KR20190037896A - OsASN1 유전자가 과별현된 형질전환 벼 및 이를 이용한 질소부족 조건에서 쌀의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 질소부족 조건에서 고품질의 쌀을 생산할 수 있는 형질전환 벼에 대한 것으로, 더욱 자세하게는 OsASN1 유전자가 과별현된 형질전환 벼 및 이를 이용한 질소부족 조건에서 쌀의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 형질전환 벼를 사용하면, 환경적인 부담이 있는 질소비료를 사용하지 않고도, 기존의 논이나, 질소부족 논에서 벼를 재배하여도, 곡물수확량이 우수하며, 질소함량과 단백질 함량이 높은 쌀을 제조할 수 있다.

Description

OsASN1 유전자가 과별현된 형질전환 벼 및 이를 이용한 질소부족 조건에서 쌀의 생산방법{Transgenic Rice Overexpressed OsASN1 Gene and Preparing Method of Rice Grain Under Nitrogen Limited Condition}

본 발명은 질소부족 조건에서 고품질의 쌀을 생산할 수 있는 형질전환 벼에 대한 것으로, 더욱 자세하게는 OsASN1 유전자가 과별현된 형질전환 벼 및 이를 이용한 질소부족 조건에서 쌀의 생산방법에 관한 것이다.

질소(N)는 아미노산, 핵산 및 엽록소에 포함되는 기본적인 빌딩 블록으로, 식물에 필요한 필수 다량 영양소이다. 토양의 질소 부족(결핍)은 광합성 요소를 줄임으로써 식물 생산성, 영양 및 작물 수확량을 부분적으로 제한한다. 질소 비료의 사용은 세계적으로 증가하여, 지난 50년간 작물 수확량의 증가를 향상시켰다. 그러나, 질소 비료의 과다 사용은 환경적으로도 경제적으로도 부정적인 영향을 미친다. 따라서, 질소 비료 의존도를 줄이고, "질소 이용 효율"(NUE; 비료 질소의 단위당 생산 된 총 바이오 매스 또는 곡물 수율)을 향상시키는 것이 환경을 보존하고 지속 가능한 농업을 개선하기 위해 필요하다. 이는 세계 인구 일인당 에너지의 21% 및 일인당 단백질의 15%를 제공하는 주요 식량인 쌀을 얻기 위한 벼농사에 특히 중요하다(http://www.knowledgebank.irri.org).

식물의 노화는 세포, 조직, 기관 및 단자엽 종에서 전체 식물 발생과정의 최종 단계이다. 일단 노화가 시작되면, 일반적으로 식물의 노화 부위에서 곡물과 같은 수용부(sink)까지 체관부-이동성 영양소의 대량 영양소 재이동이 진행된다. 벼의 경우, 이삭에 존재하는 전체 질소의 약 80%가 노화 기관으로부터 유래한 것이다. 체관부 수액 중의 질소는 글루타민과 아스파라긴의 형태로 존재한다. 따라서, 노화 기관에서의 질소 재사용에는 상기 두 아미노산의 합성이 중요한 단계이다. 벼의 잎에서 세포질 글루타민 합성효소의 주성분인 OsGS1.1의 파괴는 성장률 및 등숙(grain filling)의 현저한 감소를 가져온다(Tabuchi M et al. Plant J 42:641, 2005).

아스파라긴 합성효소(ASN)는 글루타민의 아미드기를 아스파르트산으로 전이시켜 아스파라긴을 합성한다. ASN은 질소 동화작용, 재이동 및 식물 내에서의 할당, 글루탐산과 글루타민 재합성의 역할을 한다. ASN 유전자는 성장배지의 질소 공급 등의 환경 및 발생 조건에 의해 조절된다(Lam H-M et al., Plant J 16:345, 1998; Lam H-M et al. Plant Physiol 132:926, 2003; Wong H-K et al., Plant Physiol 134:332, 2004). 애기장대에서 ASN1 및 ASN2 유전자의 전사는 빛과 대사 산물에 의해 상호 조절된다(Lam H-M et al., Plant J 16:345, 1998; Lam H-M et al. Plant Physiol 132:926, 2003). 암 조건에서의 시간별 분석에 의하면, ASN1 mRNA의 발현은 유도되는 반면, ASN2 mRNA의 발현은 억제된다. 또한, 탄소와 질소 대사 산물은 ASN1 mRNA 및 ASN2 mRNA의 축적을 상호 조절한다. ASN1 유전자의 발현은 암적응 식물에서 자유 아스파라긴 수준과 밀접하게 연관되어 있는데, 이는 아스파라긴이 특히 탄소 제한 조건에서 중요한 질소 운반체라는 것을 나타낸다(Lam H-M et al., Plant J 16:345, 1998; Lam H-M et al. Plant Physiol 132:926, 2003). 대조적으로, ASN2의 광 유도는 암모늄 의존적이지만, 암모늄의 존재는 ASN1의 광 억제에 영향을 미치지 않는다(Wong H-K et al., Plant Physiol 134:332, 2004). ASN2의 붕괴는 성장 표현형의 결손 및 체관부 수액에서 아스파르트의 결핍을 야기하여 수용부에서 ¹⁵N 유출을 저하시키고, 노화가 지연되었다. 따라서, ASN2 유전자가 질소 동화, 분포 및 재 이동에 필수적인 역할을 하는 것을 알 수 있다(Gaufichon L et al., Plant Cell Environ 36:328, 2013).

벼에는 2개의 ASN 유전자(OsASN1 및 OsASN2)가 있다. OsASN1 유전자는 NH4⁺가 공급되었을 때 주로 뿌리에 축적되었지만, 1mM의 NH4⁺의 존재 또는 부재 조건에서 성장한 뿌리에서 OsASN2 유전자는 낮은 수준만 검출되었다(Ohashi M et al. Plant Cell Physiol 56:769:, 2015). OsASN1 유전자에 Tos17 를 삽입하여 녹아웃시킨 돌연변이체는 모종기에 뿌리 및 물관부 수액의 유리 아스파라긴 함량이 약 80-90% 감소하였다. 따라서, OsASN1은 NH4⁺가 첨가된 뿌리에서 발견되지만 OsASN2는 발견되지 않기 때문에, OsASN1이 토양의 질소 공급에 의해 조절되는 것으로 생각진다(Ohashi M et al. Plant Cell Physiol 56:769:, 2015).

또한, 질소 충분히 공급조건에서 콩 유래 아스파라긴 합성효소를 코딩하는 유전자가 과발현된 형질전환 담배를 배양하는 경우 생체무게가 증체되는 것이 개시되어 있으나(US 2002-0069430), 질소 억제조건에서의 아스파라긴 합성효소가 형질전환 식물에 미치는 영향에 대하여는 알려진 바가 없다.

