. In diesem Beispiel wird die abgeschaltete Linie (Linie 106-14) mit rgs-CaM-exprimierenden Linien oder Kontrollpflanzen gekreuzt und Pflanzen der F1-Generation werden sodann auf die Expression des vorher abgeschalteten Gens getestet.
Die transgene Linie 106-14 wurde in der NC State University konstruiert und enthält mehr als 100 Kopien des uidA-Gens unter der Kontrolle des Blumenkohl-Mosaikvirus-Promotors mit flankierenden Matrix-Haftungsregionen, von denen berichtet wird, dass sie die transkriptionale Gen-Abschaltung stören. Diese Pflanzen exprimieren GUS-Aktivität in sehr hohen Konzentrationen in Sämlingen und schalten dann im Lauf der Entwicklung ab, so dass ältere Pflanzen keine nachweisbaren Konzentrationen an GUS-Aktivität exprimieren und gegen PVX-GUS resistent sind. Die entwicklungsbedingte Abschaltung ist charakteristisch für die posttranskriptionale Abschaltung. Die Linie 106-14 wird mit einer rgs-CaM-exprimierenden Linie gekreuzt. Die Nachkommen sind gegen PVX-GUS empfindlich und exprimieren hohe Konzentrationen an GUS-Aktivität, selbst in reifen, blühenden Pflanzen. Im Gegensatz dazu erzeugen Nachkommen von Kontrollkreuzungen mit untransformierten Tabakpflanzen (cv xanthi) und nur mit Vektor transformierten Tabakpflanzen (cv havana 425) keine nachweisbare GUS-Aktivität in Blättern von reifen Pflanzen. Dieses Ergebnis ist ein weiteres Beispiel für die Fähigkeit der Boostersequenzzerstörung der Gen-Abschaltung und dadurch der verstärkten Expression eines Genprodukts aus einem Transgen.
Beispiel 12
Bei bestimmten Systemen ist es erstrebenswert, PTGS zu induzieren, um eine Expression von endogenen Genen zu verhindern und dadurch einen angestrebten Phänotyp in der Pflanze hervorzurufen. Es ist jedoch aus dem Stand der Technik bekannt, dass die Abschaltung nicht immer vollständig ist und die Expression der Zielsequenz, deren Abschaltung angestrebt wird, in einem verringerten, aber immer noch unerwünschten Ausmaß erfolgt. In anderen Fällen wird die Gen-Abschaltung umgekehrt, z. B. bei einigen Fällen einer viralen Infektion, wo festgestellt worden ist, dass das durch die viralen Pathogene erzeugte HC-Pro die Gen-Abschaltung in infizierten Pflanzen umkehrt. Vorteilhafterweise kann die rgs-CaM-Boostersequenz unter Anwendung bekannter Techniken, z. B. durch positionsgerichtete Mutagenese, synthetische Konstruktion von varianten Sequenzen oder durch Bal31-Exonuclease modifiziert werden, um Deletionen oder Mutationen der Sequenz hervorzurufen, so dass Polynucleotide erhalten werden, die für variante rgs-CaM-Peptide kodieren, bei denen die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit HC-Pro erhalten bleibt, die aber nicht die Störung unter Gen-Abschaltung vermitteln. Pflanzen, in die derartige Polynucleotide eingeführt und exprimiert worden sind, weisen stabilere PTGS selbst in der Phase einer viralen Infektion auf.
Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich eine erhöhte Expression von Zielsequenzen realisieren. Somit lassen sich Pflanzen, Pflanzenzellen und Pflanzengewebe mit verstärkter Erzeugung von Pflanzenproteinen, transgenen Proteinen und dergl. erzeugen. Da eine Cosuppression eine allgemeine Erscheinung in Pflanzen ist, finden die Verfahren eine breite Anwendbarkeit bei sämtlichen Pflanzen.
