CN110972944B - 一种间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法，包括如下步骤：种子萌发：将金钗石斛种子无菌播种到固体培养基上进行萌发培养；原球茎增殖培养：将萌发的种子无菌转接到原球茎增殖固体培养基上进行原球茎增殖培养；液体适应性培养：将培养得到的原球茎无菌接种到液体培养基中培养；间歇浸没培养：将完成适应性培养且无污染原球茎连同液体培养基一起倒入间歇浸没培养生长室中，进行间歇浸没培养。本发明间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法，具有培养周期短、移栽成活率高、自动化程度高、劳动力消耗少等优点，尤其是在间歇浸没培养过程中不移动组培苗，而是更换培养液，组培苗不受伤害，显著提高生产效率和培养质量。

Description

一种间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法

技术领域

本发明属于中药材育苗领域，涉及一种金钗石斛种苗生产方法，具体涉及一种利用间歇浸没液体培养系统生产金钗石斛组培苗的方法。

背景技术

金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)为兰科石斛属(Dendrobium)珍稀药用植物，早在《神农本草经》中就有记载，为中国濒危物种，具有滋阴生津、润肺明目、抗癌防老等功效。

金钗石斛的种子极为细小，胚胎发育不完全，无胚乳组织，在自然状态下发芽率极低。加之长期以来掠夺性的采挖，致使野生的资源已近枯竭，处于濒危状态，远远不能满足国内外市场需求，造成市场供应紧缺。随着人工种植面积不断增加，优质种苗的需求量也越来越多。

应用植物组培快繁方法可获得遗传基础、外观品质等重要性状均一的繁殖体，是目前常用的扩繁石斛的方法，在一定程度上解决了石斛优质种苗短缺的现象。但是，传统的方法对于金钗石斛组培苗的获得具有许多难以避免的缺点：1)由于密封式培养，培养过程中无法进行气体的交换，致使组培苗出现玻璃化现象、种苗质量差，移栽成活率低；2)培养过程中需要大量的转接操作，并需要处理废弃的培养基，增加了劳动成本；3)由于组培瓶空间有限，组培苗需要不断的组培瓶生长，人为的转接造成不大量的污染损失，在转接的过程中也造成了组培苗的损伤，导致组培苗生长速度减慢，培养周期延长。

应用间歇浸没液体培养系统进行金钗石斛的生产可以弥补传统方法生产的缺陷，为低成本的生产高质量的种苗提供有效的方法。

利用间歇浸没培养反应器成功进行植物培养的研究已有报道。如专利号为ZL200910114406.1的“利用间歇浸没式间歇浸没培养系统进行甘蔗组织培养快繁”的研究，其对利用间歇浸没培养反应器对三个品种的甘蔗培养进行了介绍，同时也为利用此种培养方式进行其它种类植物的培养提供了技术启示。但是，一方面不同间歇浸没培养装置的操作方法不同；另一方面由于各种植物生理、生化上的不同，相同的培养方法对不同的植物培养不一样，需要大量的实验优化最佳培养条件，并不能通过简单的有限的实验推理来得到。文献专利中提及的步骤以及其中涉及到的具体的培养方式和培养条件完全不能用于金钗石斛种苗的培育。

然而，利用间歇浸没式培养方法进行金钗石斛组织培养快繁的方法未见报道和公开应用。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法，该方法采用间歇浸没式培养，具有培养周期短、移栽成活率高、自动化程度高、劳动力消耗少等优点，尤其是在间歇浸没培养过程中不移动组培苗，而是更换培养液，组培苗不受伤害，显著提高生产效率和培养质量。

技术方案：为实现上述发明目的，如本发明所述一种间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法，包括如下步骤：

(1)种子萌发：将金钗石斛种子无菌播种到固体培养基上进行萌发培养；

(2)原球茎增殖培养：将萌发的种子无菌转接到原球茎增殖固体培养基上进行原球茎增殖培养；

(3)液体适应性培养：将步骤(2)培养得到的原球茎无菌接种到液体培养基中适应性培养；

(4)间歇浸没培养：将完成适应性培养且无污染原球茎连同步骤(3)液体培养基倒入间歇浸没系统的生长室中，设定培养参数，进行间歇浸没培养的壮苗培养；再进行间歇浸没培养的生根培养。

