TWI530503B - 修飾的啟動子序列及其應用 - Google Patents

Description

修飾的啟動子序列及其應用

本發明係有關一種修飾的啟動子，及其應用，包括表現構築體，其包含用於表現感興趣之基因的啟動子，以及使用該表現構築體產製多胜肽的方法，具體而言是在植物表現系統。

已有越來越多基於植物的表現系統用於產製蛋白質，因其具多種優於習知的細菌或動物細胞表現系統的優勢。舉例而言，植物能以低成本大規模方式產製蛋白質，植物不含可造成最終蛋白質產物污染的動物病原體、以及植物細胞提供真核細胞的轉譯後加工，其可為蛋白質的正常生物功能所必需。目前已於植物中產製之重組型蛋白質的實例包括治療性蛋白如胰島素、干擾素、表皮生長因子、及免疫球蛋白、以及工業酵素，如木聚糖酶(xylanase)。

啟動子為一段可啟動基因轉錄的DNA序列。已有文獻描述多種於植物細胞中具活性的啟動子，包括花椰菜鑲嵌病毒(cauliflower mosaic virus；CaMV)35S啟動子、鴨拓草黃斑紋病毒(commelina yellow mottle virus)啟動子、水稻細胞溶質三碳糖磷酸異構酶(rice cytosolic triosephosphate isomerase；TPI)啟動子、水稻肌動蛋白1(actin 1；Act1)基因啟動子、泛素(uniquitin；Ubi)啟動子、水稻澱粉酶基因啟動子、阿 拉伯芥腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(adenine phosphoribosyltransferase；APRT)啟動子、甘露鹼合成酶(mannopine synthase)與章魚肉鹼合成酶(octopine synthase)啟動子。

此領域仍需具強大活性之修飾的啟動子，以達導入的基因之高水平表現，尤其是在植物細胞。

在一方面，本發明提供一種修飾的啟動子，其包含SEQ ID NO：1所示之序列。

在另一方面，本發明提供一種重組型構築體，其包含表現匣，其含有調節序列，係可操作地連接至編碼感興趣之多胜肽之核苷酸序列，其中調節序列包含具本文所述之SEQ ID NO：1所示序列之啟動子。

本發明亦提供一種轉形細胞，其包含本文所述之重組型構築體。

本發明進一步提供一種產製多胜肽的方法，其包含：(a)將以本文所述之重組型構築體轉形的細胞培養於可供表現該多胜肽之條件下；以及(b)自培養物回收該多胜肽。

在一特定具體實施例中，本發明之方法係於植物細胞中進行，並自轉形植物細胞之懸浮培養物(特別是自培養基)回收表現的多胜肽。在一實例中，植物細胞係來自水稻。

本發明之一或多個具體實施例之細節係說明如下。本發明之其他特徵或優點將因下列幾個具體實施例之詳述及所附之申請專利範圍而 更臻清楚。

為說明本發明，所列之圖式具體實施例係較佳之呈現。然而，應理解到，本發明並未侷限於所述之較佳具體實施例。在圖式中：圖1顯示經修飾的αAmy8啟動子，其含有G匣及重複TA匣，於轉基因水稻細胞及幼苗產生明顯較高螢光素酶活性。(A)用於αAmy8及αAmy8(+G+2TA)啟動子分析的構築體示意圖。(B)將攜帶αAmy8：：Luc基因或αAmy8(+G+2TA)：：Luc基因的T0轉形水稻懸浮細胞培養於含蔗糖(+蔗糖，空心長條)或無蔗糖(-蔗糖，實心長條)的MS液體培養基2天。收集細胞並測定螢光素酶活性。誤差線代表對於每個構築體的五個獨立轉形水稻細胞株之螢光素酶活性讀值的SE值。(C)使分別攜帶αAmy8：：Luc及αAmy8(+G+2TA)：：Luc嵌合基因之同型組合的轉基因株Amy8-16-6及Amy8(+G+2TA)-5-2的T2種子發芽及生長7天。每日從各轉基因株的10個發芽種子或幼苗，收集胚乳(實心長條)、胚(點狀長條)、莖(斜紋長條)、及根(空心長條)，各部位分別匯集，進行螢光素酶活性試驗。誤差線代表SE值。

圖2顯示水中轉基因水稻幼苗之αAmy8(+G+2TA)啟動子展現明顯較高的螢光素酶活性。使分別攜帶αAmy8：：Luc基因及αAmy8(+G+2TA)：：Luc基因之同型組合之轉基因株Amy8-16-6及Amy8(+G+2TA)-5-2的T2種子於空氣中(Air)或水中(Sub)發芽及生長達9天。(A)每日收集各轉基因株的10個供氧或缺氧處理的幼苗。(B)在第7天收集胚、胚乳、及芽鞘，進行螢光素酶活性試驗。(C)使轉基因株Amy8(+G+2TA)-5-2的T2種子於含(+)或不含(-)蔗糖之空氣中(缺氧，「-」)或水中(缺氧， 「+」)發芽及生長7天，測定螢光素酶活性。誤差線代表SE值。

圖3顯示H-EGF於水稻懸浮細胞中的表現。(A)用於水稻轉形的二元載體pA8(+G+2TA)-SP-H-EGF的示意圖。(B)T1轉基因細胞株H-EGF 43基因體DNA的PCR分析。(C)細胞株H-EGF 43的RT-PCR分析。以未轉形的水稻細胞作為野生型(WT)並以ddH₂O作為陰性對照組。(D)於轉形水稻細胞產生的重組型H-EGF的蛋白質凝膠墨點分析。在第2至6天，分別以抗HSA多株抗體及抗EGF抗體，檢測經糖飢餓處理之水稻細胞H-EGF 43所分泌的總培養基蛋白。最下方部分為藉由銀染SDS-PAGE凝膠，以顯示總培養基蛋白。箭號代表H-EGF的位置。

