CN112280692A - 一株作物促生抗病dse菌株及其应用 - Google Patents

一株作物促生抗病dse菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及DSE真菌菌株J2PC4及其应用。本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.20236的菌株Phialocephala fortinii J2PC4，该菌株具有促进水稻生长，降低南方水稻黑条矮缩病发病率，妨碍白背飞虱害虫生长繁殖、有效防治香蕉枯萎病的作用，是一种具有良好促生、防病效果的DSE真菌，能将其广泛地利用在生物化肥和生物农药领域，有效地降低农业生产对化学农药、化学肥料的依赖；经初步实验，与对照比较，其可有效促进水稻生长，对生物量(干重)的提高率达46.43％，有效降低南方水稻黑条矮缩病的发病率11.70％，对白背飞虱的致死率提高369.23％，降低白背飞虱的繁殖率26.73％、对香蕉枯萎病的防效达到70.97％。

Description

一株作物促生抗病DSE菌株及其应用
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株作物促生抗病DSE菌株及其应用。
【背景技术】
深色有隔内生真菌(Dark septate endophyte，DSE)是植物共生真菌的典型代表之一，它们能够定居在植物根部但对宿主无致病性，菌丝深色有分隔，能够在根部形成“微菌核”等结构特征。DSE广泛存在于自然界，甚至能在高山、极地、酸性和干旱土壤等逆境和极端环境中生存。申请人团队一直致力于对DSE资源及其在农业自然环境保护中的应用研究，目前已筛选出多株具有良好生物学特性的DSE真菌，虽然DSE可以与宿主植物互惠共生，但是不同种类和不同菌株间其对不同作物的互作作用是不一样的，有些真菌能促进某一植物生长，并不能促进另一植物生长，有些真菌能起到防病、抗病作用，但是有些真菌并不能起到相应效果，甚至有报道发现DSE对植物的生长具有负面的影响。为此，为了能进一步筛选出具有良好促生、防病效果的菌株，有必要收集物种丰富多样的菌株并进行功能评价，为该类微生物的开发利用提供丰富的种质资源保障和提供理论支持。目前，申请人团队研究并获得了多个DSE菌株的授权，例如：申请号为201910884589.9发明名称为《枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用》的DSE真菌，该真菌由申请人从柳州的甘蔗根围土壤分离而得，属于Cladophiaphora属新种，具有促进铁皮石斛、西红柿生长的作用，且具有防治香蕉枯萎病的作用；申请号为202010702956.1发明名称为《一种作物促生内生真菌及其应用》的菌株，该真菌由申请人从铃木根系中分离得到，属于Glutinomyces属，具有促进白菜、甘蔗的根系生长，还可显著提高铁皮石斛生物量以及多糖的含量，促进铁皮石斛的生长的作用；可见，开发DSE真菌的肥效和生防功能，可减少化学肥料和农药的施用，符合我国当前大力推行的“两减”政策，在农业自然环境保护中具有广阔的开发利用前景。
【发明内容】
鉴于上述内容，筛选出更多性状优良的DSE促生真菌，有利于促进DSE真菌种质资源的开发利用；本发明目的在于提供一种DSE菌株J2PC4及其在促进水稻生长、降低南方水稻黑条矮缩病发病率、抗白背飞虱、防治香蕉枯萎病上的应用。
为达到上述目的，本发明筛选出一株DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4，其保藏编号为CGMCC NO.20236。属于真菌界，Phialocephala属，fortinii种。所述DSE真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20236，保藏日期为2020年08月10日。
本发明还包括所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在促进水稻生长上的应用。
本发明还包括所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在降低南方水稻黑条矮缩病发病率上的应用。
本发明还包括所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治白背飞虱上的应用。
本发明还包括所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治香蕉枯萎病上的应用。
本发明还包括一种应用所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4对促进水稻生长的方法，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻盆栽苗中。