其中，步骤(1)中所述种子为成熟未开裂的金钗石斛果夹，并经表面消毒处理后得到的无菌种子；所述固体培养基的配方为N6+8～10％椰汁+2～3％蔗糖+0.65％琼脂，pH6.0，本发明中各培养基配方中物质含量均为质量分数；

作为优选，步骤(2)中所述原球茎增殖固体培养基配方为N6+0.2～0.5％海藻提取液+8～10％椰汁+3％蔗糖+0.65％琼脂，pH6.2。

作为优选，步骤(3)中所述液体培养基配方为N6+0.1～0.2％花宝2+0.2～0.5％海藻提取液+8～10％土豆+4～6％香蕉+2～3％蔗糖，pH6.2；每100mL液体培养基接种原球茎8～15g。

进一步地，步骤(2)所使用的培养容器为250mL的三角瓶，每瓶倒入100mL液体培养基、接种原球茎优选10～12g。

作为优选，步骤(3)中所述培养为3-5天。此外，步骤(4)液体培养基与适应性培养的培养基，是同一个培养基的。适应性培养的目的是确保无污染且生长良好，再转入到反应器培养。

其中，步骤(4)中所述间歇浸没培养分两个阶段，第一阶段为壮苗培养，培养时间为30～40天；第二阶段为生根培养，培养时间为50～70天。

作为优选，所述壮苗培养的培养基配方为步骤(3)中所述的液体培养基，壮苗培养设定间歇时间为2～6h，浸没时间为5～20min；所述生根培养的培养基配方为N6+0.15～3％花宝2+8～10％香蕉+5～6％土豆+3％蔗糖+1～1.5％活性炭pH6.5，生根培养设定间歇时间为6～12h，浸没时间为1～10min。

其中，所述壮苗培养阶段完成后，不移动组培苗，将间歇浸没培养容器中的壮苗培养基倒出，将生根培养基倒入，并更改为生根培养的间歇浸没频率参数。

其中，所述间歇浸没系统，包括罐体部分、动力系统和控制系统，所述动力系统产生气体通过连接的管道提供给罐体部分，控制系统通过电路或者网络连接动力系统；所述罐体分为上下结构，通过育苗盘密封相隔，上部分为生长室(体积4000mL)、下部分为储液室(体积2000mL)，两室通过连接在育苗盘上的导管相连；动力系统提供气压可以将液体培养基从储液室顺着导管压入到生长室，而气压消失后液体培养基在重力作用下通过导管回流到储液室中；控制系统控制动力系统的工作。

作为优选，动力系统如气泵、控制系统如时控器。

进一步地，上述所有培养基及容器的灭菌均采用121℃高温高压湿热灭菌；培养环境均为光照强度1800～2000lux，光照时间12～14h/d，温度25±1℃。

本发明提供的金钗石斛种苗生产方法，不仅在组培苗生产效率上远高于传统的固体培养，而且在间歇浸没系统中不移出组培苗的情况下直接壮苗和生根培养，节约了劳动力，缩短了炼苗时间，降低了污染率。为金钗石斛的生产与炼苗提供了一个行之有效的方法。

工作原理：本发明的间歇浸没系统的间歇浸没培养的壮苗培养和生根培养均可分成四个阶段：第一阶段，间歇阶段，培养体不与液体培养基接触；第二阶段，开始浸没阶段，在外力的作用下，液体培养基开始进入组培体生长室；第三阶段，浸没阶段，液体培养基完全与进入到生长室，并保持一定时间；第四阶段，浸没结束，在重力及外力作用下，液体培养基开始回流到储液室并与培养体分离；最后液体培养基完全回流到储液室又进入到间歇阶段，完成一次循环。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)炼苗成活率高：本发明利用液体培养的特点，根据需要及时更换培养液，而不用取出组培苗，直接在同一个容器中完成壮苗和生根培养，减少组培苗的损伤；且在培养的过程中主动有效的进行容器内外空气交换，种苗生长更健康。显著提高炼苗成活率，实际效果达到98％-100％。

