KR20030054129A

KR20030054129A - 파리목 해충에 대해 방제효과를 가지는 바실러스슈린지에스 균주 및 이를 이용한 미생물 살충제의 제조방법

Info

Publication number: KR20030054129A
Application number: KR1020010084244A
Authority: KR
Inventors: 문병주; 이수희; 김현주; 송주희; 이재필; 김철승; 임은경
Original assignee: 학교법인 동아대학교; 문병주
Priority date: 2001-12-24
Filing date: 2001-12-24
Publication date: 2003-07-02
Also published as: KR100458765B1

Abstract

본 발명은 파리목 해충에 대해 방제효과를 가지는 바실러스 슈린지에스 균주 및 이를 이용한 미생물 살충제의 제조방법에 관한 것으로, 느타리 버섯 재배지의 버섯파리 병사충으로부터 분리한 바실러스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스 D(Bacillus thuringiensissubsp.israelensisD)는 파리목 해충, 특히 버섯파리 유충에 높은 살충효과를 나타내어, 미생물 살충제로써 뛰어난 효과가 있는 한편, 상기 곤충병원성 균주를 이용한 미생물 살충제 제조방법은 생산단가가 저렴하고, 부산물 생성등의 문제가 없어 환경친화적일 뿐만 아니라 균주들의 생육이 양호하여 대량생산할 수 있는 효과가 있다.

Description

파리목 해충에 대해 방제효과를 가지는 바실러스 슈린지에스 균주 및 이를 이용한 미생물 살충제의 제조방법{Bacillus thuringiensis strain for controlling dipteran pests and method for producing biological pesticide using it}

본 발명은 곤충병원성 세균인 바실루스(Bacillus sp.)균주를 이용한 생물학적 방제에 관한 것으로 더욱 상세하게는 버섯파리 병사충으로부터 바실루스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스 D(Bacillus thuringiensissubsp.israelensis) 균주를 분리·동정하고, 상기 균주를 이용하여 느타리 버섯 재배시에 발생하는 버섯 파리의 생물학적 방제에 관한 것이다.

최근 국민소득의 증가와 식생활 패턴의 변화로 버섯 소비량이 증가되면서 버섯 재배면적이 급격히 증가하고 있는데 이들 버섯 중 가장 생산량이 많은 것은 느타리버섯이다. 그러나 시설내에 재배되는 버섯 재배의 특수성 때문에 병해충의 발생이 극심하여 고품질 버섯 생산에 막대한 지장을 초래하고 있다.

느타리버섯 재배사에 발생하는 해충은 주로 선충, 응애, 달팽이류, 버섯 파리류 등이 보고되어 있으나, 이 중 버섯파리류에 의한 피해가 가장 심각한 것으로 알려져 있다(Hussey, N. W. 1959. Biology of mushroom phorids.Mushroom Science Ⅳ :260∼270.). 버섯파리의 감염은 재배초기에 자연상태에서 서식하다가 느타리버섯의 재배 시작과 함께 균상에 산란하고, 유충이 부화되면서 버섯의 균사체와 자실체를 섭식하여 버섯의 품질을 저하시킨다. 게다가, 각종 병원체를 매개하여 간접적인 피해를 더하는 것으로 알려져 있다(Kim, K. P. and Hwang, C. Y. 1996. An investigation of insect pest on the mushroom (Lentinus edode, Pleurotus osteratus) in south region of Korea.Korean J. Appl. Entomol.35(1): 45∼51). 최근 버섯파리중 리코리엘라 말리[Lycoriella mali(Sciaridae)]와 코볼디아 후스시페스[Coboldia fuscipes(Scatopsidae)]가 느타리버섯에 전국적으로 연중 발생하는 것으로 알려져 있어, 향후 이들 버섯 파리류에 의한 느타리버섯 재배에 큰 피해가 우려된다(Kim, S. R., Choi, K. H., Cho, E. S., Yang, W. J., Jin, B. R. and Sohn, H. D. 1999. An inverstigation of the major dipteran pests on the oyster mushroom(Pleurotus ostreatus) in Korea.Korea J. Appl. Entomol. 38(1): 41∼46).

