CN111733084B - 新种内生真菌菌株x22及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及新种内生真菌菌株X22及其应用。新菌株X22从甘蔗根围土壤分离而得，保藏编号为CGMCC NO.19656，根据分类学方法，该菌株是Ochroconis属的一个新种，根据国际命名法将该菌株命名为：Ochroconis guangxiensis，并选菌株X22为该种的模式菌株。经研究发现该菌株能起到促进植物生长、降低水稻矮缩病发病率，提高水稻对矮缩病抗病能力的作用，具有促生和提高植物抗病能力的双重功能。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及新种内生真菌菌株X22及其应用。
【背景技术】
植物体内普遍存在着内生菌，这些内生菌有些对植物有生长促进作用，有些对植物有抗病作用，目前，在农业生产中普遍采用化肥和农药来促进农作物生长，或者提高农作物的抗病能力，但是大量化肥农药的使用带来了一系列严重的环境污染和残留，给人体造成不可逆的损害，如果能研究出植物体内的内生菌哪些能促进作物生长，哪些可以起到抗病作用，并在今后的应用中适当增加这些具有特定功能的内生菌含量，将能替代或减少现行的化肥和农药，有效改进我国目前对农药、化肥过度依赖的情况；申请人在内生菌的研究中发现，自然界中存在很多未被发掘的内生菌，例如，申请人筛选的申请号为201910884589.9发明名称为《枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用》的内生菌，该菌由申请人从土壤中分离获得，属于Cladophiaphora sp.属，具有促进甘蔗生长和防治香蕉枯萎病的双重作用；甚至申请人还发现了一些新种，例如，申请号为201911188968.0发明名称为《新种内生真菌LZ3及其应用》的内生菌，该菌由申请人从甘蔗根围土壤分离而得中分离获得，属于Acidomelania属的一个新种，该菌株同样具有促生和防治香蕉枯萎病的双重作用；请号为201610652927.2发明名称为《防治香蕉枯萎病的内生真菌L-14及其应用》的内生真菌，该真菌由申请人从土壤中诱捕分离获得，属于Schizothecium属，具有防治香蕉枯萎病的作用；可见内生菌种质资源的发现显著提高微生物与植物共生发展的用途，能更广泛的利用在植物的促生、抗病中，能为促进农作物生长提供资源保障。
【发明内容】
鉴于上述内容，为了在丰富多样的内微生物种质资源中进一步挖掘更多更优异的优良菌株，为促进农作物生长提供资源保障，本发明目的在于提供一种新种菌株Ochroconis guangxiensis X22及其在促进植物生长和抑制矮缩病中的应用。
为达到上述目的，本发明筛选出一种新种菌株Ochroconis guangxiensis X22，其保藏编号为CGMCC NO.19656。属于真菌界，赭霉属Ochroconis的一个新种：Ochroconisguangxiensis。所述真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19656，保藏日期为2020年06月08日。
将菌株接种在MEA培养基上，观察菌落形态特征，如图1所示：图1中，A为菌株X22在MEA培养基上的形态特征图，B-D为X22的分生孢子梗及分生孢子图，菌落在MEA培养基上长速一般，28℃培养2周后菌落直径29mm，黄褐色，绒毡状，近圆形。菌丝黄褐色，有隔，直径1.5-4.0μm。分生孢子梗黄褐色，0-3个分隔，直立或稍微弯曲，圆柱形或烧瓶状，不分枝或有1个分枝，大小为5.8-31.9×1.7-3.6μm。产孢细胞圆柱形，透明至黄褐色。分生孢子黄褐色，棒状或圆柱形，多具有一个分隔，偶有2-3个分隔，分隔处收缩或不收缩，孢子表面光滑或有较密的小疣刺，顶端钝圆，底部较细，大小为6.7-15.7×2.1-5.3μm，分散孢子成熟后稍微膨大。未观察到厚垣孢子。未发现其有性态。
进一步的，所述菌株从甘蔗根围土壤分离而得。
本发明还包括所述的新种菌株Ochroconis guangxiensis X22在促进植物生长上的应用。
进一步的，所述植物为西红柿。
本发明还包括所述的新种菌株Ochroconis guangxiensis X22在降低植物矮缩病发病率的应用，所述植物矮缩病为南方水稻黑条矮缩病。
进一步的，所述植物为水稻。
本发明还包括一种应用所述新种菌株Ochroconis guangxiensis X22促进植物生长的方法，所述方法为：将菌株X22接种到植物的组培苗和/或植株中；所述接种方法为将植物的组培苗直接接种于培养X22菌株的培养基中。
