CN107177536B

CN107177536B - 一种消除植物杀菌剂残留的降解菌及其应用

Info

Publication number: CN107177536B
Application number: CN201710556397.6A
Authority: CN
Inventors: 陈立伟; 林举媚; 董晓梦; 余静
Original assignee: Jiangsu Nanzi Environmental Protection Science & Technology Co ltd
Current assignee: Zhongzhi Jiangsu Environmental Construction Co ltd
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2017-07-10
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2037-07-10
Also published as: CN107177536A

Abstract

本发明提供了一种消除植物杀菌剂残留的降解菌及其应用，所述降解菌鉴定为雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri，属于革兰氏阴性菌类，其已于2017年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC NO.14163，能以植物杀菌剂叶枯唑为唯一碳源和能源进行生长，96 h内对100 mg/L叶枯唑的降解率达到90%以上，降解菌剂直接施用可使田间叶枯唑残留显著降低，能够有效地消除污染，解决了农业生产中叶枯唑残留超标问题，生产出无毒无公害的绿色农产品。

Description

一种消除植物杀菌剂残留的降解菌及其应用

技术领域

本发明属于生物降解技术领域，具体涉及一种消除植物杀菌剂残留的降解菌及其应用。

背景技术

我国是个农业大国，近年来我国的农作物细菌性和真菌性病害越来越严重，病害严重时可造成大幅减产甚至绝收，给农民带来沉重的负担。叶枯唑是我国自主创制研发的一种防治细菌性病害的内吸性杀菌性，特别对水稻白叶枯病和细菌性条斑病有特效，还可以广泛用于果树的溃疡性防治；噻呋酰胺、戊唑醇、嘧菌酯、氢氧化铜、氯溴异氰尿酸杀菌剂对辣椒、水稻、蔬菜、果树、玉米、小麦等作物多种真菌性病害有显著功效，但由于作物同时伴有细菌性病害和真菌性病害发生，而且农作物由于长期使用农药，作物病菌抗性提高，防效开始下降。随着叶枯唑的推广使用和深入研究，其代谢产物、亚慢性毒性、环境风险、抗药性等问题也逐渐显露出来，引起了广泛关注和重视。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解菌剂，使用本菌剂可以使土壤中叶枯唑的残留量降低90％以上，生产和使用成本较低。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。

本发明提供一种消除叶枯唑残留的降解菌，其菌株CS-7是一株革兰氏阴性菌，其已于2017年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC NO.14163，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，经鉴定是雷氏普罗维登斯菌（Providencia rettgeri）。LB培养基上菌落成圆形、突起，呈淡黄色，直径1.5-2.5mm，具有不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的特性。本发明提供了雷氏普罗维登斯菌CS-7在叶枯唑降解中的应用，在实验室摇瓶培养条件下叶枯唑的降解率达90％以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

本发明提供了含有所述雷氏普罗维登斯菌CS-7的菌剂。

本发明还提供了所述雷氏普罗维登斯菌CS-7生产菌剂的方法。

所述雷氏普罗维登斯菌CS-7生产菌剂的方法具体为：

1）将叶枯唑降解菌雷氏普罗维登斯菌CS-7的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期，LB培养基配方为：NaCl 10.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，pH7.0；

2）将步骤1）培养好的菌种按10％的接种量接种入500L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH₄）₂SO₄1%，K₂HPO₄0.2%，MgSO₄ 0.05%，NaCl0.01%，CaCO₃ 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.0。

3）将步骤2）所述种子液按10％的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵完成后的培养液即为菌剂。

步骤2）所述种子罐和步骤3）所述的生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为180-240 r/min，培养温度为30-35℃，步骤2和3的整个工艺流程培养时间为48-60 h。

所述的高效降解植物杀菌剂的降解菌在降解植物杀菌剂中的应用。

所述植物杀菌剂为叶枯唑。

有益效果：

本发明所述的雷氏普罗维登斯菌CS-7能使土壤中叶枯唑的残留量降低90％以上，大大降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本。所制备的菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行病虫害防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。田间试验表明，用本发明生产的降解菌剂直接施用于土壤，可使土壤中农药残留量降低90％以上。本发明成功地解决了农业生产中农药残留超标问题，既充分发挥了化学农药在植物病虫草害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。

附图说明

图1本发明所述的雷氏普罗维登斯菌CS-7的菌落形态图；

图2 本发明所述的雷氏普罗维登斯菌CS-7的摇瓶降解图；

图3含有雷氏普罗维登斯菌CS-7菌剂的田间降解实验结果。

具体实施方式

实施例1 叶枯唑降解雷氏普罗维登斯菌CS-7的筛选和分离

取从生产叶枯唑的某农药厂生产车间的废水处理池中得到的活性污泥3.0 ml加入叶枯唑浓度为100 mg/L的100 ml无机盐液体培养中，其配方为：每升含1.50 g K₂HPO₄、0.50 g KH₂PO₄、0.20 g MgSO₄·7H₂O、1.00 g NaCl、1.00 g (NH₄)₂SO₄， pH 7.0，于160 r/min，30℃条件下振荡培养，每隔5天按3%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次。