한편, 버섯파리 방제용 약제에 대한 연구로서 Cantelo(Cantelo, W. W. 1979.Lycoriella mali: Control in mushroom compost by incorporation of insecticides into compost.J. Econ. Entomol. 72: 703∼705.)는 다이아지논(diazinon), 클로르피리포스(chlorpyrifos), 페토프렌(methopren)을 보고하였으며, Snetsinger 등(Snetsinger, R. 1978. Morcap 10% granular insecticide for larval Sciarid fly cintrol.Mushroom News. 26(4): 12∼14.)은 몰캡(morcap)등을 방제용 약제로 보고한 바 있다. 국내서도 두스반(dusban), 프리미사이드(primicide), 디시스톤(disyston)등을 느타리버섯 종균재식시 퇴비에 혼합하거나 표면살포하면 방제효과가 있었다고 하였다(김태산, 김광포. 1981. 버섯파리 방제약제 선발시험. 시험연구보고서(농업기술연구소 생물부), 660∼671.). 또한, 전 등(전창성, 유창현, 차동렬. 1990. 디밀린수화제 처리에 따른 느타리버섯파리 방제 효과에 관한 연구. 농진청, 농시논문집32(2): 58∼63.)에 의하면 주론(디밀린)수화제를 느타리버섯 종균재식시의 4, 8g/m²을 종균에 혼합하거나, 하온시의 4g/m²을 살포하면 뚜렷한 방제효과가 있다고 하였다. 주론 수화제와 테프루벤주론액상 수화제가 버섯파리의 방제약제로서 품목고시 되어있다(농약사용지침서, 1999). 그러나 화학살충제의 지속적인 사용으로 인한 잔류독성 및 저항성 발현 등 여러 가지 사회문제가 야기됨을 보고하였고(김태산, 김광포. 1981. 버섯파리 방제약제 선발시험. 시험연구보고서(농업기술연구소 생물부), 660∼671.), 다이아지논(diazinon)의 연용으로 약제내성이 발생하여(Cantwell, G. E. andCantelo, W. W. 1984. Effectiveness ofBacillus thuringiensisvar.israelensisin controlling a Sciarid fly,Lycoriella mali, in mushroom compost.J. Econ. Entomol.77: 473∼475.) 환경친화적인 생물학적 방제가 관심의 대상이 되고 있다.

곤충병원성 세균인 바실루스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스[Bacillus thuringiensissubsp.israelensis(이하B. t. israelensis로 표시)]을 이용한 버섯파리의 생물학적 방제연구가 시도되고 있으나 연구가 극히 미진한 실정에 있어(Cantwell, G. E. and Cantelo, W. W. 1984. Effectiveness ofBacillus thuringiensisvar.israelensisin controlling a Sciarid fly,Lycoriella mali, in mushroom compost.J. Econ. Entomol.77: 473∼475.), 본 발명에서는 느타리버섯 재배사의 버섯파리 병사충에서 곤충병원성 세균을 분리하여 살충효과가 우수한 균주를 선발한 후 생물학적 방제를 위한 효과적인 미생물 살충제를 개발하고자 하였다.

본 발명의 목적은 느타리 버섯의 가해충인 버섯파리에 기주 특이적 독성을 지니는 곤충병원성 세균인 바실루스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스 D(B. t. israelensis) 균주를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 곤충병원성 균주와 값이 저렴하고 구입하기 쉬운 천연고분자 재료를 사용하여 버섯파리 방제용 생물농약 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법에 의해 제조된 미생물 살충제를 제공함에 있다.

이하 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 느타리버섯 재배지의 버섯파리 병사충에서 분리한 다양한 종(species)의 살충효과를 비교한 결과이다.

도 2는 느타리버섯 재배지의 버섯파리 병사충에서 분리한 본 발명 균주 바실러스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스 D(Bacillus thuringiensissubsp.israelensisD; 이하 'Bti-D'라고 약칭함)의 살균효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명 Bti-D 균주의 버섯파리 유충의 발육단계에 따른 살충효과를 나타낸 결과이다.

도 4는 본 발명 Bti-D 균주에 감염된 버섯파리 유충을 나타낸 사진이다.

도 5는 본 발명 Bti-D 균주의 전자현미경사진이다.

도 6은 본 발명 Bti-D 균주의 내생포자(endospores)와 내독소(parasporal inclusions)를 보여주는 사진이다.

도 7은 SDS-PAGE하여 내독소의 단백질 패턴을 확인한 결과이다.

