CN107034252A - 一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮类成分的方法 - Google Patents

一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮类成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导白木香愈伤细胞产生名贵中药沉香中的主要活性成分2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，包括将白木香愈伤细胞置于含有氯化钠75mM～300mM的生产培养基中进行培养。本发明方法简单，能够诱导白木香愈伤组织产生更多种类和更高含量的2-(2-苯乙基)色酮化合物。

Description

一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮类成分的 方法
技术领域
本发明涉及一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物生产培养基，以及一种白木香愈伤细胞继代培养基。
背景技术
白木香(Aquilariasinensis)别名土沉香，为瑞香科沉香属植物，主要分布于我国的海南、广东、云南、福建、广西和台湾等省，是一种珍贵的药用植物。白木香以其含有树脂的木材入药，因系木的心材、体重、置水中则沉、气香，故名沉香。沉香是我国、日本、印度、中东及东南亚国家的传统名贵药材和名贵的天然香料。沉香具有行气镇痛、温中止呕、纳气平喘等功效，对于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐、肾虚气逆喘急有显著疗效。临床实验证明，沉香是胃癌的特效药和很好的镇痛药。沉香临床应用广泛，具有消化系统和中枢神经系统保护等药理作用。
健康的白木香植物并不产生沉香，只有通过自然因素(雷劈、火烧、虫蛀等)或者人为因素(砍伤、打洞、接菌等)的作用，沉香才会在白木香植物中逐渐形成。但由于天然沉香形成缓慢，资源匮乏，因而极其珍贵。加上沉香香味独特，为名贵香料，因而市场上供不应求。我国的药用沉香主要依赖进口，价格昂贵(目前特级沉香奇楠香的价格达到数万元/克)。由于沉香价值高，而且国际市场需求极大,长期以来沉香属(Aquilaria)物种遭到掠夺式砍伐，其原始林已经破坏殆尽，被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ和我国二级保护植物。为了促使产香植物能够快速结香，人们采用了多种人工结香方法，如砍伤、打洞、通体结香等，但其结香效率仍然有待提高，目前方法生产的沉香远远无法满足市场需要。因此，从分子水平阐明沉香形成的分子机制，建立有针对性的快速高效的结香技术，才能生产高质量、高产率的沉香，根本上解决沉香的资源问题。2-(2-苯乙基)色酮化合物是沉香的主要化学成分和特征性成分，具有抗炎、神经保护等多种药理活性，也是沉香产生独特香气的主要化学成分。目前自然界中发现的2-(2-苯乙基)色酮化合物有一百余个，绝大部分是从沉香中分离得到。2015年《中华人民共和国药典》中沉香的质量标准中，也明确以2-(2-苯乙基)色酮类成分作为评价沉香真伪优劣的指标。由于只有在受到外界刺激后，白木香才能够形成沉香，并产生2-(2-苯乙基)色酮化合物，因此，揭示2-苯乙基色酮化合物的生物合成途径和调控机制对白木香结香机理的研究具有重大意义，其中关于2-苯乙基色酮类物质的生物合成和调控机制的研究至关重要。
然而，在自然条件下和人工条件下的形成周期比较长，而研究2-苯乙基色酮合成机制及调控机制需要不断的提供新鲜材料，难以满足白木香结香机制的研究需求。愈伤组织和悬浮细胞能够为白木香机制研究提供源源不断的新鲜材料，利用不同的诱导方法能够产生2-苯乙基色酮类物质，因此构建稳定高效的产生2-苯乙基色酮化合物的愈伤组织体系和悬浮细胞体系对其机理研究尤为重要。
