CN110172428A - 一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110172428A
CN110172428A CN201910503024.1A CN201910503024A CN110172428A CN 110172428 A CN110172428 A CN 110172428A CN 201910503024 A CN201910503024 A CN 201910503024A CN 110172428 A CN110172428 A CN 110172428A
Authority
CN
China
Prior art keywords
subtilis
bacillus subtilis
agent
pathogen
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910503024.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110172428B (zh
Inventor
单宝龙
胡著然
高国瑞
孔德荣
郭静
刘晓晓
艾米莉亚·卡米莉娅
安娜·斯塔琳娜
玛丽娜·迈瑞林肯斯
尤里劳斯·库帕特索夫
张文娟
申小冉
侯磊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Greenblue Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shandong Greenblue Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Greenblue Biotechnology Co ltd filed Critical Shandong Greenblue Biotechnology Co ltd
Priority to CN201910503024.1A priority Critical patent/CN110172428B/zh
Publication of CN110172428A publication Critical patent/CN110172428A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110172428B publication Critical patent/CN110172428B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本公开属于微生物技术领域，具体涉及一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用。采用微生物制剂提高作物的产量及防治病虫害问题，可有效的减少传统化学试剂对土壤的危害作用。本公开提供了一种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c及其复合制剂，该菌株对植物真菌病原菌和植物细菌病原菌有拮抗作用，尤其对植物根腐病的防治效果显著；同时复合制剂应用于大棚番茄实验，可促进果实增产15％；有效防治番茄生长过程中出现的病害，其防治效果高达80％以上；番茄果实各项指标均有提升，其中番茄红素含量有显著提高。在提高作物品质的同时，减少对土壤的危害作用，具有良好的推广意义。