도 8은 본 발명 Bti-D 균주의 플라스미드 패턴을 확인한 결과이다.

도 9는 느타리 버섯의 소형상자 재배시 버섯파리 유충에 대한 본 발명 균주의 방제효과를 조사한 결과이다.

도 10은 본 발명 곤충병원성 세균이 느타리 버섯 균사밀도에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 11는 느타리 버섯의 병재배시 버섯파리 유충에 대한 본 발명 균주의 방제효과를 조사한 결과이다.

도 12는 본 발명 배지 조성물에서의 배양한 결과이다.

도 13은 본 발명 균주를 이용하여 제조한 살충제의 버섯파리 방제효과를 검정한 결과이다.

도 14는 본 발명 살충제가 pH의 변화에 따른 버섯파리 방제효과에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 느타리버섯을 가해하는 버섯파리 병사충으로부터 각종 병원성 세균을 분리하고, 이중 가장 높은 살충력을 보이는 균을 분리·동정하여 바실러스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스 D(Bacillus thuringiensissubsp.israelensisD)라 명명하였다.

상기 곤충병원성 세균은 파리목 해충에 내부 독성이 탁월한 균주로 특히, 느타리버섯을 가해하는 버섯파리인 리코리엘라 말리(Lycoriella mali), 코볼디아 후스시페스(Coboldia fuscipes(Scatopsidae)에 대해 탁월한 독성을 나타낸다.

또한, 본 발명은 상기 곤충병원성 세균과 염가의 기질을 첨가하여 대량배양하고, 이로부터 배양액을 얻어 곤충병원성 세균이 생산하는 독성 화합물을 유효성분으로 하는 살충제 조성물로 제공한다.

버섯파리용 미생물살충제 제제화에 있어서는 버섯재배실의 실내환경이라는 특수성 때문에 강우등에 의한 BT의 독소 손실을 막기 위한 제제의 부착성, 자외선의 차단성을 높이거나 잎표면의 화학적 조성에 관련된 부가제 첨가는 고려할 필요가 없어서 미생물 살충제의 공정과정을 줄일 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 점에 착안하여 콩, 비지, 밀기울추출물, 밀기울등의 농가 부산물 및 농가 폐기물을 대량 배양용 기질로 이용하였는데, 이중 비지(bean-curd dregs)는 대량 배양시 곤충병원성 세균의 밀도를 높여 주고, 시중에서 비교적 쉽게 구할 수 있으며 염가여서 배지의 가격을 낮출 수 있을 뿐만 아니라, 다른 영양물질을 전혀 첨가하지 않아도 살충성분이 다량 생성되는 풍부한 영양원으로 이용될 수 있다.

미생물 농약의 제제화에 있어서, 상기 곤충병원성 미생물을 비지배지에서 대량배양하고, 그 배양액에 천연고분자 재료인 옥수수전분, 솔잎가루, 콩가루, 미역가루, 양배추가루, 당근가루를 제제별로 혼합하여 건조한 후, 마쇄하고 수화제형 미생물농약으로 제조한다. 이때 옥수수 전분은 미생물농약이 식물체의 잎에 잘 부착되도록 하는 전착제 역할을 하며, 햇빛으로부터 세균을 보호하는 보호제 역할을 할 뿐만 아니라 가루 형태(powder type)로 제조하기 쉽게 만들어 주는 작용을 한다.

본 발명 미생물 살충제에 글루코스, 펩톤, MgCl_2,CaCO₃, FeSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, KH₂PO₄및 버뮤큘레이트(vermiculite) 중에서 선택된 1종 이상의 것을 기초대사를 위한 영양원 및 미생물 안정제로서 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 세균배양액 1L에 천연고분자 재료를 400g 첨가한 혼합물에 글루코스 2.0g, 펩톤 2.0g, MgCl₂0.04g, CaCO₃2.0g, FeSO₄·7H₂O 0.12g, MnCl₂·4H₂O 0.02g, KH₂PO₄0.1g, 버미큘라이트(vermiculite) 40.0g을 첨가한다.

