CN112280692B - 一株作物促生抗病dse菌株及其应用 - Google Patents

一株作物促生抗病dse菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及DSE真菌菌株J2PC4及其应用。本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.20236的菌株Phialocephala fortinii J2PC4，该菌株具有促进水稻生长，降低南方水稻黑条矮缩病发病率，妨碍白背飞虱害虫生长繁殖、有效防治香蕉枯萎病的作用，是一种具有良好促生、防病效果的DSE真菌，能将其广泛地利用在生物化肥和生物农药领域，有效地降低农业生产对化学农药、化学肥料的依赖；经初步实验，与对照比较，其可有效促进水稻生长，对生物量(干重)的提高率达46.43％，有效降低南方水稻黑条矮缩病的发病率11.70％，对白背飞虱的致死率提高369.23％，降低白背飞虱的繁殖率26.73％、对香蕉枯萎病的防效达到70.97％。

Description

一株作物促生抗病DSE菌株及其应用
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株作物促生抗病DSE菌株及其应用。
【背景技术】
深色有隔内生真菌(Dark septate endophyte，DSE)是植物共生真菌的典型代表之一，它们能够定居在植物根部但对宿主无致病性，菌丝深色有分隔，能够在根部形成“微菌核”等结构特征。DSE广泛存在于自然界，甚至能在高山、极地、酸性和干旱土壤等逆境和极端环境中生存。申请人团队一直致力于对DSE资源及其在农业自然环境保护中的应用研究，目前已筛选出多株具有良好生物学特性的DSE真菌，虽然DSE可以与宿主植物互惠共生，但是不同种类和不同菌株间其对不同作物的互作作用是不一样的，有些真菌能促进某一植物生长，并不能促进另一植物生长，有些真菌能起到防病、抗病作用，但是有些真菌并不能起到相应效果，甚至有报道发现DSE对植物的生长具有负面的影响。为此，为了能进一步筛选出具有良好促生、防病效果的菌株，有必要收集物种丰富多样的菌株并进行功能评价，为该类微生物的开发利用提供丰富的种质资源保障和提供理论支持。目前，申请人团队研究并获得了多个DSE菌株的授权，例如：申请号为201910884589.9发明名称为《枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用》的DSE真菌，该真菌由申请人从柳州的甘蔗根围土壤分离而得，属于Cladophiaphora属新种，具有促进铁皮石斛、西红柿生长的作用，且具有防治香蕉枯萎病的作用；申请号为202010702956.1发明名称为《一种作物促生内生真菌及其应用》的菌株，该真菌由申请人从铃木根系中分离得到，属于Glutinomyces属，具有促进白菜、甘蔗的根系生长，还可显著提高铁皮石斛生物量以及多糖的含量，促进铁皮石斛的生长的作用；可见，开发DSE真菌的肥效和生防功能，可减少化学肥料和农药的施用，符合我国当前大力推行的“两减”政策，在农业自然环境保护中具有广阔的开发利用前景。
【发明内容】
鉴于上述内容，筛选出更多性状优良的DSE促生真菌，有利于促进DSE真菌种质资源的开发利用；本发明目的在于提供一种DSE菌株J2PC4及其在促进水稻生长、降低南方水稻黑条矮缩病发病率、抗白背飞虱、防治香蕉枯萎病上的应用。
为达到上述目的，本发明筛选出一株DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4，其保藏编号为CGMCC NO.20236。属于真菌界，Phialocephala属，fortinii种。所述DSE真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20236，保藏日期为2020年08月10日。
本发明还包括所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在促进水稻生长上的应用。
本发明还包括所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在降低南方水稻黑条矮缩病发病率上的应用。
本发明还包括所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治白背飞虱上的应用。
本发明还包括所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治香蕉枯萎病上的应用。
本发明还包括一种应用所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4对促进水稻生长的方法，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻盆栽苗中。