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Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Exprimieren eines fremden Gens oder eines endogenen Pflanzengens, das in Pflanzenzellen, Pflanzenprotoplasten oder vollständige Pflanzen eingeführt worden ist, wobei das Verfahren das Versorgen der Pflanzenzellen, Pflanzenprotoplasten oder vollständigen Pflanzen mit einer Boostersequenz umfasst, die ein Polynucleotid umfasst, das für ein rgs-CaM-Polypeptid kodiert, das die Fähigkeit aufweist, als Suppressor einer posttranskriptionalen Gen-Abschaltung zu wirken, wobei das Polynucleotid folgendes umfasst: (a) eine Nucleotidsequenz, die zumindest für ein Fragment des Polypeptids von SEQ ID NO: 2 kodiert; oder (b) eine Nucleotidsequenz mit einer mindestens 70%igen Identität zu SEQ ID NO: 1.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem eingeführten Gen um ein fremdes Gen handelt, das nicht natürlicherweise in den Pflanzenzellen, Pflanzenprotoplasten oder vollständigen Pflanzen auftritt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem eingeführten Gen um ein endogenes Pflanzengen handelt, das natürlicherweise in den Pflanzenzellen, Pflanzenprotoplasten oder vollständigen Pflanzen vorkommt, bevor eine oder mehrere zusätzliche Kopien des endogenen Gens eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Boostersequenz in unabhängiger Weise exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Boostersequenz mit anderen Sequenzen fusioniert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eingeführte Gen über einen viralen Expressionsvektor eingeführt wird und die Boostersequenz durch Expression aus dem gleichen viralen Vektor zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eingeführte Gen über einen viralen Expressionsvektor eingeführt wird und die Boostersequenz durch Expression von einer oder mehreren DNA-Kopien der Boostersequenz, die in stabiler Weise in das Pflanzengenom eingebaut ist, zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Boostersequenz aus einem vorübergehenden Expressionssystem exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, welches die Verwendung eines viralen Zweikomponenten-Vektorsystems umfasst, von dem eine virale Komponente die Boostersequenz exprimiert und die andere virale Komponente das eingeführte Gen exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eingeführte Gen in das Pflanzengenom über einen beliebigen Modus der stabilen Transformation von einer oder mehreren Kopien des eingeführten Gens eingeführt wird und die Boostersequenz vor der Einführung des eingeführten Gens über stabile Transformationsvorgänge zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eingeführte Gen in das Pflanzengenom über einen beliebigen Modus der stabilen Transformation von einer oder mehreren Kopien des eingeführten Gens in das Pflanzengenom eingeführt wird und die Boostersequenz während des Verfahrens der Einführung des eingeführten Gens über stabile Transformationsvorgänge zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eingeführte Gen in das Pflanzengenom über einen beliebigen Modus der stabilen Transformation von einer oder mehreren Kopien des eingeführten Gens in das Pflanzengenom eingeführt wird und die Boostersequenz nach Einführung des eingeführten Gens über stabile Transformationsvorgänge zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Boostersequenz eine Nucleotidsequenz umfasst, die für SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Boostersequenz SEQ ID NO: 1 umfasst.
Isoliertes Polynucleotid, kodierend für ein rgs-CaM-Polypeptid, das die Fähigkeit besitzt, als Suppressor einer posttranskriptionalen Genabschaltung zu wirken, wobei das Polynucleotid folgendes umfasst: (a) eine Nucleotidsequenz, die zumindest für ein Fragment des Polypeptids von SEQ ID NO: 2 kodiert; oder (b) eine Nucleotidsequenz mit einer mindestens 70%igen Identität zu SEQ ID NO: 1.
Polynucleotid nach Anspruch 15, das für SEQ ID NO: 2 kodiert.
Polynucleotid nach Anspruch 15, das SEQ ID NO: 1 umfasst.
rgs-CaM-Polypeptid, das die Fähigkeit besitzt, als Suppressor der posttranskriptionalen Genabschaltung zu wirken, wobei das Polynucleotid folgendes umfasst: (a) mindestens ein Fragment des Polypeptids von SEQ ID NO: 2; oder (b) eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nucleotidsequenz mit einer Identität von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 1 kodiert wird.
Polypeptid nach Anspruch 18, umfassend SEQ ID NO: 2.
Transformierte Pflanze, die nach dem Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 14 hergestellt worden ist und die die Boostersequenz umfasst.
Transformierter Samen der Pflanze nach Anspruch 20, der die Boostersequenz umfasst.
Transformierte Pflanzenzelle, die nach dem Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 14 hergestellt worden ist und die Boostersequenz umfasst.
Transformierte Pflanze, umfassend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 15 bis 17, das in stabiler Weise in das Genom der Pflanze eingebaut ist.
Transformierter Samen der Pflanze nach Anspruch 23, der das Polynucleotid umfasst, das in stabiler Weise in sein Genom eingebaut ist.
Transformierte Pflanzenzelle, die ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 15 bis 17 umfasst, das in stabiler Weise in ihr Genom eingebaut ist.