CN106469251B - 评估抗菌肽抗菌力的系统及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种评估/预测抗菌肽抗菌力的方法，其包含以下步骤：(a)利用第一输入单元建构多肽，将构建的多肽构型置于水溶液环境，并持续第一时间，进行平衡反应；(b)利用第二输入单元建构磷酸双脂层，将该磷酸双脂层置于水溶液环境中，并持续第二时间，进行平衡反应；(c)利用第一处理单元，将所述第一输入单元所建构的多肽型与所述第二输入单元建构的磷酸双脂层于水溶液环境中进行分子动力学模拟；(d)通过第二处理单元，计算该多肽构型的分配自由能；(e)通过输出单元，该输出单元与所述第一处理单元和所述第二处理单元连接，并将预测信息输出。
Description
技术领域
本发明涉及一种评估抗菌肽之抗菌力之系统及其使用方法，其是通过规律移动抗菌肽上的氨基酸而产生的具有不同抗菌效果的多肽，并用新创的计算机平台来评估/预测抗菌肽的抗菌效果。
技术背景
抗生素可分为二种，一为是由天然微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)所产生的一种具有抑制其它微生物生长、生存的次级代谢产物，另一类系通过化学方法合成或半合成的类似化合物。其可包括抗细菌抗生素、抗真菌抗生素以及抑制其他微小病原的抗生素；但临床实验中，抗生素通常是指抗细菌抗生素。自从抗生素被发现至今，已被大量使用乃至滥用，使得具有抗药性的病菌越来越多，人类用来对抗病菌的抗生素武器中持续有效的已愈来愈少，因此积极开发新的、更有效的“抗生素”药物为目前制药产业亟待发展的目标之一。
据美国数据库公司FierceBiotech发布的数据显示，全球抗生素市场，预计从2013年到2018年之间，以1.41％的年复合成长率扩大；虽然抗生素的抗药性问题引起了国际社会的高度关注，部分国家采取了一定的限抗措施，但是由于其特定的功效，全球抗生素市场规模仍将延续增长的态势，根据IMS统计，抗感染药品2014年将全球市场规模403亿美元(约2.67千亿人民币)。
抗菌肽，普遍称为抗微生物多肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)，其长度大约是由10～80个不等的氨基酸所组成，是许多生物体中一种对抗病原的微小物质。它的功能主要就是帮助生物体对抗体内的有害物质，其作用大致有渗透细菌之细胞膜、穿孔、干扰细菌增殖与促进伤口愈合等功能，未来具有取代抗生素的潜力。
然而，现今大部分的研究皆是对单一抗菌肽的抗菌能力进行研究，并通过置换抗菌肽上的氨基酸提高抗菌能力，然而此种方法需耗费大量时间评估置换哪个氨基酸及位置可提高抗菌能力，且多肽抗菌能力是一个复杂的残基协同现象，而以往仅能通过疏水力矩、非键结作用位能以及接触表面积预测多肽的抗菌效果，且无法准确地预测多肽的抗菌效果，需进行额外实验才能证明多肽的抗菌效果。因此，若不通过分子动力学模拟是难以提供一种系统性并快速的评估设计抗菌肽的方法。
发明内容
本发明提供一种通过“逐步循环重排”(stepwise circular reshuffling)的方式依序移动已知有抗菌效果之抗菌肽上的氨基酸序列，来设计具有不同抗菌效果、溶血性及抗盐性之多肽，再通过计算机模拟及自由能计算的平台来评估这些抗菌肽的抗菌效果及溶血性。
本发明提供了一个新的分子动力学模拟系统来评估任意一种抗菌肽的抗菌活性及溶血性。此套分子动力学模拟系统，特色在于透过“下沉而上浮”的方式，将抗菌肽快速地拉入仿细菌的仿真生物膜内，并且相较于自然插入大幅缩短所需的平衡时间达10倍左右。根据其模拟轨迹可计算一个新设计出的分配自由能，ΔGp。此分配自由能ΔGp可作为一个更好的物理指标来预测某一种多肽的抗菌活性。
有鉴于此，本发明提供一种评估抗菌肽抗菌力的系统，其包括：
(a)第一输入单元，用于多肽的建构；
(b)第二输入单元，用于磷酸双脂层的建构；
(c)第一处理单元，其与所述第一输入单元以及所述第二输入单元连接，该第一处理单元用于将所述第一输入单元建构的多肽与第二输入单元建构的磷酸双脂层置于水溶液环境中进行分子动力学模拟；
(d)第二处理单元，其与该第一处理单元相连接，用于计算所述多肽在每格模拟快照(snapshot)中与膜内脂链尾有碰触的重原子数Ni及与膜内脂链尾未碰触的重原子数NO，对模拟平衡后4纳秒中所收集的快照做平均，得到<Ni>与<NO>，进而计算分配自由能ΔGp，其中所述重原子系指氢原子之外的所有原子；
(e)输出单元，其与该第二处理单元连接，用于将预测信息输出；
其中，所述第一输入单元、所述第二输入单元、所述第一处理单元、所述
第二处理单元及所述输出单元通过计算机操作。
本发明又提供一种利用本发明系统，来评估/预测抗菌肽抗菌力的方法，其包含以下步骤：
I.利用第一输入单元建构多肽，将该多肽置于水溶液环境中持续第一时间，进行模拟平衡；