圖4顯示以抗EGF多株抗體進行的西方墨點法分析，顯示需氧(空氣)及缺氧(淹水)轉基因幼苗的H-EGF重組型蛋白質表現。P，以商用EGF作為陽性對照組；NT，非轉基因水稻株。箭號代表H-EGF的位置。箭頭代表EGF的位置。

圖5顯示自轉基因水稻細胞分泌的重組型H-EGF於哺乳類動物細胞株的生物活性試驗。(A)重組型H-EGF對於人類A549細胞EGF受體之磷酸化(p-EGFR)的影響。以類胰島素生長因子1作為陽性對照組(+)。以無任何處理(-)及水稻野生型非轉形細胞培養基(WT)作為陰性對照組。(B)重組型H-EGF對於HK-2細胞增生的影響。以無血清及非轉形水稻細胞作為原始對照組。以商用EGF(標記為EGF)作為陽性對照組。在第0、2、及4天計數細胞數目。(C)重組型H-EGF對於人骨髓神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y增生的影響。(D)重組型H-EGF對於大鼠肺臟上皮細胞株L2增生的影響。以商用EGF作為陽性對照組(+)，及以MS無糖培養基作為陰性對 照組(-)。誤差線代表以三重複進行的三次獨立實驗的SE值。

除非另有定義，本文所使用的技術性及科學性術語具有熟習本發明領域之技術人員所能共同理解的相同意義。若出現衝突，應依循本文件，包括其中之定義。

本文所使用的「一」及「一者」等詞是指該詞之語法對象的一者或一者以上(亦即，至少一者)。舉例而言，「一元件」是指一元件或一元件以上。

「聚核苷酸」或「核酸」等詞是指由核苷酸單元組成的聚合物。聚核苷酸包括天然存在的核酸，如去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid；「DNA」)及核糖核酸(ribonucleic acid；「RNA」)，以及核酸類似物，包括那些具非天然存在之核苷酸者。可利用如自動化DNA合成儀合成聚核苷酸。「核酸」乙詞典型而言是指大型聚核苷酸。應理解到，當以DNA序列(亦即，A、T、G、C)表示核苷酸序列時，其亦包括RNA序列(亦即，A、U、G、C)，其中以「U」代替「T」。「cDNA」乙詞是指互補於或相同於mRNA的DNA，不論是單股或雙股形式。

「互補」乙詞是指二個聚核苷酸的作用表面係拓樸上兼容或匹配在一起。因此，該二分子可描述成互補，此外，接觸面特性係彼此互補。若第一聚核苷酸的核苷酸序列相同於第二聚核苷酸之結合配偶體聚核苷酸的核苷酸序列，則第一聚核苷酸互補於第二聚核苷酸。因此，序列為5'-TATAC-3'的聚核苷酸互補於序列為5'-GTATA-3'的聚核苷酸。

「編碼」乙詞是指聚核苷酸(如基因、cDNA、或mRNA) 之核苷酸的特定序列的固有性質，可作為模板，於生物過程中合成其他具有特定之核苷酸(如rRNA、tRNA、及mRNA)序列或特定之胺基酸序列及由其產生之生物性質之聚合物及巨分子。因此，若一基因產生的mRNA於細胞或其他生物系統中經由轉錄及轉譯而產生蛋白質，表示該基因能編碼蛋白質。熟習本領域之技術人員應理解到，由於遺傳密碼的簡併性(degeneracy)，多種不同的聚核苷酸及核酸可編碼相同的多胜肽。亦應理解到，熟習本領域之技術人員可以常規技術進行核苷酸取代，不影響所述之聚核苷酸編碼的多胜肽序列，其反映任何特定宿主生物體之欲表現多胜肽的密碼子慣用情形。因此，除非另有指明，「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括所有彼此為簡併形式且編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列。編碼蛋白質及RNA的核苷酸序列可包括內含子。

「重組型構築體」乙詞是指具非天然地連接在一起的聚核苷酸或核酸。重組型構築體可以載體形式呈現。「載體」可含有表現匣，其包含指定的感興趣之核苷酸序列及可操作地連接的調節序列，因此可轉錄及任意地轉譯所指定的核苷酸序列。載體可用於表現指定的核苷酸序列(表現載體)或維持指定的核苷酸序列，供其複製、操縱或於不同位置間(例如，不同生物體間)轉移。針對上述目的，可將載體導入適用的宿主細胞。「重組型細胞」是指具導入重組型核酸的細胞。

本文所使用的「可操作地連接」乙詞可指聚核苷酸連接至表現控制序列，從而當適當分子(如轉錄因子)結合至表現控制序列時，可使聚核苷酸表現。

本文所使用的「調節序列」或「表現控制序列」等詞是指 DNA序列於特定宿主細胞中調節可操作地連接之核酸序列的表現。

載體之實例包括但不侷限於，質體、黏接質體(cosmids)、噬菌體、YACs、或PACs。就植物而言，較佳為用於農桿菌(Agrobacterium)媒介之DNA轉移的二元載體，其包括來自Ti質體之修飾的T區域，容許於大腸桿菌及農桿菌細胞兩者進行複製。二元載體之實例包括但不侷限於，pPZP及pCAMBIA系列。