질소는 비옥하지 않은 토양에서 작물의 수확량을 제한하는 주요 요인이다. 증가하는 식량 수요를 충족시키고 환경 비용을 절감하기 위하여, 질소 이용을 개선한 작물이 필요하다. 특히, 세계 인구 대부분의 주요 주식인 쌀의 질소 이용 개선이 필요하다. 질소 비료의 사용은 세계적으로 작물 수확량이 증가했음에도 불구하고, 엄청난 양의 비료 사용으로 환경 및 경제적으로 심각한 악영향을 초래하였다. 따라서, 질소 이용 효율을 높이는 것은 환경의 보전과 지속 가능하고 생산적인 농업의 개선에 중요하다.

이에, 본 발명자들은 질소이용 효율이 향상된 벼 품종를 개발하고자 예의 노력한 결과, OsASN1 유전자를 과발현시킨 형질전환 벼를 제조하고, 상기 형질전환 벼가 야생형 벼(WT)에 비해 질소제한 조건에서 재배하였을 때, 생산된 쌀의 질소함량과 단백질 함량이 증가하였다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 질소이용 효율이 향상된 형질전환 벼를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 질소제한 조건에서도 질소함량과 단백질 함량이 우수한 쌀을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스파라긴 합성효소 1을 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 형질전환 벼를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 질소 비료를 사용하지 않은 토양에서 상기 형질전환 벼를 재배하여, 쌀을 등숙시키는 단계; 및 (b) 상기 등숙된 쌀을 수확하는 단계를 포함하는 질소제한 조건에서 쌀의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환 벼를 사용하면, 환경적인 부담이 있는 질소비료를 사용하지 않고도, 기존의 논이나, 질소부족 논에서 벼를 재배하여도, 곡물수확량이 우수하며, 질소함량과 단백질 함량이 높은 쌀을 제조할 수 있다.

