CN105985907B - 一种临界相生物反应器及反应方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种临界相生物反应器，包括收集罐，还包括气雾培养室，气雾培养室的底部与收集漏斗连通，收集漏斗与收集罐底部连通，收集罐顶部设置有抽气口，气雾培养室的底部设置有筛板，还包括用于照射气雾培养室内部的LED灯，气雾培养室的顶部设置有声场发生器，气雾培养室的顶部还依次连通有强磁管、超声雾化器、负离子发生器和活性炭空气过滤柱。还公开了一种临界相生物反应方法。本发明培养植物个体或器官可以抑制角质层产生，提高次生代谢产物分泌能力，或培养微生物固定化菌丝或微生物固定化细胞，并采用超声雾洗脱法，不断洗脱并降低植物体或器官表面的代谢产物，以实现连续生产次生代谢产物而无需破坏植物体或器官或菌丝体。

Description

一种临界相生物反应器及反应方法

技术领域

本发明属于生物技术和天然产物领域，具体涉及一种临界相生物反应器，还提供一种临界相生物反应方法，适用于珍稀濒危药用植物个体或组织或微生物高效培养与代谢产物连续提取。

背景技术

天然产物是食品医药领域永恒的热点。培养植物个体获得人类需要的次生代谢产物，以此作为食品或医药原料，是现代食品医药的唯一健康发展方向。由于自然资源的有限性，很多具有重要利用价值的药用植物资源由于人类过度开发利用，其自然资源已经濒临枯竭。于是，采用人工种植的方法大量生产植物个体以提取人类需要的化学成分是目前天然产物资源的发展方向。但是随着土地日益紧张、土壤和空气污染日益加重，可耕种土地越来越少，人工种植日益受到限制。在此趋势下，工厂化农业应运而生，除了用于生产粮食和蔬菜之外，采用工厂化农业生产一些珍稀濒危药用植物也成为趋势，但是仍旧摆脱不了“靠增加生物量来提高目的成分产量”这一传统瓶颈。如何把植物体或者植物器官变成一个可无数次循环的生物反应器不断生产次生代谢产物，是一个重大的科学问题。此科学问题的解决，可以使天然产物资源生产摆脱“靠增加生物量来提高目的成分产量”这一传统瓶颈，把天然产物应用推到一个全新的阶段。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，提供一种临界相生物反应器，还提供一种临界相生物反应方法，采用气液临界相环境，再施加以特定波长LED光源、节律性声场和磁负离子调节植物体或器官的生长代谢，使植物细胞和组织处于完全不同于陆生环境和水生环境的组织结构状态，其生长停滞于某一阶段，并不断向细胞外分泌次生代谢产物，这些次生代谢产物被雾滴不断洗脱下来，以解除反馈抑制，使组织细胞不断分泌出次生代谢产物，通过一定的方法回收洗脱液，进而分离其中的目的活性成分。该发明装置与方法可以高密度生产，技术密集，自动化程度高，不需要无菌操作，高效率低成本。还可用于在气液临界相进行微生物固定化培养，包括野生型菌株和基因工程菌株，连续提取目的代谢产物。

一种临界相生物反应器，包括收集罐，还包括气雾培养室，气雾培养室的底部与收集漏斗连通，收集漏斗与收集罐底部连通，收集罐顶部设置有抽气口，气雾培养室的底部设置有筛板，还包括用于照射气雾培养室内部的LED灯，气雾培养室的顶部设置有声场发生器，气雾培养室的顶部还依次连通有强磁管、超声雾化器、负离子发生器和活性炭空气过滤柱。

如上所述的收集漏斗的漏嘴设置有阀门。

如上所述的气雾培养室的中部设置有若干层筛板，各个筛板上按照预定间隔设置有糙面固定化珠子。

一种临界相生物反应方法，包括以下步骤：

配制好MS培养液，然后注入到超声雾化器中，将洗干净的石斛幼苗放进气雾培养室的筛板上；然后开机对抽气口进行抽气：在抽气口的负压作用下，空气经过活性炭空气过滤柱过滤后经过负离子发生器，加电子后与超声雾化器的营养雾一起通过强磁管，雾滴的水分子被磁化并带上负电荷，然后一起进入气雾培养室，LED灯中680纳米的光始终开启，LED灯中420纳米的光按照每隔5小时开启10分钟的方式开启，待石斛的叶片全部死亡，石斛的根长满筛板时，LED灯中680纳米和420纳米的光同时开启，整个培养过程中开启声场发生器，培养期间，每天检测收集罐内的洗脱液，当洗脱液里面检测出生物碱时，往洗脱液中加入乙酸乙酯，培养完毕后，取出乙酸乙酯，浓缩回收得到石斛总碱。

