CN111944851A - 一种纳米尺度siRNA递送系统 - Google Patents

一种纳米尺度siRNA递送系统 Download PDF

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CN111944851A CN201910407443.5A CN201910407443A CN111944851A CN 111944851 A CN111944851 A CN 111944851A CN 201910407443 A CN201910407443 A CN 201910407443A CN 111944851 A CN111944851 A CN 111944851A
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张巧平
郭锦棠
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Abstract

本发明公开一种纳米尺度siRNA递送系统，星型寡聚精氨酸载体负载siRNA形成稳定的二元复合物，继而通过包覆弱酸敏感型聚阴离子制备了一种具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度siRNA递送系统。该系统可于酸性内涵体/溶酶体环境中进行智能解组装，重新生成原二元复合物以及ε‑PLL，这一过程可原位加速siRNA的内涵体/溶酶体逃逸。此外，该系统也具有良好的血清稳定性以及生物相容性。基于上述优势，相比于二元复合物该系统展现了更优的递送效率，高效抑制了血管平滑肌细胞的迁移。

Description

一种纳米尺度siRNA递送系统
技术领域
本发明属于基因载体材料技术领域，具体涉及一种具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度siRNA递送系统及制备方法和应用。
背景技术
血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移是导致血管内膜增生的重要原因，同时这也为内膜增生的预防和治疗提供了有效的靶点。近年来，新兴的基因工程技术，尤其是RNA干扰技术，在疾病(如癌症和心血管类疾病等)的诊断和治疗中取得了令人满意的效果。由此，我们认为利用siRNA递送技术来沉默血管平滑肌细胞中的靶mRNA、蛋白以及相关细胞通路将是一种抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移的有效策略。然而，一直以来限制siRNA治疗效果的瓶颈是缺乏安全、高效的载体。因此，开发多功能的siRNA递送载体，将siRNA安全、高效地递送至血管平滑肌细胞便成为了关键。
近年来，细胞穿透肽研究的兴起为基因/药物递送领域中载体的设计注入了新的活力。通常，科研人员会通过阳离子型细胞穿透肽，比如寡聚精氨酸，负载基因并且发挥其穿透细胞膜的功能，从而将基因高效递送至细胞内。然而，这种策略也面临着非特异性血清吸附以及低内涵体/溶酶体逃逸等问题。为了进一步解决此类问题，科研人员发现聚阴离子包覆技术可以有效地降低血液循环过程中的血清吸附，增加基因复合物的血清稳定性，延长血液循环时间。然而，其却未能同时实现增强内涵体/溶酶体逃逸的功能。近期，智能型高分子材料的发展为上述药物/基因递送用高分子基载体的设计提供了新的视野，尤其是弱酸环境触发的应答。现有技术可支持化学合成出一类弱酸敏感型的高分子材料，此类材料具有在中性或者弱碱性条件下保持稳定并呈现出聚阴离子的性质，然而将其置于弱酸性环境则会触发特定酰胺键的水解反应还原出聚阳离子的性质。此过程可于细胞内的酸性内涵体/溶酶体细胞器内触发。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度siRNA递送系统及其制备方法和应用。
一种纳米尺度siRNA递送系统及其制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1，星型寡聚精氨酸POSS-(C-G-R8-G-W)16基因载体的制备