Description

一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本公开涉及微生物技术领域，具体涉及一种具有抗病及提高果实品质功效的的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)21c及其复合菌剂在抗病、提高果实品质方面的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
在中国，每年在农业生产过程中因病虫害造成的损失占农业总产值的30％以上，为了挽回这些损失，普遍采用了化学防治、生物防治、遗传防治、物理防治等方法。化学防治具有防效高、速度快、成本低、使用简便等优点，从而得到迅速发展，成为防治病虫草害的一个重要手段。但由于化学农药长期大量的反复使用，也带了一些弊端，如污染土壤、水体以及大气，农副产品中农药的残留量增加，果蔬品质下降，直接危害了人类的健康及生存环境；同时，长期使用化学农药，造成病害的抗药性增强，导致农药使用频率及用量逐年增加，形成了恶性循环；此外化学农药在杀死病虫的同时也会杀死农田有益微生物，破坏农业微生态系统。
随着现代生物科技的进步，人们对利用微生物提高林木产量和防治病虫害给予了高度关注。从自然界寻找能够促进植物生长或防治植物病害的有益微生物，利用生物多样性促进植物生长、改善果实品质和对病害的可持续控制及无害化处理已经显示出良好的应用前景。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生胞外分泌物枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，相关研究表明某些枯草芽孢杆菌能够抑制部分植物病菌真菌。除此之外，还有相关研究表明，枯草芽孢杆菌还具有提高茄果类果实品质的效果。基于枯草芽孢杆菌的上述效果，有望作为一种良好的微生态制剂肥料进行应用。微生态制剂能够很好地解决农药化肥带来的土壤污染及病虫害抗性等问题，相比化学试剂而言，微生态制剂对土壤的危害程度更低。针对该问题，发明人认为：目前市面上生物防控微生态制剂产品种类繁多，但仍存在一定的使用缺陷，许多生防制剂的效果不稳定，预防的病害较为单一、抑菌谱窄。另外，将多种菌株进行配合制成复合微生物制剂也是本领域内的常见操作，提供更多效果优良的复合微生物制剂有利于促进微生物制剂的应用。
发明内容
针对上述研究背景，发明人认为提供一种具有广谱抑菌效果的菌株有利于克服目前生防制剂防效单一的缺陷。另外，现有技术中针对枯草芽孢杆菌的促生作用进行开发的菌剂往往侧重于提高作物的亩产量，发明人认为提供一种能够提高农作物果实品质，提高作物中营养物质的复合菌剂具有良好的应用价值。为了实现上述技术效果，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供一种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c，该菌株已于2018年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，其生物保藏号为：CCTCC M 2018565。
第一方面所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c具有SEQ ID NO:1所示的16SrDNA序列。
该菌株分离自山东省宁阳县的土壤样品，该序列与其他已知同属的芽孢杆菌的16S rDNA序列有98％的相似性，综合测序与生理生化反应结果确定为枯草芽孢杆菌，定名为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c。
所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的形态学特征如下：
菌体特征：革兰氏阳性直杆，大小为0.6×1.0-1.4μm，具有圆形末端，单个或成对分组，形成内生孢子。孢子是椭圆形的，具有中心或亚顶部定位。孢子囊没有肿胀。
菌落特征：NA平板固体培养基培养48h后干燥，有褶皱，规则，奶油状，直径2-4mm，有扁平轮廓。
参考伯杰氏系统细菌学手册，所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的生理生化特征如下：
氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐的利用、明胶水解实验、普里斯考尔试验、硝酸盐还原试验、丙二酸盐利用试验、淀粉水解试验、酶解酪蛋白试验阳性；吲哚检测、H2S试验、NH3试验、尿素分解试验、甲基化试验、卵磷脂酶、苯丙氨酸阴性。
优选的，上述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的培养基为糖蜜2.5～3.5％，蛋白胨1.5～2.5％，K2HPO4×3H2O 0.5～1.0％，KH2PO4 0.2～0.5％，(NH4)2SO4 0.1～0.3％，柠檬酸钠×2H2O 0.02～0.08％，MgSO4×7H2O 0.008～0.12％，余量为水，рН6-7。
本公开提供的菌株能够抑制多种植物真菌病原菌及植物细菌病原菌，其中植物真菌病原菌包括但不限于尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、链格孢、灰霉病病原菌、核盘菌、小麦根腐病病原菌、虫疫病病原菌；植物细菌病原菌包括但不限于欧文式杆菌、根癌土壤杆菌、黄单胞菌、波氏假单胞菌、丁香假单胞菌、番茄溃疡病菌、马铃薯黑胫病菌。该菌株的抑菌谱广，针对引发作物疾病的多种病原菌都有抑制效果，可以有效防止多种病害，减少化学农药的使用。
本公开第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c和/或菌的培养物。
优选的，所述菌的培养物通过如下方法制备：将所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c接种于上述培养基中26～34℃下培养24～48h，搅拌速率100～260rpm/min。
本公开第三方面，提供一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一方面所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)27及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)和/或各菌株的培养物，其中水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27于2018年8月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2018566；所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)菌株于2018年8月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号CCTCCM 2018563。