典型地，載體上指定的核苷酸序列係可操作地連接至調節序列，因此當以載體導入宿主細胞時，指定的核苷酸序列可於調節序列控制下於宿主細胞內表現。調節序列可包含，例如但不限於，啟動子序列(如細胞巨大病毒(cytomegalovirus；CMV)啟動子、猿猴病毒40(simian virus 40；SV40)早期啟動子、T7啟動子、及酒精氧化酶基因(AOX1)啟動子、及特定適用於植物表現系統者，例如，玄參鑲嵌病毒(Figwort mosaic virus)35S啟動子、花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)35S啟動子、鴨拓草黃斑紋病毒啟動子、水稻細胞溶質三碳糖磷酸異構酶(TPI)啟動子、水稻肌動蛋白1(Act1)基因啟動子、水稻澱粉酶基因啟動子、阿拉伯芥腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(APRT)啟動子、甘露鹼合成酶與章魚肉鹼合成酶啟動子)、起始密碼子、複製起始序列、強化子(如泛素(Ubi)強化紫、豇豆鑲嵌病毒(Cowpea Mosaic Virus；CPMV)5'UTR、及色素體藍素3' UTR)、操作子序列、分泌訊息序列(如α-交配因子訊息及αAmy3訊息胜肽序列)及其他控制序列(如終止序列)。較佳地，載體可進一步包含用於後續篩選流程的標記序列(如抗生素抗性標記序列)。為蛋白質產製之目的，在載體中，可將指定之感興趣的核苷酸序列連接至上述調節序列以外的另一核苷酸序列， 如此可產生融合多胜肽，有利於後續純化流程。該融合多胜肽包括但不限於，組胺酸標籤(His-tag)融合的多胜肽及麩胱甘肽S轉移酶(GST)融合的多胜肽。

欲製備轉基因植物，本文所使用的表現載體較佳為攜帶一或多個篩選標記，以篩選轉形植物，如具抗生素(如濕黴素、安比西林、健他黴素、氯黴素、鏈黴素、康黴素、新黴素、遺傳黴素、及四環黴素)抗性的基因、URA3基因、具任何其他毒性化合物(如特定金屬離子或除草劑，如草銨膦或雙丙氨膦)抗性的基因。

本文所使用的「轉基因植物」或「轉基因株」等詞是指含有編碼基因(即轉基因)之重組型核苷酸序列的植物。可自重組型細胞生長轉基因植物。

在本領域中，有多種方式可用於建造穩定的轉基因植物。在本發明之一具體實施例中，轉基因植物的產生係藉由以包含編碼所欲蛋白質(如表皮生長因子；EGF)之聚核苷酸的重組型構築體之農桿菌細胞，使植物組織(例如，植物原生質體或子葉盤)轉形，並自轉形之植物組織產生全株植物。在另一具體實施例中，經由基因槍技術可將編碼所欲蛋白質之聚核苷酸導入植物，特別是當以重組型農桿菌細胞轉形植物之效果不佳時。

藉由重組型技術，表現系統可於宿主生物體內表現感興趣之蛋白質。本文所使用的編碼欲於宿主生物體內表現之感興趣蛋白質的基因，例如，存在於重組型構築體者，其可操作地連接至調節序列，可視為「外源性」基因，係因其未天然存在於指定之宿主基因體內，不論所編碼 的蛋白質本身對於宿主生物體而言可為內源性或異源性。在植物中，可將經設計之表現載體導入植物細胞，以表現感興趣之蛋白質。一般而言，轉形之植物細胞係培養於具篩選試劑(如抗生素)之適當培養基，可篩選存活於培養基之具適當篩選標記的轉形植物細胞，以進行植物再生。依據本領域之習知方法，一旦形成癒傷組織(callus)，可藉由使用適當的植物激素，促使枝芽(shoot)形成，並將枝芽轉移至生根培養基，以進行植物再生。植物可隨即用於建立重複世代，例如，藉由種子或使用無性生殖技術。本發明適用之植物細胞可取自種子、癒傷組織、花、根、莖、葉、及細胞懸浮培養液。依據本發明，表現系統較佳為應用於較高等植物，如水稻、玉米、大麥、馬鈴薯、蕃茄、棉花、甜菜、及胡蘿蔔。

「多胜肽」乙詞是指由胺基酸殘基組成的聚合物，其經由胜肽鍵連接。典型地，「蛋白質」乙詞是指比較大的多胜肽。典型地，「胜肽」乙詞是指比較短的多胜肽。

本文所述之多胜肽之胺基酸序列可包括其生物等同物，意指與蛋白質之活性或功能不相關之分子的特定部分可進行有限數量的變化或修飾，並仍能產生實質上相同程度之生物活性的分子。因此，生物學上等效的多胜肽於此定義為特定胺基酸殘基可經取代的多胜肽。依據本發明，可製造及使用具不同取代的多胜肽。可進行此類多胜肽結構的修飾及改變，並仍能取得具類似或所欲特徵之分子。舉例而言，可以其他胺基酸取代胜肽/多胜肽結構之特定胺基酸而不會明顯損失其活性。一般而言，胺基酸取代係基於胺基酸側鏈取代基之相對相似度，例如其疏水性、親水性、電荷、大小、及其類似物。舉例而言，精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、及 組胺酸(His)皆為帶正電荷殘基；且丙胺酸(Ala)、甘胺酸(Gly)、及絲胺酸(Ser)皆具類似大小。因此，基於這些考量，精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、及組胺酸(His)；以及丙胺酸(Ala)、甘胺酸(Gly)、及絲胺酸(Ser)可定義為生物學上功能性等同物。吾人可易於設計及製備重組型基因，以進行具等效胺基酸殘基之多胜肽的微生物表現。