如上所述的强磁管内表面磁场强度为2000-6000mT。

如上所述的声场发生器的节律性声场参数为：频率80-90Hz，功率50-100W，声场发射方式为：强—弱交替反复循环，强声场功率为100W，时间为0.1～1秒；弱声场功率为50W，时间为0.1～1秒。

一种临界相生物反应方法，往洗脱液中加入乙酸乙酯时，乙酸乙酯：洗脱液的质量比为1：10～20。

一种临界相生物反应方法，包括以下步骤：将洗干净的糙面固定化珠子紧密排列在气雾培养室的筛板上，首先全程通入臭氧气体对气雾培养室及各个连通管道灭菌后，再关紧阀门，配制好培养北虫草的MS培养液，无菌过滤后注入到超声雾化器和气雾培养室中，在气雾培养室中北虫草的MS营养液淹没糙面固定化珠子， 然后接种北虫草菌种，开始发酵，发酵温度控制在18-20摄氏度，LED灯的波长控制在620-680纳米照射，光强400-600LX，等到菌丝体全部包裹糙面固定化珠子后，排出气雾培养室的培养液，启动超声雾化器和负离子发生器进行气雾浴培养：在抽气口的负压作用下，空气经过活性炭空气过滤柱过滤后被负离子发生器加电子后与超声雾化器的雾状的北虫草的MS营养液一起通过强磁管时，强磁管内表面磁场强度为4000mT，雾滴的水分子被磁化，然后一起进入气雾培养室为虫草菌丝体提供负离子环境和营养， LED灯同时开启680纳米和420纳米的LED灯，光照强度比率按照680纳米的光/420纳米的光为3/1，整个气雾浴培养过程中开启声场发生器，声场发射方式为：强—弱交替反复循环，强声场功率为100W，时间为0.1～1秒；弱声场功率为50W，时间为0.1～1秒，在培养过程中不断收集收集罐内的洗脱液，用于提取分离腺苷和虫草素。

一种临界相生物反应方法，包括以下步骤： 将洗干净的糙面固定化珠子和沙堆堆放在气雾培养室的筛板上，沙堆为粒径1-3毫米的洁净石英砂或粒径2-5毫米的洁净珍珠岩，再通入臭氧气体对气雾培养室及各个连通管道灭菌后，再关紧阀门，向气雾培养室内注入含有鼠李糖的MS培养液，鼠李糖在MS培养液中的含量为1-20g/L，直至浸没筛板上的沙堆，并向培养液接种薯蓣皂苷菌Penicillium dioscin（中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No: M206001.）接种量为液体菌种10-50毫升/升，25-28摄氏度液体发酵3-7天之后，放出MS培养液，此时沙粒表面和沙粒缝隙布满菌丝，向超声雾化器加入薯蓣皂苷饱和水溶液并开启超声雾化器，或者通过喷雾口向培养室内的沙堆喷洒薯蓣总皂苷饱和水溶液或薯蓣总皂苷悬浊液，让培养室的筛板上的沙堆浸满薯蓣皂苷但不下滴为准， 然后再将超声雾化器内溶液换成MS无糖培养液，开启超声雾化器和负离子发生器，并从抽气口开始抽气，并在收集罐内加入10-50%收集罐容积的石油醚，薯蓣皂苷菌和薯蓣皂苷在沙粒表面气液临界相进行生化反应，整个生化反应过程中开启声场发生器，声场发射方式为：强—弱交替反复循环，强声场功率为100-500W，时间为0.1～1秒；弱声场功率为50W，时间为0.1～1秒，在抽气口的负压作用下，空气经过活性炭空气过滤柱过滤后被负离子发生器加电子后与超声雾化器产生的MS无糖营养液雾滴一起通过强磁管时，强磁管内表面磁场强度为4000mT，雾滴的水分子被磁化，然后一起进入气雾培养室为薯蓣皂苷水解菌提供负离子环境和营养，促进微生物的水解活性，水解产生的薯蓣皂苷元一部分附着在微生物表面或沙粒表面，一部分随雾化形成的雾滴流到收集罐内进入石油醚层，水解反应1-7天后，回收收集罐内的石油醚，蒸干得到薯蓣皂苷元，收集培养室内筛板上的沙堆并将沙堆烘干，用石油醚提取回收得到薯蓣皂苷元，将这两种薯蓣皂苷元合并一起即为薯蓣皂苷的水解产物。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、气液临界相环境，符合大多数植物及其组织或微生物最佳生长发育条件；

