TWI491406B - 抗微生物組合物及其抑制微生物的方法 - Google Patents

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抗微生物組合物及其抑制微生物的方法
本發明係一種控制或抑制微生物的方法；本發明亦是關於一種用來抑制微生物之抗微生物組合物。
抗菌胜肽(Antimicrobial peptides,AMPs)為天然的抗生素，能夠做為主要防禦屏障來防止致病性微生物對生物的侵害。近日，科學研究揭露了一種於自然界中存在於人類、哺乳類、植物、昆蟲和其他生物的抗菌胜肽。這些胜肽通常帶正電(如：陽離子)；且一般認為這些胜肽的抗微生物功效是由於它們能夠滲透和破壞微生物的細胞膜，因此而殺死微生物或抑制微生物的生長。
植物抗菌胜肽多為具有高量半胱胺酸與甘胺酸殘基組成之3-10 kDa正電性胜肽。這些植物抗菌胜肽可持續性的表現或是於病原體攻擊後才會被誘導表現；且大部份的抗菌胜肽是位在細胞外基質(extracellular matrix)；一般來說，其經半胱胺酸連結之分子內雙硫鍵(disulfide bound)能夠穩定結構，進而與微生物之細胞膜發生交互作用並破壞其完整性，達到抑菌效果(Pelegrini et al.2011；Hammam et al.2009)。除了膜透化 (membrane permeabilization)外，抗菌胜肽尚可透過阻止核酸與蛋白質生合成、抑制酵素活性、誘導細胞程序性死亡(programmed cell death)等機制達到抑制微生物的效果(Brogden,2005；De Brucker et al.2011；Rahnamaeian,2011)。由於抗菌胜肽兼具多樣抑菌機制與廣效的抗微生物活性之特性，它們已成為開發藥物與植物病害防治資材之有力後備資源(Brandenburg et al.2012；Montesinos,2007；Stotz et al.2009)。
植物誘導性抗病(Induced resistance)屬於一種對抗生物性與非生物性逆境之抗性強化狀態(Bostock,1999；Sticher et al.1997；van Loon et al.1998；Durrant and Dong,2004)。植物荷爾蒙水楊酸(salicylic acid)已被證實為一種抗病性調控物質，它能在諸多植物系統內調控防禦訊息傳遞路徑與誘導抗性基因表現(Alvarez,2000；Kessmann et al.1994)。百合LsGRP1 (Lilium ‘Stargazer’glycine-rich protein 1)為水楊酸和撲殺熱(probenazole)誘發對百合灰黴病菌(Botrytis elliptica (Berk.)Cooke)之抗病性過程中差異性表現的防禦相關基因。LsGRP1 基因推測編碼一138個胺基酸之富含甘胺酸蛋白(glycine-rich protein,GRP)，該蛋白質含有一23個胺基酸的N端信息胜肽(N-terminal signal peptide)，負責引導成熟蛋白移動至細胞膜或胞外基質(extracellular matrix)。該LsGRP1衍生性胜肽與其他植物富含甘胺酸蛋白具有超過53%之序列相似度，並且具有一高度保守之區域結構，該區域結構包括一N端信號胜肽、一富含甘胺酸之中央區域(central glycine-rich domain)及一富含半胱胺酸之C端區域(C-terminal cysteine-rich domain)(Chen et al.2003；Lu and Chen,2005；Lu et al.1998,2007)。
然而，目前為止並無任何的研究報告確認LsGRP1衍生性胜肽的抗微生物活性；因此本領域有必要探索該LsGRP1衍生性胜肽及其於抗微生物應用之巨大潛力。
參考文獻
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首先，本發明是關於一種控制或抑制微生物的方法，該方法包括：應用一抗菌胜肽於微生物，其中該微生物為真菌或細菌；其中該抗菌胜肽係選自於由LsGRP1N (SEQ ID NO：1)、LsGRP1G (SEQ ID NO：2)、LsGRP1C (SEQ ID NO：3)及與LsGRP1N 、LsGRP1G 和LsGRP1C 序列具至少80%相似度的胜肽所組成之群組。
本發明的另一目的係關於一抗微生物組合物，該抗微生物組合物包括一本發明之抗菌胜肽(一活性成份)，該組合物可進一步包括一附加的殺菌劑及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等。