도 1은 벼의 두 ASN 유전자의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 싹과 뿌리에서의 OsASN1 발현을 나타낸 것이고, (B)는 싹과 뿌리에서의 OsASN2 발현을 나타낸 것이다. 벼 모종은 0, 0.1, 1, 10 또는 100mm의 NH4+를 포함하는 1/2 MS 배지에서 4일간 배양하였다. (C, D)는 OsASN1 및 OsASN2 명조절을 나타낸 것이다. 벼모종은 4일간 빛조건에서 재배(L)하고나 암조건에서 재배(D)한 후, 명 또는 암조건에서 6시간, 12시간 및 24시간 배양하였다(E, F). 수크로오스에 의한 OsASN1(E) 및 OsASN2(F)의 조절을 확인하였고, 벼 모종은 수크로오스 0%, 3% 또는 만니톨 3%를 포함하는 1/2 MS 배지에서 4일간 배양하였다.
도 2는 OsASN1 유전자 넉아웃 변이체의 분리 및 특징을 나타낸 것으로, (A)는 OsASN1 유전자와 T-DNA 삽입 위치를 나타낸 그림으로, 박스와 선은 각각 코딩 부위 내의 엑손 및 인트론을 나타낸 것이다. osasn1-1(3D-02739) 와 osasn 1-2(3A-05359)에서 T-DNA는 첫번째 인트론과 4번째 인트론에 각각 삽입하였다. 수평 화살표는 T2자손의 지노타이핑에 사용한 프라이머를 나타낸 것이다. (B)는 OsASN1 RT-PCR 분석결과를 나타낸 것이다. 7일된 osasn1-1, osasn 1-2 및 격리된 야생형(WT)의 모종싹의 총 RNA를 OsASN1 특이 프라이머(Fw 및 Rv)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였으며. OsUbi유전자를 내부 대조군으로 하여 증폭하였다. (C, D)는 성숙 이삭에서의 아스파라긴(C) 및 글루타민(D)의 농도를 나타낸 것이다. (E-G)는 논에서 재배한 벼 식물체의 키(E), 식물체 당 건조중량(DW)(F) 및 번식력(G)을 나타내었다. 표준편자는 5번 반복한 결과를 나타낸 것이고, *는 P≤0.05; 스튜던트 t 테스트를 나타낸다.
도 3은 osasn1 변이체의 작물학적 특성을 나타낸 것으로, (A)는 전통적인 논에서 전통적인 방법으로 재배한 osasn1-1 및 osasn1-2 변이체 벼와 야생형 벼를 비교한 사진이다. 작물들의 사진은 수확하기 전에 찍었으며(bar=20cm), 사진을 찍기위하여 논에서 화분으로 옮겨 심었다. (B, C)는 논에서 재배한 식물체 당 총 이삭 수확량(B)과 야생형 벼와 osasn1 변이체로부터 수확한 이삭의 무게(C)를 나타낸 것이고, (D-F)는 이삭의 질소(D), 단백질(E) 및 아미노산(F) 농도를 나타낸 것이고, Fw는 fresh weight를 나타낸다.
도 4는 야생형 벼와 넉아웃 벼의 지엽에서의 노화 표현형을 나타낸 것으로, (A, B)는 자연노화(개화 후 1, 3, 5 및 7주) 동안의 야생형 벼와 넉아웃 벼의 주된 줄기의 지엽의 색깔을 나타낸 것이다. 막대는 5cm를 나타낸다. (C, D)는 지엽의 총 엽록소 수준 및 (E, F)는 총 질소 농도를 나타낸 것이고, (G, H)는 야생형 벼와 넉아웃 벼의 주된 줄기의 이삭(원추꽃차례)의 총 질소함량을 나타낸 것이다. 식물은 자연 조건에서 논에서 재배하였다.
도 5는 질소 제한 조건의 모종에서 넉아웃 변이체의 감수성을 나타낸 것으로, (A)는 질소 충분 배지 또는 질소 제한 배지에서 8일간 배양한 야생형과 넉아웃 변이체의 표현형을 나타낸 것이다. 막대는 2.5cm를 나타낸다. (B)는 키, (C)는 신선무게(fresh weight)를 나타낸다. (D)는 야생형과 osasn1-2 변이체의 싹과 뿌리의 질소함량을 나타낸 것으로(n=4), S는 질소 충분조건에서 자란 싹, NS는 질소 결핍조건에서 자란 싹, R은 질소 풍부조건에서 자란 뿌리, NR은 질소결핍조건에서 자란 뿌리를 나타낸다.
도 6은 OsASN1 과발현 형질전환 식물체의 제작방법 및 특징을 나타낸 것으로, (A)는 옥수수유래 유비퀴틴 프로모터(pUbi) 및 nopaline synthase 터미네이터(Tnos)의 조절 하에서 OsASN1를 발현하는 벡터를 도식화한 것이다. OsASN1 특이 프라이머(OxF 및 OXR)를 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. (B)는 야생형 및 OsASN1 과발현(OX) 형질전환 식물체의 모종 싹으로부터 RNA를 분리하여 OsASN1를 qRT-PCR 분석한 결과를 나타낸 것이다. (C)는 성숙 잎에서의 아스파라긴 및 글루타민 농도를 나타낸 것이고, (D)는 성숙 이삭에서의 아스파라긴 및 글루타민 농도를 나타낸 것이다. (E)는 논에서 재배한 벼의 키를 나타낸 것이고, (F)는 작물당 건조중량(DW), (G)는 번식력을 나타낸 것이다. 건조중량은 지상 바이오매스의 건조중량을 나타낸 것이다.
도 7은 OsASN1 과발현 형질전환 식물의 작물학적 특성을 나타낸 것으로, (A)는 전통적인 논에서 전통적인 방법으로 재배한 OsASN1 과발현 형질전환체(OX1, OX2) 및 이의 야생형(WT) 벼의 형태를 나타낸 것이고, 작물들의 사진은 수확하기 전에 찍었으며(bar=20cm), 사진을 찍기위하여 논에서 화분으로 옮겨 심었다. (B, C)는 논에서 재배한 식물체 당 총 이삭 수확량(B)과 야생형 벼와 OX 벼로부터 수확한 이삭의 무게(C)를 나타낸 것이고, (D-F)는 이삭의 질소(D), 단백질(E) 및 아미노산(F) 농도를 나타낸 것이고, Fw는 fresh weight를 나타낸다.
도 8은 야생형과 OX 품종의 지엽의 노화 표현형을 나타낸 것으로, (A)는 자연노화(개화 후 1, 3, 5 및 7주) 동안의 야생형 벼와 OX 품종 벼의 주된 줄기의 지엽의 색깔을 나타낸 것이다. 막대는 5cm를 나타낸다. (B)는 지엽의 총 엽록소 수준을 나타낸 것이고, (C)는 지엽의 총 질소 농도를 나타낸 것이고, (D)는 야생형 벼와 OX 품종 벼의 주된 줄기의 이삭(원추꽃차례)의 총 질소함량을 나타낸 것이다. 식물은 자연 조건에서 논에서 재배하였다.
도 9는 OsASN1 과발현 형질전환체가 질소 제한조건의 모종에서 내성이 향상된 것을 나타낸 것으로, (A)는 질소 충분 배지 또는 질소 제한 배지에서 8일간 배양한 야생형과 OX1, OX2 품종의 표현형을 나타낸 것이다. 막대는 2.5cm를 나타낸다. (B)는 8일 배양 후의 모종의 키, (C)는 신선무게(fresh weight)를 나타낸다. (D)는 야생형과 형질전환체의 싹과 뿌리의 질소함량을 나타낸 것으로(n=4), S는 질소 충분조건에서 자란 싹, NS는 질소 결핍조건에서 자란 싹, R은 질소 풍부조건에서 자란 뿌리, NR은 질소결핍조건에서 자란 뿌리를 나타낸다.
도 10은 OsASN1 과발현 형질전환체의 번식 단계에서 질소 제한에 대한 향상된 내성을 확인한 것으로, (A)는 번식 단계에서 질소 제한 조건에서 재배한 OX1, OX2 및 WT 식물의 형태를 나타낸 것이다. 식물은 야외의 화분에서 보편적인 질소 풍부 보육 토양의 1/16 질소 수준을 가지는 질소 부족 보육 토양으로 재배하였으며, 개화 후 5주째에 찍은 사진이고, 막대는 20cm를 나타낸다. (B)는 식물 키를 비교한 것이고, (C)는 지상 바이오매스의 건조중량, (D)는 곡물이 익는 속도를 나타낸 것이다. (E, F)는 한 식물당 총 곡물 수확량을 나타낸 것이다. (G)는 (A)의 조건에서 수확한 성숙 이삭에 포함된 질소함량을 나타낸 것이고, (H)는 엽록소 농도를 나타낸 것이고, (I)는 광화학적 효율을 나타낸 것이다.
도 11은 osasn1 변이체의 번식 단계에서 질소 제한에 대한 표현형을 확인한 것으로, (A)는 번식 단계에서 질소 제한 조건에서 재배한 osasn1 변이체 및 WT 식물의 형태를 나타낸 것이다. 식물은 야외의 화분에서 보편적인 질소 풍부 보육 토양의 1/16 질소 수준을 가지는 질소 부족 보육 토양으로 재배하였으며, 개화 후 5주째에 찍은 사진이고, 막대는 20cm를 나타낸다. (B)는 식물 키를 비교한 것이고, (C)는 식물 당 건조중량, (D)는 곡물이 익는 속도를 나타낸 것이다. (E, F)는 한 식물당 총 곡물 수확량을 나타낸 것이다. (G)는 (A)의 조건에서 수확한 성숙 이삭에 포함된 질소함량을 나타낸 것이고, (H)는 엽록소 농도를 나타낸 것이고, (I)는 광화학적 효율을 나타낸 것이다.

질소는 비옥하지 않은 토양에서 작물의 수확량을 제한하는 주요 요인이다. 증가하는 식량 수요를 충족시키고 환경 비용을 절감하기 위하여, 질소 이용을 개선한 작물이 필요하다. 세계 인구의 주요 주식인 쌀의 질소 이용 개선이 필요하다. 본 발명에서는 쌀의 질소 가동화에 핵심 효소인 아스파라긴 합성효소(Oryza sativa Asparagine Synthetase1, OsASN1)이 질소 제한 조건과 질소가 풍부한 조건 모두에서 재배된 식물의 최적 작물 생산을 위해 필요하다는 것을 확인하였다. 재래식 논에서 재배된 OsASN1 (OX)를 과발현하는 형질전환 식물은 야생형(WT)에 비해 영양이 풍부한 곡물을 생산하였다. 중요하게도, 질소 제한 조건에서 OsASN1이 과발현된 OX 식물은 광합성 활동이 향상됨과 동시에 야생형 품종에 비해 곡물 수확률 및 질소 함량이 증가하였다. 따라서, 본 발명에서는 OsASN1의 조절이 벼의 질소 이용 효율, 영양소 함량 및 곡물 수확량을 개선하는데 유용하다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 아스파라긴 합성효소 1을 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 형질전환 벼에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 아스파라긴 합성효소 1을 코딩하는 유전자는 OsASN1 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 OsASN1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 아스파라긴 합성효소 1을 코딩하는 유전자는 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 발현조절되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 옥수수 유비퀴틴 프로모터의 염기서열은 서열번호 16에 나타내었다.