关于采用白木香的愈伤组织和悬浮细胞能够快速产生结香物质-2苯乙基色酮的研究并不多见。CN104593443A公开了一种沉香色酮类成分的制备方法，利用未结香的白木香木屑，通过内生真菌B.rhodinaA13的接种、固体发酵即可获得含沉香特征成分——5个2-(2-苯乙基)色酮化合物的沉香药材。再如，在白木香的悬浮细胞或者愈伤组织中添加黄绿墨耳真菌的粗提物诱导，鉴定出4个2-苯乙基色酮化合物。该方法由于黄绿墨耳真菌提取物的成分难以确定，因此，可控性不足，不利于2-(2-苯乙基)色酮化合物的生物合成调控机理研究。又如，文献报道在白木香的悬浮细胞及愈伤组织中加入信号分子水杨酸及茉莉酸甲酯，成功地诱导生成少量2-(2-苯乙基)色酮化合物，而白木香愈伤组织和悬浮细胞或悬浮细胞本身就是一种逆境胁迫状态下生长的细胞，不经诱导也会产生少量的2-(2-苯乙基)色酮化合物，而茉莉酸甲酯，水杨酸等激素诱导产生的2-苯乙基色酮与未经诱导的愈伤组织和悬浮细胞中的2-苯乙基色酮种类和产量很相似，因此，对于诱导效果的判断有很大的干扰，不利于研究该类成分的生物合成机制，进而难以满足白木香结香机制的研究需要。
因此，需要一种能够有效诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，为阐明该类成分生物合成机制奠定基础，为阐明沉香形成的分子机制，进而为大规模、产业化人工生产优质沉香提供基础。
发明内容
为了有效诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物，发明人针对多种作用机制的多种物质对白木香愈伤细胞的诱导作用进行了研究。结果发现，在培养基中添加适当浓度的氯化钠，能够使白木香愈伤细胞中2-(2-苯乙基)色酮化合物的种类和产量明显提高。培养基中添加的氯化钠的浓度是影响2-(2-苯乙基)色酮的产生的重要因素，NaCl的浓度太高或者太低都对2-(2-苯乙基)色酮化合物的产生有不利的影响。发明人还发现，在培养基中添加氯化钠的基础上，再添加活性氧抑制剂，不仅能够进一步提高2-(2-苯乙基)色酮化合物的产量，同时能够更好地保持细胞活性。
因此，本发明的目的在于提供一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，通过该方法，白木香愈伤细胞能够产生更多种类和更高产量的2-(2-苯乙基)色酮化合物。
本发明的另一目的是提供一种适合白木香愈伤细胞继代培养的继代培养基。
本发明的再一目的是提供一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物的生产培养基。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，将白木香愈伤细胞接种于生产培养基中进行培养；以所述生产培养基为基准，所述生产培养基含有75mM～300mM的氯化钠。
根据本发明的方法，优选地，以所述生产培养基为基准，所述生产培养基还含有如下组分：3.5～7.0g/L的MS盐、5～15mg/L的KH2PO4、80～120mg/L的肌醇、0.5～2mg/L的萘乙酸，0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.5～2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5～2.0mg/L的6-糠氨基嘌呤、0.5～2mg/L的维生素B5和20～40g/L的蔗糖。
根据本发明的方法，优选地，所述生产培养基中进一步含有活性氧抑制剂，所述活性氧抑制剂选自二苯基氯化碘盐、过氧化氢酶、二甲基硫脲中的至少一种。
根据本发明的方法，优选地，所述活性氧抑制剂为二苯基氯化碘盐；以所述生产培养基为基准，二苯基氯化碘盐的添加量为10μM～100μM。
根据本发明的方法，优选地，所述白木香愈伤细胞是通过在诱导培养基中诱导白木香材料得到的，所述白木香材料选自白木香的新鲜的茎或叶，所述诱导培养基为含有0.5～2.0mg/L的萘乙酸和0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤的MS培养基。
根据本发明的方法，优选地，所述白木香愈伤细胞是通过在诱导培养基中诱导白木香材料、并将诱导产生的愈伤细胞接种于继代培养基中进行继代培养得到的；所述白木香材料选自白木香的新鲜的茎或叶，所述诱导培养基为含有0.5～2.0mg/L的萘乙酸和0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤的MS培养基。
根据本发明的方法，优选地，以继代培养基为基准，所述继代培养基含有如下组分：3.5～7.0g/L的MS盐、5～15mg/L的KH2PO4、80～120mg/L的肌醇、0.5～2mg/L的萘乙酸，0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.5～2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5～2.0mg/L的6-糠氨基嘌呤、0.5～2mg/L的维生素B5和20～40g/L的蔗糖。