经本公开实验验证，该复合菌剂应用于茄果类作物的种植，能够有效提高果实中营养成分的含量。现有技术中针对枯草芽孢杆菌的促生作用往往体现在对植物生长重量、高度及果实重量的增产效果，而本公开中筛选得到的复合菌剂应用于茄果类植株的生产，实现的是果实中营养成分的提升。该复合菌剂应用于番茄的生产，可有效提高果实中可溶性糖含量、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸、番茄红素等主要营养物质的含量。
优选的，所述复合菌剂中，所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)的比例为0.8-3:0.8-3:0.8-4。
进一步优选的，所述复合菌剂中，三种菌的比例为1:1:1。
进一步优选的，所述复合菌剂中，有效活菌数为≥10亿/mL。
由于菌株对培养基的营养需求不同，菌株胞外分泌物的种类不同等，不同菌种处于混合状态时有可能表现出抑制、促进的效果，菌株的比例不同，其共同表现出的效果也不相同，经本公开验证，上述比例下的三种菌株混合时，制备成为微生物制剂的作用效果较好。
优选的，所述水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27的培养基为玉米淀粉2.5～3.5％，蛋白胨1.5～2.5％，K2HPO4×3H2O 0.6～0.8％，KH2PO4 0.2～0.4％，(NH4)2SO40.1～0.2％，柠檬酸钠×2H2O 0.1～0.2％，MgSO4×7H2O 0.05～1.5％，余量为水；和/或发酵条件为рН5.5～7；30～40℃，搅拌速率120～180rpm/min，培养36～50小时，获得水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27发酵液。
优选的，所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)的培养基为糖蜜2.5～3.5％，蛋白胨1.5～2.5％，K2HPO4×3H2O 0.6～0.8％，KH2PO4 0.2～0.4％，(NH4)2SO4 0.1～0.2％，柠檬酸钠×2H2O 0.1～0.2％，MgSO4×7H2O 0.05～1.5％；余量为水；和/或发酵条件为рН5.5～7；30～40℃，搅拌速率120～180rpm/min，培养18-36小时，获得枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)发酵液。
优选的，第二方面所述菌剂或第三方面所述复合菌剂剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；进一步的为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
作为优选，所述菌剂或复合菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
本公开第四方面，提供上述第一方面所述菌株、第二方面所述菌剂和/或第三方面所述复合菌剂在下列任一方面的应用：
(1)抑制植物真菌病原菌及植物病细菌病原菌；
(2)提高果实品质；
优选的，所述植物真菌病原菌包括但不限于尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、链格孢、灰霉病病原菌、核盘菌、小麦根腐病病原菌、虫疫病病原菌；
优选的，所述植物细菌病原菌包括但不限于欧文式杆菌、根癌土壤杆菌、黄单胞菌、丁香假单胞菌、番茄溃疡病菌、马铃薯黑胫病菌；
优选的，所述促进植物生长体现在提高果实品质；进一步的，提高番茄果实中包括但不限于可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸及番茄红素的含量；所述植物包括但不限于番茄、生菜、黄瓜和小麦。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1、本公开中的菌株具有良好广谱抑菌效果，针对引发农作疾病的多种植物真菌病原菌及细菌病原菌都具有良好的抑制效果。采用该菌株及包含该菌株培养物的菌剂制备微生物复合制剂可有效克服现有产品的防效单一的缺陷。
2、本公开针对上述菌株进一步提供了一种复合菌株产品，当三种菌株以一定比例混合后，能够获得较高的活菌数量，并且经本公开实验验证该复合菌剂具有良好的抑菌、防病及提高果实品质的功效。相比现有技术中采用枯草芽孢杆菌应用于番茄产量的提升，本公开的菌剂不仅具有提升产量的效果，还能够实现提高果实中营养成分含量的效果。应用于实际生产，一方面可以降低农药及肥料的使用剂量，一方面可以提高果实品质，提高经济收益。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c显微镜下观察图；
图2为实施例1中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c菌落形态图；
图3为实施例1中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对丁香假单胞菌拮抗实验图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，采用微生物制剂提高作物的产量及防治病虫害问题，可有效的减少传统化学试剂对土壤的危害作用。本公开提供了一种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c及其复合制剂，该菌株对植物真菌病原菌和植物细菌病原菌有拮抗作用，尤其对植物根腐病的防治效果显著；同时复合制剂应用于大棚番茄实验，可促进果实增产22％；有效防治番茄生长过程中出现的病害，其防治效果高达80％以上；番茄果实各项指标均有提升，其中番茄红素含量有显著提高。在提高作物品质的同时，减少对土壤的危害作用，具有良好的推广意义。。
实验过程中涉及的普通培养基及其成分如下：
NB培养基：蛋白胨-1％，牛肉粉-0.3％，氯化钠-0.5％；琼脂-2％为NA培养基。
PDA培养基：土豆-20％，葡萄糖-2％，琼脂-2％。
本公开提供的具有抗病提高果实品质的枯草芽孢杆菌已于2018年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，其生物保藏号为：CCTCC M 2018565。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
一、菌株的筛选与鉴定
