CN106544396A - 室内稻瘟病苗瘟鉴定及快速选育抗病水稻的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物保护领域，具体公开了一种室内稻瘟病苗瘟鉴定方法，其为针对各个生态区域的菌株，选产孢好的相对优势菌株分析致病力，挑选N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株进行温室内水稻苗瘟的接种鉴定；N为正整数。本发明还提供以大规模的室内稻瘟病苗瘟鉴定平台为基础，快速选育抗稻瘟病水稻新品种的方法。本发明筛选适用菌株构建内稻瘟病苗瘟鉴定平台，通过室内苗瘟抗性鉴定，提高水稻抗性鉴定的准确性，缩短鉴定时间，加快抗性品种的培育时间。

Description

室内稻瘟病苗瘟鉴定及快速选育抗病水稻的方法
技术领域
本发明属于植物保护领域，具体涉及一种室内稻瘟病苗瘟鉴定方法及以其选育抗病水稻的方法。
背景技术
稻瘟病是由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的真菌性病害，是水稻主要病害之一，发病严重时可导致水稻大面积减产，甚至绝收。目前受全球气候变化影响，频繁出现适于稻瘟病发生的气候条件，2012至2016年湖南省仅2013年稻瘟病危害较低；近几年，绿色通道、联合体试验等商业育种模式快速发展，杂交水稻推广面积逐步扩大，对水稻品种稻瘟病抗性提出了更高要求，现已成为水稻品种审定中的一项“一票否决”的指标。目前水稻品种的稻瘟病抗性鉴定，都是通过在稻瘟病区进行田间鉴定。田间鉴定需要较多人力、物力和财力，耗费时间长；且由于自然环境的因素，鉴定结果容易受到季节性和气候条件的影响，导致结果不准确、稳定性差等。基于上述原因，迫切需要一种不受水稻种植季节和气候条件的限制，且能规模化、快速、准确的稻瘟病鉴定方法，以满足水稻稻瘟病抗性育种工作需求。已有的相关研究表明，温室苗瘟抗性率与田间自然病圃穗颈瘟抗性率呈极显著正相关关系，因此，利用温室苗期叶瘟鉴定结果，初步判断品种稻瘟病抗性基本是可行的。
因而，规模化、快速、准确的稻瘟病苗期叶瘟鉴定平台的创建，可以满足抗性育种的现实需求，加快水稻精准育种的进程，对保障水稻生产安全具有重要意义。
发明内容
针对目前田间鉴定选育抗稻瘟病品种所需育种时间长、易受自然环境影响的现状，本发明提供一种室内稻瘟病苗瘟鉴定及快速选育抗稻瘟病水稻新品种的方法。
本发明提供一种室内稻瘟病苗瘟鉴定方法，其为针对各个生态区域的菌株，选产孢好的相对优势菌株分析致病力，挑选N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株进行温室内水稻苗瘟的接种鉴定。
所述N为正整数，优选N≥15，更优选20≤N≤30。
本发明提供一种室内稻瘟病苗瘟鉴定方法，包括如下具体步骤：
1)根据生态气候、纬度以及水稻种植面积的不同将所在省份划分成几个生态区域，在各个生态区域收集菌株；
2)检测所收集菌株的产孢量，选其中产孢好的菌株；
3)鉴定产孢好的菌株的生理种群，针对不同生态地区分析不同生理种群的分布比例，确定其中较为优势的生理种群，属于较为优势的生理种群的菌株即为该生态区域的相对优势菌株；
4)分析各相对优势菌株的致病力，挑选N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株；
5)以步骤4)所选的N个菌株进行温室内水稻苗瘟的接种鉴定：
对于性状已稳定不再分离的水稻材料，将N个菌株分别接种鉴定；
对于性状未稳定还继续分离的水稻材料，将N个菌株混合接种鉴定。
所述鉴定，参考《中华人民共和国国家标准·稻瘟病测报调查规范》进行。
其中，各个生态区域的菌株，每个生态区域的菌株收集量≥50份。
其中，所述产孢好，为产孢量检测孢子液的浓度≥1×105个/ml。
所述产孢量检测孢子液的获得方式为：以CM培养基培养菌株7天，用20ml质量百分含量0.25％的植物凝胶溶液冲洗4个9cm的培养平板的孢子，获得产孢量检测孢子液。
其中，所述生理种群，其鉴定方法为将菌株温室内接种到我国7个稻瘟病菌鉴别品种上，根据不同鉴别品种上抗、感表型，将菌株分为不同的稻瘟病菌生理种群。我国7个稻瘟病菌鉴别品种为特特勃、珍龙13、四丰43、东农363、关东51、合江18、丽江新团黑谷，鉴别的详细方法参见全国稻瘟病菌生理小种联合试验组的《我国稻瘟病菌生理小种研究》(植物病理学报,1980,10:71-82)。