本发明还提供一种白木香愈伤细胞继代培养基，所述继代培养基含有如下组分：MS盐3.5～7.0g/L、KH2PO45～15mg/L、肌醇80～120mg/L、萘乙酸0.5～2mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5～2.0mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5～2.0mg/L、6-糠氨基嘌呤0.5～2.0mg/L、维生素B50.5～2mg/L、蔗糖20～40g/L。
本发明还提供一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物的生产培养基，所述生产培养基含有如下组分：MS盐3.5～7.0g/L、KH2PO45～15mg/L、肌醇80～120mg/L、萘乙酸0.5～2mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5～2.0mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5～2.0mg/L、6-糠氨基嘌呤0.5～2.0mg/L、维生素B5 0.5～2mg/L、蔗糖20～40g/L、氯化钠75mM～300mM，可选地，所述生产培养基进一步包含活性氧抑制剂。所述活性氧抑制剂选自二苯基氯化碘盐、过氧化氢酶(CAT)、二甲基硫脲(DMTU)中的一种或几种。优选地，所述活性氧抑制剂为二苯基氯化碘，添加量为10μM～100μM，更优选为10μM～45μM。
采用本发明的方法，添加氯化钠这样简单的化合物来控制白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物，方法简便、可控，且产生的2-(2-苯乙基)色酮类种类更多，产量更大。这对于研究该类成分的生物合成途径和调控机制、进而研究沉香的结香机制提供了十分有利的工具。根据本发明优选的实施方式，通过在含有氯化钠的培养基中添加活性氧抑制剂，进一步增加了2-(2-苯乙基)色酮化合物的产量，同时有效地降低了诱导方法所产生的胁迫对于白木香细胞的伤害，对于2-(2-苯乙基)色酮化合物的人工合成具有重要意义。
附图说明
图1为实施例3中不同浓度NaCl诱导白木香愈伤组织产生2-(2-苯乙基)色酮化合物的基峰图。
图2为实施例3中不同浓度NaCl诱导白木香愈伤组织产生AH6，AH8的定量分析。
图3为实施例4中添加DPI前后产生2-(2-苯乙基)色酮变化的HPLC图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明中，所述白木香的原植物为Aquilariasinensis(Lour.)Gilg。
本发明中，mM表示mmol/L，即毫摩尔/升。
本发明中，所述“2-(2-苯乙基)色酮”，或者“2-(2-苯乙基)色酮化合物”是指具有如下式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ母体结构的化合物：
式中，R1和R2均表示苯环上任意取代的基团，R1和R2各自独立地选自烷基、烷氧基、羟基、卤素，优选为C1-C6的烷基、C1-C6的烷氧基或羟基。本发明所述的2-(2-苯乙基)色酮化合物的实例包括但不限于5,8-二羟基-2-(2-对甲氧基苯乙基)色酮，6,7-二甲氧基-2-(2-对甲氧基苯乙基)色酮，5,8-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮，6-羟基-7-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮，6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮，(5S,6R,7S,8R)-2-(2-苯乙基)-5e′,6e,7e,8e′-四羟基-5,6,7,8-四羟基色酮，6-羟基-2-(2-苯乙基)色酮和4'-羟基-2-(2-苯乙基)色酮等。