본 발명에서 개발한 제제 중 가장 효과가 우수한 Bti-D균주의 수화형 WCS제제(천연고분자 재료로 옥수수전분을 첨가한 제제)를 느타리버섯 병재배시에 처리할 경우, 버섯파리의 방제가는 Bti-D의 생균처리보다 높았으며, 이 WCS제제를 살포하기 위하여 희석할 때 pH 8로 보정된 물을 사용할 경우에는 방제가가 현저하게 상승하였는데 이는 WCS제제 성분 중 옥수수전분이 버섯파리의 습식을 촉진한 결과이다.

본 발명 미생물 살충제는 수화제로 제조하였으나, 입제, 액상수화제, 분제 등의 형태로 제형화될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 곤충병원성 세균의 분리, 살충효과 검정을 통한 균주 선발 및 상기 균주의 동정

제1단계: 곤충병원성 세균의 분리

각종 곤충의 병원성 세균으로 확인된 바실루스 슈린지에스(B. t.) 15 아종을 서울대학교 응용생물화학부 곤충병리·유전공학 연구실에서 분양받아 하기 제 2단계의 살충효과검정에 공시하여 실험을 수행하는 한편, 전국 느타리버섯 재배지와 버섯파리 병사충에서 일반세균 284 균주와 바실루스 속(Bacillussp.)으로 추정되는 53균주를 분리하여 사용하였다.

상기 버섯파리 병사충에서 균을 분리하는 방법은 일반적인 Bt 균주분리법에따라 분리하였다(Ohba, M, K. Aizawa. J. Invertebr. Pathol. 32: 303-309. Park, S. H., B. et al., J. Appl. Mocrobial. Biotechnol. 25:159-165). 대한민국 전국 느타리버섯 재배지에서 채집한 버섯파리 병사충을 시험관에 넣고 멸균증류수 10 ㎖로 현탁하여 2분간 강하게 교반한 다음, 80℃에서 10분 동안 열처리하였다. 이를 1000배로 희석하여 희석액 300 ㎕를 영양 평판배지(Nutrient agar)위에 도말하고 30℃에서 5일간 배양하였다. 형성된 콜로니들을 위상차 현미경으로 관찰하여 포자와 내독소 단백질 결정체(Crystal protein)를 형성하는 것을 비티 균주로 선발하였다. 선발된 콜로니를 순수배양하여 4℃에서 보관하였다.

제 2단계: 살충효과 검정을 통한 균주 선발

감자한천배지(PDA)에 원형느타리 1호 종균을 이식하여 25℃에서 15일간 배양한 다음 공시 세균부유액 1㎖(1×10⁸spores/㎖)을 종균 균총에 골고루 도말하고 24시간 풍건하였다.B. t.와 바실루스속 세균은 영양액체(NB, nutrient broth)배지에 6일동안 그리고 일반세균은 2일동안 30℃, 120rpm에서 진탕 배양한 것을 사용하였다. 페트리디쉬내에서 24시간 절식시킨 공시 버섯파리 3령 유충 100마리를 공시세균으로 도말하여 풍건한 버섯종균 감자한천배지에 이식하고 다음날부터 6일 후까지 치사 유충수를 조사하여 살충율이 가장 큰 균주를 곤충 병원성 세균으로 선발하였다.

실험결과, 분양 받은B. t.와 바실루스속 세균들은 모두 살충률이 13.2 % 이하로서 매우 낮았으나, 느타리 버섯재배지의 버섯파리 사충에서 분리한 일반세균 284균주 중 6균주는 버섯파리 유충에 높은 병원성을 보여 동정하였는데, 세라티아 마르센스(Serratia marscens)인 SC2와 KH3 균주의 살충율은 각각 76.7%, 73.3%였고, 살모넬라 속(Salmonellasp.)의 MFA5는 66.7%, 슈도모나스 속(Pseudomonasspp.)인 HK4와 SH4는 각각 63.3%, 43.3%, 버콜데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)의 KH1 균주는 50.0%의 살충효과를 보였다(도 1). 또한 동일한 느타리 버섯재배지의 버섯파리 병사충에서 분리한 바실루스속으로 추정되는 53균주 중 2개의 균주가 높은 병원성을 보였는데, Bti-D 및 Bti-U의 살충율은 각각 82.3%, 87.3%이었다(도 2). 이상의 결과, 곤충 병원성 세균 8균주 중 바실루스속 두 균주는 살충효과가 높을 뿐만 아니라 내생포자를 형성하므로 버섯파리의 생물학적 방제용 미생물로서 Bti-D와 Bti-U 균주를 우수 곤충병원성 세균으로 선발하였다. 한편 이들 선발세균에 의한 살충효과 검정시 효율성을 높이기 위하여 버섯파리 유충의 발육단계에 따른 살충효과를 검정하였는데, Bti-D와 Bti-U 두균주 모두 3령에서 높은 살충효과를 보였다(도 3).