本發明之抗微生物組合物可以使用來處理任一目標微生物，例如：任一真菌或細菌。於本發明之一實施例中，該目標微生物為一革蘭氏陽性細菌(Gram-positive bacterium)，例如：枯草桿菌(Bacillus subtilis 28-4)。於另一實施例中，該目標微生物為革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacterium)，例如：菜豆細菌性斑點病菌(Pseudomonas syringae pv.syringae 61)、農桿菌(Agrobacterium tumefaciens C58C1 )、大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)、細菌性軟腐病菌(Dickey chrysanthemi TA1)及十字花科 黑腐病菌(Xanthomonas campestris XCP3)。又於另一實施例中，該目標微生物為真菌，例如：十字花科黑斑病菌(Alternaria brassicicola Ac1)、灰黴病菌(Botrytis cinerea B-134)、百合灰黴菌(Botrytis elliptica B061)、急尖炭疽刺盤孢菌(Colletotrichum acutatum HL1)或似膠黏孢炭疽刺盤孢菌(Colletotrichum gleosporioides MT1)。
大體而言，本發明的抗菌胜肽能夠被使用於任一處，如植物表面和任一組織(包括任一移植物的表面)，來處理一目標微生物。
更進一步，本發明的抗菌胜肽能夠被使用於一傷口癒合組合物或衛生用品，如：繃帶、抗頭皮屑產品和濕紙巾。
第1圖LsGRP1衍生性胜肽示意圖與抑菌活性預測；區塊分別標明LsGRP1N 、LsGRP1G 與LsGRP1C 於LsGRP1推定序列之位置與長度，其下為使用軟體AMPA(Torrent et al.2009)、APD2(Wang et al.2009)、AntiBP2(Lata et al.2007)、CAMP(Thomas et al.2010)及ClassAMP(Joseph et al.2012)進行LsGRP1衍生性胜肽之抑菌活性預測結果；抑菌活性預測結果為正與負者分別標作+與-，不確定者則標作+/-。
第2圖LsGRP1衍生性胜肽之抗菌活性分析；(A)以2.5 mg/ml胜肽溶液處理OD600 為0.15之細菌懸浮液90分鐘之後進行序列稀釋塗盤，並於20-24小時之後計算菌落數；抑制率=[(水處理組菌落數-胜肽溶液處理組菌落數)/水處理組菌落數]×100%；(B)以2.5 mg/ml胜肽溶液處理濃度為1×105 spores/ml之孢子懸浮液，並於16-20小時之後於光學顯微鏡下觀察並記錄孢子萌芽百分比；抑制率=[(水處理組萌芽孢子數-胜肽溶液處理組萌芽孢子數)/水處理組萌芽孢子數]×100%。
第3圖LsGRP1C 改變細菌的外型(morphology)與膜通透性(membrane permeability)；(A)以掃描式電子顯微鏡觀察LsGRP1C 處理後之P.syringae pv.syringae 61和X.campestris XCP3；比例尺=4 μm(P.syringae pv.syringae )或5 μm(X.campestris )。(B)以SYTOX Green對LsGRP1C 處理後之P.syringae pv.syringae 61和X.campestris XCP3進行染色；比例尺=10 μm。
第4圖LsGRP1C 對植物病原真菌所造成之影響；以50 μg/ml LsGRP1C 處理真菌孢子2小時(A)與菌絲16小時(B)後，使用SYTOX Green、DAPI與H2 DCFDA染色分析LsGRP1C 對膜通透性、染色質凝集(chromatin condensation)與活性氧化物(reactive oxygen species,ROS)累積之影響。對照組以無菌去離子水(ddH2 O)取代LsGRP1C 。比例尺=20 μm(A)或50 μm(B)。
第5圖 於植物病原真菌之菌絲進行LsGRP1C 免疫螢光染色；以50 μg/ml LsGRP1C 處理真菌菌絲16小時後進行之；對照組以無菌去離子水(ddH2O)取代LsGRP1C 。比例尺=25 μm。
首先本發明係關於一種控制或抑制微生物的方法，該方法包括：應用一抗菌胜肽於微生物，其中該抗菌胜肽具有抗微生物活性，如抗真菌活性和抗細菌活性；並且該抗菌胜肽係選自於由LsGRP1N (SEQ ID NO：1)、LsGRP1G (SEQ ID NO：2)、LsGRP1C (SEQ ID NO：3)及與LsGRP1N 、LsGRP1G 和LsGRP1C 序列具至少80%相似度的胜肽所組成之群組。