在本發明中，非可預期地發現，一種全新設計的啟動子序列，其係藉由於GC匣附近專一性插入一G匣及重複TA匣以修飾習知的αAmy8啟動子而達成，其具SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列，可產生明顯強化的啟動子活性，並可用於發展更具生產效率的蛋白質表現系統。

因此，在一方面，本發明提供修飾的啟動子，其包含SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列。

在另一方面，本發明提供一種重組型構築體，包含表現匣，其含有調節序列、可操作地連接至編碼多胜肽的核苷酸序列，其中調節序列包含啟動子，其具本文所述之SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列。

在一些具體實施例中，調節序列可進一步包含強化子以增加轉錄效力。在特定實例中，強化子為泛素(Ubi)內含子序列，其具SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列。

在一些具體實施例中，調節序列可進一步包含訊息胜肽序列，以確保重組型蛋白質之分泌。在特定實例中，訊息胜肽序列係衍生自αAmy3，其具SEQ ID NO：3所示之核苷酸序列。

在一些具體實施例中，調節序列包含SEQ ID NO：1之啟動子、SEQ ID NO：2之Ubi內含子序列、及SEQ ID NO：3之訊息胜肽序列。在 特定實例中，調節序列包含SEQ ID NO：4之核苷酸序列(啟動子及Ubi加上SP)。

依據本發明，含有SEQ ID NO：1啟動子序列之調節序列係可操作地連接至編碼感興趣之多胜肽之核苷酸序列，以形成表現匣，其可包括於表現載體中。表現載體可含有其他元件(elements)，例如，篩選標記及終止子。適合將本發明聚核苷酸導入植物細胞的載體包括Ti質體、根誘導(root-inducing；Ri)質體、及植物病毒載體。適用載體之實例包括但不限於，二元載體，如pPZP及pCAMBIA系列。熟習本領域之技術人員可選擇適合將本發明聚核苷酸導入植物的載體。

在一些具體實施例中，欲於本文所述之表現系統表現的感興趣的多胜肽可為治療性蛋白質，例如，表皮生長因子(EGF)。在特定具體實施例中，EGF係源自人類，其具SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列。較佳地，EGF為融合至人類血清白蛋白(human serum albumin；HSA，SEQ ID NO：6)，以改進穩定性。在特定實例中，編碼EGF與HSA之融合多胜肽(即H-EGF)的核苷酸序列，其具SEQ ID NO：7所示之核苷酸序列，係可操作地連接至調節序列，其包含本文所述之SEQ ID NO：1序列所示之啟動子，以形成表現匣。表現匣可包括於適當載體以形成重組型構築體。

可以本領域習知之方法將重組型構築體導入細胞。因此，本發明提供一種以本發明之構築體轉形的重組型細胞。可藉由於適當條件下培養重組型構築體轉形之重組型細胞，並以本領域習知之方法進行純化以製備感興趣的蛋白質。

據此，本發明提供一種產製多胜肽的方法，其包含(a)培 養以本文所述之重組型構築體轉形的細胞及(b)自培養物回收多胜肽。可藉由本領域習知之方法(如西方墨點法)監測或確認重組型蛋白質於轉形細胞內之表現。

在特定具體實施例中，本發明之方法係應用於植物細胞。特定而言，本發明之轉形植物細胞係用於轉基因植物的再生。可將再生的植物移至土壤環境並以常規方式培養。較佳地，選擇包含本發明之穩定表現匣及可視需要大於一複製數之導入的編碼感興趣的蛋白質之核苷酸序列的穩定株，因此可達到蛋白質的高水平表現。可視需要地考慮育種方式，如此可藉由例如控制回交(backcrossing)方式取得具所欲感興趣的蛋白質之編碼序列的其他植物品系或品種。可產生含有包括於本發明之表現匣之感興趣的蛋白質之編碼序列的親代株及源自親代株的所有後代植物。本發明提供所有的植物部件，如種子，其含有包括於本發明之表現匣之感興趣的蛋白質的編碼序列，從而可生長此類植物部件並產生後續組織培養物，如癒傷組織、原生質體、幼苗、或細胞懸浮液，其可用於蛋白質表現或可生長回植株。

在本發明之具體實施例中，產生懸浮培養物並自懸浮培養物(較佳為自培養基)收集表現之蛋白質。亦可藉著經由細胞溶裂之蛋白質萃取方式，自植物部件(如幼苗)收集表現之蛋白質。

在本發明之具體實施例中，將植物細胞培養於缺氧缺糖條件(如水中)。缺糖條件可指糖(如蔗糖)濃度為零的條件或實質上低於正常的條件，例如正常含糖培養基中的糖濃度(10-30g/L)之50%、40%、30%、20%、或10%。缺氧條件可指移除氧氣供應，其中氧氣濃度為零或實質上低 於正常條件，例如，大氣中的氧濃度(20%)之50%、40%、30%、20%、或10%，例如，於水中。