선발된 곤충병원성 세균인 Bti-D와 Bti-U의 접종에 의해 감염된 버섯파리 유충에 나타난 병징의 증상은 감염초기에 중장의 앞부분이 연한 갈색을 띄고, 차츰 중장의 뒷부분까지 진행되어 중장의 전부분이 흑갈색으로 변색되면서 치사되었으며, 중장 뒷부분에 타원형의 투명부가 형성되고 이 부위가 분해되기 시작하면서 결국 사충체 전체가 분해되는 특징을 보였다. 한편 선발 세균에 의해 감염은 되었으나, 병진전 속도가 느린 유충은 용으로 변태되었지만 기형으로 변하였으며 용의 가슴부분이 분해되어 결국 치사되는 증상을 보였다(도 4).

상기와 같은 결과에 근거하여 가장 높은 곤충병원성을 나타낸 Bti-D와 Bti-U 두균주를 선발하였다.

제 3단계: 선발세균의 동정

선발된 우수 곤충병원성 세균을 동정하기 위하여 생화학적, 배양적 및 생리적 특성을 버기스 메뉴얼(Bergey's manual)에 따라 조사하였고, 형태적 특성은 1% PTA음성 염색법(PTA Negative stain)으로 주사전자현미경(SEM)하에서 관찰하였으며, 바실루스속의 내생포자와 내독소 단백질은 형광현미경을 이용하였으며, 동정을 위해 바이올로그 시스템(Biolog system)을 사용하였다. 바실루스 슈린지에스로 동정된 된 후에는 아종을 확인하였는데, 장 등(장진희, 노종열, 제연호, 이대원, 우수동, 설광열, 강석권. 1996. 거세미 나방속 해충에 독성을 가지는Bacillus thuringiensis균주의 분리 및 특성. 한잠학.)의 방법에 따라, 편모항체와 공시균주들을 동량으로 섞어 응집반응여부를 조사하여 편모항원성을 검정하였고 공시균주의 내독소 단백질 패턴은 Laemmli(Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature. 227: 680∼685.)의 SDS-PAGE로 조사하였으며, plasmid DNA패턴은 Birnboim 와 Doly(Birnboim, H. C. and Doly, J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.Nucleic Acids Res.7: 1513∼1523.) 방법에 따라 조사하였다. 그 결과, 버섯파리 유충에 높은 살충효과를 보인 Bti-D와Bti-U 균주들은 모두 바실루스 슈린지에스로 동정되었으며(표 1, 도 5, 6), 아종 확인을 위한 편모항원성 조사 결과, 두 균주 모두 서브스페시스 이스렐렌시스와 동일한 H14의 편모항체와 응집반응을 보여 바실루스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스로 동정되었는데, 정확성을 기하기 위하여 내독소 단백질 패턴을 SDS-PAGE로 조사하여 serotype 14인 바실루스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스와 선발 세균인 Bti-D와 Bti-U을 비교하였는데 세 균주 모두 거의 유사한 밴드 패턴을 보였다(도 7). 하지만, Bti-D와 Bti-U의 plasmid 패턴을 조사한 결과, 바실루스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스와는 상이한 결과를 보였다(도 8). 이러한 결과는 바실루스 슈린지에스의 아종이 동일하더라도 균주에 따라서 버섯파리에 대한 독성이 다른 것으로 추정되었다.

상기와 같이 동정한 균주 중 가장 높은 살충효과를 나타내는 균주 Bti-D를Bacillus thuringiensissubsp.israelensisD로 명명함과 동시에, 2001년 12월 7일자로 생명공학연구소내 미생물 기탁센터에 기탁하여, 기탁번호 KCTC 10130BP를 부여받았다.