本发明还包括一种应用所述新种菌株Ochroconis guangxiensis X22降低植物矮缩病的发病率的方法，所述方法为：将培养基培养后的X22菌液浇灌到水稻植株根系。
进一步的，所述培养基为PSB培养基：马铃薯200g，蔗糖15g，蒸馏水1000mL，pH6。
本发明具有以下有益效果：
本申请的新种菌株Ochroconis guangxiensis X22是赭霉属新种菌株，能起到促进植物生长、降低水稻矮缩病发病率，提高植物对南方水稻黑条矮缩病抗病能力的作用，具有促生和提高植物抗病能力的双重功能申请人利用该菌株对甘蔗和西红柿进行共培养，发现该菌株对甘蔗和西红柿都有良好的促生作用；同时，通过接种南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)后还发现，X22菌液能明显降低南方水稻黑条矮缩病的发病率，具有提高水稻矮缩病抗病能力的作用。
【附图说明】
图1为本发明X22菌株的形态图；图中A是X22菌株在MEA培养基上的菌落形态图、图B-D是X22菌株的分生孢子梗及分生孢子，标尺10μm。
图2为本发明菌株X22基于SSU+ITS+LSU基因序列的系统发育树图；
图3为番茄在平皿上接种X22后的生长情况；图中，左边为不接种X22菌株的西红柿苗，右边为接种了X22菌株的西红柿苗。
图4为接种X22的水稻接种南方水稻黑条矮缩病毒后的情况图。图中，左边为不接种X22菌株的感染南方水稻黑条矮缩病毒水稻苗，右边为接种了X22菌株的感染南方水稻黑条矮缩病毒水稻苗。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例筛选出一种新种菌株Ochroconis guangxiensis X22，其保藏编号为CGMCC NO.19656。属于真菌界，赭霉属Ochroconis的一个新种：Ochroconis guangxiensis。所述真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.19656，保藏日期为2020年06月08日。
本实施例菌株分离至广西钦州市浦北县大成镇金街村甘蔗根围土壤。
对本实施例的微生物进行形态学分类和分子生物学鉴定具体如下：
1、菌株的形态学分类
将菌株接种在MEA培养基上，观察菌落形态特征，如图1所示：图1中，A为菌株X22在MEA培养基上的形态特征图，B-D为X22的分生孢子梗及分生孢子图，从图1中可以看出：菌落在MEA培养基上长速一般，28℃培养2周后菌落直径29mm，黄褐色，绒毡状，近圆形。菌丝黄褐色，有隔，直径1.5-4.0μm。分生孢子梗黄褐色，0-3个分隔，直立或稍微弯曲，圆柱形或烧瓶状，不分枝或有1个分枝，大小为5.8-31.9×1.7-3.6μm。产孢细胞圆柱形，透明至黄褐色。分生孢子黄褐色，棒状或圆柱形，多具有一个分隔，偶有2-3个分隔，分隔处收缩或不收缩，孢子表面光滑或有较密的小疣刺，顶端钝圆，底部较细，大小为6.7-15.7×2.1-5.3μm，分散孢子成熟后稍微膨大。未观察到厚垣孢子。未发现其有性态，该菌株在形态上与O.musae和模式种O.constricta相似，都具有烧瓶形或圆柱形的分生孢子梗，以及双细胞的分生孢子，但O.guangxiensis比后两者具有更长的分生孢子梗，且分生孢子中间隔膜处收缩更明显。
2、分子生物学鉴定
基于SSU+ITS+LSU三个基因的联合进化树(图2)分析发现该菌株虽然在进化关系与O.podocarpi较为接近，但仍单独聚为一个分支，与其他种明显区分开来；且这两者在形态结构上有较明显差异，即O.guangxiensis的分生孢子梗长度和分生孢子隔膜处的收缩程度比O.podocarpi更明显。综上，将该发明菌株鉴定为赭霉属Ochroconis的一个新种，根据国际命名法将该菌株命名为Ochroconis guangxiensis。并选择X22为该种的模式菌株。
实施例2：
对西红柿的促生作用：
(1)X22菌株的培养：采用三点接种法将菌株接在OA(MgSO4·7H2O 1.0g，KH2PO41.5g，NaNO3 1.0g，燕麦粉10g，琼脂粉11g，蒸馏水1 000mL)培养基上，共接3皿，25℃下黑暗培养10d后每个皿形成3个菌落。
(2)番茄苗的培养：番茄种子进行表面消毒、催芽，然后将发芽的种子移栽至事先培养好的菌落上，每个菌落接1粒种子，然后连同培养皿放入培养箱中培养。
(3)调查：培养14d后将西红柿幼苗烘干至恒重后称量干重，测试结果参见表1：
表1 X22对番茄生长的影响
| 处理 | 干重(g) |
| X22 | 0.0085 |
| X22 | 0.0074 |
| X22 | 0.0060 |
| 对照 | 0.0058 |