取上面得到的富集菌液1.0 ml，加入9.0 ml无菌水中，配成10^-1的富集液，再吸取1.0 ml配好的10^-1的富集液加入9.0 ml无菌水中，充分混匀配成10^-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1 ml涂布于含叶枯唑的浓度为100 mg/L无机盐固体培养基(配方为：每升含1.50 g K₂HPO₄、0.50 g KH₂PO₄、0.20 g MgSO₄·7H₂O、1.00g NaCl、1.00 g (NH₄)₂SO₄，20.00 g 琼脂， pH 7.0)上，30℃培养7天。7天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于3.0 ml的LB液体培养基中培养24 h后，LB液体培养基配方为：NaCl 10.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，pH 7.0于8000 r/min的条件下离心3 min，倒去上清液，加入3.0 ml的无菌水摇匀，仍于8000 r/min的条件下离心3 min，按此方法用无菌水洗两遍后，加入3.0 ml无菌水重悬该菌。吸取1.0 ml该菌液加入100 ml叶枯唑浓度为100 mg/l的无机盐液体培养基中，于160 r/min，30℃条件下振荡培养4天后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株菌株保存，进行后续实验。

将降解菌株接种于LB固体培养基上，其配方为：NaCl 10.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，琼脂20.00 g/L，pH7.0，30℃恒温培养48 h后观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形态（1000X）。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。鉴定为雷氏普罗维登斯菌Providencia rettgeri；命名为：CS-7。其菌落形态见图1所示，主要生物学特性为革兰氏阴性，LB培养基上菌落成圆形、突起，呈淡黄色，直径1.5-2.5mm，具有不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的特性。

实施例2 雷氏普罗维登斯菌CS-7的摇瓶降解实验

在含100 mg/L叶枯唑的无机盐培养基中，其配方为：每升含1.50 g K₂HPO₄、0.50gKH₂PO₄、0.20 g MgSO₄·7H₂O、1.00 g NaCl、1.00 g (NH₄)₂SO₄，pH 7.0，按3%的接种量接种CS-7，于30℃振荡培养，隔12 h取样测定。由图2可以看出，处理样品的吸收峰明显下降，叶枯唑被降解90%以上。

实施例3 含有雷氏普罗维登斯菌CS-7菌剂的制备

将叶枯唑降解雷氏普罗维登斯菌CS-7的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200 ml LB培养基的1000 ml摇瓶中，LB培养基配方为：酵母膏5.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，NaCl 10.00 g/L，pH 7.0，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500 L，投料量400 L，培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH₄）₂SO₄1%，K₂HPO₄0.2%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO₃ 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.0。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500L种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220 r/min，无菌空气通入量为1:0.8。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1: 1.2，搅拌速度为240 r/min，整个工艺流程培养时间为60 h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

实施例4 含有雷氏普罗维登斯菌CS-7菌剂的田间实验

实验用大田为1块尺寸为20m×20m的耕作土壤，对耕作层土壤松土（松土深度大约25cm）、整平备用。

对此耕作土壤施用叶枯唑原药，使叶枯唑初始浓度为100 mg/kg，搅拌均匀，喷施含1 g/L的葡萄糖水溶液使其含水量达到饱和含水量的60%。然后将1#田平均划分为6块，向其中3块分别加入实施例3制备的菌剂60 g；另外3块分别加入同体积的灭菌处理（121℃，30min）的实施例3制备的液体菌剂。共两种处理，每个处理均是3个重复。分别于5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d后取样测定叶枯唑在土壤中的降解率。由图3可知，加入菌体后，加入未灭活的菌剂的土壤中叶枯唑降解明显，降解率可达90%，加入灭活后的菌剂的土壤中叶枯唑没有明显降解。实施例3所述方法制备的固体菌剂，经过实施例4所述的方法，具有同样的效果。

Claims

1.一株消除植物杀菌剂叶枯唑残留的降解菌，其分类命名为雷氏普罗维登斯菌（Providencia rettgeri）CS-7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.14163。

2.权利要求1所述的消除植物杀菌剂叶枯唑残留的降解菌在降解植物杀菌剂中的应用，其特征在于，所述植物杀菌剂为叶枯唑。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将降解菌直接施用于土壤，降解土壤中叶枯唑残留。

4.含有权利要求1所述降解菌的菌剂。

5.权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期;

2）将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入500 L种子罐，培养至对数生长期；

3）将种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

LB培养基配方为：NaCl 10.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，酵母粉5.00 g/L，pH 7.0；

种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH₄）₂SO₄1%，K₂HPO₄0.2%，MgSO₄ 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO₃ 0.3%，酵母膏0.02%，pH值7.0；

在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30-35℃，全流程培养时间为48-60 h，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂，该液体剂即为菌剂。