本發明進一步以下列實施例說明，其提供之用意在於闡述而非侷限。

實施例

1. 材料及方法

1.1 植物材料

在本研究中，用於基因轉形的水稻品種為台農水稻67號(Oryza sativa L.cv.Tainung 67)。將未成熟種子去殼，以3%次氯酸鈉滅菌30分鐘，以無菌水徹底清洗，然後置於N6D瓊脂培養基上(Toki S(1997).Plant Mol Biol Rep 5：16-21)，以誘導癒傷組織。在培養一個月之後，將衍生自子葉盤(scutellum)的癒傷組織繼代培養於新鮮N6D培養基，以進行轉形作用。

1.2 質體

質體p8SRC/GARC-4(pαAmy8SRC/GARC-Luc)含有αAmy8 SRC/GARC(-318至-89)，其融合至CaMV35S最小啟動子(自轉錄起始位置之-46 bp處)，上游Adh1內含子，Luc編碼序列以及胭脂鹼合成酶基因(nopaline synthase gene；Nos)終止子(Chen et al.(2006).Plant Cell 18(9)：2326-2340)。質體pUG含有β-葡萄醣醛酸酶(GUS)cDNA，其介於玉蜀黍Ubi啟動子與Nos終止子之間(Christensen and Quail(1996).Transgenic Res 5(3)：213-218)。質體pAHC18含有Ubi啟動子及Luc cDNA(Bruce et al.(1989).Proc Natl Acad Sci USA 86(24)：9692-9696)。質體 p35mA-Luc含有CaMV35S最小啟動子及Luc cDNA(Lu et al.(1998)J Biol Chem 273(17)：10120-10131)。

1.3 質體構築

使用基於PCR的寡核苷酸導向式突變法，於SRC/GARC修飾同側作用因子(cis-acting elements)(Picard et al.(1994).Nucleic acids research 22(13)：2587-2591)。

1.4 水稻轉形作用

依據製造商之指示，以MicroPulser電穿孔機(Bio-Rad)將質體pA8(+G+2TA)導入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA101(Hood et al.(1986).J Bacteriol 168(3)：1291-1301)。以先前所述方式進行水稻轉形(Chen et al.(2002).J Biol Chem 277(16)：13641-13649)。於含有50mg/L濕黴素的N6培養基上篩選轉形的水稻癒傷組織。

1.5 水稻胚暫時表現試驗

將水稻種子滅菌並於28℃下培養於含有2μg/ml 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的液體MS培養基。在培養8天之後，將胚剖開，接著將子葉盤朝上放置於以0.3%(w/v)植物凝膠(Phytagel)(Sigma)凝固的相同培養基上。在暫時表現分析中，以過去描述的方式進行水稻胚粒子轟擊(Umemura et al.(1998)Planta 204(4)：420-428)。在28℃下，將轟擊的水稻胚培養於含有100mM葡萄糖或甘露醇的液體MS培養基中24小時。在各次獨立實驗中，使用8個胚，並進行三次重複。測定螢光素酶及GUS活性，並以內部對照組(Ubi：：GUS)進行數據標準化，如過去描述的方式進行(Chen et al.(2006)，如前述)。

1.6 螢光素酶及GUS活性分析

以CCLR緩衝液(100mM KH₂(PO₄)，pH 7.8、1mM EDTA、10%甘油、1% Triton X-100、7mM β-巰乙醇)，從轟擊的水稻胚、各組織、或培養的懸浮細胞萃取總細胞蛋白質，並以考馬思亮藍(Coomassie Brilliant Blue)R 250蛋白質分析試劑(Pierce)測定蛋白質濃度。以過去描述的方式進行螢光素酶及GUS活性試驗(Lu et al.(1998)，同前)。

1.7 懸浮細胞培養

以過去描述的方式繁殖轉形的癒傷組織(Yu et al.(1991)J Biol Chem 266(31)：21131-21137)。以過去描述的方式將產生的懸浮細胞繼代培養(Lu et al.(1998)J Biol Chem 273(17)：10120-10131)。以切除法將米粒的含胚部位移除，且所得的米粒以1% NaOCl及一滴Tween 20滅菌約60min，接著以無菌水澆灌三次，每次約20min。以子葉盤側朝上將米粒放置於瓊脂培養基上，並於24小時照明下培養於28℃三週。將所得的癒傷組織移至置於125ml燒瓶之液體培養基。在24小時照明下，將懸浮培養物震盪(100rpm)培養於28℃。

1.8 空氣中或在淹水條件下的種子發芽或幼苗生長

以3% NaOCl將水稻種子滅菌，並以無菌去離子水清洗。針對空氣中發芽，將種子置於1%(w/v)凝固瓊膠水試管。針對水中，將種子置於試管，如同空氣發芽實驗，並將試管置於裝填45cm高壓滅菌水的2L量筒底部。隨後，於指定時間點之28℃閉光下，使種子於去離子水中發芽。自10個水稻幼苗收集需氧及缺氧組織，將樣本匯集並進行螢光素酶活性試 驗或西方墨點分析。在水中長苗方面，種子係發芽及生長於含3%蔗糖的1/2 MS培養基試管中達7天，其條件為28℃下進行14小時光照(7000 lux)/10小時閉光之週期。將7天大的幼苗培養於含或不含3%蔗糖的1/2 MS培養基，在空氣中或在淹水條件下，28℃閉光7天。收集需氧及缺氧幼苗並進行螢光素酶活性試驗。在處理期間，量筒內的水不進行循環或更換。以溶氧測定儀(Model EcoScan DO6,Eutech Instruments Pte.Ltd.)測定量筒內的水中氧濃度。在淹水條件處理下，7天後的水中氧濃度降至<0.03mol m^-3。

