CN1876807A - 一种抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌及Bt杀蝗剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis BTH－13，CCTCC NO：M206061。制备杀虫剂的步骤是：首先是摇瓶发酵，在100单位体积的培养基中，按比例加入淀粉、豆饼粉、棉饼子粉、蛋白胨、酵母粉、玉米浆、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钙、及α－淀粉酶，补充水；其次是在三角瓶中装100ml培养基，灭菌后接种BTH－13，在一定温度培养至芽孢脱落；第三是采用筛选出来的培养基，在全自动发酵罐中进行发酵，发酵结束后发酵液酸化，加入乳化剂，酵液浓缩后直接喷雾干燥制备可湿性粉剂。本发明的特点是特异性强，不杀伤昆虫天敌，对人畜无毒，不污染环境，增加农作物产量，具有良好的应用前景。

Description

一种抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌及Bt杀蝗剂的制备方法

                    技术领域

本发明涉及一种抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌，同时还涉及杀蝗剂的制备方法。该株抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌对直翅目的东亚飞蝗等有活性毒性，其活性物质为杀虫晶体蛋白质。用该菌株制备的杀蝗剂可用于直翅目害虫如蝗虫等的防治，杀虫晶体蛋白质基因可用于高效工程菌的构建和抗虫转基因植物的研究。

                    背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)由于具有杀虫效果好，特异性强，生产和使用方便，不污染环境等特点而在害虫生物防治中发挥了重要作用。不同的Bt菌株产生不同的杀虫晶体蛋白质(Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs)，使得菌株间的杀虫谱和杀虫活性存在明显差异。现已报道，苏云金芽孢杆菌对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等9个目的昆虫和螨类、植物线虫、原生动物、扁形动物等有特异性杀虫活性。目前，筛选高效特异性Bt菌株，发掘新的ICP基因，对菌株进行遗传改良或构建高效广谱基因工程菌是世界性的课题，也是Bt研究的发展趋势，据报道，全世界已分离出了71个H血清型86个亚种的数万株苏云金芽孢杆菌，从分离的菌株中筛选出了多株对鳞翅目和鞘翅目等害虫有毒效的菌株。在苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定、筛选方面，文献“土壤来源的苏云金芽孢杆菌的形态、δ-内毒素蛋白质及其毒力特性(微生物学报，1992，32(6)：387-393)”、“从土壤分离的410株苏云金芽孢杆菌的鉴定(华中农业大学学报，1994，第二期)、“我国南北方土壤中苏云金芽孢杆菌的分布及杀虫特性”(微生物学报，1996，36(4)；295-302)、及“土壤来源的五个苏云金芽孢杆菌新亚种的鉴定(微生物学报，1999，39(2)：154-159)等对我国苏云金芽孢杆菌的分离、鉴定、分布特点、晶体蛋白质形态、杀虫特性等进行了研究。在高效、特异性菌株的筛选方面，文献“对斜纹夜蛾高毒力的Bt新分离株及其特性的研究(微生物学通报，1997，24(5)：262-265)”、“对夜蛾幼虫高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株及其晶体蛋白质特征(中国生物防治，1997，13(2)82-85)”、及“苏云金芽孢杆菌对甜菜夜蛾毒性的筛选(中国病毒学，2000，Vol.15：98-101)、“一株广谱苏云金芽孢杆菌及其发酵条件的研究”(华中农业大学学报，2003，22：(5)462-465)”等分别从众多的苏云金芽孢杆菌菌株中筛选到了杀鳞翅目夜蛾科害虫的高效特异性菌株；文献“苏云金芽孢杆菌抗东亚飞蝗(Locust migratoria manilensis)的活性”(应用与环境生物学报，2005，11(5)：592-594)报道了苏云金芽孢杆菌抗蝗虫的活性。在杀虫基因克隆方面，自1981年第一个杀虫晶体蛋白质基因被克隆以来，目前全世界内已克隆了50类300多个苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白质Cry基因和两类Cyt基因