(2)自动化程度高、劳动量小：本发明由于利用间歇浸没液体培养系统是气泵提供动力，时控开关来控制培养间歇频率，整个培养过程只需要一次接种，省去了培养物的频繁转接和大批量组培瓶的灌装清洗等的操作，大大的减少了劳动量，降低了生产成本。

(3)成苗时间短，减少生产成本：本发明一次接种后不再转接，降低了继代次数，减少了污染和转接工作的费用和试剂、药品等的消耗，节省生产成本，尤其是缩短了组培苗适应时间，缩短培养周期。

(4)本发明的间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法可以减少污染，通过适应性培养确定无污染后在进行间歇浸没系统培养避免了污染，并且在进入到间歇浸没系统培养后，进入了自动培养，减少人为干预带来的污染。

(5)本发明的金钗石斛种苗的生产方法具有培养周期短、种苗质量高、培养效率好、生产成本低的特点。

附图说明

图1为间歇浸没系统的结构示意图及工作原理图；

图2为不同培养方式的比较示意图；①间歇浸没培养；②固体培养。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

如图1所示，间歇浸没系统，包括罐体1、动力系统2和控制系统3，动力系统2产生气体通过连接的管道提供给罐体1，控制系统3通过电路连接动力系统2；罐体1分为上下结构，通过育苗盘4密封相隔，上部分为生长室5、下部分为储液室6，两室通过连接在育苗盘4上的导管相连；动力系统2提供气体气压可以将液体培养基从储液室6顺着导管压入到生长室5，而气体气压消失后液体培养基在重力和大气空气压力作用下通过导管回流到储液室5中；控制系统3控制动力系统2的工作；动力系统为气泵、控制系统为时控器。罐体1内外气体是等压的，通气阶段多余的气体和停止通气后外界的空气从罐体1顶部左侧的扁圆的空气过滤除菌的装置排出和进入，以保持管内的无菌。

实施例2

(1)配制固体培养基(N6+10％椰汁+2％蔗糖+0.65％琼脂pH6.0)，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用。将成熟且无开裂的金钗石斛果荚经表面消毒(升汞或次氯酸钠消毒)后，将种子均匀播撒到培养基中，以种子之间不重叠为宜，培养30天左右。

(2)配制原球茎增殖固体培养基(N6+0.5％海藻提取液+10％椰汁+3％蔗糖+0.65％琼脂pH6.2)，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用。将已萌发的种子接种到原球茎增殖固体培养基中，培养35天，完成原球茎培养。

(3)配制液体培养基(N6+0.1％花宝2+0.5％海藻提取液+10％土豆+6％香蕉+3％蔗糖pH6.2)，将1000mL培养基装入三角瓶中，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用。将10g金钗石斛原球茎接种到三角瓶中，培养4天。

(4)将间歇浸没培养系统中的罐体组装并包扎灭菌，灭菌后冷却备用，无菌环境下已培养4天且无污染原球茎连同液体培养基倒入歇浸没培养系统生长室中，培养基流入储液室内、原球茎均匀分布到生长室的育苗盘上。将接种完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为10min/4h，在培养室中培养35天，完成壮苗培养。

壮苗培养第一阶段，间歇阶段，组培体不与液体培养基接触；第二阶段，开始浸没阶段，在外力(动力系统2提供气体气压)的作用下，液体培养基开始进入组培体生长室；第三阶段，浸没阶段，液体培养基完全与进入到生长室，并保持一定时间(10min)；第四阶段，浸没结束，在重力及罐体1顶部的大气空气压力作用下，液体培养基开始回流到储液室并与培养体分离；最后液体培养基完全回流到储液室又进入到间歇阶段，完成一次循环，4h后继续下一次循环。

(5)配制生根培养的液体培养基(N6+0.15％花宝2+10％香蕉+6％土豆+3％蔗糖+1.5％AC pH6.5)，将1000mL装入三角瓶中，121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用。在无菌操作台中将间歇浸没系统罐体原有的培养基倒出，不移动组培苗，将新的1000mL生根培养的液体培养基倒入，完成培养基更换，进入生根培养阶段。将更换完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为5min/8h，在培养室中培养60天，完成生根培养。