1.9 蛋白質凝膠墨點試驗

以CCLR緩衝液，從經培養的水稻懸浮細胞、需氧及缺氧水稻幼苗萃取總細胞蛋白質。以過去描述的蛋白質凝膠墨點分析法(Lu et al.(2007)Plant Cell 19(8)：2484-2499.doi：tpc.105.037887)分析轉基因水稻細胞及幼苗的重組型hEGF表現，其中總可溶性蛋白質係於16% Tris-tricine SDS-PAGE進行電泳，並將凝膠電墨染至0.2μm硝化纖維素膜。以抗HSA多株抗體(1：1000，Abcam)或抗hEGF單株抗體(1：500，R&D Systems)檢測hEGF融合蛋白。

1.10 細胞增生試驗

以描述於Sarkozi et al.(2007)J Cell Physiol 211(1)：88-100的人類腎臟-2(HK-2)細胞增生試驗，分析轉基因水稻細胞及幼苗所產生的重組型hEGF的生物活性。將HK-2細胞生長於含5ng/ml商用EGF的角質細胞無血清培養基K-SFM(Gibco BRL)並培養於37℃的5% CO₂加濕培養箱。每隔2或3天以1：3的比例進行細胞繼代培養。在測定細胞增生方面，以PBS仔細清洗HK-2細胞三次並再次懸浮於無血清之K-SFM中。接著，將細胞培 養於6孔培養盤(Falcon)，其濃度為每孔每毫升無血清K-SFM中1x10⁵個細胞。在37℃下培養48小時之後，更換培養基，並於第0及2天以取自水稻品種TNG67(非轉形水稻細胞)或H-EGF水稻細胞株(含有5ng/ml H-EGF蛋白)懸浮細胞的150ng/ml總水稻分泌蛋白、或5ng/ml商用EGF刺激HK-2細胞。在第0、2、及4天以胰蛋白酶將三重複培養孔中的細胞脫附、以0.2%台盼藍染色、及以血球計計數細胞三次。人骨髓神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y及大鼠肺臟上皮細胞株L2亦進行相同處理。

2. 結果

2.1 本發明修飾的αAmy8啟動子的構築

針對攜帶著修飾的αAmy8 SRS/GARS的質體之構築，其係在αAmy8啟動子具有G匣及重複TA匣，以HindIII及NcoI自pAG8(Chan et al.,(1993)Plant Mol Biol 22：491-506.)切除αAmy8之5’-側翼區(-1060至+127)並將限制片段次選殖至p35mA-Luc，以產生pαAmy8-Luc。以前述二階段PCR複製αAmy8的TA匣，其係分別以2TAF(5’-CCTTATCCATATCCACGCGCCCCGGGAATTGCAACAGC-3’(SEQ ID NO：9))及Luc1(5’-TCCAGCGGTTCCATCCTC-3’(SEQ ID NO：10))引子作為正向及反向引子，並以pαAmy8-Luc作為第一次PCR的DNA模板。以PCR產物作為第二次PCR的反向巨引子(megaprimer)，並以T3引子作為正向引子。接著，將含有重複TA匣的αAmy8啟動子的PCR片段次選殖至p35mA-Luc之HindIII與NcoI之間，產生pαAmy8(+2TA)-Luc。以PCR修飾αAmy8啟動子的G匣及重複TA匣，其分別以GboxF1(5’-GTGAGTCGACCTACGTGGCAAGTAGCTGCACGGC-3’(SEQ ID NO： 11))及Luc1引子作為正向及反向引子，並於第一次PCR時以pαAmy8(+2TA)-Luc作為DNA模板。接著，以PCR產物作為第二次PCR的反向巨引子，並以T3引子作為正向引子及，以pαAmy8(+2TA)-Luc作為DNA模板。接著，將含有αAmy8啟動子的G匣及重複TA匣的DNA片段次選殖至p35mA-Luc之HindIII與NcoI位置處，產生pαAmy8(+G+2TA)-Luc。請見圖1(A)下方部分。以DNA定序法確認經基因工程之本發明具SEQ ID NO：1核苷酸序列之啟動子(pαAmy8(+G+2TA)。

2.2 啟動子活性試驗

本發明的1-kb αAmy8啟動子，亦即pαAmy8(+G+2TA)，含G匣及重複TA匣，係於上游融合螢光素酶基因，以產生αAmy8(+G+2TA)：：Luc(圖1A)。將嵌合基因導入水稻基因體，並隨機篩選及培養各構築體產生的五個獨立轉形細胞株以成為懸浮細胞。進行螢光素酶活性試驗，結果顯示相較於野生型αAmy8啟動子，αAmy8(+G+2TA)啟動子於存在及不存在蔗糖下分別產生多達10及5倍高的螢光素酶活性(圖1B)。在轉基因幼苗之各組織中，αAmy8(+G+2TA)啟動子於第5至6天亦產生高於野生型αAmy8啟動子約4倍的螢光素酶活性(圖1C)。結果證實，本發明之αAmy8啟動子可應用於植物表現系統，以進行外來蛋白質的高水平表現。

2.3 αAmy8(+G+2TA)啟動子於轉基因水稻幼苗在水中條件下具顯著較高的螢光素酶活性

接著，測定缺氧下G匣及重複TA匣對於提升αAmy8啟動子活性的功效。野生型αAmy8及αAmy8(+G+2TA)的啟動子活性皆於發芽後6至7天最高，但αAmy8(+G+2TA)啟動子於缺氧下產生的絕對活性及誘導 能力明顯高於野生型啟動子(圖2A)。在缺氧下，αAmy8(+G+2TA)啟動子的誘導倍數於胚、胚乳、及芽鞘皆類似，而其絕對活性於胚乳顯著較高(圖2B)。不論是否幼苗以蔗糖培養或不以蔗糖培養，αAmy8(+G+2TA)啟動子均產生高的缺氧誘發性活性(圖2C)。總之，這些結果證實，G匣及重複TA匣於所有的水稻組織皆明顯提升αAmy8啟動子活性，特別是在缺糖及缺氧下。