将二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷(POSS-(DA)8)和寡聚精氨酸W-G-R8-G-C均匀分散于四氢呋喃和水的混合溶液中，加入光引发剂，混合均匀后在紫外灯下照射下进行反应，反应结束后进行透析，冷冻干燥，得到星型寡聚精氨酸POSS-(C-G-R8-G-W)16粉末，二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷和寡聚精氨酸的质量比2：(30—60)；
在步骤1中，POSS为笼型聚倍半硅氧烷的缩写，POSS-(DA)8为二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷，寡聚精氨酸W-G-R8-G-C的氨基酸序列为：Trp-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Cys。
在步骤1中，四氢呋喃和水的体积比为(2：3)—(1：2)。
在步骤1中，二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷和寡聚精氨酸的质量比2：(40—50)。
在步骤1中，反应结束后，将反应液置于截留分子量2000-8000Da(数均分子量)的透析袋中用蒸馏水进行透析48-72h，冷冻干燥，获得星型寡聚精氨酸POSS-(C-G-R8-G-W)16粉末。
在步骤1中，选择在紫外灯下照射下反应10-15min。
在步骤1中，光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，加入量为二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷、寡聚精氨酸和光引发剂质量之和的0.05％-0.5％，优选0.1—0.5％。
步骤2，弱酸敏感型聚阴离子PLL-g-Aco的制备
将ε-聚赖氨酸均匀分散在PBS溶液中并冷却至0℃，再向其中加入顺式乌头酸酐粉末并添加氢氧化钠水溶液，以使整体pH维持在8—9，继续搅拌反应，以得到顺式乌头酸酐修饰的ε-聚赖氨酸；
在步骤2中，ε-聚赖氨酸与顺式乌头酸酐的质量比为1：(1—5)，优选1：(1.5—4.5)。
在步骤2中，PBS溶液中，浓度为10mM，pH为8.5，ε-聚赖氨酸数均分子量为4200Da，搅拌反应时间为12—24小时。
在步骤2中，反应结束后，将反应液置于截留分子量500-3500Da(数均分子量)的透析袋中，用pH在8-9之间的蒸馏水透析48-72h，冷冻干燥，获得PLL-g-Aco粉末，即用作弱酸敏感型聚阴离子。ε-PLL为ε-聚赖氨酸的缩写，PLL-g-Aco是顺式乌头酸酐修饰的ε-聚赖氨酸的缩写。
步骤3，纳米尺度siRNA递送系统的制备
将步骤1制备的星型寡聚精氨酸粉末均匀分散在PBS溶液，得到第一溶液；再向第一溶液中加入siRNA，星型寡聚精氨酸与siRNA的质量比为(0.5-6)：1，涡旋并室温孵化，得到二元siRNA复合物溶液；
将步骤2制备的弱酸敏感型聚阴离子均匀分散在PBS溶液，得到第二溶液；向二元siRNA复合物溶液中加入第二溶液，星型寡聚精氨酸与弱酸敏感型聚阴离子的质量比为6：(1—5)，涡旋并室温孵化，获得三元siRNA复合物溶液，用作具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度siRNA递送系统。
在步骤3中，PBS溶液pH为7.4，浓度为10mM。
在步骤3中，星型寡聚精氨酸粉末均匀分散在PBS溶液中，涡旋2min，得到第一溶液，再加入siRNA，涡旋1min，室温孵化20-60min，得到二元siRNA复合物溶液。
在步骤3中，星型寡聚精氨酸与siRNA的质量比为(2-6)：1。
在步骤3中，星型寡聚精氨酸与弱酸敏感型聚阴离子的质量比为6：(2—3)。
在步骤3中，向二元siRNA复合物溶液中加入第二溶液，涡旋1min，室温孵化20-60min。
在步骤3中，弱酸敏感型聚阴离子均匀分散在PBS溶液，涡旋2min，得到第二溶液，质量浓度为0.1-0.3mg/mL。
在步骤3中，siRNA为ERK2-siRNA或者Cy5-ERK2-siRNA。