本发明中，NAA表示萘乙酸；6-BA表示6-苄氨基嘌呤；KT表示6-糠氨基嘌呤，又称激动素；2,4-D表示2,4-二氯苯氧乙酸；VB5表示维生素B5；DPI表示二苯基氯化碘盐；CAT表示过氧化氢酶；DMTU表示二甲基硫脲；TTC表示2,3,5-三苯基氯化四氮唑。为了表述方便，本申请中部分采用了简写形式。
本发明的生产2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，包括如下步骤：将白木香愈伤细胞置于生产培养基中进行培养；从生产培养基获得的愈伤细胞中提取2-(2-苯乙基)色酮化合物。可选地，该方法还包括构建愈伤体系的方法，构建方法包括将诱导愈伤的步骤，可选地，和愈伤继代培养步骤，得到白木香愈伤细胞。
<白木香愈伤组织的诱导>
将白木香外植体材料接种于愈伤组织诱导培养基中诱导产生愈伤组织。所述白木香外植体材料可以采用白木香的新鲜的根、茎段、叶片、子叶、胚轴等。所述白木香的新鲜的根、茎段或叶片可以采集自白木香植物，也可以由白木香种子在无菌培养得到的实生苗获得。根据本发明的一种实施方式，所述白木香外植体材料采用白木香种子在无菌培养得到的实生苗获得。根据本发明一种优选的实施方式，所述外植体材料采用茎段或叶片，更优选为叶片。
本发明可以采用已知的能够诱导白木香愈伤组织产生的培养基来诱导白木香材料产生愈伤组织。根据本发明一种优选的实施方式，所述诱导培养基为含有NAA 0.2～2.0mg/L、6-BA 0.2～2.0mg/L的MS培养基。优选地，所述诱导培养基为含有NAA 0.2～1.5mg/L、6-BA0.5～1.2mg/L的MS培养基；更优选地，所述诱导培养基为含有NAA 0.2～0.8mg/L、6-BA 0.8～1.2mg/L的MS培养基。根据本发明一种特别优选的实施方式，所述诱导培养基为含有NAA 0.5mg/L、6-BA 1.0mg/L的MS培养基。需要说明的是，上述诱导培养基中，除了NAA和6-BA，可以另外含有或者不含有另外的植物激素。根据本发明的一种实施方式，上述诱导培养基中，除了NAA和6-BA，不含有另外的植物激素。采用本发明的诱导培养基，能够容易地诱导得到健康的白木香愈伤组织，得到的白木香愈伤组织更容易存活和继代培养。上述愈伤组织诱导培养基采用固体培养基，即在上述诱导培养基配方基础上添加琼脂或其他种类固化剂制成，固化剂的用量采用常规用量即可。上述愈伤组织诱导培养基中还含有蔗糖，含量为20～40mg/L，优选为25～35mg/L。
根据本发明的方法，所述愈伤组织诱导的培养温度为23～28℃，优选为24～26℃；诱导时间为20～40天，优选为25～35天，更优选为27～33天。
<白木香愈伤组织继代培养>
通过诱导培养基诱导得到的白木香愈伤组织可以直接接种至生产培养基中，培养产生2-(2-苯乙基)色酮化合物；也可以接种于继代培养基中进行多次继代培养后，获得更稳定的白木香愈伤细胞再接种于生产培养基中，用以培养得到2-(2-苯乙基)色酮化合物。优选地，将诱导得到的白木香愈伤组织进行多次继代培养后，再接种于生产培养基中培养。所述继代培养基可以是已知的白木香愈伤继代培养基。发明人发现，现有的白木香愈伤继代培养基多是在MS基础培养基上添加不同种类和含量的植物激素，虽然能够使愈伤细胞存活和生长，但细胞生长速度较慢，且愈伤组织形态大多较为紧密，同时容易褐化，不利于细胞悬浮培养。通过大量实验筛选发现，采用本发明的继代培养基能够使愈伤组织生长旺盛，且愈伤组织形态松散，不褐化，十分适合悬浮培养，效果显著优于目前文献中报道的白木香愈伤组织继代培养基。本发明优选的继代培养基，含有MS盐3.5～7.0g/L、KH2PO45～15mg/L、肌醇80～120mg/L、NAA 0.5～2mg/L，6-BA 0.5～2.0mg/L、2,4-D 0.5～2.0mg/L、KT 0.5～2.0mg/L、VB5 0.5～2mg/L、蔗糖20～40g/L。优选地，所述继代培养基含有如下组分：MS盐4.0g～6.3g/L、KH2PO48～12mg/L、肌醇90～110mg/L、NAA 0.5～2mg/L，6-BA 0.5～1.0mg/L、2,4-D 0.5～2.0mg/L、KT 0.5～2.0mg/L、VB5 0.5～2mg/L、蔗糖25～35g/L。根据本发明的方法一种特别优选的实施方式，所述继代培养基含有如下组分：MS盐4.3g/L、KH2PO4 10mg/L、肌醇100mg/L、NAA 2mg/L、6-BA1mg/L、2,4-D 1mg/L、KT 1mg/L、VB5 1mg/L、蔗糖30g/L。根据本发明优选的实施方式，本发明的继代培养基由上述组分配制而成，而不含有其他植物激素和其他大量、微量组分。