( http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt)。文献“抗鞘翅目δ-内毒素及毒素基因文库的构建(生物工程学报，1994，10(2)：103-108)”、“苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因的启动子及其转录调控(微生物学通报，1999，26(2)：130-134)”、“苏云金芽孢杆菌高效菌株cry基因分析及多价基因组合的研究(南开大学学报，1999，32(3)：163-168)”等分别建立了抗鞘翅目δ-内毒素的基因文库、克隆了杀鳞翅目害虫的基因，对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因的表达与调控进行了阐述。文献“广谱重组Bt菌的构建及基因的高效表达”(《微生物农药及其产业化》，喻子牛主编，科学出版社，2000，55-61)用电击转化方法将杀鳞翅目害虫的晶体蛋白质基因crylAc转入杀鞘翅目害虫的Bt菌株中，获得了广谱杀鳞翅目和鞘翅目害虫的Bt工程菌；“杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建”(生物工程学报，-1999，15(2)：215-220)以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pHB201和pRP22为载体，通过感受态转化方法，将苏云金芽孢杆菌HD-1杀虫蛋白质基因crylAc导入水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916。工程菌株质粒酶切电泳分析，核酸印记(Southern)分析和杀虫生物活性测定结果证实了crylAc基因的导入及其在B916中的有效表达。抑菌测定证明了工程菌保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。在杀虫剂的研制方面，文献“杀鞘翅目苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫剂的研究”(微生物学报，1999.12，Vol.39(6)：515-520)及“广谱重组苏云金芽孢杆菌的生产工艺研究”(中国病毒学，2000.Vol.15：192-195)等分别对不同杀虫特点的苏云金芽孢杆菌的发酵和后处理工艺进行的研究。

蝗虫(Locust)是世界性的重大农业害虫。蝗灾与水灾、旱灾常相间或伴随发生而成为人类历史上农业三大自然灾害。自80年代起，全球的蝗虫灾害进入频发阶段，除南极外，各大洲均有蝗灾发生，常年发生面积达4680万平方公里，有八分之一的人口常年受到蝗灾的袭扰。我国的蝗灾也随之加重，从1997年起，我国连续几年大面积爆发蝗灾，最高虫口密度可达到3000-10000头/m²。蝗虫中的东亚飞蝗(Locust migratoria manilensis)主要分布在东亚、东南亚地区，如中、日、菲、泰、越等国，在我国分布范围最广、成灾最频繁、最严重。蝗灾在我国频繁发生主要有三方面原因：一是，我国气候旱涝交替，先涝后旱往往是蝗灾发生的前兆；其次，我国现有蝗区80％都是杂草丛生的河滩、近海盐碱地及水面涨落不定的滨湖和水库区等，改造这些蝗虫的孳生地相当困难；另外，治蝗措施单一，主要采用有机磷、菊酯类等广谱性化学农药，使蝗虫天敌也被杀伤，蝗虫因免受自然天敌的控制而更趋猖獗。蝗灾的频发，不仅给农业生产造成了重大损失，而且为了治理蝗灾，要花费大量的人力、物力和财力。目前，对于蝗虫的防治，仍然主要是采用飞机大面积喷洒化学农药或人工使用喷雾器喷洒化学农药，但是，这种大面积使用化学农药的防治方式在迅速有效地遏制蝗害的同时，也杀死了大量蝗虫的天敌，破坏了生态平衡，还使蝗虫产生抗药性，导致蝗灾的恶性循环，而且也严重污染了生态环境，给人类健康造成威胁。因此在化学防治的同时，加大生物方法治蝗力度，建立与生态友好、资源可持续利用的蝗虫治理体系和技术规范，已成为我国蝗虫防治工作的当务之急。