2、从植物体或组织连续获得活性成分不需要破坏植物体或微生物菌丝体，可连续生产成本低廉；

3、与传统意义上的生物反应器相比，本装置在培养植物体或组织器官时无需无菌环境，生产成本更低；

4、本发明不仅适用于植物体及其组织器官的密集培养，也适用于微生物固定化培养以生产人类需要的次生代谢产物

5、本发明全部采用物理技术，除了营养液中必须的营养成分之外，培养过程不使用任何化学手段，环保无毒。

附图说明

图1：本发明装置的第一种实施方式的结构示意图；

图2：本发明装置的第二种实施方式的结构示意图；

图3：本发明装置的第三种实施方式的结构示意图；

图4：本发明装置的第四种实施方式的结构示意图。

图中：1-活性炭空气过滤柱；2-负离子发生器；3-超声雾化器；3-1：喷雾头；4-强磁管；5-LED灯；6-气雾培养室；7-石斛幼苗；9-收集漏斗； 11-抽气口；12-筛板；13-植物组织块；14-洗脱液；15-阀门；16-乙酸乙酯；17-收集罐；18-糙面固定化珠子；19-声场发生器。

具体实施方式

实施例1：

如图1所示，一种临界相生物反应器，包括收集罐17，还包括气雾培养室（6），气雾培养室6的底部与收集漏斗9连通，收集漏斗9与收集罐17底部连通，收集罐17顶部设置有抽气口11，气雾培养室6的底部设置有筛板12，还包括用于照射气雾培养室6内部的LED灯5，气雾培养室6的顶部设置有声场发生器19，气雾培养室6的顶部还依次连通有强磁管4、超声雾化器3、负离子发生器2和活性炭空气过滤柱1。收集漏斗9的漏嘴设置有阀门15。

优选的，气雾培养室6为透明材质，LED灯5设置在气雾培养室6的侧部。

优选的，气雾培养室6的中部设置有若个层筛板12，各个筛板12上按照预定间隔设置有糙面固定化珠子18。

有糙面固定化珠子18为实心磁珠或者中空磁珠。

优选的，实心磁珠可以是双层结构，包括球心和第一外包层，球心为天然磁铁或人造永磁体；

优选的，中空磁珠为三层结构，从里到外依次包括真空球心，磁芯和第二外包层，所述磁芯为包裹在真空球心外的天然磁铁或人造永磁体；

优选的，第一外包层和第二外包层的材质均为耐有机溶剂且对生物细胞生长和代谢没有抑制作用的惰性材料，例如玻璃或陶瓷或不锈钢或聚四氟乙烯等等；

优选的，第一外包层和第二外包层的表面是带有突出结构的粗糙表面，所述突出结构可以为规则的，也可也为不规则的；

优选的，实心磁珠或中空磁珠外径可以根据发酵罐的大小和培养要求来定制。

优选的，磁珠的表面磁场强度为100-400mT，也可以根据培养要求定制磁珠。

实施例2：

如图2所示，一种临界相生物反应器，包括收集罐17，还包括气雾培养室6，气雾培养室6的底部与收集漏斗9连通，收集漏斗9与收集罐17底部连通，收集罐17顶部设置有抽气口11，气雾培养室6的底部设置有筛板12，还包括用于照射气雾培养室6内部的LED灯5，气雾培养室6的顶部设置有声场发生器19，气雾培养室6的顶部还依次连通有强磁管4、超声雾化器3、负离子发生器2和活性炭空气过滤柱1。收集漏斗9的漏嘴设置有阀门15。