在本发明中，室温为20—30摄氏度。
本发明的纳米尺度siRNA递送系统在细胞转染中的应用，体现“自加速内涵体逃逸”功能，如加速siRNA的内涵体/溶酶体逃逸效率，高效抑制血管平滑肌细胞的迁移，抑制血管内膜增生。
在本发明中，将阳离子型细胞穿透肽寡聚精氨酸共价偶联至笼型聚倍半硅氧烷上的活性臂，制备出星型的寡聚精氨酸基因载体。该载体可通过静电相互作用负载siRNA形成稳定的二元siRNA复合物。为了提高二元复合物的血清稳定性并延长其血液循环时间，本发明将弱酸环境敏感的聚阴离子静电包覆至二元复合物表面形成三元复合物，也被称为siRNA递送系统。此递送系统具有良好的血清稳定性，同时可被血管平滑肌细胞高效摄取。此外，当其陷于内涵体/溶酶体环境中时，弱酸敏感型聚阴离子会被逐渐触发还原成聚阳离子，继而被静电排斥作用诱导从二元复合物表面脱离，重新生成原二元复合物以及聚阳离子，这一过程能显著加速siRNA的内涵体/溶酶体逃逸效率，从而促进了siRNA的递送效率和沉默效果。
与现有技术相比，本发明制备的星型寡聚精氨酸载体具有较强的siRNA负载能力，并且形成的siRNA复合物具有良好的稳定性。解决了传统意义上siRNA难负载、易降解等问题。本发明制备的具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度siRNA递送系统可于酸性内涵体/溶酶体环境中进行智能解组装，重新生成原二元复合物以及ε-PLL，这一过程可原位加速siRNA的内涵体/溶酶体逃逸。此外，该系统也具有良好的血清稳定性以及生物相容性。基于上述优势，相比于二元siRNA复合物该系统展现了更优的递送效率以及沉默效果，高效抑制了血管平滑肌细胞的迁移。
附图说明
图1为本发明中POSS-(C-G-R8-G-W)16的核磁共振氢谱图。
图2为本发明中PLL-g-Aco和PLL-g-Suc的核磁共振氢谱图。
图3为不同质量比的二元siRNA复合物和递送系统的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为不同质量比的siRNA递送系统的粒径和Zeta电位图。
图5为本发明siRNA递送材料和系统细胞毒性测试结果图。
图6为Zeta电位变化监测弱酸诱导siRNA递送系统解组装行为的实验结果图。
图7为siRNA的内涵体/溶酶体逃逸效果和效率的实验结果图。
图8为血管平滑肌细胞transwell迁移实验的实验结果图。
具体实施方式
以下通过实施例的具体实施方式对本发明的上述内容作进一步的详细说明。在本发明实施例中，寡聚精氨酸W-G-R8-G-C的氨基酸序列为：Trp-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Cys，购于吉尔生化(上海)有限公司。ε-PLL购于上海源叶生物科技有限公司。POSS-(DA)8为二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷，在实验室合成。ERK2-siRNA购于广州锐博生物技术有限公司，核苷酸序列为：Forward：5’-GATCCGCACCTCAGCAATGATCATCTTCCTGTCAGAATGATCATTGCTGAGGTGCTTTTTG-3’；Reverse:5’-AATTCAAAAAGCACCTCAGCAATGATCATTCTGACAGGAAGATGATCATTGCTGAGGTGCG-3’。
实施例1：星型寡聚精氨酸POSS-(C-G-R8-G-W)16基因载体的制备
将2mgPOSS-(DA)8和43mg W-G-R8-G-C溶解于4.5mL的四氢呋喃/水混合溶液(体积比为1/2)中，加入1mg的光引发剂2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，混合均匀，将其于紫外灯下照射10min进行反应，将反应液置于截留分子量3500Da的透析袋中用蒸馏水进行透析72h，冷冻干燥，获得星型寡聚精氨酸POSS-(C-G-R8-G-W)16粉末。经核磁共振检测，如附图1所示，谱中化学位移5-6ppm的范围内未发现烯丙基的特征信号峰，同时于7-8ppm处观察到W-G-R8-G-C中吲哚基团的特征信号峰，这可以说明反应过程中烯丙基完全被W-G-R8-G-C加成，生成了目标产物POSS-(C-G-R8-G-W)16。