其中，所述致病力，其分析方法为：将菌株温室内接种到以丽江新团黑谷为背景的24个抗性单基因系中，根据不同抗性单基因系上的抗、感表现，将菌株分为不同致病力类型。所述24个抗性单基因系为IRBLa-A(Pia)、IRBLi-F5(Pii)、IRBLks-F5(Piks)、IRBLk-Ka(Pik)、IRBLkp-K60(Pikp)、IRBLkh-K3(Pikh)、IRBLz-Fu(Piz)、IRBLz5-CA(Piz5)、IRBLzt-T(Pizt)、IRBLta-K1(Pita)、IRBLb-B(Pib)、IRBLt-K59(Pit)、IRBLsh-B(Pish)、IRBL1-CL(Pi1)、IRBL3-CP4(Pi3)、IRBL5-M(Pi5)、IRBL7-M(Pi7)、IRBL9-W(Pi9)、IRBL12-M(Pi12)、IRBL19-M(Pi19)、IRBLkm-Ts(Pikm)、IRBL20-IR24(Pi20)、IRBLta2-Pi(Pita2)、IRBL11-Zh(Pi11)。(上述24个抗性单基因系参见Tsunematsu,H.,Yanoria,M.J.T.,Ebron,L.A.,Hayashi,N.,Ando,I.,Kato,H.,Imbe,T.,and Khush,G.S.2000.Development ofmonogenic lines of rice for rice blast resistance.Breed.Sci.50:229-234.)
所述温室内水稻苗瘟的接种鉴定，具体步骤如下：
将稻瘟病菌株孢子液喷施接种至三叶一心期的待鉴定水稻后，黑暗密闭条件下培养24小时，之后正常光照培养，接种第7天对待测水稻进行发病等级评估鉴定。
其中，所述三叶一心期，为浸种后约2-3周时达到。
其中，所述稻瘟病菌株孢子液的浓度为1～5×105个/ml。
其中，所述稻瘟病菌株孢子液的获得方式为将稻瘟病菌株在CM培养基上27℃培养7-10天，用质量百分浓度0.25％的植物凝胶冲洗孢子，并用4层纱布过滤，将孢子液浓度调整到接种所需浓度。
其中，所述喷施接种的接种量为每300-400株水稻喷施10～20ml稻瘟病菌株孢子液。
其中，将稻瘟病菌株孢子液喷施接种至三叶一心期的待鉴定水稻，具体为将三叶一心的水稻置于接种箱内，用喷枪将10～20ml，浓度为1～5×105个/ml的瘟病菌株孢子液喷施到300-400株水稻叶片上。
其中，培养的温湿度条件为：27℃，相对湿度90％以上。
其中，所述CM培养基，配方如下：葡萄糖10g/L、胰蛋白胨2g/L、酵母提取物1g/L、酪蛋白氨基酸1g/L、硝酸钠6g/L、维生素0.1％(v/v)、微量元素0.1％(v/v)、KCI 0.5g/L、MgSO4 0.5g/L、KH2P04 1.5g/L、琼脂15g/L，调pH值为6.5-7。参见(Talbot NJ,Ebbole DJ,Hamer JE.Identification and characterization of MPG1,a gene involved inpathogenicity from the rice blast fungus Magnaporthe grisea.Plant Cell 5:1575-1590)
本发明提供的以室内稻瘟病苗瘟鉴定为基础快速选育抗稻瘟病水稻新品种的方法，具体步骤如下：
利用室内稻瘟病苗瘟鉴定，选择稻瘟病抗性优良的水稻株系A作为亲本之一，与农艺性状优良的水稻株系B杂交，杂交后代从F2代开始每个世代进行室内稻瘟病苗瘟鉴定：
当水稻材料性状未稳定时，将N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株混合接种，去除感病单株，将剩余的材料移栽到大田继续农艺性状选择，直至获得性状稳定的株系；
当水稻材料性状已稳定时，将N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株分别接种，鉴定结果符合以下任一情况的株系即为所育的抗病水稻：
①所有菌株接种后抗病表现均≤3级；
或②仅有1-2个菌株接种后表现为感病，其它菌株接种后表现为高抗。
其中，所述将剩余的材料移栽到大田，为于温室内炼苗7-15天后移栽至大田。
本发明还提供所述室内稻瘟病苗瘟鉴定方法在抗性鉴定中的应用。
本发明还提供所述一种选育抗稻瘟病水稻新品种的方法在育种中的应用。
本发明提供的一种室内稻瘟病苗瘟鉴定方法，筛选了N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株，构建了室内稻瘟病苗瘟鉴定平台，可准确快速地进行大量水稻品种的稻瘟病抗性鉴定。申请人按照本发明的方法构建的平台已经实现规模化、流程化的抗性鉴定模式。完成一个鉴定过程仅需40天左右。与上一批鉴定材料播种时间仅需间隔5～7天，即可播种下一批鉴定材料，可以达到不间断的循环鉴定。