本发明还包括一种应用所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4降低南方水稻黑条矮缩病发病率的方法，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻盆栽苗中。
本发明还包括一种应用所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治白背飞虱上的方法，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻杯苗中，每杯苗放入白背飞虱成虫饲养并促其产卵孵化。
进一步的，所述J2PC4菌液的配制方法为：将菌株在麦芽汁培养基平板上培养约10d，转接于马铃薯液体培养基培养基中在28℃，120r/min条件下振荡培养10～15d；用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105cfu/mL的菌液。
本发明还包括一种应用所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4对香蕉枯萎病进行防治的方法，其特征在于，所述方法为：将香蕉组培苗直接栽培在菌株J2PC4形成的菌落上。
本发明具有以下有益效果：
本申请的DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4能够有效促进水稻生长，降低南方水稻黑条矮缩病发病率，对南方水稻黑条矮缩病传播媒介白背飞虱有致死作用，并对其产卵孵化有一定抑制作用；有效防治香蕉枯萎病；是一株具有促生、防病、抗虫的新DSE菌株；能很好的利用与生物促生、防病、防虫领域，是制备肥料的良好种质资源。
【附图说明】
图1为本发明J2PC4菌株在麦芽汁培养基培养基生长的菌落形态图；
图2为本发明菌株J2PC4对水稻盆栽苗生长的影响，图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组；
图3为本发明菌株J2PC4对南方水稻黑条矮缩病发病的影响；图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组；
图4为本发明菌株J2PC4对白背飞虱产卵孵化的影响；左图为不接种J2PC4的对照组，右图为接种J2PC4的实验组；
图5为本发明菌株J2PC4对香蕉枯萎病的影响；图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本发明提供了一株DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4，其保藏编号为CGMCCNO.20236。属于真菌界，Phialocephala属，fortinii种。所述DSE菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20236，保藏日期为2020年08月10日。
对菌株J2PC4进行形态观测，如图1所示，该菌株在麦芽汁培养基培养基上在28℃培养14d后，菌落呈近圆形至圆形，灰色，呈白色绒毛状，菌落直径为50-55mm绒毛布满整个平板。符合Phialocephala属，fortinii种菌株的形态特征。
实施例2：
对水稻的促生长作用：
(1)制备菌液：将菌株在麦芽汁培养基平板上培养约10d，转接于马铃薯液体培养基培养基中振荡培养(28℃，120r/min)10～15d；用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105cfu/mL的菌液备用；
(2)水稻苗的培养：水稻种子催芽露白后点播于透明培养杯中，杯内的育苗基质均已灭菌，30株/杯，以菌液J2PC4浇灌为处理组，以不接种J2PC4菌株的蒸馏水浇灌为对照处理，每个处理设三个重复，每个重复3杯；水稻苗第二次接种J2PC4菌株2～3天后移栽至条盆中。
(3)接种方法：在步骤(2)的基础上，水稻种子点播至培养杯时，即进行第一次浇菌，待幼苗长至1.5～2.5叶时第二次浇菌。
移栽后30d，采收植株，将植株根部洗净后于阴凉处晾干水，测量并记录株高、鲜重等生长指标，置于50℃烘箱中烘干后称量干重，具体实验结果如表1：
表1接种J2PC4菌株对水稻苗生长的影响
Figure BDA0002768207860000041
由表1可知，接种了J2PC4菌株后，水稻的株高、鲜重、干重和根长均明显高于对照；从上述结果可知，J2PC4菌株对水稻盆栽苗的株高较对照提高率达到17.04％；对鲜重的提高率达到83.58％；对干重的提高率达到46.43％；对根长的提高率达到40.71％。
图2是菌株J2PC4对水稻盆栽苗生长的影响，图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组，图中明显可见B的长势优于A。