近50年来，采用微生物防治蝗虫发展较快。早在20世纪60年代末，美国开始研究和应用微生物----蝗虫微孢子虫防治蝗虫，到20世纪80年代初期，该项生物防治技术被列入美国防治蝗虫的计划，蝗虫微孢子虫是世界上第一个注册的防治蝗虫的生物制剂，也是世界广泛应用的治蝗生物制剂。美国注册了白僵菌用于防治蝗虫的制剂，英国和澳大利亚分别注册绿僵菌制剂，并在很多国家进行田间试验。除此之外，印度、美国成功地开发出了植物源杀虫剂-印楝素。中国是较早开展生物治蝗的国家，在明清时期就有采用养鸡、养鸭防治蝗虫的实例，而且至今仍在一些地方应用。有关蝗虫天敌的记录，可以追溯到东晋时期，距今有1700多年。然而，直到20世纪80年中期，我国才真正开展蝗虫生物防治的研究和应用。中国农业大学首先从美国引入了蝗虫微孢子虫，经过近10年的努力，在深入研究了微孢子虫致病机理、疾病传播途径和流行规律的基础上，成功地研制出了人工大量繁殖蝗虫微孢子虫的技术、防治草原蝗虫和东亚飞蝗的田间应用技术及其配套技术体系，累计示范应用1000多万亩次，取得了良好的经济效益、社会效益和生态效益，该项技术在国际上处于领先水平。中国农业科学院、重庆大学等单位开发研究了绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)制剂，经过多年室内实验后，近年来也较为广泛地开展了田间试验示范。这些微生物制剂，均可以采用喷雾或喷粉的方法施用。同时，国内也有几个厂家在生产印楝素、苦参碱等生物制剂。

然而到目前为止，有关高效抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌(Bt)特异性菌株及其杀虫晶体蛋白质基因和Bt杀蝗剂还未见报道。

                        发明内容

本发明的目的在于提供了一种抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌，该菌株对直翅目的蝗虫等有特异性的毒杀作用，但对人、畜和环境安全。

本发明的另一个目的是提供了一种制备Bt杀蝗剂的方法，用该方法制备的杀蝗剂可用于危害水稻、小麦、玉米、高粱和牧草等蝗虫的防治，其特点是特异性强，不杀伤昆虫天敌，对人、畜无毒，对环境安全。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

发明的目的在于，分离筛选对直翅目的蝗虫等害虫具有特异性毒杀作用的苏云金芽孢杆菌。因此，筛选抗蝗虫的Bt特异性菌株，可为研制Bt杀蝗剂奠定基础。这对于更好地保持生物的多样性，维护生态平衡，实现农业的可持续发展具有十分重要的意义。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：NO：M206061。BTH-13是一株从我国土壤样品中分离、并以直翅目的东亚飞蝗为试虫，经过毒力生物测定所筛选出的对直翅目的东亚飞蝗等害虫有高毒力的菌株；该菌株的杀虫活性是由其产生的124kD的杀虫晶体蛋白质所决定的。

基本的技术原理是：利用芽孢可耐80℃高温的特性，在80℃高温下通过弹土法分离苏云金芽孢杆菌。以1龄东亚飞蝗为试虫，进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量Lc₅₀，筛选到该高毒力菌株Bacillus thuringiensisssp.BTH-13。

抗蝗虫苏云金芽孢杆菌菌株BTH-13的制备方法：

利用芽孢可耐80℃高温的特性，在80℃高温下通过弹土法，用普通固体细菌培养基倒平板，在30℃下培养3天，分离细菌单菌落。该普通固体细菌培养基的组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，用水补充体积至100ml。随机挑选单菌落涂片，用石碳酸复红染色后在光学显微镜下观察，筛选能产生芽孢和晶体的苏云金芽孢杆菌。根据分离该Bt菌株的土壤样品来源地的名称(Heilongjiang)的第一个字母组成其代码BTH，又因该菌株是从同一批土壤样品中分离的多株苏云金芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为13的一株，因此将该苏云金芽孢杆菌命名为BTH-13。

以东亚飞蝗为试虫，对筛选出的苏云金芽孢杆菌进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量Lc₅₀，筛选到该高毒力菌株Bacillus thuringiensisssp.BTH-13。