实施例2：星型寡聚精氨酸载体/ERK2-siRNA二元复合物的制备
取5mg实施例1中的产品POSS-(C-G-R8-G-W)16溶解于10mL PBS(10mM,pH＝7.4)，涡旋2min，得到溶液一。按照POSS-(C-G-R8-G-W)16与ERK2-siRNA的质量比分别为0.5:1，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，6:1，将ERK2-siRNA溶液加入至溶液一，涡旋30s，室温孵化30min，获得星型寡聚精氨酸载体/ERK2-siRNA二元复合物。
实施例3：具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度siRNA递送系统的制备
(1)弱酸敏感型聚阴离子的制备：
取50mg商售的ε-PLL(数均分子量为4200Da)溶解于15mL PBS(10mM,pH＝8.5)中得到ε-PLL水溶液。将上述溶液冷却至0℃，并向其中缓慢加入122mg的顺式乌头酸酐粉末，此过程中不断向反应液中补充1M的氢氧化钠水溶液，使反应液的pH保持在8.5，再继续搅拌12h，将反应液置于截留分子量1000Da的透析袋中，用pH在8-9之间的蒸馏水透析72h，冷冻干燥，获得弱酸敏感型聚阴离子PLL-g-Aco粉末。
(2)称取2mg步骤(1)中的产品PLL-g-Aco粉末，溶解于10mL PBS(10mM,pH＝7.4)中，得到PLL-g-Aco溶液。向实施例2中制备的质量比为6:1的二元siRNA复合物溶液中加入PLL-g-Aco溶液，涡旋1min，室温孵化30min，获得具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度siRNA递送系统，所述POSS-(C-G-R8-G-W)16与ERK2-siRNA与PLL-g-Aco的质量比为6：1：(1—5)。
实施例4：非弱酸敏感型聚阴离子包覆的纳米尺度siRNA递送系统的制备
(1)非弱酸敏感型聚阴离子的制备：
取50mg商售的ε-PLL(数均分子量为4200Da)溶解于15mL PBS(10mM,pH＝8.5)中得到ε-PLL水溶液。将上述溶液冷却至0℃，并向其中缓慢加入78mg的琥珀酸酐粉末，此过程中不断向反应液中补充1M的氢氧化钠水溶液，使反应液的pH保持在8.5，再继续搅拌12h，将反应液置于截留分子量1000Da的透析袋中，用蒸馏水透析72h，冷冻干燥，获得非弱酸敏感型聚阴离子PLL-g-Suc粉末。ε-PLL为ε-聚赖氨酸的缩写，PLL-g-Suc是琥珀酸酐修饰的ε-聚赖氨酸的缩写。
(2)称取2mg步骤(1)中的产品PLL-g-Suc粉末，溶解于10mL PBS(10mM,pH＝7.4)中，得到PLL-g-Suc溶液。向实施例2中制备的质量比为6:1的二元siRNA复合物溶液中加入PLL-g-Suc溶液，涡旋1min，室温孵化30min，获得非弱酸敏感型聚阴离子包覆的纳米尺度siRNA递送系统，所述POSS-(C-G-R8-G-W)16与ERK2-siRNA与PLL-g-Suc的质量比为6:1:3。
针对实施例3和4制备的PLL-g-Aco和PLL-g-Suc进行核磁共振检测，如附图2所示，ε-PLL主结构中的特征峰被标注于图2-B，其中A琥珀酰胺部分的特征峰h和i在2.5ppm左右，B顺式乌头酰胺部分的特征峰f和g分别位于3.2ppm和5.9ppm左右，可说明PLL-g-Suc和PLL-g-Aco的化学结构。
实施例5：星型寡聚精氨酸载体/Cy5-ERK2-siRNA二元复合物的制备
制备实施例2中的溶液一，并按照POSS-(C-G-R8-G-W)16与Cy5-ERK2-siRNA的质量比为6:1，将Cy5-ERK2-siRNA溶液加入至溶液一，涡旋30s，室温孵化30min，获得星型寡聚精氨酸载体/Cy5-ERK2-siRNA二元复合物溶液。Cy5-ERK2-siRNA为Cy5标记的ERK2-siRNA的缩写。