於一較佳之實施例中，抗真菌活性(Antifungal activity)為抑制真菌生長的活性，其中該真菌係選自於由Alternaria brassicicola Ac1、Botrytis cinerea B-134、Botrytis elliptica B061，Colletotrichum acutatum HL1和Colletotrichum gleosporioides MT1所組成之群組。
於另一較佳之實施例中，抗細菌活性(antibacterial activity)為抑制細菌生長的活性，其中該細菌係選自於由Agrobacterium tumefaciens C58C1 、Bacillus subtilis 28-4、Escherichia coli DH5α、Dickey chrysanthemi TA1、Pseudomonas syringae pv.syringae 61或Xanthomonas campestris XCP3所組成之群組。
"抗菌多胜肽(Antimicrobial polypeptide)"所指 的包括線性和具活性之多胜肽折疊結構，且該名詞可以和"抗菌蛋白質(Antimicrobial protein)"交互使用。
於本發明的內容中，"抗微生物活性(Antimicrobial activity)"為本發明之多胜肽具有控制和抑制微生物的活性，其中該微生物包括真菌，如絲狀真菌(filamentous fungus)，和/或細菌，如革蘭氏陽性和陰性細菌。適當的分析方法被用來分析一多胜肽是否具有抗微生物活性，其中該方法包括但並不受限於本發明之"抗細菌分析(antibacterial assay)"和“抗真菌分析(antifungal assay)”章節中之方法。
本發明亦和一抗微生物組合物有關，該組合物包括一本發明之抗菌胜肽，其中該組合物可進一步包括一附加的殺菌劑及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑等。
本發明將進一步以下列實施例來說明；然而本發明之範圍並不受限於此處所提供之實施例。
實施例 一 1.電腦分析(Computational analysis)
以預測軟體AMPA(Torrent et al.2009)、APD2(Wang and Wang,2004；Wang et al.2009)、AntiBP2(Lata et al.2007)、CAMP(Thomas et al.2010)與ClassAMP(Joseph et al.2012)進行LsGRP1(NCBI accession number：AAL61539.1)衍生性胜肽之抑菌活性分析。
2.結果
以五種程式預測LsGRP1N 、LsGRP1G 與LsGRP1C 之抑菌活性， 發現所有程式均建議LsGRP1C 可能具有抗菌活性，但僅有兩種與四種程式分別建議LsGRP1N 與LsGRP1G 可能具有抗菌活性(第1圖)；因此，LsGRP1C 可能是於大腸桿菌系統中干擾LsGRP1表現的主要部份。
實施例 二 1. LsGRP1衍生性胜肽之準備
LsGRP1N 、LsGRP1G 和LsGRP1C 是由Genscript USA Inc以化學方法來合成，並透過高效液相層析儀(high performance liquid chromatography)結合由乙腈(acetonitrile)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid)與水組成之溶劑系統純化合成胜肽，使純度大於90%之後，再使用電噴灑離子化質譜(electrospray ionization mass spectrometry)檢測回收產物之成分與純度。合成胜肽與胎牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA,Sigma-Aldrich)均以無菌去離子水溶解為10 mg/ml之溶液，保存於-20℃。
2.微生物