生根培养第一阶段，间歇阶段，组培体不与液体培养基接触；第二阶段，开始浸没阶段，在外力(动力系统2提供气体气压)的作用下，液体培养基开始进入组培体生长室；第三阶段，浸没阶段，液体培养基完全与进入到生长室，并保持一定时间(10min)；第四阶段，浸没结束，在重力及罐体1顶部的大气空气压力作用下，液体培养基开始回流到储液室并与培养体分离；最后液体培养基完全回流到储液室又进入到间歇阶段，完成一次循环，4h后继续下一次循环。

(6)整个培养过程培养室环境光照强度2000lux，光照时间14h/d，温度25±1℃。

对比实施例

对比实施例采用500mL兰花瓶固体培养方法，培养基配方与实施例1中的各阶段培养基相同，且均添加琼脂，培养基种琼脂含量为0.65％；培养时间和培养环境也与实施例1相同；培养基添加量为100mL/瓶，壮苗阶段接种量1g原球茎/瓶，生根阶段接种量20株/瓶。

结果如图2所示，实施例2培养的植株高度10～13厘米，根部生长较好(如图2中①)，而对比例固体培养的植株高度5～8厘米，根部生长较差；移栽成活率情况(如图2中②)，前者可以达到98以上，后者在93～95％。

实施例3

(1)配制固体培养基(N6+8％椰汁+3％蔗糖+0.65％琼脂pH6.0)，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用。将成熟且无开裂的金钗石斛果荚经表面消毒(升汞或次氯酸钠消毒)后，将种子均匀播撒到培养基中，以种子之间不重叠为宜，培养30天左右。

(2)配制原球茎增殖固体培养基(N6+0.2％海藻提取液+8％椰汁+3％蔗糖+0.65％琼脂pH6.2)，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用。将已萌发的种子接种到原球茎增殖固体培养基中，培养35天，完成原球茎培养。

(3)配制液体培养基(N6+0.2％花宝2+0.2％海藻提取液+8％土豆+4％香蕉+2％蔗糖pH6.2)，将1000mL培养基装入三角瓶中，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用。将8g金钗石斛原球茎接种到三角瓶中，培养3天。

(4)将间歇浸没培养系统中的罐体组装并包扎灭菌，灭菌后冷却备用，无菌环境下已培养3天且无污染原球茎连同液体培养基倒入歇浸没培养系统生长室中，培养基流入储液室内、原球茎均匀分布到生长室的育苗盘上。将接种完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为5min/2h，在培养室中培养30天，完成壮苗培养。

壮苗培养第一阶段，间歇阶段，组培体不与液体培养基接触；第二阶段，开始浸没阶段，在外力(动力系统2提供气体气压)的作用下，液体培养基开始进入组培体生长室；第三阶段，浸没阶段，液体培养基完全与进入到生长室，并保持一定时间(5min)；第四阶段，浸没结束，在重力及大气空气压力作用下，液体培养基开始回流到储液室并与培养体分离；最后液体培养基完全回流到储液室又进入到间歇阶段，完成一次循环，2h后继续下一次循环。

(5)配制生根培养的液体培养基(N6+3％花宝2+8％香蕉+5％土豆+3％蔗糖+1％ACpH6.5)，将1000mL装入三角瓶中，121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用。在无菌操作台中将间歇浸没系统罐体原有的培养基倒出，不移动组培苗，将新的1000mL生根培养的液体培养基倒入，完成培养基更换，进入生根培养阶段。将更换完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为1min/6h，在培养室中培养50天，完成生根培养。

生根培养第一阶段，间歇阶段，组培体不与液体培养基接触；第二阶段，开始浸没阶段，在外力(动力系统2提供气体气压)的作用下，液体培养基开始进入组培体生长室；第三阶段，浸没阶段，液体培养基完全与进入到生长室，并保持一定时间(1min)；第四阶段，浸没结束，在重力及大气空气压力作用下，液体培养基开始回流到储液室并与培养体分离；最后液体培养基完全回流到储液室又进入到间歇阶段，完成一次循环，6h后继续下一次循环。

(6)整个培养过程培养室环境光照强度1800lux，光照时间12h/d，温度25±1℃。

实施例4

实施例4和实施例1的过程相同，不同之处在于：步骤(3)将1000mL培养基装入三角瓶中，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用。将15g金钗石斛原球茎接种到三角瓶中，培养5天。