实施例3：
降低南方水稻黑条矮缩病发病率、抗白背飞虱的作用：
(1)菌液的制备：将菌株在麦芽汁培养基平板上培养约10d，转接于马铃薯液体培养基培养基中振荡培养(28℃，120r/min)10～15d；用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105cfu/mL的菌液备用。
(2)水稻播种及J2PC4的接种：水稻种子催芽露白后点播于透明培养杯中，瓶内的育苗基质均已灭菌，30株/杯，以菌液J2PC4浇灌为处理组，以不接种J2PC4菌株的蒸馏水浇灌为对照处理，每个处理设三个重复，每个重复3杯；水稻种子点播至培养杯时，即进行第一次浇菌，待幼苗长至1.5～2.5叶时第二次浇菌。
然后将步骤(2)的幼苗分别进行抗病、白背飞虱成虫的致死率实验和对白背飞虱产卵孵化实验，具体如下：
①南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的抗性和对白背飞虱成虫的致死率实验：
在步骤(2)第二次浇菌完成后将杯苗放置于60目防虫网罩内，通过带SRBSDV病毒的白背飞虱进行人工接种，有效接种虫量为平均每苗1.0～1.5头带毒白背飞虱成虫；接种48h后把虫转移，记录杯中白背飞虱死亡头数，将已接种J2PC4菌株及SRBSDV的幼苗移栽至防虫网室条盆中，常规管理，定期观察记录发病情况。
移栽后30d，对南方水稻黑条矮缩病的发病情况进行调查，采收植株，将植株根部洗净后于阴凉处晾干水，测量并记录株高、鲜重等生长指标，置于50℃烘箱中烘干后称量干重，抗病试验：参照感染SRBSDV的水稻植株矮缩病的症状，对全部植株的发病情况进行调查剔除死亡植株、记录并统计，最后采收全部植株，并调查生长指标，结果如表2所示：
其中，发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100％
飞虱死亡率(％)＝48h后飞虱死亡头数/接种飞虱总头数×100％
表2接种J2PC4与SRBSDV发病的影响
Figure BDA0002768207860000051
由表1和表2对比可知，接种南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)后，对水稻的生长起到抑制作用；接种了J2PC4菌株后，水稻即使感染了SRBSDV病毒，但其株高、鲜重、干重和根长均明显高于对照；发病率低于对照：J2PC4菌株对水稻盆栽苗的株高提高率达到29.13％；对鲜重的提高率达到38.91％；对干重的提高率达到63.64％；对根长的提高率达到18.18％；飞虱死亡率较对照提高了369.23％；发病率降低11.70％；由此说明，菌株J2PC4能明显降低南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)对水稻的影响，降低南方水稻黑条矮缩病的发病率。
图3是菌株J2PC4对南方水稻黑条矮缩病发病的影响图，图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组，图中明显可见B的长势优于A。
②对白背飞虱产卵及孵化的抑制作用实验：
在步骤(2)水稻种子点播至培养杯时(30株/杯，设3个重复)，即进行第一次浇菌，待幼苗长至1.5～2.5叶时第二次浇菌。浇菌后继续培养1～2天，每杯苗放入8只白背飞虱成虫(3公5母)饲养并促其产卵，用防虫罩盖住杯口，期间注意观察并记录产卵情况，8～13天后往杯苗中灌水洗脱低龄白背飞虱至60目防虫笼内的盆苗中，记录幼虫的数量并进行统计分析，结果如表3所示：
表3接种J2PC4对白背飞虱产卵及繁殖的影响
处理 平均幼虫数/头
J2PC4 370
对照 505
由表3可知，接种了菌株J2PC4对白背飞虱的产卵及繁殖起到了抑制作用，白背飞虱的幼虫数量处理组明显低于对照组，降低了26.73％。
图4是菌株J2PC4对白背飞虱产卵孵化的影响图；左图为不接种J2PC4的对照组，右图为接种J2PC4的实验组；明显可见左图的水稻茎秆上白背飞虱幼虫数量明显高于右图，由此说明菌株J2PC4对白背飞虱产卵繁殖有较好的抑制作用。
由本实施例可知，菌株J2PC4对南方水稻黑条矮缩病的发病率有一定的降低作用，且还能抑制SRBSDV传播虫媒——白背飞虱的成活，对其产卵繁殖也起到了抑制作用，具有较突出的抗虫效果。
实施例4：
对香蕉枯萎病的防治作用：
(1)J2PC4与香蕉组培苗的共培养：
将菌株J2PC4活化后接种于燕麦培养基培养基中培养10d，备用；然后选择长势一致的无菌香蕉组培苗移栽至菌落上，每个菌落移栽1株组培苗，每皿移栽3株，并命名为处理组；同时，将香蕉组培苗移栽至不接种J2PC4的培养平皿上(每皿3株)，并命名为CK组；将处理组和CK组放入培养箱中在相同条件下进行共培养。
(2)致病培养基制备：