本發明所使用的細菌菌株為Agrobacterium tumefaciens C58C1 (Van Larebeke et al.,1974)、Bacillus subtilis 28-4、Escherichia coli DH5α(Invitrogen)、Dickey chrysanthemi TA1、Pseudomonas syringae pv.syringae 61(Huang et al.,1988)和Xanthomonas campestris XCP3等六種，均以Luria-Bertani(LB)平板培養基(1% tryptone,0.5% yeast extract,1% NaCl,1.5% agar)或523平板培養基(1% sucrose,0.8% casein hydrolysate,0.4% yeast extract,0.2% KH2 PO4 ,0.00358% MgSO4 ,1.5% agar,pH 7.0)培養與保存；除E. coli DH5α之培養溫度為37℃，其餘菌株均為28℃。在抗菌分析中，各菌株於3ml之LB液態培養基以180 rpm培養12-16小時後，以無菌去離子水調整至試驗所需濃度即可使用。
本發明使用之真菌為Alternaria brassicicola Ac1、Botrytis cinerea B-134、Botrytis elliptica B061、Colletotrichum acutatum HL1和Colletotrichum gleosporioides MT1等五種；B.elliptica B061以V-8平板培養基(20% V-8 vegetable juice[Campbell Soup Company,Camden,N.J.,U.S.A.],0.3% CaCO3 ,and 1.5% agar)於20℃培養5-8天，其餘菌株於馬鈴薯葡萄糖平板培養基(potato dextrose agar,Difco Laboratories,Detroit,MI,U.S.A.)於25℃培養7-10天後，收取其分生孢子並以無菌去離子水調整至試驗所需濃度。
3.生長抑制分析
藉由比較胜肽與無菌去離子水處理對細菌生長與真菌胞子萌芽之影響，確認並量化胜肽之抗細菌和抗真菌活性。在抑制細菌生長試驗部分，將細菌懸浮液(OD600 =0.15)以胜肽溶液處理90分鐘後，序列稀釋塗盤於LB平板培養基，並於20-24小時後計算菌落形成單位(colony-forming unit,CFU)，以計算抑制率。抑制率=[(水處理組菌落數-胜肽溶液處理組菌落數)/水處理組菌落數]×100%。在抑制真菌孢子萌芽試驗部分，將1×105 spores/ml濃度之真菌孢子懸浮液以胜肽處理16-20小時，以光學顯微鏡觀察並記錄孢子萌芽百分比。發芽管(germ tube)長度超過孢子長度兩倍者即為萌芽。抑制率=[(水處理組萌芽孢子數-胜肽溶液處理組萌芽孢子數)/水處理組萌芽孢子數]×100%。所有分析皆重覆3次，並 依據所得之實驗數據來計算胜肽對各微生物的半抑制濃度(Concentrations of peptide for 50% inhibition,IC50 )。
4.結果 (1)LsGRP1衍生性胜肽之抗細菌活性分析
在2.5 mg/ml的處理濃度下，三種LsGRP1衍生性胜肽對六種受試細菌的生長均具有顯著抑制作用(圖二(A))，因此3種合成胜肽皆被認為具有抗細菌活性。其中LsGRP1N 與LsGRP1C 造成所有受試細菌的生長超過99.5%被抑制。至於LsGRP1G 對A.tumefaciens C58C1 與D.chrysanthemi TA1之生長抑制率雖亦高於98.5%，但對B.subtilis 28-4(87.6%)、E.coli DH5α(81.8%)、P.syringae pv.syringae 61(84.8%)與X.campestris XCP3(69.6%)之抑制率較低。是以，LsGRP1N 與LsGRP1C 較LsGRP1G 具有較優異之抗細菌活性。
(2)LsGRP1衍生性胜肽之抗真菌活性分析
在2.5 mg/ml的處理濃度下，LsGRP1C 顯著抑制A.brassicicola Ac1、B.cinerea B-134、B.elliptica B061與C.acutatum HL1等受試真菌的胞子萌芽(抑制率均超過90%)，但對C.gleosporioides MT1孢子萌芽的抑制率則為74.7%(圖二(B))。同時，LsGRP1N 抑制98.0%的A.brassicicola Ac1與40.3%的C.acutatum HL1孢子萌芽，但不影響B.cinerea B-134之孢子萌芽。值得注意 的是，LsGRP1N 處理可輕微促進B.elliptica B061之孢子萌芽(抑制率-12.4%)。而LsGRP1G 則與LsGRP1N 以及LsGRP1C 不同，僅對B.elliptica B061之孢子萌芽具有抑制作用(抑制率62.7%)。因此相較於LsGRP1N 與LsGRP1G ，兼具抗真菌活性強度與作用真菌光譜廣度的LsGRP1C 更具開發為抗真菌胜肽之潛力。因此相較於LsGRP1N 與LsGRP1G ，LsGRP1C 更具開發為抗真菌胜肽之潛力。
實施例 三 LsGRP1 C 對不同種的細菌和真菌表現出有效的抑制活性