2.4 αAmy8(+G+2TA)啟動子於水稻之EGF重組型蛋白質表現之應用

欲確定是否修飾的αAmy8可於水稻中導引外來人類蛋白質的高水平累積，本實驗製備包含可操作地連接至αAmy8(+G+2TA)啟動子下游的重組型人類表皮生長因子(EGF)基因、ubi內含子1、及αAmy3之訊息胜肽的表現構築體，並導入水稻細胞以進行表現。結果顯示，於轉形的水稻懸浮細胞檢測出EGF蛋白(數據未顯示)。

此外，欲改進重組型EGF蛋白的穩定性，將人類血清白蛋白(HSA)融合至EGF之N端，以形成重組型HSA-EGF(稱作H-EGF)。將含有αAmy8(+G2TA)啟動子(SEQ ID NO：1)融合至玉蜀黍泛素基因(SEQ ID NO：2)的內含子1、αAmy3基因(SEQ ID NO：3)的訊息胜肽序列、與EGF融合的HSA(SEQ ID NO：7)、以及胭脂鹼合成酶基因的3’終止子區(終止子)的表現匣，構築至農桿菌二元載體，以進行轉基因水稻轉形(圖3A)。所得的重組型構築體經確認具表現匣，其包含SEQ ID NO：8(pαAmy8(+G+2TA)+Ubi(內含子)+SP+H-EGF)之核苷酸序列，包括SEQ ID NO：4所示之調節序列(pαAmy8(+G+2TA)+Ubi(內含子)+SP)。取得數個 轉基因水稻細胞株，並建立懸浮培養細胞。自3毫升的T1水稻懸浮細胞株H-EGF 43萃取基因體DNA、總RNA，其中基因體DNA係於缺糖3天後取得(圖3B)，以及總RNA係用於cDNA合成(圖3C)。兩種PCR反應皆使用HSA及肌動蛋白引子組，包括HSA正向(GGGCATGTTTTTGTATGAAT，SEQ ID NO：12)、HSA反向(TTATAAGCCTAAGGCAGCTT，SEQ ID NO：13)、肌動蛋白正向(CTGATGGACAGGTTATCACC，SEQ ID NO：14)、肌動蛋白反向(CAGGTAGCAATAGGTATTACAG，SEQ ID NO：15)。於此顯示，一轉形之T1細胞株H-EGF 43含有重組型HSA DNA片段(圖3B)及cDNA(圖3C)。接著，將此水稻懸浮培養細胞株H-EGF 43培養於缺乏蔗糖的培養基中2至6天，並收集細胞培養基樣本。藉由以抗EGF單株抗體及抗HSA多株抗體進行的西方墨點分析，結果證實，H-EGF蛋白穩定存在於水稻懸浮細胞培養基中(圖3D)。因此，藉由使用本發明之表現系統，可自培養基收取重組型EGF蛋白，其省去經由細胞溶解而進行蛋白質萃取的需求。

此外，欲確定是否αAmy8(+G+2TA)啟動子可於水稻幼苗中導引H-EGF的高水平累積，本試驗將攜帶aAmy8(+G+2TA)：：H-EGF基因之轉基因株H-EGF 9、36、37、及43的T1種子發芽並於空氣中或水中(淹水)生長7天；收集需氧及缺氧水稻幼苗並萃取總可溶性蛋白質。結果顯示，於本發明之αAmy8(+G+2TA)啟動子的控制下，空氣中及淹水條件下生長的轉基因幼苗皆檢測到H-EGF融合蛋白(圖4)。結果證實，本發明使用αAmy8(+G+2TA)啟動子的表現系統可作用於幼苗，並可藉由萃取方式自幼苗收取表現的感興趣蛋白質。

2.5 EGF生物活性試驗

EGF受體(EGF receptor；EGFR)與其配體的結合造成EGFR自磷酸化，以及後續涉及調節細胞增生的訊息傳導路徑活化。欲確定是否分泌至水稻細胞培養基的重組型H-EGF蛋白保留其生物性質，本試驗檢測EGFR於人類肺腺癌基底上皮細胞(adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells)A549的磷酸化作用。將A549細胞於37℃、5% CO₂之條件下培養於75-cm²培養瓶，其培養基為補充10%胎牛血清及100單位/mL健他黴素的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/F12培養基。在A549細胞達到1 x 10⁶的濃度之後，使細胞飢餓24小時，並以取自水稻品種TNG67(WT)及含H-EGF之轉形水稻細胞株的培養基蛋白質刺激10分鐘。以200ng/ml的類胰島素生長因子1作為陽性對照組(+)，並以無任何處理者作為陰性對照組(-)。結果顯示，自轉基因水稻細胞株H-EGF-43分泌的H-EGF可誘導EGFR自磷酸化，如同類胰島素生長因子1，其為EGFR配體蛋白(圖5A)，表示本發明轉基因水稻細胞產生的H-EGF保有活化EGFR的活性。