实施例6：具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度Cy5-siRNA递送系统的制备
分别制备实施例3中PLL-g-Aco溶液和实施例5中的二元复合物溶液，向二元复合物溶液中加入PLL-g-Aco溶液，涡旋1min，室温孵化30min，获得具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度Cy5-siRNA递送系统，所述POSS-(C-G-R8-G-W)16与Cy5-ERK2-siRNA与PLL-g-Aco的质量比为6:1:3。
实施例7：非弱酸敏感型聚阴离子包覆的纳米尺度Cy5-siRNA递送系统的制备
分别制备实施例4中PLL-g-Suc溶液和实施例5中的二元复合物溶液，向二元复合物溶液中加入PLL-g-Suc溶液，涡旋1min，室温孵化30min，获得具有非弱酸敏感型聚阴离子包覆的纳米尺度Cy5-siRNA递送系统，所述POSS-(C-G-R8-G-W)16与Cy5-ERK2-siRNA与PLL-g-Suc的质量比为6:1:3。
实施例8：纳米尺度siRNA递送系统负载ERK2-siRNA的能力和稳定性
制备实施例2中质量比为0.5:1，1:1，2:1，3:1，4:1的样品溶液和实施例3中质量比为6:1:1，6:1:3，6:1:5的样品溶液。将样品溶液与6×loading buffer混匀，然后在1×TAE缓冲溶液，0.8％琼脂糖凝胶，电压100伏的条件下进行电泳30min，然后在紫外灯照射下观察ERK2-siRNA在凝胶电泳中的分布位置并拍照记录。结果见图3，a、b分别为二元复合物和siRNA递送系统的结果，且a、b两图中第1、2列分别表示marker和ERK2-siRNA，后面列表示质量比，a为POSS-(C-G-R8-G-W)16与ERK2-siRNA的质量比，b为POSS-(C-G-R8-G-W)16与ERK2-siRNA与PLL-g-Suc的质量比。
实验结果表明，POSS-(C-G-R8-G-W)16与ERK2-siRNA的质量比为2:1时，ERK2-siRNA被完全负载。并且，在该质量比为6:1的二元复合物基础上，弱酸敏感型聚阴离子的加入不会影响递送系统的稳定性。
实施例9：纳米尺度siRNA递送系统的粒径和Zeta电位。
制备实施例2中质量比为6:1的样品溶液和实施例3中质量比为6:1:1，6:1:3和6:1:5的样品溶液以及实施例4中的样品溶液，使用Zetasizer Nano ZS仪器测试上述所有溶液的粒径和Zeta电位，结果见图4，左侧坐标为粒径，右侧坐标为Zeta电位，与横坐标对应最左侧的测试结果(即两个为一组的柱状图)是实施例2中质量比为6:1的样品溶液，最右侧的测试结果是实施例4中的样品溶液，中间三组对应实施例3中质量比为6:1:1，6:1:3和6:1:5的样品溶液，在每一组柱状图中，左侧柱状图对应粒径，右侧柱状图对应Zeta电位。实验结果表明，聚阴离子包覆二元siRNA复合物会使得递送系统的粒径有所增加、Zeta电位会降低。同时，所制备的siRNA递送系统的粒径值均为100-200nm，适合用于细胞转染。
实施例10：细胞毒性实验
将大鼠动脉血管平滑肌细胞以8×103/孔接种到96孔板，于37℃孵育24h，然后更换培养基为无血清DMEM培养基，继续孵育12h。加入不同浓度的聚合物材料以及siRNA复合物，混匀，培养4h，更换为含10％FBS的培养基，继续培养48h。之后，向每个孔中加入100μL含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基，继续培养4h，弃去培养液，加入100μL的DMSO，摇床震荡10min。酶标仪测试波长490nm处的光密度(OD)值。