透過檢測LsGRP1C 對各種細菌與真菌的半抑制濃度(IC50 )，進一步闡明LsGRP1C 之抗菌活性(表一)；結果顯示LsGRP1C 對所有受試微生物之半抑制濃度均低於86.13 μg/ml，為一有效抗菌胜肽。在細菌部分，除了對A.tumefaciens C58C1 的半抑制濃度為71.79 μg/ml之外，LsGRP1C 對其餘所有受試細菌之半抑制濃度均低於32.19 μg/ml，而E.coli DH5α為所有受試細菌中對LsGRP1C 最敏感者(半抑制濃度9.67 μg/ml)。在真菌部分，除了百合灰黴病病原B.elliptica 對LsGRP1C 具有較高的耐受性之外(半抑制濃度86.13 μg/ml)，LsGRP1C 對所有受試真菌之半抑制濃度均低於58.26 μg/ml。
實施例四 LsGRP1 C 改變細菌外型(morphology)與膜通透性(membrane permeability) 1.掃描顯微鏡
於預先包覆0.1% poly-L-lysine的蓋玻片上，接種20μl濃度為108 cells/ml的細菌懸浮液，並於28℃保濕培養12小時；之後分別以20 μl的2.5、0.25或0.025 mg/ml胜肽溶液處理黏附於蓋玻片之細菌菌落2小時；再將細菌細胞以1%戊二醛(glutaraldehyde)固定，並以150 mM的磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer，pH 7.2)清洗三次，每次15分鐘。隨後將玻片上的細胞以1%之OsO4 包覆 (coated)一小時，以2%醋酸鈾醯(uranyl acetate)浸漬30分鐘，並以150 mM的磷酸鹽緩衝液(pH 7.2)清洗三次，每次15分鐘。隨後樣本以一系列之30%、50%、70%、85%、90%、95%、100%和100%乙醇脫水，每次30分鐘；然後浸泡於丙酮(acetone)兩次，每次30分鐘；再以臨界點乾燥機(critical point dryer)HCP-2(Hitachi)於CO2 乾燥，並以離子覆膜機(ion sputter E101，Hitachi)包覆黃金粒子。最後將準備好的樣本以掃描電子顯微鏡(Inspect S,FEI Company)觀察。
2. SYTOX Green染色
以不同濃度之胜肽溶液處理108 cells/ml的細菌懸浮液，並同時添加1 μM SYTOX Green(Invitrogen)，再於28℃、180 rpm培養2小時後，以配備Chroma Endow GFP濾片組(BP 450-490 nm，DM 495 nm，BP 500-550 nm)之螢光顯微鏡(DMR,Leica)進行觀察。真菌孢子與菌絲以50 μg/ml胜肽溶液分別處理2與16小時後，以1 μg/ml SYTOX Green(Invitrogen)避光染色10分鐘，再以配備Chroma 41012濾片組(BP460-500 nm,DM 505 nm,LP510 nm)之螢光顯微鏡(DMIL,Leica)進行觀察。以無菌去離子水取代胜肽溶液作為對照組。
3.結果
以掃描式電子顯微鏡觀察處理LsGRP1C 對植物病原細菌P.syringae pv.syringae 61與X.campestris XCP3外形之影響。在處理 濃度為2500 μg/ml時，可觀察發現到一顯著數目之細菌細胞由棒狀(rod-shaped)轉型成球狀(spherical-shaped)(第3圖A)；當以LsGRP1C 處理的濃度降低時，與未處理的菌株相比較，P.syringae pv.syringae 61和X.campestris XCP3細胞則呈現縮短和腫脹的形態，表示此一外形變化具有LsGRP1C 的劑量依賴效應(dose-dependent effect)。
由LsGRP1C 所引起之細菌細胞外形的變化，暗示細菌的細胞膜被LsGRP1C 破壞；且隨後之SYTOX Green染色也證明了LsGRP1C 對細菌細胞膜的影響。螢光核酸染劑SYTOX Green能夠通過細胞膜受損細胞、但無法進入健康細胞並產生核螢光；於螢光顯微鏡下，在以LsGRP1C 處理之P.syringae pv.syringae 61和X.campestris XCP3細胞可觀察到螢光，但以水處理之對照組則無(第3圖B)，表示LsGRP1C 改變了細菌細胞膜的完整性(integrity)和通透性(permeability)。此外，被SYTOX Green標記的細菌之比例與LsGRP1C 濃度呈正相關，而此一結果亦與由LsGRP1C 所引起的外形變化一致。
實施例 五 LsGRP1 C 破壞真菌細胞膜完整性與誘發類程序性細胞死亡現象 1. DAPI染色