一种利用临界相生物反应器生产石斛碱的方法，包括以下步骤：

配制好MS培养液，然后注入到超声雾化器3中，将洗干净的石斛幼苗7放进气雾培养室6的筛板12上；然后开机对抽气口11进行抽气：在抽气口11的负压作用下，空气经过活性炭空气过滤柱1过滤后经过负离子发生器2，负离子发生器选用的规格为功率500W-15000W，电压10000-50000V，负离子产率8x10¹¹个/s，抗电强度：AC3750V 50Hz 5Ma 3S无击穿，使用湿度：70-90% 。加电子后与超声雾化器3的营养雾一起通过强磁管4时，强磁管内表面磁场强度为2000-6000mT，本实施例中采用4000mT，雾滴的水分子被磁化并带上负电荷，然后一起进入气雾培养室6为石斛提供矿质营养，LED灯5中680纳米的LED灯始终开启，LED灯5中420纳米的LED灯按照每隔5小时开启10分钟的方式开启，待石斛的叶片全部死亡，石斛的根长满筛板时； LED灯5中680纳米和420纳米的LED灯同时开启，整个培养过程中开启声场发生器19，声场发生器19的节律性声场参数为：频率80-90Hz，功率50-100W，声波发射时间为：强（100W，0.1～1秒）—弱（50W，0.1～1秒）交替反复循环，发射节律性低音声场使石斛的根系产生共振，以激发生长和分泌石斛碱并促进分泌产物快速分散到根系表面的水膜中去，培养期间，每天检测收集罐17内的洗脱液14，当洗脱液14里面检测出生物碱时，按照乙酸乙酯：洗脱液为1：10～20质量比往洗脱液14里面添加乙酸乙酯16，培养完毕后，取出乙酸乙酯16，浓缩回收得到石斛总碱。如上方法培养石斛，在相同的培养时间内单株石斛总碱产量比常规栽培提取的石斛总碱产量高出15-20倍以上。

实施例3：

如图3所示，一种临界相生物反应器，包括收集罐17，还包括气雾培养室6，气雾培养室6的底部与收集漏斗9连通，收集漏斗9与收集罐17底部连通，收集罐17顶部设置有抽气口11，气雾培养室6的底部设置有筛板12，还包括用于照射气雾培养室6内部的LED灯5，气雾培养室6的顶部设置有声场发生器19，气雾培养室6的顶部还依次连通有强磁管4、超声雾化器3、负离子发生器2和活性炭空气过滤柱1。收集漏斗9的漏嘴设置有阀门15。气雾培养室6的中部设置有若干层筛板12，各个筛板12上按照预定间隔设置有糙面固定化珠子18。

在本实施例中，各层筛板12为外圈与气雾培养室6内壁固定的环形筛板。

糙面固定化珠子18的表面磁场强度为100-400mT，磁珠直径为2-3cm，筛网的网格直径1-1.5cm。在本实施例中糙面固定化珠子18的表面磁场强度为250mT，磁珠直径为2.5cm，筛网的网格直径1.2cm。