从山东省宁阳县收集土壤样品，称取1g样品接入100ml无菌水中，30℃恒温箱中震荡培养5-7d，对土壤样液进行105-106倍数稀释，稀释液涂布在含有NA固体培养基的平板内，30℃培养过夜。从长出菌落的平板上分离菌株并纯化，接入NA斜面培养基保存。
显微镜下观察纯化后的菌株特征(如图1、图2)：细菌形状的革兰氏阳性直杆，大小为0.6×1.0-1.4μm，具有圆形末端，单个或成对分组，形成内生孢子。孢子是椭圆形的，具有中心或亚顶部定位。孢子囊没有肿胀。菌落干燥，有褶皱，规则，奶油状，直径2-4mm，有扁平轮廓。
参考伯杰氏系统细菌学手册鉴定方法，利用氧化实验、硫化氢实验、尿素分解实验、柠檬酸利用实验、明胶水解实验、硝酸盐还原实验等生理生化反应进一步验证目的菌株，结果如表1所示。
表1、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c生理生化反应
挑取单菌落接种至NB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，取1-5ml菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。16S rRNA通用引物8f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')对该菌株基因组DNA扩增并送至上海生工生物公司测序。BLAST软件比对分析该菌株与以下菌株的同一性可达98％：Bacillus velezensis FZB42(98％),Bacillus subtilis subsp.subtilis 168(98％),Bacillus subtilis IAM 12118(98％),Bacillus amyloliquefaciens MPA 1034(98％),Bacillus amyloliquefaciens NBRC 15535(98％)；MALDI-TOF质谱分析其与Bacillus subtilis准确率达2.201。
综合测序与生理生化反应结果确定该菌株属于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c，将其送入中国典型培养物保藏中心(武汉大学)进行保藏，保藏号为CCTCC M 2018565。
二、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的抗病抑菌作用
在实验室研究基础上选用改良后的Maynell’s培养基作为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的发酵培养基，其成分与发酵条件如下：糖蜜–3.0％，蛋白胨–2.0％，K2HPO4×3H2O–0.7％，KH2PO4–0.3％，(NH4)2SO4–0.15％，柠檬酸钠×2H2O–0.05％，MgSO4×7H2O–0.01％，余量为水，рН6.8；培养条件为：30℃培养28h，搅拌速率180rpm/min。
采用平板打孔拮抗法测定枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对农业主要致病细菌和真菌的抑制作用，下层培养基为2％NA培养基，凝固后取1ml病原菌与5ml 1.2％NA培养基(1.2％PDA培养基)充分混匀作上层培养基，凝固后打孔器打孔，加入100μl枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c菌液，于冰箱内静置2h，37℃(细菌)/28℃(真菌)正置培养48小时。通过测量抑菌圈直径，检测待测菌的抑菌能力，表2、表3。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对植物真菌病原菌(尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、链格孢、灰霉病病原菌、核盘菌、小麦根腐病病原菌、虫疫病病原菌)和植物细菌病原菌(欧文式杆菌、根癌土壤杆菌、黄单胞菌、波氏假单胞菌、丁香假单胞菌、番茄溃疡病菌、马铃薯黑胫病菌)均有良好的抑制作用，抑菌圈分别为24-30mm和20-30mm。
表2、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对植物真菌病原菌的抑制作用
表3、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c对植物细菌病原菌的抑制作用
三、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c的应用
水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27菌种保藏单位为武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2018566。水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27其培养基及发酵条件为：玉米淀粉3.0％，蛋白胨2.0％，K2HPO4×3H2O 0.7％，KH2PO4 0.3％，(NH4)2SO4 0.15％，柠檬酸钠×2H2O 0.05％，MgSO4×7H2O 0.01％，余量为水，рН 6.8；37℃，搅拌速率150rpm/min，培养48小时，获得水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27发酵液。
枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M 2018563，其菌液制备方式：糖蜜3.0％，蛋白胨2.0％，K2HPO4×3H2O 0.7％，KH2PO4 0.3％，(NH4)2SO4 0.15％，柠檬酸钠×2H2O 0.05％，MgSO4×7H2O 0.01％，余量为水，рН6.8；37℃，搅拌速率180rpm/min，培养28小时，获得枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)发酵液。
1、复合制剂的产品特征
一种复合制剂，由水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液按照一定比例制得。设置不同的比例配比产品：
配方1、水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝1:1:1；
配方2、水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝3:3:4；
配方3、水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝2:4:4。