该菌株的具体特征如下：

抗蝗虫苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis ssp.BTH-13的基本特征：

a.形态学特征：Bacillus thuringiensis ssp.BTH-13的细胞形态为杆状，产生椭圆行芽孢和菱形伴孢晶体蛋白质。

b.培养特征：Bacillus thuringiensis ssp.BTH-13牛肉膏-蛋白胨琼脂平板培养基中30℃培养24小时，形成针尖大小的浅黄色小菌落，边缘平滑，培养72小时，形成园盘状菌落，乳白色，边缘不整齐，表面似毛玻璃，有皱纹。

c.生理生化特性：

苏云金芽孢杆菌BTH-13菌株的主要生理生化特征

生理生化特性	BTH-13菌株
		革兰氏反应	+

在7％NaCL上生长在pH6.0培养基上生长在柠檬酸培养基(simmons)中生长在含KCN的Brown培养基中生长在嫌气肉汤+葡萄糖1％中产酸在嫌气条件下利用硝酸盐产气溶血试验RNA酶试验分解果胶产生吲哚产生硫化氢利用丙酮酸

++-+++++----

d.血清型：以BTH-13的鞭毛抗原与Bt的标准抗血清进行凝集反应及交叉吸收凝集反应试验，BTH-13的H血清型为H16，但含有不同于Bt.subsp.indiana亚种的鞭毛抗原成分，因此该菌株可能是Bt中的一个新亚种，暂定名为Bacillusthuringiensis ssp.BTH-13(Bt.subsp.locustcidus)。

e.杀虫晶体蛋白质：经SDS-PAGE分析，菌株BTH-13产生128kD的杀虫晶体蛋白质。

h.杀虫特性：经毒力生物测定，菌株BTH-13对东亚飞蝗等直翅目害虫有较高杀虫活性，其发酵液和晶体蛋白质经过碱和蛋白酶处理后，可明显提高抗蝗虫的活性。

i.发酵性能：菌株BTH-13易于培养，发酵性能优良，在合适的发酵条件下生长整齐，发酵周期短。

抗蝗虫Bt杀虫剂的制备

抗蝗虫Bt菌株BTH-13杀虫剂(杀蝗剂)的制备：

摇瓶发酵：

摇瓶发酵的目的在于选择最佳发酵配方，优化发酵条件，采用不同的含固量和不同的C/N比进行L₉(3⁴)正交试验。

          表2  L₉(3⁴)正交实验因子/水平百分含量表

根据正交试验，获得菌株BTH-13的最佳培养基配方为：在100单位体积的培养基中，淀粉3.0-4.0％、豆饼粉1.8-2.4％、棉饼子粉1.2-1.8％、蛋白胨0.5-0.9％、酵母粉0.4％、玉米浆2.0％、7水硫酸镁(MgSO₄7H₂O)0.04％、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2％、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.2％、碳酸钙(CaCO₃)0.1％、及α-淀粉酶(淀粉含量的1/400)，用水补充至体积100。

利用上述培养基配方，在500ml的三角瓶中装100ml培养基，灭菌后接种BTH-13，在30℃摇床中以200转/分钟培养至80％的芽孢脱落。摇瓶发酵液进行毒力生物测定。

在全自动发酵罐中的小试：

采用筛选出来的最佳发酵配方，在全自动发酵罐中进行发酵试验，培养基消前pH7.8，消后pH为7.0左右。每罐接种一支经60℃处理30分钟的斜面菌种，接种温度37℃。采用变温、变速、变压(0-11小时，32℃、500转/分、通气量0.6立方米/小时；12-21小时，29℃2、600转/分、通气量0.8立方米/小时；22-发酵结束，32℃、600转/分、通气量0.8立方米/小时)的发酵手段，确定了一套最佳发酵工艺。发酵周期为38小时，发酵结束后发酵液酸化至pH5.0，加入0.1％乳化剂(农乳100)，制成乳悬剂。发酵液浓缩后直接喷雾干燥或加10％填充料(碳酸钙)后喷雾干燥制备可湿性粉剂。