공시 곤충병원성 세균의 동정

Characteristics	Isolates	B. thuringiensis ^a
Characteristics	Bti-D	B. thuringiensis ^a	Bti-U
Gram staining	+^b	+	+
Endospore	+	+	+
Shape	rod	rod	rod
Parasporal inclusions	+	+	d
Motility	+	+	+
Catalase	+	+	+
Indole	-	-	-
Voges-Prokauer test	+	+	+
Growth in NaCl
2.0%	+	+	+
5.0%	+	+	+
7.0%	+	+	+
Growth at
5℃	-	-	-
10℃	-	-	d
30℃	+	+	+
40℃	+	+	+
50℃	-	-	-
Growth at pH
6.8	+	+	+
5.7, nutrient broth	+	+	+
Acid from
D-Glucose	+	+	+
D-Mannitol	-	-	-
D-Xylose	-	-	-
L-Arabinose	-	-	-
Hydrolysis of
Casein	+	+	+
Gelatin	+	+	+
Starch	+	+	+
^a버기스 메뉴얼(Data from Bergey`s manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2. 1122-1129)^bSymbols: -; 음성반응, +; 양성반응n, d; 11-89% 사이의 양성반응.

실시예 2: 곤충병원성세균(생균)에 의한 버섯파리의 방제효과 검정

병배지와 소형상자 배지에 느타리버섯 종균을 접종하고 재배실에 보관 48시간 후에 종균의 균사가 배지의 표면에 착상하고 있을 때, 선발 곤충병원성세균의 부유액을 균총표면위에 골고루 접종하였는데 이때 부유액의 접종양은 병재배에서는 3㎖(1×10⁸spores/㎖), 소형상자에서는 8㎖(1×10⁸spores/㎖)을 처리하였다. 세균을 접종한 후, 버섯재배실에 보관하면서 48시간 후에 공시버섯파리 3령충을 병 당 또는 소형상자 당 100마리씩 접종하고 재배실에 배양하면서 유충접종 7∼14일 후에 살아있는 성충수를 조사하여 방제가로 환산하였다. 환산식은 다음과 같다.

그 결과, 병재배시에는 Bti-D와 Bti-U의 방제가가 각각 74.4%, 64.2%였으며(도 9). 이 경우 느타리버섯 균사의 밀도를 함께 비교한 결과, 곤충병원성 세균인 Bti-D, Bti-U와 유충처리에서는 곤충병원성 세균과 유충의 무처리구에 비하여 약 80%의 균사밀도를 보인 반면, 유충만 처리할 경우에는 20% 정도의 균사밀도를 보여 선발 세균 처리시의 방제가와 거의 같은 경향이었으며(도 10), Bti-D와 Bti-U 균주의 처리가 느타리버섯 균사생육에는 어떤 억제영향도 미치지 않았다. 또한, 동일한 방법으로 느타리버섯 소형상자재배시에는 Bti-D의 방제가는 75.8%로써 병재배시의 방제가와 유사하였으나, Bti-U의 방제가는 56.8%로써 낮았다(도 11).

실시예 3: 곤충병원성세균의 대량배양용 염가 배지개발

선발 세균의 제제화를 목적으로 대량배양용 염가 배지를 개발하기 위해 공시한 7종류의 액체배지를 조제하고 고압멸균한 후, 배지 100㎖에 선발세균 부유액 1㎖(10⁸spores/㎖)을 접종하여 30℃, 200rpm, 7일간 진탕배양한 후600nm의 분광광도계(spectrophotometer)로 세균 밀도(OD, optical density)를 측정하여 증식 정도를 비교하였다. 공시배지는 하기 표2와 같다. 선발세균의 제제화를 목적으로 대량배양용 염가배지를 개발하기 위한 7종류의 배지에서의 곤충병원성세균의 세균밀도를 조사한 결과, Bti-D와 Bti-U 두 균주 모두 PDB배지(PDB)와 감자전분배지(PS)에서는 세균 밀도가 낮았으나 콩배지(SB), 비지배지(BE), NB배지(NB), 밀기울추출배지(WE), 밀기울배지(WB)에서는 세균의 밀도가 높았는데 그 중에서도 비지배지에서 가장 높았다(도 12).