II.利用第二输入单元建构磷酸双脂层，将该磷酸双脂层置于水溶液环境中持续第二时间，进行模拟平衡；
III.利用第一处理单元，将所述第一输入单元所建构的多肽与第二输入单元建构的磷酸双脂层于水溶液环境中进行分子动力学模拟；
IV.利用第二处理单元，计算该多肽在每格模拟快照(snapshot)中与膜内脂链尾有碰触的重原子数Ni及与膜内脂链尾未碰触的重原子数NO，对模拟平衡后4纳秒中所收集的快照做平均，得到<Ni>与<NO>，进而计算分配自由能ΔGp，其中所述重原子是指氢原子之外的所有原子；
V.利用输出单元，该输出单元与该第二处理单元连接，将预测信息输出；
其中，所述第一输入单元、所述第二输入单元、所述第一处理单元、所述第二处理单元及该输出单元通过计算机操作。
较佳地，该多肽构型为α-螺旋。
较佳地，该第一输入单元可包含软件(如PyMol或Discovery Studio Visualizer)创造的模拟多肽，或由实验结果(如从X-ray crystallography或NMR)得知的多肽。模拟平衡的多肽包含利用模拟软件(如NAMD、VMD、AMBER、GROMACS)以及常用力场(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)来达到多肽在类生理环境下的平衡状态。
较佳地，所述第二输入单元系包含以“CHARMM-GUI”服务器及相似软件来建膜(磷酸双脂层)。模拟平衡的磷酸双脂层包含利用模拟软件(如NAMD、VMD、AMBER、GROMACS)以及常用力场(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)来达到磷酸双脂层在类生理环境下的平衡状态。
较佳地，所述第一处理单元系包含利用模拟软件(如NAMD、VMD、AMBER、GROMACS)以及常用力场(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)来达到多肽稳定插入磷酸双脂层的平衡状态。
较佳地，所述第二处理单元的输入元素(多肽与膜内脂链尾有碰触及碰触之重原子数)是依据第一处理单元所输出的模拟轨迹得到的。
较佳地，所述磷酸双脂层是由十六酰油酰磷脂酰胆碱(palmitoyloleoylPhosphatidylcholine,简称POPC)及/或十六酰油酰磷脂酰甘油酰甘油(palmitoyloleoyl-phosphatidyl glycerol,简称POPG)构成。
较佳地，所述第一时间为数百皮秒(ps)。
其中，所述预测信息为所述多肽的抗菌效果。
其中，所述分子动力学模拟为，使所述多肽疏水面朝向预先平衡好的磷酸双脂层，而亲水面(即带正电端)朝向另一端，然后当两者的质心投影到与膜垂直的轴上相距为时，再展开“下沉而上浮表面”模拟。
其中，所述“下沉而上浮表面”模拟为所述螺旋构型的多肽被微弱的拉力拖至膜内磷酸双脂上层磷原子之平均坐标下方的位置并维持数纳秒，接着去除对螺旋构型多肽的限制力，再进行10～35纳秒的模拟，使其上浮至膜表面并且平衡。
较佳地，所述计算分配自由能ΔGp＝-kBTln(<Ni>/<No>)或ΔGp＝-kBT(<lnNi>/<lnNo>)(当Ni及No均不为零时)，其中kB为波兹曼常数、T为温度、Ni与No分别为每格模拟快照(snapshot)中与膜内脂链尾有碰触(视为已插入)和未碰触(视为未插入)的多肽内重原子之数量，<>表示4纳秒的移动平均。
较佳地，在本发明抗菌肽中，经计算该ΔGp与其对应的抗菌效果(MIC)彼此间的相关系数(R)大于0.84(“1”代表完美的相关)。在此系列中，MIC＝13.49*ΔGp-5.79。
附图说明
附图1为分子模拟系统的简单示意图。
附图2为分子模拟系统的流程图。
附图3为分子模拟结果的示意图。
附图4为表示多肽溶血性的效果图
【实施方式】
利用本发明系统所设计出的具低溶血性的抗菌肽，该抗菌肽如下列式I所示：
xAP1yBP2zCn(P3vD)；
其中x、y、z、v以及n均为正整数；
且x＝0～6、y＝0或4、z＝0～6、v＝0～4以及n＝0或1；
其中P1、P2以及P3系指-Trp-Leu-Lys-；
其中A、B以及C系选自由Trp、Leu以及Lys所组成之群组；
其中D系指Lys。
于较佳实施例中，抗菌肽于分子动力学模拟系统的结果如表1所示：
表1本发明抗菌肽的模拟结果
于较佳实施例中，抗菌肽的抗菌效果如表2所示。
最低抑菌浓度测试