真菌孢子與菌絲以50 μg/ml胜肽溶液分別處理2與16小時後，以1 μg/ml 4’,6’-diamidino-2-phenylindole(DAPI)避光染色10分鐘後，使用配備Leica A濾片組(BP340-380 nm,DM 400 nm,LP425 nm)之螢光顯微鏡(DMIL,Leica)對樣品進行觀察。以無菌去離子水取代胜肽溶液作為對照組。
2. H 2 DCFDA染色
真菌孢子與菌絲以50 μg/ml胜肽溶液分別處理2與16小時後，以10 μM H2 DCFDA避光染色60分鐘後，使用配備Chroma 41012濾片組之螢光顯微鏡(DMIL,Leica)對樣品進行觀察。以無菌去離子水取代胜肽溶液作為對照組。
3.結果
第4圖為LsGRP1C 對A.brassicicola Ac1、B.cinerea B-134、B.elliptica B061和C.acutatum HL1之孢子和菌絲的影響；透過光學顯微鏡觀察可知經LsGRP1C 處理之真菌胞子與菌絲，其細胞表面出現凹陷與皺縮，同時細胞質發生壞疽與顆粒化現象；這些改變在B.elliptica 尤其明顯。相反的，在水處理對照組中，所有真菌的菌絲與孢子均維持平滑完整的外觀，細胞質則呈現均質澄澈的狀態。
經SYTOX Green染色結果LsGRP1C 會破壞所有受試真菌之 細胞膜完整性；以DAPI標定DNA的結果則顯示LsGRP1C 能夠促使受試真菌之細胞核染色質凝集。此外透過H2 DCFDA染色可觀察到LsGRP1C 處理會導致真菌累積活性氧化物質(reactive oxygen species,ROS)(Fig.4(B))。上述細胞膜完整性受破壞、染色質凝集與活性氧物質累積等現象，在水處理對照組均未發生。有趣的是，LsGRP1C 無法誘發除B.elliptica 外的其餘受試真菌於未萌芽孢子累積活性氧物質(第4圖A)；此一結果建議，B.elliptica 對LsGRP1C 的反應較快。綜合上述結果，對於不同的真菌，LsGRP1C 能夠破壞其細胞膜的完整性和引起一類程序性細胞死亡現象。
實施例 六 LsGRP1C於受處理真菌細胞之位置 1.免疫螢光顯微鏡
真菌孢子與菌絲以50 μg/ml胜肽溶液處理16小時後，以含有4%甲醛之磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline,PBS,137 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM Na2 HPO4 ,2 mM KH2 PO4 ,pH 7.4)固定1小時，以含有25 mM dithiothreitol之磷酸鹽緩衝液處理20分鐘，再以含有20 mg/ml幾丁質分解酵素(chitinase,Sigma-Aldrich)與5 μl/ml β-mercaptoethanol之磷酸鹽緩衝液活化抗原30分鐘。然後以fluorescein isothiocyanate(FITC)標定之抗兔子IgG抗體(KLP)染色；最後使用配備Chroma 41012濾片組之螢光顯微鏡(DMIL,Leica)觀察樣品。LsGRP1C 抗體是以對應LsGRP1(accession number：AAL61539.1)C端序列之化學合成胜肽使兔子免疫後，再 以LsGRP1C 親和性管柱純化免疫後之兔子血清而得。對照組以無菌去離子水取代胜肽溶液。
2.結果
為了調查LsGRP1C於受處理真菌細胞之位置，LsGRP1C 處理過之真菌菌絲以LsGRP1C 抗體雜交(hybridize)，並以FITC-conjugated anti-rabbit IgG antibody染色；在經LsGRP1C 處理的真菌菌絲可觀察到標定LsGRP1C 之螢光訊號，但在水處理對照組則無此訊號(第5圖)。大部份的螢光信號位於菌絲的外層，而少數螢光信號則於菌絲細胞內被發現；顯示大部份的LsGRP1C 應結合至真菌細胞壁和/或細胞膜，並改變真菌細胞膜的完整性，隨後則有少數LsGRP1C 流入菌絲細胞內。
結論
所有於本發明中所使用的預測軟體，皆建議LsGRP1之抗微生物活性主要是由LsGRP1C 所賦予的；然而在實際分析中，若與BSA處理之對照組相比較，濃度為2500 μg/ml之LsGRP1N 、LsGRP1G 和LsGRP1C 對革蘭氏陽性和陰性細菌皆具有高度抑制活性；而此一結果建議，不僅是LsGRP1蛋白質之富含半胱胺酸的C端區域(cysteine-rich C-terminal region)，LsGRP1蛋白質的其他區域也對細菌具有毒性。更進一步由LsGRP1C 對E.coli DH5α的低IC50 值(9.67 μg/ml)可推知E.coli 對含有LsGRP1C 區域之LsGRP1高度敏感；是 以該C端半胱胺酸區域和LsGRP1其他部份的抗微生物活性即造成以E.coli 無法成功生產LsGRP1之結果。因為本發明證明了LsGRP1C 對不同細菌和真菌的抗微生物潛力(potency)，所以無法於微生物系統中過度表現(overexpression)之防禦相關蛋白，或許可成為一新穎抗菌胜肽(AMPs)的來源。