可通过下面公式计算相对细胞活性值(％)，结果见图5，在每一组siRNA浓度的柱状图中(30/50/100/200/400nM)，自左到右依次为ERK2-siRNA、POSS-(C-G-R8-G-W)16、POSS-(C-G-R8-G-W)16/Scr siRNA、POSS-(C-G-R8-G-W)16/ERK2-siRNA、POSS-(C-G-R8-G-W)16/Scr siRNA/PLL-g-Aco、POSS-(C-G-R8-G-W)16/ERK2-siRNA/PLL-g-Aco，其中Scr-siRNA为无活性的siRNA的缩写，制备实施例2中的溶液一，并按照POSS-(C-G-R8-G-W)16与Scr-siRNA的质量比为6:1，将Scr-siRNA溶液加入至溶液一，涡旋30s，室温孵化30min，获得星型寡聚精氨酸载体/Scr-siRNA二元复合物溶液，即POSS-(C-G-R8-G-W)16/Scr siRNA；再向星型寡聚精氨酸载体/Scr-siRNA二元复合物溶液中加入实施例3中PLL-g-Aco溶液，涡旋1min，室温孵化30min，获得具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度Scr-siRNA递送系统，所述POSS-(C-G-R8-G-W)16与Scr-siRNA与PLL-g-Aco的质量比为6:1:3，即POSS-(C-G-R8-G-W)16/Scr siRNA/PLL-g-Aco。
相对细胞活性(％)＝【OD490nm(实验组)/OD490nm(对照组)】×100％
实验结果表明：在实验浓度范围，相对细胞活性值均高于80％，说明siRNA递送系统具有良好的细胞相容性。
实施例11：Zeta电位变化监测弱酸诱导系统解组装行为
取实施例3中质量比为6:1:3的样品溶液和实施例4中的样品溶液，用0.1M的盐酸溶液将它们分别调节pH至7.4和5.5，使用Zetasizer Nano ZS仪器记录1h，2h，4h，7h，10h，13h的Zeta电位值，结果见图6，其中1为实施例3中质量比为6:1:3的样品溶液在pH5.5下的Zeta电位值，2为实施例3中质量比为6:1:3的样品溶液在pH7.4下的Zeta电位值，3为实施例4的样品溶液在pH5.5下的Zeta电位值，4为实施例4的样品溶液在pH7.4下的Zeta电位值。
实验结果表明：在pH＝7.4时，两组样品溶液的Zeta电位均不发生明显变化。在pH＝5.5的弱酸环境下，弱酸敏感型聚阴离子包覆制备的递送系统的Zeta电位值随时间逐渐由弱负电位增加至原二元复合物水平，趋平，非弱酸敏感型聚阴离子包覆制备的递送系统的Zeta电位仍无明显变化。这可指示过程：弱酸可诱导敏感型递送系统的解组装，实现重新生成原二元siRNA复合物和ε-PLL。
实施例12：siRNA的内涵体/溶酶体逃逸效率的实验。
将大鼠动脉血管平滑肌细胞以8×104/孔接种到共聚焦平皿中培养24h，然后于无血清培养基中用实施例5中的样品溶液，实施例6中质量比为6:1:3的样品溶液和实施例7中的样品溶液分别转染4h，更换为含有10％FBS的DMEM培养基再培养24h。用PBS洗涤细胞两次，加入含有0.5mM Lyso Tracker Green的预热溶液培养1h，用预热的PBS洗涤细胞2次，在温室下继续用2μg/mL of Hoechst 33342溶液培养20min，PBS洗涤细胞两次，最后在645nm，504nm和350nm处的激发下用共聚焦激光显微镜分别观察Cy5-ERK2-siRNA(红点)和溶酶体(绿点)和细胞核(蓝点)。其中：红点+绿点＝黄点，红点+蓝点＝粉点。
使用下面公式计算Cy5-ERK2-siRNA在溶酶体中的共定位比例。
共定位比例(100％)＝【(黄点数量)/(红点数量+黄点数量+粉点数量)】×100％
结果见图7，BRCs为实施例5的样品溶液，TRCs—Aco为实施例6中质量比6:1:3的样品溶液，TRCs—Suc为实施例7中的样品溶液，每一组柱状图中，左侧为4h，右侧为24h。实验结果表明：在初始的4h时，二元复合物展现了较高的内涵体/溶酶体逃逸效率。在4h-24h时间段，弱酸敏感型递送系统发生了智能解组装，大大加速了siRNA的逃逸效率，最终优于二元复合物，这一过程实为原位自加速的内涵体/溶酶体逃逸。
实施例13：细胞迁移实验