本发明提供的一种选育抗稻瘟病水稻新品种的方法，通过室内苗瘟抗性鉴定，提高水稻抗性鉴定的准确性，缩短鉴定时间，缩短抗性品种的培育时间。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1湖南省稻瘟病苗瘟鉴定适用菌株的筛选
1)首先，针对生态气候、纬度以及水稻种植面积的不同，将湖南省分为以怀化芷江，益阳桃江，浏阳大围山，郴州桂东为中心的四个不同地区。
在上述的每个生态区内收集菌株，要求每个生态区域获得纯化菌株≥50份。
2)检测所收集菌株的产孢量：以CM培养基培养菌株7天，用20ml质量百分含量0.25％的植物凝胶溶液冲洗4个9cm的培养平板的孢子，获得产孢量检测孢子液，产孢量检测孢子液的浓度≥1×105个/ml。为产孢好的菌株。
3)将步骤2)所选产孢好的菌株温室内接种到我国7个稻瘟病菌鉴别品种上，根据不同鉴别品种上抗、感表型，将菌株分为不同的稻瘟病菌生理种群。我国7个稻瘟病菌鉴别品种为特特勃、珍龙13、四丰43、东农363、关东51、合江18、丽江新团黑谷，鉴别的详细方法参见全国稻瘟病菌生理小种联合试验组的《我国稻瘟病菌生理小种研究》(植物病理学报,1980,10:71-82)。
针对不同生态地区分析不同生理种群的分布比例，确定其中较为优势的生理种群，属于较为优势的生理种群的菌株即为该生态区域的相对优势菌株；
4)分析各相对优势菌株的致病力，将菌株温室内接种到以丽江新团黑谷为背景的24个抗性单基因系中，根据不同抗性单基因系上的抗、感表现，将菌株分为不同致病力类型。所述24个抗性单基因系为IRBLa-A(Pia)、IRBLi-F5(Pii)、IRBLks-F5(Piks)、IRBLk-Ka(Pik)、IRBLkp-K60(Pikp)、IRBLkh-K3(Pikh)、IRBLz-Fu(Piz)、IRBLz5-CA(Piz5)、IRBLzt-T(Pizt)、IRBLta-K1(Pita)、IRBLb-B(Pib)、IRBLt-K59(Pit)、IRBLsh-B(Pish)、IRBL1-CL(Pi1)、IRBL3-CP4(Pi3)、IRBL5-M(Pi5)、IRBL7-M(Pi7)、IRBL9-W(Pi9)、IRBL12-M(Pi12)、IRBL19-M(Pi19)、IRBLkm-Ts(Pikm)、IRBL20-IR24(Pi20)、IRBLta2-Pi(Pita2)、IRBL11-Zh(Pi11)。
依据致病力分析结果，挑选20个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株，最终结果见表1。
表1覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株
实施例2鉴定已知品种的抗性1
2014年，以实施例1筛选的20个菌株对一个水稻组合N118S/华占进行了温室苗期叶瘟鉴定，鉴定结果为抗性，其在2014年省区试稻瘟病抗性鉴定：苗叶瘟平均3.33级，穗瘟平均4.33级，温室鉴定与田间鉴定结果一致。
实施例3鉴定已知品种的抗性2
按照实施例1的相同步骤，重新筛选了15个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株。2015年对121份水稻品种进行了温室与田间抗性鉴定结果比对，在使用15个鉴定菌株且没有重复实验的情况下，温室鉴定结果与桃江田间穗瘟鉴定结果一致率达到70％以上。
实施例4选育抗性水稻
培育具有优良农艺性状的抗性新品种
首先对已有水稻亲本材料进行室内苗瘟的抗性鉴定，选择抗性优良的亲本材料作为抗性供体。
本实施例中待筛选的材料为华占、R8006、P200、R299、中恢218、华恢451，共6个育种亲本材料。
室内稻瘟病苗瘟鉴定的具体步骤为：
1)将待鉴定水稻在温室内，培养至三叶一心(从浸种后约2-3周时间)。
2)稻瘟病菌在培养室内，27℃，培养7-10天。用质量百分浓度0.25％植物凝胶冲洗孢子，并用4层纱布过滤。将孢子液浓度调整到1～5×105个/ml后，用于温室接种。
3)在接种房内，温度设为27℃，相对湿度为90％以上。将三叶一心的水稻苗置于接种箱内，用喷枪将10～20ml，浓度为1～5×105个/ml的稻瘟病菌孢子液喷施水稻叶片。黑暗，密闭，放置24小时。
4)接种24小时后，于接种房内继续光照培养，温度湿度保持不变。接种后的第7天，参考国家标准进行发病等级调查，对水稻各株系品种抗性进行评估。