所述继代培养基优选采用固体培养基，也可以直接采用液体培养基。本发明中，采用上述继代培养基继代培养2次以上，更优选为继代培养5代以上，以使得愈伤细胞形态趋于稳定。
上述愈伤组织继代培养的培养温度为25～28℃，培养周期为20～40天，优选为25～35天，更优选为28～32天，再优选为30天。当采用液体培养基培养时，转速180～220rpm。
<培养基中添加氯化钠产生2-(2-苯乙基)色酮化合物>
将诱导产生或再经继代培养得到的白木香愈伤细胞接种于生产培养基中，培养产生2-(2-苯乙基)色酮化合物。所述生产培养基可以是在已知的白木香愈伤继代培养基或本发明的上述白木香愈伤继代培养基的基础上，额外添加一定浓度的氯化钠。
所述生产培养基可以采用固体或液体培养基的方式。根据本发明优选的实施方式，所述生产培养基采用液体培养基对白木香愈伤细胞进行悬浮培养。
发明人发现，在本发明的继代培养基的基础上添加氯化钠后，愈伤组织能够产生可观的2-(2-苯乙基)色酮化合物，同时愈伤细胞的形态、细胞活性和生长量仍然保持了较好的水平且较为稳定。发明人发现，氯化钠的浓度对于白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物是至关重要的，浓度过低或过高都不适合2-(2-苯乙基)色酮化合物的产生。当采用氯化钠浓度为75mM～300mM时，白木香愈伤细胞能够有效产生2-(2-苯乙基)色酮化合物。而当氯化钠浓度约在75mM～225mM之间，更优选在100mM～200mM之间，最优选为120mM～170mM之间，则更有利于2-(2-苯乙基)色酮化合物的生成。根据本发明一种特别优选的实施方式，当氯化钠浓度约为150mM时，2-(2-苯乙基)色酮化合物的含量最高。
上述添加氯化钠生产白木香愈伤细胞的培养温度为25～28℃；培养周期为10～60天，优选为20～50天，更优选为25～40天。当采用液体培养基培养时，转速180～220rpm。
采用本发明的含有氯化钠的生产培养基时，与背景技术中提到的现有文献的诱导方法相比，白木香愈伤细胞产生的2-(2-苯乙基)色酮的种类更多。
<培养基中添加氯化钠和活性氧抑制剂产生2-(2-苯乙基)色酮化合物>
经过进一步研究发现，在添加有氯化钠的生产培养基上培养白木香愈伤细胞时，有活性氧的产生，而在添加有氯化钠的生产培养基的基础上，再添加一定量的活性氧抑制剂，能够获得更高含量的2-(2-苯乙基)色酮化合物，且愈伤细胞具有良好的细胞活性。所述活性氧抑制剂例如为二苯基氯化碘盐(DPI，英文名称diphenyleneiodoniumchloride)、过氧化氢酶(CAT)、二甲基硫脲(DMTU)等。根据本发明的一种优选的实施方式，所述活性氧抑制剂采用二苯基氯化碘盐，其有效添加量在10μM～100μM，优选为10μM～45μM，更优选为15μM～40μM，最优选为22μM～28μM。本发明中，相比于只添加氯化钠的生产培养基，在同时添加有氯化钠和活性氧抑制剂的生产培养基上培养白木香愈伤细胞时，2-(2-苯乙基)色酮的种类和产量有了相当显著地增加；同时，白木香愈伤细胞活性更高，可见活性氧抑制剂的添加有效地保护了白木香愈伤细胞活性。
上述添加氯化钠和DPI培养白木香愈伤细胞的培养温度为25～28℃，培养周期为120～240小时。优选地，采用液体培养基培养对白木香愈伤细胞进行悬浮培养，转速180～220rpm。
[白木香愈伤细胞的细胞活力测定和2-(2-苯乙基)色酮化合物的检测]
可采用常规方法测定白木香愈伤细胞的相对细胞活力，例如采用高分辨液质联用法检测白木香愈伤细胞中的2-(2-苯乙基)色酮化合物。
以下实施例和对比例中，原料说明如下：
本发明中，所述MS盐可以来自市售或配制。本发明实施例中采用的MS盐为Sigma公司生产的M5524。
本发明中，所述的MS培养基具有本领域公知的含义，可按照公知的方法配制。例如可参考如下文献配制：Murashige,T.,Skoog,F.(1962)A revised medium for rapidgrowth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol.Plant.15,473–497。一种具体的配制方法是：首先配制MS大量元素母液、MS微量元素母液(200×)、MS有机母液(200×)、Fe盐母液(200×)；然后按照表1的配方，以双蒸水定容至预定体积，得到MS培养基。
所述母液配制方法如下：