一种利用临界相生物反应器生产虫草素的方法，包括以下步骤：

将洗干净的糙面固定化珠子18放进气雾培养室6的筛板12上，所述的糙面固定化珠子18为空心磁珠或实心磁珠，所述的筛板12为镶嵌在气雾培养室6内壁的环形筛网，筛网的网格直径0.1-18厘米，以刚好固定糙面固定化珠子18为宜，环形筛网内环直径2-5厘米，以保证气雾通畅，固定化珠子紧密排列在环形筛网上。首先全程通入臭氧气体对气雾培养室6及各个连通管道灭菌后，再关紧阀门15，配制好培养北虫草的MS培养液，无菌过滤后注入到超声雾化器3和气雾培养室6中，在气雾培养室6中北虫草的MS营养液淹没糙面固定化珠子18， 然后接种北虫草菌种，开始发酵，发酵温度控制在18-20摄氏度，LED灯5的波长控制在620-680纳米照射，光强400-600LX，等到菌丝体全部包裹固定化珠子18后，排出气雾培养室6的培养液，启动超声雾化器3和负离子发生器2进行气雾浴培养：在抽气口11的负压作用下，空气经过活性炭空气过滤柱1过滤后被负离子发生器2加电子后与超声雾化器3的营养雾（雾状的北虫草的MS营养液）一起通过强磁管4时，强磁管内表面磁场强度为4000mT，雾滴的水分子被磁化，然后一起进入气雾培养室6为虫草菌丝体提供负离子环境和矿质营养，LED灯5同时开启680纳米和420纳米的LED灯，光照强度比率按照680纳米的LED灯/420纳米的LED灯为3/1，整个气雾浴培养过程中开启声场发生器19，节律性声场参数为：频率80-90Hz，功率50-100W，声波发射时间为：强（100W，0.1～1秒）—弱（50W，0.1～1秒）交替反复循环，发射节律性重低音声场使虫草菌丝体产生共振，以激发生长和分泌虫草素并促进分泌产物快速分散到菌丝体表面的水膜中去，在这种培养条件下，北虫草菌丝可以在1-3个月内或更长时间维持很强的活力而不衰退，在培养过程中不断收集收集罐17内的洗脱液14，用于提取分离腺苷和虫草素，或者直接浓缩干燥作为药物或功能食品。采用如上方法培养北虫草菌丝，连续生产周期延长3-5倍，单位时间内虫草素和腺苷的产量比传统的液体发酵提高2-3倍以上。

实施例4：

一种临界相生物反应器，包括收集罐17，还包括气雾培养室6，气雾培养室6的底部与收集漏斗9连通，收集漏斗9与收集罐17底部连通，收集罐17顶部设置有抽气口11，气雾培养室6的底部设置有筛板12，还包括用于照射气雾培养室6内部的LED灯5，气雾培养室6的顶部设置有声场发生器19，气雾培养室6的顶部还依次连通有强磁管4、超声雾化器3、负离子发生器2和活性炭空气过滤柱1。收集漏斗9的漏嘴设置有阀门15，气雾培养室6的中部设置有若干层筛板12，各个筛板12上按照预定间隔设置有糙面固定化珠子18。气雾培养室6的顶部设置有喷雾头3-1。

一种临界相生物反应方法，将洗干净的糙面固定化珠子18和沙堆堆放在气雾培养室6的筛板12上，沙堆为粒径1-3毫米的洁净石英砂或粒径2-5毫米的洁净珍珠岩，再通入臭氧气体对气雾培养室6及各个连通管道灭菌后，再关紧阀门15，向气雾培养室6内注入含有鼠李糖的MS培养液，鼠李糖在MS培养液中的含量为1-20g/L，直至浸没筛板上的沙堆，并向培养液接种薯蓣皂苷菌Penicillium dioscin（中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo: M206001.）接种量为液体菌种10-50毫升/升，25-28摄氏度液体发酵3-7天之后，放出MS培养液，此时沙粒表面和沙粒缝隙布满菌丝，向超声雾化器3加入薯蓣皂苷饱和水溶液并开启超声雾化器3，或者通过喷雾口3-1向培养室6内的沙堆喷洒薯蓣总皂苷饱和水溶液或薯蓣总皂苷悬浊液，让培养室6的筛板12上的沙堆浸满薯蓣皂苷但不下滴为准， 然后再将超声雾化器3内溶液换成MS无糖培养液，开启超声雾化器3和负离子发生器2，并从抽气口11开始抽气，并在收集罐17内加入10-50%收集罐17容积的石油醚，薯蓣皂苷菌和薯蓣皂苷在沙粒表面气液临界相进行生化反应，整个生化反应过程中开启声场发生器19，声场发射方式为：强—弱交替反复循环，强声场功率为100-500W，时间为0.1～1秒；弱声场功率为50W，时间为0.1～1秒，在抽气口11的负压作用下，空气经过活性炭空气过滤柱1过滤后被负离子发生器2加电子后与超声雾化器3产生的MS无糖营养液雾滴一起通过强磁管4时，强磁管4内表面磁场强度为4000mT，雾滴的水分子被磁化，然后一起进入气雾培养室6为薯蓣皂苷水解菌提供负离子环境和营养，促进微生物的水解活性，水解产生的薯蓣皂苷元一部分附着在微生物表面或沙粒表面，一部分随雾化形成的雾滴流到收集罐17内进入石油醚层，水解反应1-7天后，回收收集罐17内的石油醚，蒸干得到薯蓣皂苷元，收集培养室6内筛板12上的沙堆并将沙堆烘干，用石油醚提取回收得到薯蓣皂苷元，将这两种薯蓣皂苷元合并一起即为薯蓣皂苷的水解产物。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (1)