筛选的结果为华占的抗性表现为抗性，选其作为抗性亲本，通过其与农艺性状优良的水稻亲本R900的杂交，获得具有抗性背景的遗传群体。
将杂交所获得的具有抗性背景的遗传群体从F2开始，每个世代进行室内稻瘟病苗瘟鉴定，当水稻材料性状未稳定时，将实施例1所选20个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株混合接种，去除感病单株(叶片有典型病斑出现)，剩余的材料于温室内炼苗7-15天后，移栽到大田，进行农艺性状筛选。通过室内抗性鉴定筛选抗性株系，保证群体后代中稻瘟病抗性能够得到稳定遗传，直到系谱选择至获得性状稳定的株系。
当水稻材料性状已稳定时，将20个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株分别接种，鉴定结果符合以下任一情况的株系即为所育的抗病水稻：
①所有菌株接种后抗病表现均≤3级；
或②仅有1-2个菌株接种后表现为感病，其它菌株接种后表现为高抗。
按照上述方法，在F5代中选定了稻瘟病抗性优良，农艺性状好的优质水稻品系738、748。2015年所选品系其田间叶瘟表现抗性，无病斑，性状表现为：抗稻瘟病。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种室内稻瘟病苗瘟鉴定方法，其特征在于，其为针对各个生态区域的菌株，选产孢好的相对优势菌株分析致病力，挑选N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株进行温室内水稻苗瘟的接种鉴定；其中N为正整数。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，N≥15。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，20≤N≤30。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，室内稻瘟病苗瘟鉴定方法，包括如下具体步骤：
1)根据生态气候、纬度以及水稻种植面积的不同将所在省份划分成几个生态区域，在各个生态区域收集菌株；
2)检测所收集菌株的产孢量，选其中产孢好的菌株；
3)鉴定产孢好的菌株的生理种群，针对不同生态地区分析不同生理种群的分布比例，确定其中较为优势的生理种群，属于较为优势的生理种群的菌株即为该生态区域的相对优势菌株；
4)分析各相对优势菌株的致病力，挑选N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株；
5)以步骤4)所选的N个菌株进行温室内水稻苗瘟的接种鉴定：
对于性状已稳定不再分离的水稻材料，将N个菌株分别接种鉴定；
对于性状未稳定还继续分离的水稻材料，将N个菌株混合接种鉴定。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，各个生态区域的菌株，每个生态区域获得纯化菌株≥50份。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述产孢好，为产孢量检测孢子液的浓度≥1×105个/ml。
7.以权利要求1-6所述鉴定方法选育抗稻瘟病水稻新品种的方法，其特征在于，具体步骤如下：
利用室内稻瘟病苗瘟鉴定，选择稻瘟病抗性优良的水稻株系A作为亲本之一，与农艺性状优良的水稻株系B杂交，杂交后代从F2代开始每个世代进行室内稻瘟病苗瘟鉴定：
当水稻材料性状未稳定时，将N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株混合接种，去除感病单株，将剩余的材料移栽到大田继续农艺性状选择，直至获得性状稳定的株系；
当水稻材料性状已稳定时，将N个覆盖不同生态区域、不同致病力的相对优势菌株分别接种，鉴定结果符合以下任一情况的株系即为所育的抗病水稻：
①所有菌株接种后抗病表现均≤3级；
或②仅有1-2个菌株接种后表现为感病，其它菌株接种后表现为高抗。
8.如权利要求7所述的选育抗稻瘟病水稻新品种的方法，其特征在于，所述将剩余的材料移栽到大田，为于温室内炼苗7-15天后移栽至大田。
9.权利要求1-6任一项所述室内稻瘟病苗瘟鉴定方法在抗性鉴定中的应用。
10.权利要求7-8所述选育抗稻瘟病水稻新品种的方法在育种中的应用。
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