대량배양용 염가 배지의 구성성분

대량배양용 배지	구성 성분
콩배지(SB)	콩가루 1.0gglucose 0.8gyeast extract 0.2g증류수 100㎖pH 7.2
PDB배지(PDB)	포도당 2.0g감자 20.0g증류수 100㎖pH 7.2
비지배지(BE)	비지 80.0g증류수 100㎖pH 7.2
NB배지(NB)	beef extract 0.3gpeptone 0.5g증류수 100㎖pH 7.2
밀기울 추출배지(WE)	밀기울 50g증류수 100㎖pH 7.2
밀기울 배지(WB)	밀기울 1.0gglucose 0.8gyeast extract 0.2g증류수 100㎖pH 7.2
감자전분 배지(PS)	감자전분 2.4g증류수 100㎖pH 7.2

실시예 4: 곤충병원성세균을 이용한 수화형 미생물 살충제 개발

선발된 곤충병원성 세균인 Bti-D와 Bti-U 균주를 이용하여 미생물 살충제로 제제화하고자 하였는데, 우선 비지배지 5ℓ를 7ℓ용 발효기에 넣고 세균 부유액 500㎖(1×10⁸spores/㎖)를 접종한 후 pH를 7.0으로 보정하고 30℃, 300rpm에서 3일간 대량배양하였다. 천연고분자 재료인 옥수수전분, 솔잎가루, 콩가루, 미역가루, 양배추가루, 당근가루 등을 이용하여 각각의 총량이 400g으로 조합된 상기 재료에글루코스 2.0g, 펩톤 2.0g, MgCl₂0.04g, CaCO₃2.0g, FeSO₄·7H₂O 0.12g, MnCl₂·4H₂O 0.02g, KH₂PO₄0.1g, 버미큘라이트(vermiculite) 40.0g을 첨가하였다. 여기에 비지배지에서 대량배양한 세균부유액 1ℓ를 첨가하여 잘 혼합한 다음, 철판에 얇게 깔고 50℃ 윈디오븐에서 48시간 건조한 후 블라인더로 분쇄하여 수화형으로 제제화하였다(표 3).

Bti-D 균주를 이용하여 개발한 수화형 미생물 살충제의 구성성분

제제명	구성성분/비지배지 세균배양액 1L	첨가된 영양원
WBC제제	콩가루 280g양배추가루 120g	글루코스 2.0g펩톤 2.0gMgCl₂0.04gCaCO₃2.0gFeSO₄·7H₂O 0.12gMnCl₂·4H₂O 0.02gKH₂PO₄0.1g버뮤큘레이트(vermiculite)40.0g
WC제제	당근가루 400g
WCS제제	옥수수전분 400g
WBS제제	콩가루 280g미역가루 120g
WP제제	솔잎가루 280g감자가루 120g

실시예 5 : 미생물 살충제에 의한 버섯파리의 방제효과 검정

공시한 5종의 수화형 미생물 살충제를 느타리 병재배 및 상자재배시에 처리하여 버섯파리의 방제효과를 검정하였는데 제제의 처리방법, 유충의 접종방법 및 재배실의 배양조건 등은 모두 앞서의 곤충병원성세균의 생균에 의한 방제효과 검정에서와 동일하게 하였으며, 생균처리와 비교하였는데 다만 병재배에서의 제제 농도는 제제 1g(2.4×10⁸spores/g)에 살균수(pH 8) 3㎖을 혼합하였고, 상자재배에서는 제제 20g에 살균수 60㎖를 넣어 현탁하였다. 또한, 생균처리를 위해서는 세균부유액을 병재배와 상자재배에서 각각 3㎖, 45㎖(1×10⁸spores/㎖)을 각각 종균 균총 표면에 골고루 접종하였다. 유충접종은 병재배에서는 미생물 살충제의 제제 또는 생균처리 48시간 후, 병재배 당 100마리씩, 상자재배에서는 상자 당 500마리의 3령충을 접종하고 버섯재배실에 배양하면서 7∼14일 후에 살아있는 성충수를 조사하여 방제가로 환산하였다. 또한 상자재배에서는 화학살충제인 주론(디밀린) 수화제를 대조약제로 사용하였으며, 온도 22±1℃, 상대습도 65∼70%에서 25일간 배양한 후, 15±2℃의 온도에서 상대습도 90%로 배양조건을 조정하여 자실체 형성 및 버섯수량에 미치는 영향도 조사하였다. 상기 방법에 따라, 느타리버섯 병재배 및 소형상자 재배시 버섯파리에 생균으로 처리했었던 Bti-D와 Bti-U 균주 중 방제가가 더 높았던 Bti-D 균주를 5종류의 수화형 제제로 만들어 느타리버섯 병재배시에 처리하여 버섯파리에 대한 방제효과를 검정한 결과, 생균처리에 비하여 옥수수전분을 이용하여 만든 WCS제제에서 86.4%의 방제가를 보여 공시한 5종류 수화형 제제들 중 가장 우수하였으며, 생균처리(LSU) 경우인 69.1%보다도 효과적이었다(도 13).