MS大量元素母液(20×)：
KNO3：38g/L；NH4NO3:33g/L；CaCl2·2H2O:8.8g/L；MgSO4·2H2O:7.4g/L；KH2PO4:3.4g/L；MgSO4·2H2O需要单独溶解，稀释后再与其它大量元素混合，存于4℃冰箱。
MS微量元素母液(200×)：
KI:0.166g/L；H3BO3:1.24g/L；MnSO4·4H2O:4.46g/L；ZnSO4·7H2O:1.72g/L；Na2MoO4·2H2O:0.05g/L；CuSO4·5H2O:0.005g/L；CoCl2·6H2O:0.005g/L；MnSO4·4H2O需要先用少量1mol/L溶解，然后与其它微量元素溶液混合，存于4℃冰箱。
MS有机母液(200×)：
肌醇：20g/L；盐酸：0.1g/L；盐酸吡哆醇(VB6)：0.1g/L；盐酸硫胺素(VB1)：0.02g/L；甘氨酸：0.4g/L存于4℃冰箱。
Fe盐母液(200×)：
FeSO4·7H2O:5.56g/L，Na2EDTA·2H2O:7.46g/L(EDTA:6.74g/L)，先溶于500ml双蒸水，加热，调pH至5.5，定容至1L。锡箔纸包裹，避光，存于4℃冰箱。
表1 MS基本培养基配方
以下实施例和对比例中，白木香愈伤细胞的相对细胞活力的测定方法为：
称取0.45g接种继代后的愈伤组织细胞，置于3ml的0.04wt％TTC溶液中，室温下暗反应18h后，用3ml蒸馏水漂洗细胞以洗净表面残留的TTC。用5ml的95vt％的乙醇提取已经还原的TTC(红色)，以酶标仪测定480nm处的光吸收值。以继代0小时的细胞为对照细胞，活力设为100％，计算白木香愈伤细胞的相对细胞活力。
以下实施例和对比例中，白木香愈伤组织中2-(2-苯乙基)色酮化合物的检测方法为：
1.样品的制备方法：
称取去除表面培养基的500mg干燥愈伤，以3ml甲醇超声提取，过滤，即得。
2.液相色谱测试：
色谱柱；美国安捷伦公司的色谱柱(Agilent Eclipse XDB C18，250×4.6mm，I.D.5μm)，流速1.0mL/min，检测波长为DAD检测器全波长扫描，洗脱系统采用乙腈-0.1％甲酸水梯度洗脱：0～20min，10～20％乙腈；20～35min，20～25％乙腈，35～55min，25～35％乙腈，55～70min；35～38％乙腈，70～90min，38～50％乙腈，90～105min，50～70％乙腈，105～120min，70％乙腈，120～130min，70～90％乙腈(乙腈为体积百分比)。
3.质谱测试：
正离子模式；雾化气体为N2，流速1.5mL/min；干燥气体为N2，压力100MPa；检测器电压1.40kV；曲线脱溶剂管(CDL)压力为正常模式；CDL温度为200℃；加热器温度200℃；接口电压1.4kV；离子阱真空度(IT vacuum，1.9×10-2Pa)；高纯氩气(Ar)作为冷却气体和碰撞诱导解离的碰撞气体。质谱设为自动多级MS1、MS2和MS3全扫描模式；离子累积时间为100ms；CID碰撞能量设为50％；数据处理用LC solution Version 1.1软件(Shimadzu)；分子式预测误差均在±5ppm之内。
实施例1
分别采用白木香的新鲜茎段、叶片作为外植体材料，接种至如下诱导培养基中，于26℃下诱导培养28天，诱导产生白木香愈伤组织。采用的诱导培养基分别为：
①MS+NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L；
②MS+NAA0.2mg/L+6-BA 1.2mg/L；
③MS+NAA0.5mg/L+6-BA 1.5mg/L；
④MS+NAA0.8mg/L+6-BA 1.5mg/L。
试验结果表明，上述诱导培养基均诱导得到了白木香愈伤细胞，诱导率均在85％以上，其中诱导培养基①的诱导率和愈伤组织的生长状态最佳。
实施例2
将实施例1诱导培养基①得到的愈伤细胞接种至固体继代培养基中进行继代培养，采用的继代培养基分别为：
1)MS盐4.3g/L、KH2PO4 10mg/L、肌醇100mg/L、NAA 2mg/L、6-BA 1mg/L、2,4-D 1mg/L、KT 1mg/L、VB5 1mg/L、蔗糖30g/L；
2)MS盐3.5g/L、KH2PO4 15mg/L、肌醇120mg/L、NAA 0.5mg/L，6-BA 1.0mg/、2,4-D1.5mg/L、KT 0.5mg/L、VB5 1.5mg/L、蔗糖20g/L；