对复合制剂的基本特性进行测定，情况如表4所示：复合制剂为液态深褐色，具有特殊气味，pH值7.5-8.0，活菌数为≥10亿cfu/ml。复合制剂对植物病原真菌和植物病原细菌均有拮抗作用，本实施例中以尖孢镰刀菌及丁香假单胞菌作为真菌病原菌及细菌病原菌的代表，对其抑菌作用进行考察，抑菌圈分别为24(2)9mm和23-27mm(表5)。
表4、复合制剂的基本特性
表5、复合制剂对植物病原菌的拮抗作用
2、复合制剂的植物保护作用
将三株菌的发酵液按照三个配方中的比例分别混合后，稀释50倍，得到三个2％浓度的复合制剂，2％浓度的复合制剂(三个配方)分别处理后的番茄、黄瓜、生菜种子，感染根腐病病原菌后置于培养箱内培养，2周后统计各组根腐病发病率(表6)，病情分级标准：0级，全植株无病；1级，茎基部有很少病斑，占茎基部面积1/5以下；2级，茎基部有少数病斑，占茎基部面积的1/5-1/3；3级，茎基部有许多病斑，占茎基部面积1/3-2/3，叶片出现黄叶现象；4级，茎基部全部染病斑，植株枯萎。
表6、复合制剂的植物保护作用
统计结果显示经2％浓度的复合制剂处理后可以使根腐病的发病率降低25-52％。
综合复合制剂拮抗实验与植物保护实验效果，三种发酵液比例为1:1:1时复合制剂的植物保护作用与抑菌效果最好。
3、复合制剂的大棚实验
复合制剂使用方法的研究及使用效果评价在番茄大棚中展开实验，大棚占地500m2，共分为5组，每组占地面积100m2，栽番茄苗300棵，每组使用有机肥与无机肥量相同，除以下变量外，实行统一管理。每周取样一次，定期测定植株的产量及病害发展。
实验组一：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝1:1:1，微生物制剂的使用量为18ml/m2，随水冲施，不使用农药；
实验组二：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝3:3:4，微生物制剂的使用量为18ml/m2，随水冲施，不使用农药；
实验组三：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)，与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c发酵液＝2:4:4，微生物制剂的使用量为18ml/m2，随水冲施，不使用农药；
对照组1：正常使用农药。
对照组2：不使用农药。
使用复合制剂可有效提高果实产量(表7)，其中实验组一中果实收获产量比对照组高15.82％，且实验组一较另两个实验组效果稍好。
表7不同实验组中番茄不同时间收获产量(kg)
注：A-对照组1，B-实验组一，C-实验组二，D-实验组三
表8、复合制剂对番茄病害的防效
注：A-对照组1，B-对照组2，C-实验组一，D-实验组二，E-实验组三
于番茄苗栽种后开始统计病发情况，表8结果显示，使用本制剂可有效防治番茄生长过程中出现的病害，实施例一对植株病害的防治效果稍好于使用农药的对照组，该结果说明该复合制剂一定程度上可以替代农药达到防治病害的目的。
4、番茄果实品质鉴定
番茄生长90-100天进行果实采摘，每组选择果实1-3个，测定可溶性糖含量、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸、番茄红素等指标(表9)。结果显示，使用复合制剂产品的实验组各指标均有所提高。其中，实验组维生素C、番茄红素与可溶性蛋白提升明显。
表9、复合制剂对番茄果实品质的影响
注：A-对照组1，B-实验组一，C实验组二，D-实验组三
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东碧蓝生物科技有限公司
<120> 一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用
<130> 2010
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1429
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌21c 16S rDNA
<400> 1
ctatacatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg 60
gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120
ataccggatg gttgtctgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc ggctaccact 180
tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga 240
tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300
tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg 360
cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtgccgt 420
tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480
cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg 540
caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa 600
actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg 720
agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc 840
gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct 960
ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt 1020
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc 1080
ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200
gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt 1260
tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320
catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1380
tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt taggagccag ccgccgaag 1429