将镰刀菌(病原菌)活化后接于水琼脂培养基上，每皿接种3个菌块，28℃培养4d获得致病培养基待用。
(3)平皿防效实验：
将步骤(1)获得的J2PC4-香蕉组培苗(处理组)和不含J2PC4的香蕉组培苗(CK组)一同移栽至步骤(2)的致病培养基中。观察并记录各处理的病级情况，计算病情指数和防治效果。
对平皿苗的病情分级标准如下：
0级-外观无可见症状；
1级-香蕉植株长势无明显受阻，全株黄萎面积不超35％；
2级-香蕉植株弱小，全株黄萎面积达35％-80％；
3级-香蕉植株全株黄萎面积达80％以上，甚至全株枯死。
对处理组和对照组进行观察，对病情指数和防治效果进行计算，具体如下：
Figure BDA0002768207860000071
Figure BDA0002768207860000072
通过上述公式的计算，本申请实验菌株J2PC4对香蕉枯萎病的防治效果如表4所示：
表4菌株J2PC4对香蕉枯萎病的防治效果
处理 平均病情指数 平均防治效果
J2PC4 0.27 70.97％
CK 0.93 -
由表4可见，在香蕉中接种J2PC4菌株后能提高香蕉对香蕉枯萎病的抗性，平皿共生实验中防治效果达70.97％。
图5是菌株J2PC4对香蕉枯萎病的影响，图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组，图中明显可见B的长势优于A；A枯萎严重，B基本不受影响。
综上所述，本申请的DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4属于新菌株，能起到促进水稻生长、降低南方水稻黑条矮缩病发病率、妨碍白背飞虱害虫生长繁殖、防治香蕉枯萎病的作用，是一种性能良好的植物有益DSE真菌，兼具促生、抗病和抗虫的功能。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在促进水稻生长上的应用，其特征在于，所述菌株Phialocephala fortinii J2PC4的保藏编号为CGMCC NO.20236。
2.DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在降低南方水稻黑条矮缩病发病率上的应用，其特征在于，所述菌株Phialocephala fortinii J2PC4的保藏编号为CGMCCNO.20236。
3. DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治白背飞虱上的应用，其特征在于，所述菌株Phialocephala fortinii J2PC4的保藏编号为CGMCC NO.20236。
4. DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治香蕉枯萎病上的应用，其特征在于，所述菌株Phialocephala fortinii J2PC4的保藏编号为CGMCC NO.20236。
5. 一种应用如权利要求1所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4对促进水稻生长的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻盆栽苗中。
6. 一种应用如权利要求2所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4降低南方水稻黑条矮缩病发病率的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻盆栽苗中。
7. 一种应用如权利要求3所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治白背飞虱上的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻杯苗中，每杯苗放入白背飞虱成虫饲养并促其产卵孵化。
8. 根据权利要求5所述促进水稻生长的方法、权利要求6所述降低南方水稻黑条矮缩病发病率的方法或权利要求7所述防治白背飞虱上的方法，其特征在于，所述菌液的配制方法为：将菌株在麦芽汁培养基平板上培养10 d，转接于马铃薯液体培养基培养基中在28℃，120 r/min条件下振荡培养10~15 d；用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105cfu/mL的菌液。
9. 一种应用如权利要求4所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4对香蕉枯萎病进行防治的方法，其特征在于，所述方法为：将香蕉组培苗直接栽培在菌株J2PC4形成的菌落上。
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