接著，進行HK-2細胞增生試驗(Sarkozi et al.(2007)J Cell Physiol 211(1)：88-100)。生長促進因子如EGF(Haussler et al.(2005)Am J Physiol Renal Physiol 289(4)：F808-815.doi：00434.2003；Sarkozi et al.(2007)，如前述)可誘導HK-2細胞增生，HK-2細胞為源自正常成人腎臟的永生近端小管細胞株(Ryan et al.(1994)Kidney Int 45：48-57)。將HK-2細胞培養於缺乏生長因子的無血清培養基中48h，接著以生長因子額外處理2及4天，並測定細胞數目。當HK-2細胞經血清與生長因子飢餓處理，隨後補充150ng/ml細胞株的總水稻細胞培養基蛋白(5ng H-EGF)時，造成了細胞增生增加2.9倍，其類似於以5ng/ml商用EGF誘導的結果(圖5B)。對 SH-SY5Y細胞進行相同處理，該細胞係源自人類骨髓神經母細胞瘤細胞，結果顯示H-EGF與商用EGF間之細胞增生無差異(圖5C)。大鼠肺臟上皮細胞株L2亦顯示相同結果，即自本發明之水稻懸浮培養細胞分泌的重組型H-EGF具有相當於商用EGF的生物活性(圖5D)。

總結，我們建立了αAmy8(+G+2TA)啟動子，其具強大活性，供水稻細胞及發芽幼苗中進行重組型蛋白質的高水平表現。我們亦構築一編碼EGF融合蛋白之核苷酸序列，於αAmy8(+G+2TA)啟動子控制下可操作地連接至訊息胜肽序列，在水稻懸浮細胞建立EGF表現系統，其中生物活性重組型EGF融合蛋白可穩定表現並分泌至培養基，免除經由細胞裂解以進行蛋白質萃取的需要，提供生產EGF的經濟且有效方法。

一般相信，熟習本領域之技術人員應能基於本發明之陳述最大範疇實踐本發明而無需進一步說明。因此，應理解到，本文所提供之說明及申請專利範圍僅用於陳述而不以任何方式侷限本發明之範疇。

序列資訊

SEQ ID NO：1(pαAmy8(+G+2TA))

SEQ ID NO：2(Ubi(內含子))

SEQ ID NO：3(SP)

SEQ ID NO：4(pαAmy8(+G+2TA)+Ubi+SP)

SEQ ID NO：5(EGF)

SEQ ID NO：6(HSA)

SEQ ID NO：7(H-EGF)

SEQ ID NO：8(pαAmy8(+G+2TA)+Ubi(內含子)+SP+HSA-EGF)

<110> 元智大學

<120> 修飾的啟動子序列及其應用

<130> YZ0001TW

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1174

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啟動子

<400> 1

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 2

<210> 3

<211> 96

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 3

<210> 4

<211> 2337

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啟動子+Ubi+SP

<400> 4

<210> 5

<211> 53

<212> PRT

<213> 人類

<400> 5

<210> 6

<211> 585

<212> PRT

<213> 人類

<400> 6

<210> 7

<211> 1932

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H-EGF融合序列

<400> 7

<210> 8

<211> 4269

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 啟動子+Ubi+SP+H-EGF

<400> 8

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2TAF引子

<400> 9

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Luc1引子

<400> 10

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GboxF1引子

<400> 11

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HSA正向引子

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HSA反向引子

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肌動蛋白正向引子

<400> 14

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肌動蛋白反向引子

<400> 15

Claims (16)

1. 一種基因工程之啟動子，其係由SEQ ID NO：1所示之序列所組成。
2. 一種重組型構築體，包含表現匣，其含有調節序列，係可操作地連接至編碼多胜肽的核苷酸序列，其中該調節序列包含請求項1之啟動子。
3. 如請求項2之重組型構築體，其中該調節序列進一步包含泛素(Ubi)內含子序列。
4. 如請求項3之重組型構築體，其中該Ubi內含子序列具SEQ ID NO：2之序列。
5. 如請求項2之重組型構築體，其中該調節序列進一步包含訊息胜肽序列。
6. 如請求項5之重組型構築體，其中該訊息胜肽序列具SEQ ID NO：3之序列。
7. 如請求項2之重組型構築體，其中該調節序列具SEQ ID NO：4之序列。
8. 如請求項2之重組型構築體，其中該核苷酸序列編碼表皮生長因子(epidermal growth factor；EGF)。
9. 如請求項8之重組型構築體，其中該核苷酸序列編碼融合多胜肽，該融合多胜肽包含EGF，其融合至人類血清白蛋白(human serum albumin，HSA)。
10. 如請求項9之重組型構築體，其中編碼該融合多胜肽之核苷酸序列具SEQ ID NO：7之序列。
11. 如請求項2之重組型構築體，其中該表現匣具SEQ ID NO：8之序列。
12. 一種植物轉形細胞，其包含請求項2至11中任一項之重組型構築體。
13. 一種用於產生外來多胜肽的方法，其包含：(a)將以請求項2至11中任一項之重組型構築體轉形的植物細胞培養於可供表現該多胜肽之條件下；以及(b)自培養物回收該多胜肽。
14. 如請求項13之方法，其中於步驟(a)中，培養該植物細胞並取得懸浮培養物，且於步驟(b)中，自該懸浮培養物回收該多胜肽。
15. 如請求項13之方法，其中於步驟(a)中，該植物細胞係培養於缺糖條件下。
16. 如請求項14之方法，其中於步驟(b)中，過濾該懸浮培養物以及收集培養液，以回收該多胜肽。