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c，其特征在于，所述菌株已于2018年8月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，其生物保藏号为：CCTCC M 2018565。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c，其特征在于，所述菌种的培养基为糖蜜2.5～3.5％，蛋白胨1.5～2.5％，K2HPO4×3H2O 0.5～1.0％，KH2PO4 0.2～0.5％，(NH4)2SO4 0.1～0.3％，柠檬酸钠×2H2O 0.02～0.08％，MgSO4×7H2O 0.008～0.012％，余量为水，рН6-7。
3.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c和/或所述菌的培养物。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌的培养物通过以下方法制备：将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c接种于培养基中26～34℃下培养24～48h，搅拌速率100～260rpm/min。
5.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c、水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)和/或各菌株的培养物；其中，所述水生拉恩氏菌(R.aquatilis)于2018年8月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2018566；所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)菌株于2018年8月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号CCTCC M 2018563。
6.如权利要求5所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c：水生拉恩氏菌(R.aquatilis)27：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)4(2)的比例为0.8-3:0.8-3:0.8-4；优选的，为1:1:1；优选的，所述复合菌剂中，有效活菌数为≥10亿cfu/mL。
7.如权利要求3或4所述的菌剂或权利要求5-7任一项所述的复合菌剂，其特征在于，所述菌剂或复合菌剂的剂型为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；优选的，为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂；优选的，所述菌剂或复合菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)21c、权利要求3或4所述的菌剂或权利要求5-7任一项所述的复合菌剂在下列任一方面的应用：
(1)抑制植物真菌病原菌及植物病细菌病原菌；
(2)提高果实品质；
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述所述植物真菌病原菌包括但不限于尖孢镰刀菌、水稻纹枯病菌、链格孢、灰霉病病原菌、核盘菌、小麦根腐病病原菌、虫疫病病原菌。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述所述植物细菌病原菌包括但不限于欧文式杆菌、根癌土壤杆菌、黄单胞菌、丁香假单胞菌、番茄溃疡病菌、马铃薯黑胫病菌；或所述促进植物生长体现在提高果实品质；优选的，提高番茄果实中包括但不限于可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、可滴定酸及番茄红素的含量；所述植物包括但不限于番茄、生菜、黄瓜和小麦。
CN201910503024.1A 2019-06-11 2019-06-11 一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用 Active CN110172428B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910503024.1A CN110172428B (zh) 2019-06-11 2019-06-11 一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910503024.1A CN110172428B (zh) 2019-06-11 2019-06-11 一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110172428A true CN110172428A (zh) 2019-08-27
CN110172428B CN110172428B (zh) 2021-03-12