질소는 식물 성장 및 발달 능력의 여러 측면에 강한 영향을 미치며, 질소 이용 효율의 향상은 작물 생산 및 곡물 품질을 향상시키고, 환경에 대한 영양 손실을 최소화하고, 토양 품질 요소의 지속 가능성을 유지할 수 있다.

식물에서 노화가 진행되는 동안, 질소 이동은 질소 동화 작용에서 재이동으로 전환하면서, 공급원 조직(잎 등)에서 수용부 조직(곡식 등)으로 진행된다. 세포질 글루타민 합성효소(GS; EC 6.3.1.3) 및 아스파라긴 합성효소(ASN; EC 6.3.5.4)는 무기 질소 동화에 필수적인 역할을 한다. 글루타민 합성효소는 NH4+ 및 글루타민산으부터 글루타민의 합성을 촉매한다. 아스파라긴 및 글루타민산을 제공하기 위하여, ASN를 이용하여 아미노산 전이를 위해 글루타민과 아스파르테이트을 함께 사용한다. 글루타민과 아스파라긴은 발아중인 종자에서의 질소 이동, 생물학적 및 비생물학적 스트레스에 반응하는 식물 세포에서의 질소 재활용 및 유동성 및 공급원에서 수용부 기관으로의 질소 재 이동을 포함한 다양한 발달 단계에서 질소 수송과 저장에 중심적인 역할을 한다.

작물의 질소 이용 효율 향상을 위하여, 벼에서 아스파라긴 합성 효소의 역할은 오래 동안 연구되어 왔다. 벼에는 OsASN1 및 OsASN2을 코딩하는 2개의 아스파라긴 합성효소(ASN) 유전자가 존재한다. OsASN1 유전자는 주로 뿌리에서 발현되고, OsASN2 유전자는 지엽과 외피에서 주로 발현된다는 것은 알려져 있다. 녹아웃(knockout) 돌연변이 연구를 통하여, OsASN1이 NH4+의 공급에 따른 벼 뿌리에서 아스파라긴의 합성에 관여하는 것을 확인하였다. 그러나, 곡물 수확률 및 질소 재 이동에서 아스파라긴 합성효소의 역할은 외부 논 조건에서는 실시하지 않았다(Ohashi M, et al. Plant Cell Physiol 56:769, 2015).

본 발명의 일 양태에서는 OsASN1 녹아웃 돌연변이 및 OsASN1 과발현 품종을 논에서 재배하여 성장 표현형을 조사하였다. osasn1 돌연변이는 성장 장애 및 잎 노화 표현형 지연을 나타냈다. 상기 돌연변이 씨앗의 질소 농도는 야생형 품종보다 낮았으며, 따라서 곡물이 익는 속도(등숙속도) 및 수확량이 감소하였다. 상기 돌연변이 잎에서 질소의 농도가 높을수록 곡물에 질소의 재이동이 적어지고, 이것은 지엽에서 관찰된 지연된 노화와 일치한다.

본 발명에서는 벼의 질소 동화, 재사용 및 배분의 기능을 하는 OsASN1를 과발현하는 형질전환 벼가 질소 부족 토양에서 작물의 품질 및 수확량을 상당한 개선하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명을 이용하면, 벼의 질소 이용 효율, 영양 성분 및 곡물 수확량을 개선할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 질소 비료를 사용하지 않은 토양에서 상기 형질전환 벼를 재배하여, 쌀을 등숙시키는 단계; 및 (b) 상기 등숙된 쌀을 수확하는 단계를 포함하는 질소제한 조건에서 쌀의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서 제조한 OsASN1 유전자가 과발현된 품종인 OX은 질소 충분조건에서 야생형 품종보다 많은 바이오매스를 나타내지는 않았지만, 잎 노화가 야생형 품종에 비해 지연되었고, 질소 부족조건에서 곡물의 영양분 충전에 더 효율적이라는 것을 확인하였다. OsASN1 유전자의 파괴는 (이동에 필요한) 아스파라긴을 감소시켰고, 반대로 아스파라긴 합성효소 발현의 증가는 잎의 아스파라긴 합성을 증가시키고, 종자에 질소 분배를 증가시켰다.

ASN 유전자의 형질전환 방법(접근법)에 대한 여러 보고가 있다. 예를 들어, 애기장대 ASN1 유전자의 과발현은 꽃에 할당된 유리 아미노산 및 장각(siliques)의 발생 증가와 함께 종자 단백질 함량을 증가시켰다(Lam H-M et al., Plant Physiol 132:926, 2003). 대두 종자에서 아스파라긴 합성 효소의 발현은 발생중인 종자에서 유리 아스파라긴 수준과 성숙시 단백질 농도 사이에 양의 상관관계를 보여 주었다(Pandurangan S. et al., J Exp Bot 63:3173, 2012).

곡류에서, 다른 어떤 기관보다 곡물의 전체 바이오 매스 또는 질소 농도가 질소 이용 효율(NUE)의 중요한 지표이다. 형질전환 접근법을 통해 NUE를 개선하려는 시도에도 불구하고, 곡류에 대한 NUE의 조작을 통한 곡물 수확량의 성공적인 증가에 대한 보고는 거의없다.

질소 섭취, 흡수 및 재이동과 관련된 복잡한 유전자 조절 때문에, 하나의 도입 유전자로 NUE를 증가시키는 것이 어렵다. 그러나, 본원발명에서는 단일 아스파라긴 합성 효소 유전자인 OsASN1의 과발현이 질소 부족 토양 조건에서 벼의 질소 함량 및 곡물 수확량을 현저하게 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 상기 향상된 능력은 모종시기에서의 질소 부족의 내성 및 성숙한 식물에서의 광합성 활성의 증가에 부분적으로 기인한다. 심지어, 질소 풍부 토양 조건에서도, OsASN1 유전자의 과발현은 벼의 질소 농도 및 영양가를 증가시킨다.

곡물의 영양 함량을 높이는 것은 인간의 영양과 건강에 중요하며, 쌀의 단백질 소화율과 생물학적 가치는 밀, 옥수수, 보리와 같은 다른 주요 곡물보다 더 높다. 쌀 단백질은 일반적으로 저자극성(저알레르기성)으로 여겨지며, 단백질이 풍부한 성분의 개발과 영양 제품의 제조에 적합하다. 따라서, 형질전환된 OsASN1 종자는 쌀 단백질을 함유 제품의 중요한 공급원이 될 수 있다.