在24孔板内使用实施例2中质量比为6:1的样品溶液，实施例3中质量比为6:1:3的样品溶液和实施例4中的样品溶液转染大鼠动脉血管平滑肌细胞24h，将细胞离心并以1×105细胞/孔的密度重新分散至transwell上室内，培养6h，用结晶紫标记迁移的细胞，拍照片并通过Image-Pro Plus 6.0软件计算细胞迁移率，结果见图8，其中A为ERK2-siRNA(阴性对照组)，B为商业化转染试剂Lipofectamine 3000(阳性对照组)，C为实施例2中质量比为6:1的样品溶液，D为实施例3中质量比为6:1:3的样品溶液，E为实施例4中的样品溶液。实验结果表明，相比于二元复合物和非弱酸敏感型递送系统，具有“自加速内涵体逃逸”功能的纳米尺度siRNA递送系统具有更优的抑制平滑肌细胞迁移的效果。
根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现siRNA递送系统的制备，且表现出与本发明基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种纳米尺度siRNA递送系统，其特征在于，粒径为100-200nm，按照下述步骤进行：
步骤1，星型寡聚精氨酸POSS-(C-G-R8-G-W)16基因载体的制备
将二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷和寡聚精氨酸W-G-R8-G-C均匀分散于四氢呋喃和水的混合溶液中，加入光引发剂，混合均匀后在紫外灯下照射下进行反应，反应结束后进行透析，冷冻干燥，得到星型寡聚精氨酸POSS-(C-G-R8-G-W)16粉末，二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷和寡聚精氨酸的质量比2：(30—60)；
步骤2，弱酸敏感型聚阴离子PLL-g-Aco的制备
将ε-聚赖氨酸均匀分散在PBS溶液中并冷却至0℃，再向其中加入顺式乌头酸酐粉末并添加氢氧化钠水溶液，以使整体pH维持在8—9，继续搅拌反应，以得到顺式乌头酸酐修饰的ε-聚赖氨酸；
步骤3，纳米尺度siRNA递送系统的制备
将步骤1制备的星型寡聚精氨酸粉末均匀分散在PBS溶液，得到第一溶液；再向第一溶液中加入siRNA，星型寡聚精氨酸与siRNA的质量比为(0.5-6)：1，涡旋并室温孵化，得到二元siRNA复合物溶液；
将步骤2制备的弱酸敏感型聚阴离子均匀分散在PBS溶液，得到第二溶液；向二元siRNA复合物溶液中加入第二溶液，星型寡聚精氨酸与弱酸敏感型聚阴离子的质量比为6：(1—5)，涡旋并室温孵化，获得三元siRNA复合物溶液，即纳米尺度siRNA递送系统。
2.根据权利要求1所述的一种纳米尺度siRNA递送系统，其特征在于，在步骤1中，寡聚精氨酸W-G-R8-G-C的氨基酸序列为：Trp-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Cys；四氢呋喃和水的体积比为(2：3)—(1：2)；二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷和寡聚精氨酸的质量比2：(40—50)；选择在紫外灯下照射下反应10-15min，光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，加入量为二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷、寡聚精氨酸和光引发剂质量之和的0.05％-0.5％，优选0.1—0.5％。
3.根据权利要求1所述的一种纳米尺度siRNA递送系统，其特征在于，在步骤2中，ε-聚赖氨酸与顺式乌头酸酐的质量比为1：(1—5)，优选1：(1.5—4.5)；PBS溶液中，浓度为10mM，pH为8.5，ε-聚赖氨酸数均分子量为4200Da，搅拌反应时间为12—24小时。
4.根据权利要求1所述的一种纳米尺度siRNA递送系统，其特征在于，在步骤3中，siRNA为ERK2-siRNA或者Cy5-ERK2-siRNA；PBS溶液pH为7.4，浓度为10mM；星型寡聚精氨酸与siRNA的质量比为(2-6)：1；星型寡聚精氨酸与弱酸敏感型聚阴离子的质量比为6：(2—3)。