3)MS盐7.0g/L、KH2PO45mg/L、肌醇80mg/L、NAA 1mg/L，6-BA 0.5mg/、2,4-D 0.5mg/L、KT 2.0mg/L、VB5 2mg/L、蔗糖40g/L；
4)MS盐6.3g/L、KH2PO48mg/L、肌醇105mg/L、NAA 2mg/L，6-BA 0.8mg/、2,4-D1.2mg/L、KT 1.0mg/L、VB5 1.5mg/L、蔗糖35g/L。
对比诱导培养基:
文献《白木香愈伤组织的诱导及培养》(董闪等，湖北农业科学，2014，53(15)，3673-3677)中的C2、D3培养基：
C2：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L；
D3：MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L；
上述继代培养的温度为26℃，继代培养周期为28天。结果显示，采用本发明的继代培养基1)-4)培养的白木香愈伤组织生长旺盛，生长量大，颜色呈黄绿色，质地疏松，易分散，无褐化现象产生；其中继代培养基1)中白木香愈伤组织生长量最大。C2、D3培养基诱导出的白木香愈伤细胞生长量则明显低于本发明的培养基1)-4)。
实施例3
将实施例2继代培养基①得到的白木香愈伤组织接种于液体生产培养基中，诱导产生2-(2-苯乙基)色酮化合物。采用的生产培养基为：MS盐4.3g/L、KH2PO4 10mg/L、肌醇100mg/L、NAA 2mg/L、6-BA 1mg/L、2,4-D 1mg/L、KT 1mg/L、VB5 1mg/L、蔗糖30g/L，额外添加35～450mM的氯化钠。培养温度为26℃，培养30天后，采用高分辨液质联用法检测愈伤细胞中2-(2-苯乙基)色酮化合物，不同浓度NaCl诱导白木香愈伤组织产生2-(2-苯乙基)色酮的基峰图见图1。
以最稳定出现且含量相对较高的两个2-(2-苯乙基)色酮化合物AH6、AH8作为定量对象，其结构是通过高分辨质谱推测分子式，二级质谱碎片与2-(2-苯乙基)色酮裂解规律比较，以及标准品对照而明确地鉴定出来的，定量结果见图2。AH6、AH8的结构如下：
采用150mM NaCl诱导白木香愈伤组织30天后，利用高分辨液质LCMS-IT-TOF检测到了41个2-(2-苯乙基)色酮化合物，具体见表2。
表2 NaCl诱导白木香愈伤组织产生的2-(2-苯乙基)色酮化合物
注：*代表标准品鉴定；AH6为36号峰，AH8为35号峰。
以下是采用标准品鉴定的部分2-(2-苯乙基)色酮化合物的结构式：
实施例4
将采用实施例1诱导培养基①诱导得到的白木香愈伤组织，经实施例2的继代培养基1)继代培养5次后，接种于如下液体生产培养基：
(1)按照如下配方配制液体培养基：MS盐4.3g/L、KH2PO4 10mg/L、肌醇100mg/L、NAA2mg/L、6-BA 1mg/L、2,4-D 1mg/L、KT 1mg/L、VB5 1mg/L、蔗糖30g/L、NaCl150mM，在此基础上分别添加二苯基氯化碘盐10μM～100μM，得到液体培养基。
(2)按照如下配方配制对比液体培养基：MS盐4.3g/L、KH2PO4 10mg/L、肌醇100mg/L、NAA 2mg/L、6-BA 1mg/L、2,4-D1mg/L、KT 1mg/L、VB5 1mg/L、蔗糖30g/L、NaCl 150mM。
培养温度为26℃，培养时间为5天后，采用高分辨液质联用法检测愈伤细胞中2-(2-苯乙基)色酮化合物。检测结果发现，培养基中添加二苯基氯化碘盐后，白木香愈伤组织中多种2-(2-苯乙基)色酮化合物，特别是AH6、AH8的产量有相当显著地增加；同时，经细胞活性试验证明，与仅加入氯化钠相比，同时加入氯化钠和DPI的培养基中愈伤细胞的细胞活性更高。在本研究所采用的诱导方法中，150mM NaCl+25μM DPI的组合是诱导白木香愈伤组织中产生2-(2-苯乙基)色酮最为高效的诱导方式，图3示出了加入常规继代培养基的基础上仅加入150mM NaCl和同时加入150mM NaCl+25μM DPI培养后，白木香愈伤细胞产生的2-(2-苯乙基)色酮化合物的HPLC图(波长为320nm)。本发明方法可以有效的用于人工诱导加速结香的生产实践中，改善现有的人工结香方法，具有重要的实用价值和经济价值。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物的方法，其特征在于，将白木香愈伤细胞接种于生产培养基中进行培养；以所述生产培养基为基准，所述生产培养基含有75mM～300mM的氯化钠。