雖然LsGRP1衍生性胜肽皆能有效抑制實施例中所使用的所有細菌(81-100%的抑制率)，但只有LsGRP1C 能夠高度的抑制實施例中的所有真菌；此一結果亦與AMP預測軟體所預測的胜肽抗菌活性結果一致。因此LsGRP1C 的抗微生物活性和其廣效性，亦進一步地被其對各種不同細菌和真菌的低IC50 值所證明。由LsGRP1C 之有效抑制活性和廣效抗微生物特性的綜合特徵，推測LsGRP1C 具有一微生物間共通之作用標的抑或是可對微生物生理造成多重影響。在SYTOX Green染色分析中，顯示LsGRP1C 能夠破壞細菌和真菌細胞膜的完整性，而此一特徵亦是富含半胱胺酸之陽離子抗菌胜肽(cationic cysteine-rich AMPs)的共同性質(Brogden,2005；Rahnamaeian,2011)。此外，LsGRP1C 被發現位於真菌菌絲細胞表面的事實，亦提供了LsGRP1C 於受處理真菌細胞之細胞壁和/或細胞膜位置的證據。於四種被處理之真菌中，除了破壞膜通透性外，LsGRP1C 會引起核染色質凝集和ROS的累績，這表示LsGRP1C 會誘導真菌的程序性細胞死亡。值得注意的是，LsGRP1C 所引發之未萌芽孢子的ROS累積，僅出現在百合病原菌B.elliptica 中，但其他3種真菌上卻沒有發生；此一結果建議，B.elliptica 對LsGRP1C 具有較高之敏感性。由植物病原真菌所產生的 ROS在做為植物程序性細胞死亡的調節者之外，亦可能對真菌的發育、信息傳導和毒性(virulence)具有重要的功能(Heller and Tudzynski,2011)。由LsGRP1C 於B.elliptica 引起之早期ROS累積，可能是因為B.elliptica 對百合寄主特異性的識別(host-specific recognition)所造成。因此，LsGRP1C 不僅可以直接改變細菌和真菌微生物細胞膜的完整性，且至少對某些真菌，也能引起類似程序性細胞死亡的現象；LsGRP1C 的抗微生物活性可能是其對微生物多重作用的結果。
而LsGRP1C 所引發之細菌外觀改變與細胞膜滲漏現象，與固氮細菌在終端分化(terminal differentiation)過程中所發生的變化十分相近；而此變化是由屬於IRLC演化枝(inverted repeat-lacking clade,IRLC clade)的豆科植物所分泌之類抗菌胜肽-根瘤專一性富含半胱胺酸胜肽群(nodule-specific cysteine-rich peptides,NCRs)所調控，NCRs能夠誘導固氮細菌發生終端分化而轉變為類菌體(bacteroid)，進以達成控制共生固氮細菌之目的(Van de Velde et al.2010)。由於固氮細菌的BacA蛋白質或許能靠著降低NCRs所引發之膜透化和殺菌程度，以提供固氮細菌對寄主NCRs殺菌作用的抵抗力，因此固氮細菌可以於NCRs的存在下存活(Haag et al.2011)。然而細菌在以LsGRP1C 處理60分鐘後，已出現細胞外型改變、膜透化和死亡等現象，表示由LsGRP1C 殺滅細菌為一非常迅速之反應。此外，由於維持細菌外型之主要構造-肽聚糖囊(peptidoglycan sacculus)之生合成酵素系統多位於細胞膜(Typas et al.2011)，故LsGRP1C 對細菌外型之影響可能與干擾肽聚糖囊 生合成有關。
LsGRP1為百合受到水楊酸(salicylic acid)誘發對B.elliptica 之系統性抗病過程中增強表現的防禦相關基因(Chen et al.2003；Lu and Chen,2005)；於Arabidopsis thaliana 和Nicotiana benthamiana 生體內過度表現LsGRP1則能夠增強其對病害的抵抗力。最近，由植物抗菌素(phytoalexin)camalexin所引發之寄主誘導真菌程序性細胞死亡現象，被證實可保護A.thaliana 免受B.cinerea 感染(Shlezinger et al.2011a,b)。此外，許多植物抗菌胜肽和抗菌化合物被認為是真菌中程序性細胞死亡的誘導物(inducers)(De Brucker et al.2011；Rahnamaeian,2011)。於本發明中，LsGRP1C 對B.elliptica 的體外抑制機制，顯示LsGRP1可能是透過引發真菌的細胞膜透化和程序性細胞死亡以增進植物抗病性。與此相反的，LsGRP1N 處理會輕微增加B.elliptica 孢子萌芽，則可能是由於B.elliptica 在與百合長期共同化演化(long-term coevolution)之後，能夠辨識LsGRP1上的相對應區域作為寄主信號所致。