5.根据权利要求1所述的一种纳米尺度siRNA递送系统，其特征在于，在步骤3中，星型寡聚精氨酸粉末均匀分散在PBS溶液中，涡旋2min，得到第一溶液，再加入siRNA，涡旋1min，室温孵化20-60min，得到二元siRNA复合物溶液；向二元siRNA复合物溶液中加入第二溶液，涡旋1min，室温孵化20-60min；弱酸敏感型聚阴离子均匀分散在PBS溶液，涡旋2min，得到第二溶液，质量浓度为0.1-0.3mg/mL。
6.一种纳米尺度siRNA递送系统的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤1，星型寡聚精氨酸POSS-(C-G-R8-G-W)16基因载体的制备
将二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷和寡聚精氨酸W-G-R8-G-C均匀分散于四氢呋喃和水的混合溶液中，加入光引发剂，混合均匀后在紫外灯下照射下进行反应，反应结束后进行透析，冷冻干燥，得到星型寡聚精氨酸POSS-(C-G-R8-G-W)16粉末，二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷和寡聚精氨酸的质量比2：(30—60)；
步骤2，弱酸敏感型聚阴离子PLL-g-Aco的制备
将ε-聚赖氨酸均匀分散在PBS溶液中并冷却至0℃，再向其中加入顺式乌头酸酐粉末并添加氢氧化钠水溶液，以使整体pH维持在8—9，继续搅拌反应，以得到顺式乌头酸酐修饰的ε-聚赖氨酸；
步骤3，纳米尺度siRNA递送系统的制备
将步骤1制备的星型寡聚精氨酸粉末均匀分散在PBS溶液，得到第一溶液；再向第一溶液中加入siRNA，星型寡聚精氨酸与siRNA的质量比为(0.5-6)：1，涡旋并室温孵化，得到二元siRNA复合物溶液；
将步骤2制备的弱酸敏感型聚阴离子均匀分散在PBS溶液，得到第二溶液；向二元siRNA复合物溶液中加入第二溶液，星型寡聚精氨酸与弱酸敏感型聚阴离子的质量比为6：(1—5)，涡旋并室温孵化，获得三元siRNA复合物溶液，即纳米尺度siRNA递送系统。
7.根据权利要求6所述的一种纳米尺度siRNA递送系统的制备方法，其特征在于，在步骤1中，寡聚精氨酸W-G-R8-G-C的氨基酸序列为：Trp-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Gly-Cys；四氢呋喃和水的体积比为(2：3)—(1：2)；二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷和寡聚精氨酸的质量比2：(40—50)；选择在紫外灯下照射下反应10-15min，光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，加入量为二烯丙基功能化的笼型聚倍半硅氧烷、寡聚精氨酸和光引发剂质量之和的0.05％-0.5％，优选0.1—0.5％。
8.根据权利要求6所述的一种纳米尺度siRNA递送系统的制备方法，其特征在于，在步骤2中，ε-聚赖氨酸与顺式乌头酸酐的质量比为1：(1—5)，优选1：(1.5—4.5)；PBS溶液中，浓度为10mM，pH为8.5，ε-聚赖氨酸数均分子量为4200Da，搅拌反应时间为12—24小时。
9.根据权利要求6所述的一种纳米尺度siRNA递送系统的制备方法，其特征在于，在步骤3中，siRNA为ERK2-siRNA或者Cy5-ERK2-siRNA；PBS溶液pH为7.4，浓度为10mM；星型寡聚精氨酸与siRNA的质量比为(2-6)：1；星型寡聚精氨酸与弱酸敏感型聚阴离子的质量比为6：(2—3)；星型寡聚精氨酸粉末均匀分散在PBS溶液中，涡旋2min，得到第一溶液，再加入siRNA，涡旋1min，室温孵化20-60min，得到二元siRNA复合物溶液；向二元siRNA复合物溶液中加入第二溶液，涡旋1min，室温孵化20-60min；弱酸敏感型聚阴离子均匀分散在PBS溶液，涡旋2min，得到第二溶液，质量浓度为0.1-0.3mg/mL。
10.如权利要求1—5之一所述的纳米尺度siRNA递送系统在细胞转染中的应用，其特征在于，加速siRNA的内涵体/溶酶体逃逸效率，高效抑制血管平滑肌细胞的迁移，抑制血管内膜增生。
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