OsASN1의 발현을 증가시키기 위해, 본 발명에서는 옥수수 유비퀴틴 프로모터(maize ubiquitin promoter)를 사용하였다. 옥수수 유비퀴틴 프로모터는 쌀의 이소성 발현에 널리 사용되고 강한 활성을 가지지만, 노화 조직 또는 기관에서의 활성은 잘 규명되지 않았다. 수용부 조직으로의 질소 재이동은 주로 후기 발생 단계에서 일어나기 때문에, OsASN1의 이소성 발현 효과를 높이기 위해 노화 특이적인 프로모터를 사용하는 것이 좋다. OsNAR2.1 프로모터에 의한 OsNRT2.1 유전자의 특이적 유도는 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의한 것보다 우수한 농업적 질소 이용 효율을 가진다.

본 발명에서는, OsASN1는 기존의 논 및 질소 부족 생장 조건에서 최적 생장을 담당하는 역할을 하고, OsASN1을 과발현시키면 쌀 영양 가치 및 질소 이용 효율을 개선시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

용어 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.

“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

본 발명의 정의상 “실질적으로 순수한”이란 본 발명에 따른 단백질 및 이를 코딩하는 DAN 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자로 형질감염된 저온 및/또는 염 저항성 식물을 제공한다. 식물체의 형질감염은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 재조합벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질감염된 식물을 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, (a) 대상 식물의 외식체(explant)를 전 배양(pre-culture)한 다음, 이를 상기 형질전환된 아그로박테리움과 공동배양하여 형질감염시키는 단계; (b) 형질감염된 외식체를 캘러스 유도배지에서 배양하여, 캘러스를 수득하는 단계; 및 (c) 수득된 캘러스를 절단하고, 이를 신초 유도배지에서 배양하여 신초를 형성시키는 단계를 거쳐 형질감염된 식물을 제조할 수 있다.

본 발명에서 '외식체(explant)'라 함은 식물체에서 잘라낸 조직의 절편을 말하는 것으로, 자엽(cotyledon) 또는 하배축(hypocotyl)을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 식물의 외식체로는 자엽 또는 하배축을 사용할 수 있으며, 식물의 종자를 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 얻은 자엽을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서 이용가능한 형질감염 대상 식물로는 벼, 담배, 토마토, 고추, 콩, 옥수수 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 형질전환에 사용되는 식물이 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식 시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: OsASN1 녹아웃 돌연변이 벼의 표현형 분석

OsASN1 유전자 발현이 외부 질소 공급의 변화에 따라 변화하는지 확인하기 위하여, NH4⁺의 농도별로 1/2 Murashige and Skoog (MS) 배지에서 4일 동안 벼 모종을 재배하였다(도 1A).

먼저, 표면 살균한 벼 종자를 발아시켜 0mM,0.1mM,1mM,10mM 또는 100mM의 NH4⁺를 포함하는 반 강도 MS 한천 배지(half-strength MS agar medium)에서 증식시켰다. 또한, 빛의 차별적인 효과가 있는지 조사하기 위하여, 모종을 밝은 곳이나 어둠에서 4일 동안 재배시킨 다음, 6시간, 12시간 및 24시간 동안 명조건 또는 암조건으로 재배하였다.

또한, 모종을 0% 자당(sucrose), 3% 자당(sucrose) 또는 3% 만니톨(mannitol)을 함유하는 1/2 MS 배지에서 4일동안 배양하고, 모종의 싹 및 뿌리 샘플을 액체 질소로 동결하였다.

유전자 발현수준을 확인하기 위하여, 벼에서 총 RNA를 분리하고 mRNA를 정량하였다. 총 RNA를 분리하기 위해, 제조사의 지침에 따라, WelPrep 전체 RNA 분리 시약(WELGENE, 대한민국)를 이용하고, 게놈 DNA 오염을 막기 위해, RNase-free DNase I (Takara Bio, Shiga, Japan)을 처리하였다. ImProm II Reverse Transcriptase 시스템 키트 (Promega, Madison, WI)를 이용하여, 25μL 반응 혼합물에서 2μg의 전체 RNA로부터 첫번째 가닥 cDNA를 합성한 후, SYBR premix ExTaq 키트 (Takara Bio, Shiga, Japan)를 이용하여 정량 PCR (qPCR) 분석을 실시하여 유전자 발현 수준을 확인하였다(Bio-Rad, CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System, USA).

OsUBi mRNA 수준은 각 유전자의 발현 비율을 표준화하는 데 사용하였다. 발현의 변화는 ΔΔ_Ct 법에 의해 계산하였다.

그 결과, NH4⁺ 농도가 1mM 및 10mM의 NH4⁺ 이상일 때,싹 및 뿌리에서 OsASN1 유전자 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. OsASN1 유전자와 달리, OsASN2 유전자의 발현은 NH4⁺에 의해 유도되지 않았다(도 1B). 또한, 식물에서 ASN 유전자는 암조건과 탄소 이용 가능성에 의해 조절되기 때문에, 상기 조건에서 벼 ASN 유전자의 발현을 조사하였다(Gaufichon L.et al., Plant Sci 179:141, 2010). OsASN1 유전자의 전사 수준은 암조건 및 수크로오스가 없는 배지에서 증가하였다(도 1의 C 및 E). 그러나, OsASN2 유전자는 암조건에 의해 조절되지 않았고, 수크로오즈-free 배지보다 수크로오스 함유 배지에서의 발현 수준이 더 높았다(도 1의 D 및 F).

OsASN1 유전자가 다양한 성장 조건에 반응했기 때문에, OsASN1 유전자를 추가적으로 조사하였다. 아스파라긴 합성효소의 활성 감소가 벼의 성장 및 수확량에 미치는 영향을 조사하기 위하여, OsASN1 유전자의 기능 상실 변이를 조사하였다.

본 실시예에서 형질전환 식물체는 2015년과 2016년에 대구 경북과학기술원(36^o N)에 위치한 논에서 성숙된 상태로 이식 및 재배하였다. 야생형(WT), OX 식물 및 osasn1 돌연변이의 숙성 단계를 이용하여 토양 특성 및 수확량을 관찰하였다.

식물의 총 질소, 총 가용성 단백질 및 아미노산의 측정은 다음 방법으로 수행하였다. 야생형벼(WT), osasn1 돌연변이 및 OX 식물의 조직을 80℃에서 일정 중량까지 공기 건조시켰다. 샘플은 절구를 이용하여 미세 분말로 분쇄하고, 데시케이터(desiccator)에 보관하였다(He, D. et al., J Integr Plant Biol. 53:835, 2011).