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以所述生产培养基为基准，所述生产培养基还含有如下组分：3.5～7.0g/L的MS盐、5～15mg/L的KH2PO4、80～120mg/L的肌醇、0.5～2mg/L的萘乙酸，0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.5～2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5～2.0mg/L的6-糠氨基嘌呤、0.5～2mg/L的维生素B5和20～40g/L的蔗糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生产培养基中进一步含有活性氧抑制剂，所述活性氧抑制剂选自二苯基氯化碘盐、过氧化氢酶、二甲基硫脲中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述活性氧抑制剂为二苯基氯化碘盐；以所述生产培养基为基准，二苯基氯化碘盐的添加量为10μM～100μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白木香愈伤细胞是通过在诱导培养基中诱导白木香材料得到的，所述白木香材料选自白木香的新鲜的茎或叶，所述诱导培养基为含有0.5～2.0mg/L的萘乙酸和0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤的MS培养基。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白木香愈伤细胞是通过在诱导培养基中诱导白木香材料、并将诱导产生的愈伤细胞接种于继代培养基中进行继代培养得到的；所述白木香材料选自白木香的新鲜的茎或叶，所述诱导培养基为含有0.5～2.0mg/L的萘乙酸和0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤的MS培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以继代培养基为基准，所述继代培养基含有如下组分：3.5～7.0g/L的MS盐、5～15mg/L的KH2PO4、80～120mg/L的肌醇、0.5～2mg/L的萘乙酸，0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.5～2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5～2.0mg/L的6-糠氨基嘌呤、0.5～2mg/L的维生素B5和20～40g/L的蔗糖。
8.一种白木香愈伤细胞继代培养基，其特征在于，以继代培养基为基准，所述继代培养基含有如下组分：3.5～7.0g/L的MS盐、5～15mg/L的KH2PO4、80～120mg/L的肌醇、0.5～2mg/L的萘乙酸，0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.5～2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5～2.0mg/L的6-糠氨基嘌呤、0.5～2mg/L的维生素B5、20～40g/L的蔗糖。
9.一种诱导白木香愈伤细胞产生2-(2-苯乙基)色酮化合物的生产培养基，以所述生产培养基为基准，所述生产培养基含有75mM～300mM的氯化钠；
可选地，所述生产培养基进一步包含活性氧抑制剂。
10.根据权利要求9所述的生产培养基，其特征在于，以生产培养基为基准，所述生产培养基还含有如下组分：3.5～7.0g/L的MS盐、5～15mg/L的KH2PO4、80～120mg/L的肌醇、0.5～2mg/L的萘乙酸，0.5～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.5～2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5～2.0mg/L的6-糠氨基嘌呤、0.5～2mg/L的维生素B5和20～40g/L的蔗糖。
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