Bt杀蝗剂的中试和生产：

根据小试发酵的条件在10吨的发酵罐中进行中试，中试产品进行毒力生物测定。在中试基础上进行大规模的生产。

                        优点和效果

苏云金芽孢杆菌BTH-13具有杀东亚飞蝗等直翅目害虫的特点，国内目前尚无杀东亚飞蝗等直翅目害虫的苏云金芽孢杆菌商品制剂，因而可利用BTH-13生产新型苏云金芽孢杆菌(Bt)杀蝗剂，使苏云金芽孢杆菌杀虫剂的产品多样化和系列化，扩大苏云金芽孢杆菌杀虫剂的使用范围，降低农药防治费用、减少化学农药对环境的污染，增加农作物产量。BTH-13的杀虫晶体蛋白质基因可用于Bt菌株的遗传改良以构建高效抗蝗虫的Bt工程菌，并可用于转基因植物的研究以获得抗蝗虫的牧草和农作物。因而，从优越而独特的杀虫特性、生产和使用成本低、工业化生产技术成熟、对人和动植物安全、不污染环境及市场需求等方面考虑，苏云金芽孢杆菌BTH-13及其杀虫基因具有良好的推广应用前景。

               Bt菌株BTH-13抗东亚飞蝗的毒力

处理	平均死亡率(The average of mortality)
				24h	48h	72h
	×50×100发酵    ×200液    ×400×800	1.00％8.20％6.00％3.30％1.30％	18.90％12.10％8.90％6.70％2.60％				37.50％23.60％16.00％9.40％5.00％
CK				0.00％	0.00％	0.00％
	发     ×50酵     ×100液     ×200处理     ×400液×800	45.20％27.30％11.70％5.20％2.10％	56.20％40.20％21.50％12.60％7.30％				89.80％69.80％52.10％42.10％14.90％
ck				0.00％	0.00％	0.00％
	0.25mg/ml0.5mg/ml晶      1.0mg/ml体      1.5mg/ml2.0mg/ml	2.00％4.00％7.00％9.00％12.00％	3.00％9.00％11.00％16.00％23.00％				6.00％23.00％32.00％42.00％58.00％
CK				0.00％	0.00％	0.00％
	晶    0.25mg/ml解体酶    0.5mg/ml	2.30％5.60％	9.00％35.60％				15.60％49.90％

1.0mg/ml1.5mg/ml2.0mg/ml	12.90％32.50％50.00％	46.70％73.30％82.10％	65.70％81.50％98.70％
				CK	0.00％	0.00％	0.00％

                        具体实施方式

1.抗蝗虫苏云金芽孢杆菌菌株BTH-13的制备方法：

利用芽孢可耐80℃高温的特性，在80℃高温下通过弹土法，用普通固体细菌培养基倒平板，在30℃下培养3天，分离细菌单菌落。该普通固体细菌培养基的组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，用水补充体积至100ml。随机挑选单菌落涂片，用石碳酸复红染色后在光学显微镜下观察，筛选能产生芽孢和晶体的苏云金芽孢杆菌。根据分离该Bt菌株的土壤样品来源地的名称(Heilongjiang)的第一个字母组成其代码BTH，又因该菌株是从同一批土壤样品中分离的多株苏云金芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为13的一株，因此将该苏云金芽孢杆菌命名为BTH-13。

以东亚飞蝗为试虫，对筛选出的苏云金芽孢杆菌进行毒力生物测定，经过比较毒力致死中量Lc₅₀，筛选到该高毒力菌株Bacillus thuringiensisssp.BTH-13。

2.抗蝗虫Bt杀虫剂的制备

抗蝗虫Bt菌株BTH-13杀虫剂(杀蝗剂)的制备：

摇瓶发酵：

摇瓶发酵的目的在于选择最佳发酵配方，优化发酵条件，采用不同的含固量和不同的C/N比进行L₉(3⁴)正交试验。

表2  L₉(3⁴)正交实验因子/水平百分含量表

根据正交试验，获得菌株BTH-13的最佳培养基配方为：在100单位体积的培养基中，淀粉4.0％、豆饼粉2.4％、棉饼子粉1.5％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.4％、玉米浆2.0％、七水硫酸镁(MgSO₄7H₂O)0.04％、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2％、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)0.2％、碳酸钙(CaCO₃)0.1％、及α-淀粉酶(淀粉含量的1/400)，用水补充至体积100。