총 질소 함량은 제조 프로토콜에 따라 Elemental Analyzer(Vario MICRI 큐브, Elementar, Germany)을 이용하여 측정하였다. 아세트아닐리드는 표준으로 사용하였다. 가용성 단백질 측정은 He 등의 방법에 따라 수행하였다(He D. et al.,J Integr Plant Biol. 53:835, 2011). 아미노산은 2%(w/v) 설포살리실산(sulfosalicylic acid)으로 추출하고, 함량은 Rosen의 방법으로 측정하였다 (Rosen, H. Arch Biochem Biophys. 67:10, 1957)

글루타민 및 아스파라긴의 농도는 제조자의 지시에 따라, L-아스파라긴/L-글루타민/암모니아 분석 키트(Megazyme International Ireland, Bray, Ireland)를 이용하여 측정하였다.

먼저, 벼 flanking 시퀀스태그 데이터베이스로부터 두 개의 독립적인 T-DNA 녹아웃 대립 유전자를 확인하였다 (Jeon JS, et al., Plant J 22:561, 2000). T-DNA가 OsASN1 유전자의 첫 번째 인트론 (osasn1-1)과 네 번째 인트론 (osans1-2)에 각각 삽입되어 있었다 (도 2의 A). 유전자형 분석을 위하여, 두 개의 유전자 특이적 프라이머와 하나의 T-DNA 특이적 프라이머를 사용하였다. 유전자형 분석을 위한 프라이머는 표 1에 나타내었다.

프라이머	염기서열	서열번호
OsASN1-forward	5'- TACAGGCAGAAAGAGCAGTTCA-3′'	2
OsASN1-reverse	5'- CAGCGTTCTTCATCATTTCATC-3′'	3
OsASN2-forward	5'- TGGTTTGAAAGGTTCTCCTGAT-3'	4
OsASN2-reverse	5'- GGTAAATGACTTCCTCCAGTGC-3'	5
OsUbi-forward	5'- CTGCTGCTGTTCTAGGGTTCAC-3′'	6
OsUbi-reverse	5'- CAAAACGTTTCAGACACCATCA-3′'	7
OX-F	5'- AAAGCTTATCCATCCACCGTCTCAATC-3′'	8
OX-R	5'- AAGGTACCAGCTTCGAGCGTTATGCTTC-3′'	9
F1	5'- AATCCATCGTCAGTTCGTCAC-3′'	10
R1	5'- ACCATCACGCTACCGTACAAG-3′'	11
F2	5'- ATCCATCCACCGTCTCAATCT-3'	12
R2	5'- ATCTCTCCATTGGCCTTCAAT-3'	13
LB	5'-TAAGAGGATAATTGATTTGCTTAC-3'	14
RB	5'-CTGATCATTCCAATCCTAGTACAAT-3'	15

OsASN1의 전사 수준은 RT-PCR로 확인하였으며, 상기 RT-PCR은 osasn1-1 (line 3D-02739), osasn1-2 (line 3A-05359) 및 분리된 야생형(WT)의 7일된 종자 발아로부터 준비된 cDNA를 사용하였다. 그 결과, 대조군에 비해 osasn1-1 및 osasn1-2에서 발현이 현저히 감소하였다 (도 2B).

돌연변이체는 야생형 대조군에 비해 벼에서 낮은 아스파라긴 농도를 나타내었으나(도 2C), OsASN1의 기질인 글루타민은 야생형과 변이체가 비슷한 수준을 나타내었다(도 2D). 이러한 결과를 통하여, 벼의 아스파라긴 생산에서 OsASN1이 기능적인 역할을 수행한다는 알 수 있다.

먼저 기존의 농업방법을 이용하여, 논에서 넉아웃 식물의 성장과 수율을 조사하였다(도 3A). 녹아웃 식물의 식물 키 및 지상 바이오매스는 야생형 부모 대조군과 비교하여 유의하게 감소하였다(도 2의 E 및 F). 총 곡물 생산량은 생식 능력 감소와 종자 무게 감소와 함께, osasn1-1 및 osasn1-2의 야생형 품종에서 각각 23.3% 및 74.7%로 크게 감소하였다(도 2G, 도 3의 B 및 C). 또한, 녹아웃 돌연변이 곡물은 곡물의 질소, 단백질 및 유리 아미노산 농도가 야생형과 비교하여 낮았다(도 3의 D-F). 따라서, OsASN1 유전자는 질소가 충분한 재래식 논에서 재배된 벼의 최적 성장, 수확량 및 영양 품질에 필요하다는 것을 알 수 있다.

osasn1 돌연변이는 야외(논) 조건에서 지연된 노화 표현형을 나타내었다(도 4의 A 및 B). 지옆에서 엽록소 함량의 시간적 변화를 측정하였다(도 4의 C 및 D). 처음 출수(heading)에, 돌연변이와 야생형의 엽록소 수치는 유사했지만, 출수(heading) 후 야생형과 비교하여 돌연변이 잎의 엽록소 수치가 더 높았다(도 4C 및 D). OsASN1은 노화 동안 질소의 재이동에 영향을 줄 수 있기 때문에, 영양 조직중 지엽과 수용부 조직 중 원추꽃차례의 총 질소 함량을 분석하였다(도 4의 E-H). 전체 질소 함량은 지엽에서는 점차 감소했지만, 야생형의 이삭(원추꽃차례)에서는 증가하였다. 이는 곡물 충전 기간 동안에 질소가 잎에서 이삭(원추꽃차례)으로 재이동한다는 것을 의미한다. 상기 기간 동안에, 돌연변이체에서는 야생형에 비하여 지엽에 질소의 수치가 높게 유지되었다(도 4의 E 및 F). 반대로, 돌연변이체의 이삭(원추꽃차례)는 야생형보다 질소의 축적이 낮았다(도 4의 G 및 H). 따라서, 질소 함량은 돌연변이 종자에서 더 낮았다(도 3D).