本发明还包括一种应用所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4降低南方水稻黑条矮缩病发病率的方法，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻盆栽苗中。
本发明还包括一种应用所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治白背飞虱上的方法，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻杯苗中，每杯苗放入白背飞虱成虫饲养并促其产卵孵化。
进一步的，所述J2PC4菌液的配制方法为：将菌株在麦芽汁培养基平板上培养约10d，转接于马铃薯液体培养基培养基中在28℃，120r/min条件下振荡培养10～15d；用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105cfu/mL的菌液。
本发明还包括一种应用所述DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4对香蕉枯萎病进行防治的方法，其特征在于，所述方法为：将香蕉组培苗直接栽培在菌株J2PC4形成的菌落上。
本发明具有以下有益效果：
本申请的DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4能够有效促进水稻生长，降低南方水稻黑条矮缩病发病率，对南方水稻黑条矮缩病传播媒介白背飞虱有致死作用，并对其产卵孵化有一定抑制作用；有效防治香蕉枯萎病；是一株具有促生、防病、抗虫的新DSE菌株；能很好的利用与生物促生、防病、防虫领域，是制备肥料的良好种质资源。
【附图说明】
图1为本发明J2PC4菌株在麦芽汁培养基培养基生长的菌落形态图；
图2为本发明菌株J2PC4对水稻盆栽苗生长的影响，图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组；
图3为本发明菌株J2PC4对南方水稻黑条矮缩病发病的影响；图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组；
图4为本发明菌株J2PC4对白背飞虱产卵孵化的影响；左图为不接种J2PC4的对照组，右图为接种J2PC4的实验组；
图5为本发明菌株J2PC4对香蕉枯萎病的影响；图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
实施例1：
本发明提供了一株DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4，其保藏编号为CGMCCNO.20236。属于真菌界，Phialocephala属，fortinii种。所述DSE菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.20236，保藏日期为2020年08月10日。
对菌株J2PC4进行形态观测，如图1所示，该菌株在麦芽汁培养基培养基上在28℃培养14d后，菌落呈近圆形至圆形，灰色，呈白色绒毛状，菌落直径为50-55mm绒毛布满整个平板。符合Phialocephala属，fortinii种菌株的形态特征。
实施例2：
对水稻的促生长作用：
(1)制备菌液：将菌株在麦芽汁培养基平板上培养约10d，转接于马铃薯液体培养基培养基中振荡培养(28℃，120r/min)10～15d；用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105cfu/mL的菌液备用；
(2)水稻苗的培养：水稻种子催芽露白后点播于透明培养杯中，杯内的育苗基质均已灭菌，30株/杯，以菌液J2PC4浇灌为处理组，以不接种J2PC4菌株的蒸馏水浇灌为对照处理，每个处理设三个重复，每个重复3杯；水稻苗第二次接种J2PC4菌株2～3天后移栽至条盆中。
(3)接种方法：在步骤(2)的基础上，水稻种子点播至培养杯时，即进行第一次浇菌，待幼苗长至1.5～2.5叶时第二次浇菌。
移栽后30d，采收植株，将植株根部洗净后于阴凉处晾干水，测量并记录株高、鲜重等生长指标，置于50℃烘箱中烘干后称量干重，具体实验结果如表1：
表1接种J2PC4菌株对水稻苗生长的影响
Figure BDA0002768207860000041
由表1可知，接种了J2PC4菌株后，水稻的株高、鲜重、干重和根长均明显高于对照；从上述结果可知，J2PC4菌株对水稻盆栽苗的株高较对照提高率达到17.04％；对鲜重的提高率达到83.58％；对干重的提高率达到46.43％；对根长的提高率达到40.71％。