1.一种临界相生物反应方法，

利用一种临界相生物反应器，包括收集罐(17)，还包括气雾培养室(6)，气雾培养室(6)的底部与收集漏斗(9)连通，收集漏斗(9)与收集罐(17)底部连通，收集罐(17)顶部设置有抽气口(11)，气雾培养室(6)的底部设置有筛板(12)，还包括用于照射气雾培养室(6)内部的LED灯(5)，气雾培养室(6)的顶部设置有声场发生器(19)，气雾培养室(6)的顶部还依次连通有强磁管(4)、超声雾化器(3)、负离子发生器(2)和活性炭空气过滤柱(1)，

收集漏斗(9)的漏嘴设置有阀门(15)，

气雾培养室(6)的中部设置有若干层筛板(12)，各个筛板(12)上按照预定间隔设置有糙面固定化珠子(18)，

气雾培养室(6)的顶部设置有喷雾头(3-1)，

其特征在于，包括以下步骤：将洗干净的糙面固定化珠子(18)和沙堆堆放在气雾培养室(6)的筛板(12)上，沙堆为粒径1-3毫米的洁净石英砂或粒径2-5毫米的洁净珍珠岩，再通入臭氧气体对气雾培养室(6)及各个连通管道灭菌后，再关紧阀门(15)，向气雾培养室(6)内注入含有鼠李糖的MS培养液，鼠李糖在MS培养液中的含量为1-20g/L，直至浸没筛板上的沙堆，并向培养液接种薯蓣皂苷菌Penicillium dioscin，中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No:M206001，接种量为液体菌种10-50毫升/升，25-28摄氏度液体发酵3-7天之后，放出MS培养液，此时沙粒表面和沙粒缝隙布满菌丝，向超声雾化器(3)加入薯蓣皂苷饱和水溶液并开启超声雾化器(3)，或者通过喷雾头(3-1)向培养室(6)内的沙堆喷洒薯蓣总皂苷饱和水溶液或薯蓣总皂苷悬浊液，让培养室(6)的筛板(12)上的沙堆浸满薯蓣皂苷但不下滴为准，然后再将超声雾化器(3)内溶液换成MS无糖培养液，开启超声雾化器(3)和负离子发生器(2)，并从抽气口(11)开始抽气，并在收集罐(17)内加入10-50％收集罐(17)容积的石油醚，薯蓣皂苷菌和薯蓣皂苷在沙粒表面气液临界相进行生化反应，整个生化反应过程中开启声场发生器(19)，声场发射方式为：强—弱交替反复循环，强声场功率为100-500W，时间为0.1～1秒；弱声场功率为50W，时间为0.1～1秒，在抽气口(11)的负压作用下，空气经过活性炭空气过滤柱(1)过滤后被负离子发生器(2)加电子后与超声雾化器(3)产生的MS无糖营养液雾滴一起通过强磁管(4)时，强磁管(4)内表面磁场强度为4000mT，雾滴的水分子被磁化，然后一起进入气雾培养室(6)为薯蓣皂苷水解菌提供负离子环境和营养，促进微生物的水解活性，水解产生的薯蓣皂苷元一部分附着在微生物表面或沙粒表面，一部分随雾化形成的雾滴流到收集罐(17)内进入石油醚层，水解反应1-7天后，回收收集罐(17)内的石油醚，蒸干得到薯蓣皂苷元，收集培养室(6)内筛板(12)上的沙堆并将沙堆烘干，用石油醚提取回收得到薯蓣皂苷元，将这两种薯蓣皂苷元合并一起即为薯蓣皂苷的水解产物。