실시예 2: osasn1 돌연변이체의 질소 부족에 대한 내성확인

질소 충분 배지 및 질소 부족 배지에서 osasn1 돌연변이 모종의 성장을 비교하였다. 질소 충분 배지에서, 돌연변이 모종의 성장은 야생형 품종과 유사하였다(도 5A). 식물의 높이와 무게(fw, fresh weight)는 크게 변하지 않았다(도 5A-C). 그러나, 질소 부족 배지에서, osasn1 돌연변이 모종은 야생형에 비해 유의적으로 손상된 성장을 보였다(도 5A). osasn1-1 및 osasn1-2의 높이는 각각 WT 모종의 83%와 75%로 감소하였다(도 5B). 따라서, osasn1-1 및 osasn1-2의 무게(fw)는 각각 ㅇ야생형보다 89%와 83%로 감소하였다(도 5C). 돌연변이체는 야생형보다 싹에 질소(91%)를 적게 축적하는 반면, 돌연변이 뿌리는 외부 질소 상태와 무관하게 더 많은 질소를 가지고 있었다(도 5D).

실시예 3: 논에서 재배된 OsASN1 유전자 과발현 형질전환식물의 특성

OsASN1 과발현이 벼에서의 질소 이용을 향상시키고, 토양에서 질소에 대한 의존성을 감소시키고 영양을 증가시킬 것이라고 판단하고, OsASN1를 과발현하는 형질전환 벼 품종을 제작하였다.

OsASN1 과발현 구조를 만들기 위하여, 프라이머 쌍 OxF 및 OxR을 이용하여 full-length cDNA 서열을 증폭시켰다(표 1). PCR 산물은 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 구동되는 pGA1611(Kim SR et al., J Plant Biol. 52:73, 2009)에 삽입하였다. Oryza sativa cv. Dongjin은 아그로박테리움(Agrobacterium)이 매개하는 공동 배양에 의한 형질전환 식물을 생산하는 데 사용하였다.

그 결과, 야생형(WT) 품종 및 다른 형질 전환 품종과 비교하여 모종 싹에서 OsASN1의 발현이 증가된 2개의 독립적인 형질전환 품종(OX1 및 OX2)을 확인하였다(도 6의 A 및 B). 또한, 상기 두 형질전환 품종은 야생형에 비해 아스파라긴 함량이 높았으며, 이는 아스파라긴 합성효소 활성의 증가와 일치하였다. 구체적으로, 형질전환 잎에서 아스파라긴 함량은 3.4배(OX1) 및 2.2배(OX2) 높았으며, 형질전환 곡물에서는 3.4배(OX1) 및 3.1배(OX2) 높았다(도 6의 C 및 D). 대조적으로, 글루타민 수치는 야생형과 비교하여 각각 잎에서는 42.9%(OX1) 및 66.4%(OX2), 곡물에서는 69.5%(OX1) 및 79.6%(OX2)로 감소되었다. 이는 글루타민이 ASN1의 질소 공여자인 것을 나타낸다(도 6의 C 및 D). 따라서, OX1 및 OX2는 야생형에 비해 ASN1 활성을 증가시켰다.

OsASN1 활성의 증가가 질소 이용, 성장 및 형태에 어떻게 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 먼저, 논에서 전통적인 농업 방식으로 식물을 재배하였다. OX 품종은 수확시 녹색 잎을 나타낸 것을 제외하고 야생형과 유사하게 나타났다(도 7). OX 식물의 높이, 지상 건조 물질 및 곡물이 익는 속도(grain filling rate)는 야생형 품종과 유사하고, 비슷한 곡물 수확량을 나타냈다(도 6의 E-G; 도 7B). 야생형 과 OX 품종의 곡물의 크기도 크게 차이가 없었다(도 7C). 그러나, 야생형 품종과 비교하여 OX 품종은 곡물 내 질소 농도가 더 높았다(OX1 및 OX2는 각각 야생형의 140% 및 131%; 도 7D). 따라서, 두 OX 품종 모두에서, 곡물의 단백질 농도가 야생형의 120%까지 상승하였다 (도 7E). 또한, 곡물에서 유리 아미노산 농도는 야생형의 127%(OX1) 및 113% (OX2)로 증가하였다(도 7F). 따라서, OsASN1 유전자의 과발현은 재래식 논에서 재래식 농법으로 재배할 때 쌀 수확량을 저해하지 않고 영양 품질을 향상시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.

수확량과 식물 바이오매스과 같은 농업적 특성은 WT와 OX 식물 간에 차이가 없었지만, OX 식물에서는 잎의 노화가 지연되었다(도 8A). 노화 진행은 개화 후 지엽의 엽록소 수치로 측정하였다(도 8B). 엽록소 농도는 OX 식물에서 서서히 감소하였고, 출수기(heading stage) 후 7주째에 2배 높은 엽록소 수치를 나타냈다(도 8A 및 B). 잎의 총 질소 함량은 곡물 충전의 초기 단계에서 OX 식물에서 더 높았지만, 후기 단계에서는 유의한 차이가 없었다(도 8C). 원추꽃차례에서, OX 품종은 야생형보다 훨씬 더 많은 질소를 축적하였다(도 8D). 이러한 결과는 OX 품종의 성숙한 종자에서 질소의 수치가 높아지는 것과 일치한다(도 7D).

실시예 4: OsASN1 과발현 형질전환체의 질소 부족에 대한 내성 강화 확인

질소 부족 생장 조건에서 OX 식물의 성장을 조사하기 위하여, 먼저 성장 배지의 질소 유무에 관계없이 모종의 성장을 비교하였다. OX 및 야생형(WT) 벼 모종의 성장은 질소 충분 배지와 유의한 차이가 없었다(도 9A~C). 그러나, N 부족 배지에서, OX 모종은 WT에 비해 식물 높이가 높고 바이오매스가 더 많았다(도 9A-C). OX1 및 OX2의 높이는 각각 WT 모종보다 119% 및 113%로 증가하였다(도 9B). 또한, OX1 및 OX2 FW(fresh weight)는 각각 WT의 137%와 127% 증가하였다(도 9C). 따라서, OsASN1 과발현은 식물 생장시 질소 부족에 대해 내성을 부여할 수 있다고 판단된다. 질소 충분조건에서 배양하였을 때, OX 계통은 야생형에 비하여 질소를 싹에 138%(OX1) 및 131%(OX2), 뿌리에 125%(OX1) 및 119%(OX2) 더 축적하였다(도 9D). 질소 부족조건에서, OX 식물의 상대 질소 농도는 야생형보다 싹에서 125%(OX1) 및 121%(OX2), 뿌리에서 133%(OX1) 및 130%(OX2)로 증가하였다(도 9D). 상기 결과를 통하여, ASN1 과발현이 질소 충분 및 부족 조건하에서 질소를 보다 효율적으로 흡수할 수 있다는 것을 알 수 있다.