이 WCS제제의 방제효과를 제고하기 위해 제제를 살포할 때 희석에 사용하는 물의 pH를 5에서 9까지 달리하여 동일한 방법으로 제제의 방제효과를 검정한 결과, pH 8로 보정된 물을 사용할 경우 93.2%의 방제가를 보여 제제의 pH가 버섯파리의방제가에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

또한, 느타리버섯 상자재배에서 Bti-D를 이용한 미생물 살충제인 WCS제제와 화학살충제인 주론수화제의 버섯파리 방제효과를 검정한 결과, WCS제제에서의 방제효과는 74.3%로 주론수화제의 92.2%보다 낮았다. 하지만 한 주기의 버섯 생산성에 미치는 영향의 비교에서는 미생물 살충제(WCS제제)를 처리할 경우, 상자당 다발수 및 한다발 개체수가 화학농약처리, 유충처리 및 무처리보다 모두 높았으며, 자실체의 양도 상자 당 평균 130.9g으로 화학살충제인 주론수화제 처리보다 81.9g이 증가되었고, 유충만 처리한 경우와 무처리에서 각각 55.3g, 25.5g 증가되었다(표 4).

느타리버섯 상자재배에서의 WCS제제(미생물살충제)와 주론수화제(화학농약)의 버섯파리 방제효과 및 버섯생산성에 미치는 영향 비교

처리 종류	방제가(%)	생산성(Productivity)
처리 종류	방제가(%)	다발수(개/상자)	다발 개체수(개/상자)	자실체양(g/상자)
WCS제제^a	74.3	7.0	8.0	130.9
주론수화제^b	92.2	3.8	3.3	49.0
유충단독처리	0	3.2	4.6	75.6
대조구(무처리)	_	4.6	5.6	101.1
^a 옥수수전분으로 제조한 수화형 제제 ^b 화학 농약

이상, 상기 실시예를 통하여 명백한 듯이, 본 발명은 고부가 가치의경제작물인 느타리 버섯을 가해하는 버섯파리의 생물학적 방제를 위하여 곤충 병원성 세균인 바실루스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스(Bacillus thuringiensissubsp.israelensis)인 Bti-D 균주 및 이를 이용한 미생물 살충제(BT제제)를 제공하는 효과가 있을 뿐만 아니라 상기 곤충병원성 균주를 대량배양하기 위한 환경친화적이고 생산단가가 저렴한 생산방법을 제공하는 효과가 있으므로 농약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

버섯파리 병사충에서 분리한 기탁번호 KCTC 10130BP인 Bacillus thuringiensissubsp.israelensisD.
제1항의 미생물을 포함함을 특징으로 하는 파리목 해충에 대해 살충효과를 가지는 미생물 살충제.
(A) 곤충병원성세균을 콩배지, 비지배지, 밀기울추출물배지, 밀기울배지의 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배지에서 배양하는 단계;

(B) 상기 미생물 배양액에 콩가루, 양배추가루, 당근가루, 옥수수전분, 미역가루, 솔잎가루, 감자가루의 군으로부터 선택된 어느 하나이상을 첨가하는 단계;

(C) 상기 혼합물을 건조한 후 분쇄하는 단계를 포함하는 미생물 살충제의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 (B)단계의 혼합물에 글루코스, 펩톤, MgCl_2,CaCO₃,FeSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, KH₂PO₄및 버뮤큘레이트(vermiculite) 중에서 선택된 1종 이상의 것을 기초대사를 위한 영양원 및 미생물 안정제로서 첨가하는 것을 특징으로 하는 미생물 살충제의 제조방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 곤충병원성 세균은 바실러스 슈린지에스 서브스페시스 이스렐렌시스 D(Bacillus thuringiensissubsp.israelensisD)임을 특징으로 하는 미생물 살충제의 제조방법.