由表1可知，接种X22的番茄的平均干重为0.0073g，比不接种X22的对照增加了25.9％，表明X22对番茄具有较好的促生作用。
图3是番茄在平皿上接种X22后的生长情况图，图中左边为对照(CK)组，右边为接种了X22菌株的试验组，图中明显可见接种了X22菌株后，番茄苗的长势优于未接种X22的对照组。
实施例3：
X22对南方水稻黑条矮缩病的影响：
(1)菌液的制备：菌株在含150mL PSB(马铃薯200g，蔗糖15g，蒸馏水1000mL，pH6)培养液的容量为250mL的三角瓶中振荡培养10d后用纱布过滤、收集菌丝体，将培养液冲洗掉，然后挤干水，称取4克打碎，制备成120mL菌液。
(2)水稻播种及X22的接种：将灭菌育苗基质等量装入(11×15)cm的透明塑料杯中，每杯倒入40mL菌液搅拌均匀；水稻种子经消毒、催芽露白后点播于杯内基质上，30粒/杯，共3杯。待幼苗长至1.5-2.5叶时进行第二次接种，同样每杯浇40mL菌液，共接种2次，以蒸馏水为对照。
(3)接种南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)：第二次接种完成后杯苗放置于60目防虫网罩内，按平均每苗1.0-1.5头带毒白背飞虱成虫的量接种，每天早晚各轻摇塑料杯1次，尽量保证水稻苗获毒均匀；接种48h后把虫转移或放飞，将稻苗移栽至防虫网室条盆中。常规管理。
(4)调查：移栽后30d调查记录发病株数，计算发病率，称量鲜重。
发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100％
上述调查、测试结果如表2所示：
表2 X22对南方水稻黑条矮缩病(SRBSDV)的影响
| 处理 | 发病率/％ | 鲜重(g) | 干重(g) |
| X22 | 60 | 25.3 | 0.15 |
| X22 | 60 | 28.4 | 0.16 |
| X22 | 89 | 16.8 | 0.13 |
| 对照 | 97 | 16.2 | 0.12 |
由表2可知，接种X22的水稻平均发病率为69.67％，明显低于对照的发病率(97％)；植株的平均鲜重(23.5g)比对照(16.2g)增加了45.06％，植株的平均干重(0.15g)比对照组(0.12g)增加了22.22％；由此说明，菌株X22能有效降低南方水稻黑条矮缩病的发病率，具有提高水稻矮缩病抗病能力的作用。
图4为接种X22菌株的水稻接种南方水稻黑条矮缩病毒后的长势图，图中左图为对照(CK)组，右图为接种了X22菌株的试验组，图中明显可见水稻接种了X22菌株后，再感染矮缩病毒(SRBSDV)，其长势仍优于对照(CK)组。
综上所述，本申请的Ochroconis guangxiensis X22菌株是赭霉属新种菌株，能起到促进植物生长、降低水稻矮缩病发病率，提高水稻对南方水稻黑条矮缩病的抗病能力，具有促生和提高植物抗病能力的双重功能，是一种新的微生物种质资源。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (7)
1.内生真菌菌株Ochroconis guangxiensis X22，其保藏编号为CGMCC NO.19656。
2.根据权利要求1所述的内生真菌菌株Ochroconis guangxiensis X22，其特征在于，所述菌株从甘蔗根围土壤分离而得。
3.如权利要求1-2任意一项所述的内生真菌菌株Ochroconis guangxiensis X22在促进植物生长上的应用；所述植物为西红柿。
4.如权利要求1-2任意一项所述的内生真菌菌株Ochroconis guangxiensis X22在降低植物矮缩病发病率的应用，所述植物矮缩病为南方水稻黑条矮缩病。
5. 一种应用如权利要求1-2任意一项所述的内生真菌菌株Ochroconis guangxiensis X22促进植物生长的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株X22接种到植物的组培苗和/或植株中；所述接种方法为将植物的组培苗直接接种于培养X22菌株的培养基中；所述植物为西红柿。
6.一种应用如权利要求1-2任意一项所述内生真菌菌株Ochroconis guangxiensis X22降低植物矮缩病的发病率的方法，其特征在于，所述方法为：将培养基培养后的X22菌液浇灌到水稻植株根系。
7.根据权利要求6所述应用内生真菌菌株Ochroconis guangxiensis X22降低植物矮缩病的发病率的方法，其特征在于，所述培养基为PSB培养基：马铃薯200g，蔗糖15 g，蒸馏水1000 mL ，pH6。
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