실시예 5: OsASN1 과발현에 의한 질소 부족조건에서 곡물 생산량 향상 확인

보편적인 질소 풍부 보육 토양의 1/16 질소 수준을 가지는 질소 부족 보육 토양에서 묘를 키운 후, 수확되기 전까지의 야외 논에서 자란 변이 식물의 생장 및 수확량을 확인하였다. OX 계통은 WT 대조군보다 식물의 높이(OX1 및 OX2는 각각 WT의 112%와 116%) 및 건조 중량(OX1 및 OX2는 각각 WT의 132% 및 119%)은 증가하였다(도 10A-C). 또한,OX 식물의 임실율(spikelet fertility)은 WT보다 높았다(도 10D). 마지막으로, OX1 및 OX2 식물의 곡물 수확량은 WT에 비해 각각 147% 및 130%의 증가하였다(도 10의 E 및 F). OX1 및 OX2 식물의 질소 농도도 WT에 비해 각각 132% 및 133% 증가하였다(도 10G). 따라서, OsASN1 과발현은 질소 부족 조건에서 재배된 식물의 곡물 수확량 및 질소 농도를 실질적으로 증가시켰다. 또한, 질소 부족 토양 조건에서 재배된 OX 식물은 WT에 비해 높은 수준의 엽록소를 유지하였다(도 10H). 출수기(heading stage)에서는 OX 및 WT 식물의 광화학 효율의 최대치, Fv/Fm 비율은 유사하지만, 등숙기(ripening stage)에서는 WT의 잎보다 형질전환체 잎의 Fv/Fm 비율이 더 높았다(도 10I). 이러한 데이터는 질소 부족 배양 조건에서 OX 품종의 증가된 곡물 수확량의 일부는 광합성 활성의 증가에 의한 것임을 시사한다.

또한, 질소 부족 보육 토양이 채워진 화분에서 수확할 때 까지 질소 제한 조건으로 OsASN1 유전자의 넉아웃 변이체인 osasn1의 모종을 재배하였다. 그 결과, WT와 비교하여 osasn1 변이체가 식물 높이, 지상 일 질량(aboveground dry mass), 곡물 충전율, 곡물 수확량 및 종자 질소 농도가 낮았다는 것을 확인하였다(도 11A-G). 따라서, OsASN1 유전자는 질소 부족 조건에서 재배된 벼의 최적 성능을 위해 필수적이라는 것을 확인하였다. 한편, osasn1 돌연변이체의 클로로필 수준 및 Fv/Fm 비율은 WT와 차이가 없었다(도 11의 H 및 I).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE DAEGU GYEONGBUK INSTITUTE OF SCIENCE & TECHNOLOGY <120> Transgenic Rice Overexpressed OsASN1 Gene and Preparing Method of Rice Grain Under Nitrogen Limited Condition <130> P17-B170 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1815 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgtgcggga tcctggccgt gctcggcgcc gccgactggt cgcaggcgaa gagggctcac 60 gtcctctcct gctcccgcag gctgaagcac aggggacccg actggtccgg gttgtaccag 120 tgcgagggaa acttcctcgc tcagcagcgt ctcgccatcg tctccccgct ctccggcgac 180 cagccgctgt acaacgcgga ccggaccatc gtcgtcgtgg ccaatggaga gatctacaac 240 cacaagaaga tcaggaagca gttcgcctcc aagcacacgt tcagcaccgg cagcgactgc 300 gaggtcatca tcccgctgta tgaggagtac ggcgaggact tcgtcgacat gctggacggc 360 gtgttcgcct tcgtcctcta cgacacccgc accaagacgt acatggccgc ccgcgacgcc 420 atcggcgtca accccctcta catcggcagg ggcagcgacg gcgccgtctg gatatcgtcc 480 gagatgaagg cgctgaacga ggactgcgtg gagttcgaga tcttccctcc gggccacctc 540 tactccagcg ccgccggcgg gctccggcgg tggtacaagc cgcagtggtt cgccgagaac 600 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aagtgtaccc gcacaacacg cccgtcaaca aggaggcgta ctactaccgc 1500 atgatatttg agaggctctt cccgcaggaa tcggcgaggg agacggtgcc gtggggcccg 1560 agcatcgcgt gcagcacgcc ggcggcgatc gagtgggtgg agcagtggaa ggcgtcgcac 1620 gacccatccg gccggctgat cgcctcccac aactccgcct ccgcctccgc caaccacacc 1680 aaccacgcaa acgccaacgc caacggcaac agcaacggca aggccaacgg caactgcgcg 1740 atggcggcca acgggacgaa cggcgtcggc ctggttgtgg ccaacgggac agccaacggg 1800 aagatggaag cataa 1815 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tacaggcaga aagagcagtt ca 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cagcgttctt catcatttca tc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tggtttgaaa ggttctcctg at 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggtaaatgac ttcctccagt gc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctgctgctgt tctagggttc ac 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caaaacgttt cagacaccat ca 22 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aaagcttatc catccaccgt ctcaatc 27 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aaggtaccag cttcgagcgt tatgcttc 28 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aatccatcgt cagttcgtca c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 accatcacgc taccgtacaa g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atccatccac cgtctcaatc t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atctctccat tggccttcaa t 21 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 taagaggata attgatttgc ttac 24 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctgatcattc caatcctagt acaat 25 <210> 16 <211> 1927 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maize ubiquitin promoter <400> 16 gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat 60 ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat 120 atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag 180 tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt 240 tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg 300 tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta 360 gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata atttagatat 420 aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa 480 actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac 540 gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac 600 ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga 660 cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg 720 gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc tttcccaccg 780 ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt 840 tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac 900 ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ctctctacct 960 tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt 1020 tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc 1080 tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg 1140 atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata 1200 gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca 1260 tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct 1320 agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat 1380 gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta 1440 ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc 1500 gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag 1560 aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata 1620 catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg 1680 ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct 1740 ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt 1800 gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc 1860 atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg 1920 ttacttc 1927

Claims (5)

1. 아스파라긴 합성효소 1을 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 형질전환 벼.
   
2. 제1항에 있어서, 아스파라긴 합성효소 1을 코딩하는 유전자는 OsASN1 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환 벼.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 OsASN1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 형질전환 벼.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 아스파라긴 합성효소 1을 코딩하는 유전자는 옥수수 유비퀴틴 프로모터에 의해 발현조절되는 것을 특징으로 하는 형질전환 벼.
   
5. 다음 단계를 포함하는 질소제한 조건에서 쌀의 생산방법:
   (a) 질소 비료를 사용하지 않은 토양에서 제1항의 형질전환 벼를 재배하여, 쌀을 등숙시키는 단계; 및
   (b) 상기 등숙된 쌀을 수확하는 단계.
   

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