图2是菌株J2PC4对水稻盆栽苗生长的影响，图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组，图中明显可见B的长势优于A。
实施例3：
降低南方水稻黑条矮缩病发病率、抗白背飞虱的作用：
(1)菌液的制备：将菌株在麦芽汁培养基平板上培养约10d，转接于马铃薯液体培养基培养基中振荡培养(28℃，120r/min)10～15d；用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105cfu/mL的菌液备用。
(2)水稻播种及J2PC4的接种：水稻种子催芽露白后点播于透明培养杯中，瓶内的育苗基质均已灭菌，30株/杯，以菌液J2PC4浇灌为处理组，以不接种J2PC4菌株的蒸馏水浇灌为对照处理，每个处理设三个重复，每个重复3杯；水稻种子点播至培养杯时，即进行第一次浇菌，待幼苗长至1.5～2.5叶时第二次浇菌。
然后将步骤(2)的幼苗分别进行抗病、白背飞虱成虫的致死率实验和对白背飞虱产卵孵化实验，具体如下：
①南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的抗性和对白背飞虱成虫的致死率实验：
在步骤(2)第二次浇菌完成后将杯苗放置于60目防虫网罩内，通过带SRBSDV病毒的白背飞虱进行人工接种，有效接种虫量为平均每苗1.0～1.5头带毒白背飞虱成虫；接种48h后把虫转移，记录杯中白背飞虱死亡头数，将已接种J2PC4菌株及SRBSDV的幼苗移栽至防虫网室条盆中，常规管理，定期观察记录发病情况。
移栽后30d，对南方水稻黑条矮缩病的发病情况进行调查，采收植株，将植株根部洗净后于阴凉处晾干水，测量并记录株高、鲜重等生长指标，置于50℃烘箱中烘干后称量干重，抗病试验：参照感染SRBSDV的水稻植株矮缩病的症状，对全部植株的发病情况进行调查剔除死亡植株、记录并统计，最后采收全部植株，并调查生长指标，结果如表2所示：
其中，发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100％
飞虱死亡率(％)＝48h后飞虱死亡头数/接种飞虱总头数×100％
表2接种J2PC4与SRBSDV发病的影响
Figure BDA0002768207860000051
由表1和表2对比可知，接种南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)后，对水稻的生长起到抑制作用；接种了J2PC4菌株后，水稻即使感染了SRBSDV病毒，但其株高、鲜重、干重和根长均明显高于对照；发病率低于对照：J2PC4菌株对水稻盆栽苗的株高提高率达到29.13％；对鲜重的提高率达到38.91％；对干重的提高率达到63.64％；对根长的提高率达到18.18％；飞虱死亡率较对照提高了369.23％；发病率降低11.70％；由此说明，菌株J2PC4能明显降低南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)对水稻的影响，降低南方水稻黑条矮缩病的发病率。
图3是菌株J2PC4对南方水稻黑条矮缩病发病的影响图，图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组，图中明显可见B的长势优于A。
②对白背飞虱产卵及孵化的抑制作用实验：
在步骤(2)水稻种子点播至培养杯时(30株/杯，设3个重复)，即进行第一次浇菌，待幼苗长至1.5～2.5叶时第二次浇菌。浇菌后继续培养1～2天，每杯苗放入8只白背飞虱成虫(3公5母)饲养并促其产卵，用防虫罩盖住杯口，期间注意观察并记录产卵情况，8～13天后往杯苗中灌水洗脱低龄白背飞虱至60目防虫笼内的盆苗中，记录幼虫的数量并进行统计分析，结果如表3所示：
表3接种J2PC4对白背飞虱产卵及繁殖的影响
处理 平均幼虫数/头
J2PC4 370
对照 505
由表3可知，接种了菌株J2PC4对白背飞虱的产卵及繁殖起到了抑制作用，白背飞虱的幼虫数量处理组明显低于对照组，降低了26.73％。
图4是菌株J2PC4对白背飞虱产卵孵化的影响图；左图为不接种J2PC4的对照组，右图为接种J2PC4的实验组；明显可见左图的水稻茎秆上白背飞虱幼虫数量明显高于右图，由此说明菌株J2PC4对白背飞虱产卵繁殖有较好的抑制作用。
由本实施例可知，菌株J2PC4对南方水稻黑条矮缩病的发病率有一定的降低作用，且还能抑制SRBSDV传播虫媒——白背飞虱的成活，对其产卵繁殖也起到了抑制作用，具有较突出的抗虫效果。
实施例4：
对香蕉枯萎病的防治作用：
(1)J2PC4与香蕉组培苗的共培养：