抗菌活性的最低抑菌浓度值被定义为能抑制90％的细菌生长的最低蛋白浓度，而大肠杆菌(ATCC 25922)被选作为此次WLK异构多肽系列(SEQ ID NO:1～13)的最低抑菌浓度测试的代表菌株。蛋白浓度由紫外光/可见光光谱仪(Ultrospec 1100pro fromAmersham Biosciences)在波长280nm的吸光值搭配消光系数计算(Gill S.C.&Von HippelP.H.,Analytical biochemistry1989,182(2),319-326)得到，然后被配置为以下七个初始浓度：5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078mg/ml。将处于对数生长中期、浓度为每毫升5×105菌落形成单位(CFU)的细菌培养液与上述浓度的蛋白溶液于96孔盘中均匀混和(每孔中含有1微升的蛋白溶液与99微升的菌液)。在37℃环境下震荡培养16小时后，由微量孔盘仪(Thermo Max,Molecular Devices)在波长600nm环境下的吸光值来侦测该细菌生长抑制情形。最后，最低抑菌浓度值将通过三次上述重复实验结果来确定。
溶血活性测试
溶血活性是由受测多肽对于人类红血球的溶血性测定。新鲜的红血球和PBS缓冲溶液(pH 7.4)均匀混和后在相对离心力(RCF)800g环境下采用离心10分钟进行，然后再由PBS缓冲溶液依体积百分比浓度(v/v)稀释至10％。各个受测多肽预先配置好不同浓度(800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56μg/ml)，分别与PBS缓冲溶液依1：1的体积比例混合(100μL：100μL)。而红血球溶液依体积比例1：1，分别与包含或不包含2％聚乙二醇辛基苯基醚X-100(Triton X-100)(v/v)的PBS缓冲液混合，用来作为正、负控制组样本。然后所有受测样品在37℃环境下静置1小时。接着将样品在RCF 800g环境下再离心10分钟，取其上清液并测其波长450nm下的吸光值，溶血活性将依照以下公式而测定：
溶血性(％)＝[A样本-APBS]/[ATritonX100-APBS]
表2本发明之抗菌肽的溶血性、抗盐性及抗菌效果
针对原先为螺旋构型的SEQ ID NO:1，经”序列逐步位移置换”过程中新设计的12段异构多肽(SEQ ID NO:2～13)，其抗菌效果、溶血性及其盐类耐受性如表2所示，进一步运用上述“下沉而上浮”模拟策略与ΔGp计算方式来衡量其抗菌活性，并分析该13段多肽(含原始序列)的分配自由能(ΔGp)与实验抗菌性(MIC)之间的相关性，得到其相关系数大于0.8(MIC＝13.50*ΔGp-5.79,R＝0.84)，表2的结果更说明该13段多肽在高盐浓度中仍然具有抑制效果，且在本发明提供的这12段异构多肽中有3段的抗菌活性比原先序列更佳，其中SEQ ID NO:12同时表现出对人类红血球更低的溶血性。本发明明显地提供了一个新的平台，运用已知的抗菌肽来合理地设计更有效的抗菌肽，并且利用计算机模拟来预测新抗菌肽的活性。
Claims (13)
1.一种评估抗菌肽抗菌力的系统，其特征在于，包括：
第一输入单元，用于多肽的建构；
第二输入单元，用于磷酸双脂层的建构；
第一处理单元，其与所述第一输入单元以及所述第二输入单元连接，该第一处理单元用于将第一输入单元建构的多肽与第二输入单元建构的磷酸双脂层于水溶液环境中进行分子动力学模拟；
第二处理单元，该第二处理单元与所述第一处理单元相连接，用于计算该多肽在每格模拟快照(snapshot)中与膜内脂链尾有碰触之重原子数Ni及与膜内脂链尾未碰触之重原子数NO，对模拟平衡后4纳秒中所收集的快照做平均，得到<Ni>与<NO>，进而计算分配自由能ΔGp，其中所述重原子是指氢原子之外的所有原子；
输出单元，该输出单元与所述第二处理单元连接，用于将预测信息-分配自由能ΔGp输出；
其中，所述第一输入单元、所述第二输入单元、所述第一处理单元、所述第二处理单元及该输出单元系通过计算机操作；
所述分子动力学模拟用于调整所述多肽的方向，使其疏水面朝向预先平衡好的磷酸双脂层，而亲水面朝向另一端，然后当两者的质心投影到与膜垂直的轴上相距为时，再展开下沉而上浮表面模拟；所述下沉而上浮表面模拟包括螺旋构型的多肽被微弱的拉力拖至膜内磷酸双脂上层磷原子之平均坐标下方的位置并维持数纳秒，接着去除对螺旋构型多肽的限制力，进行10～35纳秒的模拟，使其上浮至膜表面并且平衡。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一输入单元包含由软件PyMol或Discovery Studio Visualizer创造的模拟多肽，或由实验结果从X-ray crystallography或NMR得知的多肽，模拟平衡的多肽包含利用模拟软件NAMD、VMD、AMBER或GROMACS以及常用力场CHARMM、AMBER、GROMOS或OPLS来达到多肽在类生理环境下的平衡状态。