本發明展示了一種源自於百合防禦相關蛋白之新穎抗菌胜肽(AMP)，並揭露了無法於大腸桿菌系統(E.coli system)中過度表現(overexpression)的植物防禦相關蛋白，可於實務上成為新穎抗菌胜肽的自然來源。
<110> 國立臺灣大學
<120> 抗微生物組合物及其抑制微生物的方法
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<213> 葵百合(Lilium Stargazer)
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<211> 38
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<213> 葵百合(Lilium Stargazer)
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Claims (10)

  1. 一種控制或抑制微生物的方法，該方法係包括使用一抗菌胜肽於非動物或人體上之微生物與使用該胜肽製備衛生用品，其中該抗菌胜肽係為LsGRP1C (SEQ ID NO：3)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該微生物為一細菌。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該細菌係選自於由Agrobacterium tumefaciens 、Bacillus subtilis 、Escherichia coli 、Dickey chrysanthemi 、Pseudomonas syringae pv.syringae 和Xanthomonas campestris 所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該微生物為一真菌。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該真菌係選自於由Alternaria brassicicola 、Botrytis cinerea 、Botrytis elliptica 、Colletotrichum acutatum 和Colletotrichum gleosporioides 所組成之群組。
  6. 一種用以抑制微生物之抗微生物組合物，該抗微生物組合物包括：一抗菌胜肽，其中該抗菌胜肽係為LsGRP1C(SEQ ID NO：3)；一附加的殺菌劑；及藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑和輔劑等。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之抗微生物組合物，其中該微生物為一細菌。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之抗微生物組合物，其中該細菌係選自於由Agrobacterium tumefaciens 、Bacillus subtilis 、Escherichia coli 、Dickey chrysanthemi 、Pseudomonas syringae pv.syringae 和Xanthomonas campestris 所組成之群組。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之抗微生物組合物，其中該微生物為一真菌。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之抗微生物組合物，其中該真菌係選自於由Alternaria brassicicola 、Botrytis cinerea 、Botrytis elliptica 、Colletotrichum acutatum 和Colletotrichum gleosporioides 所組成之群組。
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