将菌株J2PC4活化后接种于燕麦培养基培养基中培养10d，备用；然后选择长势一致的无菌香蕉组培苗移栽至菌落上，每个菌落移栽1株组培苗，每皿移栽3株，并命名为处理组；同时，将香蕉组培苗移栽至不接种J2PC4的培养平皿上(每皿3株)，并命名为CK组；将处理组和CK组放入培养箱中在相同条件下进行共培养。
(2)致病培养基制备：
将镰刀菌(病原菌)活化后接于水琼脂培养基上，每皿接种3个菌块，28℃培养4d获得致病培养基待用。
(3)平皿防效实验：
将步骤(1)获得的J2PC4-香蕉组培苗(处理组)和不含J2PC4的香蕉组培苗(CK组)一同移栽至步骤(2)的致病培养基中。观察并记录各处理的病级情况，计算病情指数和防治效果。
对平皿苗的病情分级标准如下：
0级-外观无可见症状；
1级-香蕉植株长势无明显受阻，全株黄萎面积不超35％；
2级-香蕉植株弱小，全株黄萎面积达35％-80％；
3级-香蕉植株全株黄萎面积达80％以上，甚至全株枯死。
对处理组和对照组进行观察，对病情指数和防治效果进行计算，具体如下：
Figure BDA0002768207860000071
Figure BDA0002768207860000072
通过上述公式的计算，本申请实验菌株J2PC4对香蕉枯萎病的防治效果如表4所示：
表4菌株J2PC4对香蕉枯萎病的防治效果
处理 平均病情指数 平均防治效果
J2PC4 0.27 70.97％
CK 0.93 -
由表4可见，在香蕉中接种J2PC4菌株后能提高香蕉对香蕉枯萎病的抗性，平皿共生实验中防治效果达70.97％。
图5是菌株J2PC4对香蕉枯萎病的影响，图中A为不接种J2PC4的对照组，B为接种J2PC4的实验组，图中明显可见B的长势优于A；A枯萎严重，B基本不受影响。
综上所述，本申请的DSE菌株Phialocephala fortinii J2PC4属于新菌株，能起到促进水稻生长、降低南方水稻黑条矮缩病发病率、妨碍白背飞虱害虫生长繁殖、防治香蕉枯萎病的作用，是一种性能良好的植物有益DSE真菌，兼具促生、抗病和抗虫的功能。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (10)

1.DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4，其保藏编号为CGMCC NO.20236。
2.如权利要求1所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在促进水稻生长上的应用。
3.如权利要求1所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在降低南方水稻黑条矮缩病发病率上的应用。
4.如权利要求1所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治白背飞虱上的应用。
5.如权利要求1所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治香蕉枯萎病上的应用。
6.一种应用如权利要求1所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4对促进水稻生长的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻盆栽苗中。
7.一种应用如权利要求1所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4降低南方水稻黑条矮缩病发病率的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻盆栽苗中。
8.一种应用如权利要求1所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4在防治白背飞虱上的方法，其特征在于，所述方法为：将菌株J2PC4配制成菌液后浇灌到水稻杯苗中，每杯苗放入白背飞虱成虫饲养并促其产卵孵化。
9.根据权利要求6所述促进水稻生长的方法、权利要求7所述降低南方水稻黑条矮缩病发病率的方法和/或权利要求8所述防治白背飞虱上的方法，其特征在于，所述J2PC4菌液的配制方法为：将菌株在麦芽汁培养基平板上培养约10d，转接于马铃薯液体培养基培养基中在28℃，120r/min条件下振荡培养10～15d；用灭菌纱布过滤收集菌丝体，用无菌水冲洗数次，将菌丝团打碎，配成5×105cfu/mL的菌液。
10.一种应用如权利要求1所述DSE真菌菌株Phialocephala fortinii J2PC4对香蕉枯萎病进行防治的方法，其特征在于，所述方法为：将香蕉组培苗直接栽培在菌株J2PC4形成的菌落上。
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