3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第二输入单元包含以“CHARMM-GUI”服务器及相似软件来建磷酸双脂层，模拟平衡的磷酸双脂层包含利用模拟软件NAMD、VMD、AMBER或GROMACS以及常用力场CHARMM、AMBER、GROMOS或OPLS来达到磷酸双脂层在类生理环境下的平衡状态。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第一处理单元包含利用模拟软件NAMD、VMD、AMBER14或GROMACS以及常用力场CHARMM、AMBER、GROMOS或OPLS来达到多肽稳定插入磷酸双脂层的平衡状态。
5.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述磷酸双脂层由十六酰油酰磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl Phosphatidyl choline,简称POPC)及/或十六酰油酰磷脂酰甘油酰甘油(palmitoyloleoyl-phosphatidylglycerol,简称POPG)所构成。
6.一种应用权利要求1的系统预测抗菌肽抗菌力的方法，其特征在于，包含以下步骤：
通过第一输入单元建构多肽，并将该多肽置于水溶液环境中持续第一时间，进行平衡反应；
通过第二输入单元建构磷酸双脂层，并将该磷酸双脂层置于水溶液环境中持续第二时间，进行平衡反应；
通过第一处理单元，将所述第一输入单元建构的多肽与所述第二输入单元建构的磷酸双脂层在水溶液环境中进行分子动力学模拟；
通过第二处理单元，计算所述多肽在每格模拟快照(snapshot)中与膜内脂链尾有碰触的重原子数Ni及与膜内脂链尾未碰触的重原子数NO，对模拟平衡后4纳秒中所收集的快照做平均，得到<Ni>与<NO>，进而计算分配自由能ΔGp；
通过与所述第二处理单元连接的输出单元，将分配自由能或预测的多肽活性信息输出；
所述分子动力学模拟用于调整具有螺旋构型多肽的方向，使其疏水面朝向预先平衡好的磷酸双脂层，而亲水面朝向另一端，然后当两者的质心投影到与膜垂直的轴上相距为时，再展开下沉而上浮表面的模拟；所述下沉而上浮表面模拟该螺旋构型的多肽被微弱的拉力拖至膜内磷酸双脂上层磷原子的平均坐标下方的位置并维持数纳秒，接着去除对螺旋构型多肽的限制力，使其上浮至膜表面，再进行10～35纳秒的模拟。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述平衡反应是将多肽置于模拟水环境中数百皮秒(ps)。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一输入单元包含由软件PyMol或Discovery Studio Visualizer创造的模拟多肽，或由实验结果从X-ray crystallography或NMR得知的多肽，模拟平衡的多肽包含利用模拟软件NAMD、VMD、AMBER或GROMACS以及常用力场CHARMM、AMBER、GROMOS或OPLS来达到多肽在类生理环境下的平衡状态。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二输入单元是包含以“CHARMM-GUI”服务器及相似软件来建磷酸双脂层，模拟平衡的磷酸双脂层包含利用模拟软件NAMD、VMD、AMBER或GROMACS以及常用力场CHARMM、AMBER、GROMOS或OPLS来达到磷酸双脂层在类生理环境下的平衡状态。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一处理单元包含利用模拟软件NAMD、VMD、AMBER或GROMACS以及常用力场CHARMM、AMBER、GROMOS或OPLS来达到多肽稳定插入磷酸双脂层的平衡状态。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述磷酸双脂层系由十六酰油酰磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl Phosphatidylcholine,简称POPC)及/或十六酰油酰磷脂酰甘油酰甘油(palmitoyloleoyl-phosphatidylglycerol,简称POPG)所构成。
12.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预测信息是指该多肽的抗菌性。
13.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分配自由能系为ΔGp＝-kBTln(<Ni>/<No>)或ΔGp＝-kBT(<lnNi>/<lnNo>)，其中kB为波兹曼常数、T为温度、Ni与No分别为每格模拟快照(snapshot)中与膜内脂链尾有碰触和未碰触的多肽内重原子的数量，<>表示4ns的移动平均。
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