Family

ID=67698110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910503024.1A Active CN110172428B (zh) 2019-06-11 2019-06-11 一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110172428B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471624A (zh) * 2020-04-25 2020-07-31 浙江师范大学 贝莱斯芽孢杆菌csqxdz26菌株及其应用
CN112125747A (zh) * 2020-06-04 2020-12-25 单舒馨 酶解豆磷脂微生物菌剂
CN112998032A (zh) * 2021-03-02 2021-06-22 广东省科学院生物工程研究所 一种农作物叶面喷施型芽孢杆菌菌剂及其制备方法
CN113980834A (zh) * 2021-09-23 2022-01-28 中化农业（临沂）研发中心有限公司 枯草芽孢杆菌及其在肥料中的应用
CN114874931A (zh) * 2021-12-22 2022-08-09 河北省科学院生物研究所 一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用
CN115141785A (zh) * 2022-08-26 2022-10-04 甘肃省科学院生物研究所 一种枯草芽孢杆菌及其在甘蓝种植中的应用
CN115226718A (zh) * 2022-05-13 2022-10-25 安徽久易农业股份有限公司 一种含有枯草芽孢杆菌与丙硫菌唑的杀菌组合物及其制备方法和应用
CN116042492A (zh) * 2023-03-07 2023-05-02 潍坊科技学院 一种短小芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998050422A1 (en) * 1997-05-09 1998-11-12 Agraquest, Inc. A novel strain of bacillus for controlling plant diseases and corn rootworm
CN101012444A (zh) * 2007-02-02 2007-08-08 中国农业大学 水生拉恩氏菌hx2及其应用
CN101148650A (zh) * 2007-09-03 2008-03-26 河北省农林科学院植物保护研究所 一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用
CN102433282A (zh) * 2011-12-16 2012-05-02 华南农业大学 枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998050422A1 (en) * 1997-05-09 1998-11-12 Agraquest, Inc. A novel strain of bacillus for controlling plant diseases and corn rootworm
CN101012444A (zh) * 2007-02-02 2007-08-08 中国农业大学 水生拉恩氏菌hx2及其应用
CN101148650A (zh) * 2007-09-03 2008-03-26 河北省农林科学院植物保护研究所 一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用
CN102433282A (zh) * 2011-12-16 2012-05-02 华南农业大学 枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471624A (zh) * 2020-04-25 2020-07-31 浙江师范大学 贝莱斯芽孢杆菌csqxdz26菌株及其应用
CN111471624B (zh) * 2020-04-25 2023-02-24 浙江师范大学 贝莱斯芽孢杆菌csqxdz26菌株及其应用
CN112125747A (zh) * 2020-06-04 2020-12-25 单舒馨 酶解豆磷脂微生物菌剂
CN112998032B (zh) * 2021-03-02 2021-12-17 广东省科学院生物工程研究所 一种农作物叶面喷施型芽孢杆菌菌剂及其制备方法
CN112998032A (zh) * 2021-03-02 2021-06-22 广东省科学院生物工程研究所 一种农作物叶面喷施型芽孢杆菌菌剂及其制备方法
CN113980834A (zh) * 2021-09-23 2022-01-28 中化农业（临沂）研发中心有限公司 枯草芽孢杆菌及其在肥料中的应用
CN113980834B (zh) * 2021-09-23 2022-08-30 中化农业（临沂）研发中心有限公司 枯草芽孢杆菌及其在肥料中的应用
CN114874931A (zh) * 2021-12-22 2022-08-09 河北省科学院生物研究所 一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用
CN115226718A (zh) * 2022-05-13 2022-10-25 安徽久易农业股份有限公司 一种含有枯草芽孢杆菌与丙硫菌唑的杀菌组合物及其制备方法和应用
CN115141785A (zh) * 2022-08-26 2022-10-04 甘肃省科学院生物研究所 一种枯草芽孢杆菌及其在甘蓝种植中的应用
CN115141785B (zh) * 2022-08-26 2023-07-25 甘肃省科学院生物研究所 一种枯草芽孢杆菌及其在甘蓝种植中的应用
CN116042492A (zh) * 2023-03-07 2023-05-02 潍坊科技学院 一种短小芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用
CN116042492B (zh) * 2023-03-07 2023-06-27 潍坊科技学院 一种短小芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110172428B (zh) 2021-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110172428A (zh) 一种具有抗病及提高果实品质的枯草芽孢杆菌及其应用
CN104762223B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌ba-ka3及其应用
CN104164394B (zh) 一株拮抗植物病原菌的菌株及其应用
RU2634386C2 (ru) Штамм microbacterium, композиции и способы для борьбы с фузариозом
CN105219681B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM及制备方法和应用
CN103695356B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌和微生物菌剂及其应用
CN106455580A (zh) 用于改良玉米产量的方法和组合物
CN102433282A (zh) 枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用
CN108034618A (zh) 暹罗芽孢杆菌菌株及其应用
CN109266589A (zh) 一株抑制炭疽菌和镰刀菌的杰米拉类芽孢杆菌及其应用
CN104673705B (zh) 一株防治小麦赤霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN110205273A (zh) 一种具有促生长及抗病作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN104651260A (zh) 一种短短芽孢杆菌bbc-3及其应用与菌剂制备
CN106479934A (zh) 一种灰霉病菌拮抗菌株及其筛选方法和应用
CN114214220A (zh) 一株苏云金芽孢杆菌及其在促进植物生长中的应用
CN112143686A (zh) 一种拮抗水稻黄单胞菌的高地芽孢杆菌st15及其应用
CN108795830A (zh) 一种埃吉类芽孢杆菌（Paenibacillus elgii）SWL-W8及其应用
CN105567600A (zh) 黄萎病菌拮抗菌及其应用
CN104894008B (zh) 一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
US20230225329A1 (en) Boxwood endophyte burkholderia sp ssg as potential biocontrol agent against a wide range of pathogens
Kumar et al. Trichoderma spp.: Identification and characterization for pathogenic control and its potential application
CN107164233B (zh) 一种球毛壳菌lj-s2l1菌株及其应用
Singh et al. Plant growth promoting microbial consortia against late blight disease of tomato under natural epiphytotic conditions
AU2018267591B2 (en) An Herbicidal Composition for Controlling Parthenium Weed and Strain Thereof
CN110257286A (zh) 一株能抑制病原真菌的解淀粉芽孢杆菌

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Bacillus subtilis with disease resistance and improving fruit quality and its application

Effective date of registration: 20211122

Granted publication date: 20210312

Pledgee: Shandong Ningyang Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: SHANDONG GREENBLUE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Registration number: Y2021980012896

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Date of cancellation: 20221116

Granted publication date: 20210312

Pledgee: Shandong Ningyang Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: SHANDONG GREENBLUE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Registration number: Y2021980012896

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A Bacillus subtilis with disease resistance and improved fruit quality and its application

Effective date of registration: 20221117

Granted publication date: 20210312

Pledgee: Shandong Ningyang Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: SHANDONG GREENBLUE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Registration number: Y2022980022154