利用上述培养基配方，在500ml的三角瓶中装100ml培养基，灭菌后接种BTH-13，在30℃摇床中以200转/分钟培养至80％的芽孢脱落。摇瓶发酵液进行毒力生物测定。

在全自动发酵罐中的小试：

采用筛选出来的最佳发酵配方，在全自动发酵罐中进行发酵试验，培养基消前pH7.8，消后pH为7.0左右。每罐接种一支经60℃处理30分钟的斜面菌种，接种温度37℃。采用变温、变速、变压(0-11小时，32℃、500转/分、通气量0.6立方米/小时；12-21小时，29℃、600转/分、通气量0.8立方米/小时；22-发酵结束，32℃、600转/分、通气量0.8立方米/小时)的发酵手段，确定了一套最佳发酵工艺。发酵周期为38小时，发酵结束后发酵液酸化至pH5.0。加入0.1％乳化剂(农乳100)，制成乳悬剂。发酵液浓缩后直接喷雾干燥或加10％填充料(碳酸钙)后喷雾干燥制备可湿性粉剂。

Bt杀蝗剂的中试和生产：

根据小试发酵的条件在10吨的发酵罐中进行中试，中试产品进行毒力生物测定。在中试基础上进行大规模的生产。

发酵液的酶解：在BTH-13发酵液中加入10M氢氧化钾(NaOH)，调发酵液的pH值到11.0左右。37℃温育3h，镜检观察，直到晶体完全溶解。加入胰蛋白酶，使其终浓度为25mg/ml，37℃温育2-4h。

晶体蛋白的酶解

5mg/ml晶体原毒素蛋白质溶于0.05M碳酸钠-碳酸氢钠(Na₂CO₃-NaHCO₃)(pH10)的缓冲液中37℃温育3h，镜检观察，直到晶体完全溶解。加入胰蛋白酶干粉，使其中浓度为25mg/ml，37℃温育过夜，5000rpm离心5min，弃去沉淀，留上清液，加苯甲基磺酰氟(PMSF)终止酶反应，做进一步提纯和电泳分析用。

Claims (2)

1、一种抗蝗虫的苏云金芽孢杆菌，其特征在于，苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis BTH-13，CCTCC NO：M206061。

2、一种苏云金芽孢杆菌BTH-13杀虫剂的制备方法，其特征在于，它包括下列步骤：

A、摇瓶发酵：

获得菌株BTH-13的培养基配方为，在100单位体积的培养基中，淀粉3.0-4.0％、豆饼粉1.8-2.4％、棉饼子粉1.2-1.8％、蛋白胨0.5-0.9％、酵母粉0.4％、玉米浆2.0％、七水硫酸镁0.04％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸氢二钾0.2％、碳酸钙0.1％、及α-淀粉酶/淀粉含量的1/400，用水补充至体积100；

B、利用A步骤的培养基配方，在500ml的三角瓶中装100ml培养基，灭菌后接种BTH-13，在30℃摇床中以200转/分钟培养至80％的芽孢脱落；

C、采用A步骤中筛选出来的培养基，在全自动发酵罐中进行发酵试验，培养基消前pH7.8，消后pH为7.0，接种一支经60℃处理30分钟的斜面菌种，接种温度37℃，用变温、变速、变压/11小时，32℃、500转/分、通气量0.6立方米/小时；12-21小时，29℃、600转/分、通气量0.8立方米/小时；22-发酵结束，32℃、600转/分、通气量0.8立方米/小时的发酵，发酵周期为38小时，发酵结束后发酵液酸化至pH5.0，加入0.1％乳化剂，制成乳悬剂，酵液浓缩后直接喷雾干燥或加10％碳酸钙后喷雾干燥制备可湿性粉剂。