步骤(4)将接种完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为20min/6h，在培养室中培养40天，完成壮苗培养。

步骤(5)将更换完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为10min/12h，在培养室中培养70天，完成生根培养。

Claims (1)

1.一种间歇浸没式培养金钗石斛种苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）配制固体培养基：N6+10%椰汁+2%蔗糖+0.65%琼脂，pH6.0，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用，将成熟且无开裂的金钗石斛果荚经表面消毒后，将种子均匀播撒到培养基中，以种子之间不重叠为宜，培养30天；

（2）配制原球茎增殖固体培养基：N6+0.5%海藻提取液+10%椰汁+3%蔗糖+0.65%琼脂，pH6.2，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用，将已萌发的种子接种到原球茎增殖固体培养基中，培养35天，完成原球茎培养；

（3）配制液体培养基：N6+0.1%花宝2+0.5%海藻提取液+10%土豆+6%香蕉+3%蔗糖，pH6.2，将1000mL培养基装入三角瓶中，并经过121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用，将10g金钗石斛原球茎接种到三角瓶中，培养4天；

（4）将间歇浸没培养系统中的罐体组装并包扎灭菌，灭菌后冷却备用，无菌环境下已培养4天且无污染原球茎连同液体培养基倒入间歇浸没培养系统生长室中，培养基流入储液室内、原球茎均匀分布到生长室的育苗盘上，将接种完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为10min/4h，在培养室中培养35天，完成壮苗培养；

壮苗培养第一阶段，间歇阶段，组培体不与液体培养基接触；第二阶段，开始浸没阶段，在外力动力系统提供气体气压的作用下，液体培养基开始进入组培体生长室；第三阶段，浸没阶段，液体培养基完全进入到生长室，并保持10min；第四阶段，浸没结束，在重力及罐体顶部的大气空气压力作用下，液体培养基开始回流到储液室并与培养体分离；最后液体培养基完全回流到储液室又进入到间歇阶段，完成一次循环，4h后继续下一次循环；

（5）配制生根培养的液体培养基：N6+0.15%花宝2+10%香蕉+6%土豆+3%蔗糖+1.5%AC ，pH6.5，将1000mL装入三角瓶中，121℃高温高压湿热灭菌后冷却备用，在无菌操作台中将间歇浸没系统罐体原有的培养基倒出，不移动组培苗，将新的1000mL生根培养的液体培养基倒入，完成培养基更换，进入生根培养阶段，将更换完成的罐体连接到动力和控制系统中，设定间歇浸没频率为10min/4h，在培养室中培养60天，完成生根培养；

生根培养第一阶段，间歇阶段，组培体不与液体培养基接触；第二阶段，开始浸没阶段，在外力动力系统提供气体气压的作用下，液体培养基开始进入组培体生长室；第三阶段，浸没阶段，液体培养基完全进入到生长室，并保持10min；第四阶段，浸没结束，在重力及罐体顶部的大气空气压力作用下，液体培养基开始回流到储液室并与培养体分离；最后液体培养基完全回流到储液室又进入到间歇阶段，完成一次循环，4h后继续下一次循环；

（6）整个培养过程培养室环境光照强度2000 lux，光照时间14 h/d，温度25±1℃；

间歇浸没系统，包括罐体（1）、动力系统（2）和控制系统（3），动力系统（2）产生气体通过连接的管道提供给罐体（1），控制系统（3）通过电路连接动力系统（2）；罐体（1）分为上下结构，通过育苗盘（4）密封相隔，上部分为生长室（5）、下部分为储液室（6），两室通过连接在育苗盘（4）上的导管相连；动力系统（2）提供气体气压可以将液体培养基从储液室（6）顺着导管压入到生长室（5），而气体气压消失后液体培养基在重力和大气空气压力作用下通过导管回流到储液室（6 ）中；控制系统（3）控制动力系统（2）的工作；动力系统为气泵、控制系统为时控器；罐体（1）内外气体是等压的，通气阶段多余的气体和停止通气后外界的空气从罐体（1）顶部左侧的扁圆的空气过滤除菌的装置排出和进入，以保持管内的无菌。

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