TW201709097A - 評估抗菌胜肽之抗菌力之系統及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種評估/預測抗菌胜肽之抗菌力之方法，其包含以下步驟：(a)透過一第一輸入單元建構一胜肽，將該胜肽構型置於一水溶液環境中一第一時間，進行一平衡反應；(b)透過一第二輸入單元建構一磷酸雙脂層，將該磷酸雙脂層置於一水溶液環境中一第二時間，進行平衡反應；(c)透過一第一處理單元，將前述第一輸入單元所建構之該胜肽與第二輸入單元建構之磷酸雙脂層於水溶液環境中進行分子動力學模擬；(d)透過一第二處理單元，計算該胜肽構型之分配自由能；(e)透過一輸出單元，該輸出單元係與該第一處理單元與該第二處理單元連接，並將一預測資訊輸出。

Description

評估抗菌胜肽之抗菌力之系統及其使用方法
本發明係關於一種評估抗菌胜肽之抗菌力之系統及其使用方法，其係藉由規律移動抗菌胜肽上之胺基酸而產生具有不同抗菌效果之多胜肽，並用新創之電腦平台來評估/預測抗菌胜肽之抗菌效果。
抗生素可分為二種，一為是由天然微生物(包括細菌、真菌、放線菌屬)所產生的一種具有抑制其它微生物生長、生存的次級代謝產物，另一類係透過化學方法合成或半合成的類似化合物。其可包括抗細菌抗生素、抗真菌抗生素以及對付其他微小病原之抗生素；但臨床實務中，抗生素通常是指的是抗細菌抗生素。自從抗生素被發現至今，開始被大量使用，使得具有抗藥性的病菌就越來越多，人類用來對抗病菌的武器「抗生素」有效的也就愈來愈少，也因此積極開發新的、更有效的抗生素藥物為目前製藥產業亟待發展的目標之一。
據美國資料庫公司FierceBiotech發佈的資料顯示，全球抗生素市場，預計從2013年到2018年之間，以1.41%的年複合成長率擴大；雖然抗生素的抗藥性問題引起了國際社會的高度關注，部分國家採取了一定的限抗措施，但是由於其特定的功效，全球抗生素市場規模仍將延續增長的態勢，根據IMS統計，抗感染藥品2014年將全球市場規模403億美元(約1.24 兆元台幣)。
抗菌胜肽，普遍稱為抗微生物胜肽(Antimicrobial Peptides, AMPs)，其長度大約是由10~80個不等的胺基酸所組成，是許多生物體中一種對抗病原的微小物質。它的功能主要就是幫助生物體對抗體內的有害物質，其作用大致有滲透細菌之細胞膜、穿孔、干擾細菌增殖與促進傷口癒合等功能，未來發展的潛能具有取代抗生素的能力。
然而，現今大部分之研究皆對單一抗菌胜肽研究其抗菌能 力，並藉由置換抗菌胜肽上之胺基酸提高抗菌能力，然而此種方法需耗費大量時間評估置換哪個胺基酸及位置可提高抗菌能力，且胜肽抗菌能力是一個複雜的殘基協同現象，而以往僅能藉由疏水力矩、非鍵結作用位能以及接觸表面積預測胜肽之抗菌效果，但又無法準確地預測胜肽之抗菌效果，而需進行額外實驗才能證明胜肽之抗菌效果。因此，若不透過分子動力模擬是難以提供一種系統性並快速的評估設計抗菌胜肽的方法。
本發明提供一種藉由stepwise circular reshuffling(SCR)的方式規律移動一已知有抗菌效果之抗菌胜肽上的胺基酸，來設計具有不同抗菌效果、溶血性及抗鹽性之多胜肽，再藉由電腦模擬及自由能計算之平台來評估這些抗菌胜肽之抗菌效果及溶血性。
本發明提供了一個新的分子動力模擬系統來評估任何抗菌胜肽之抗菌活性及溶血性。此套分子動力模擬系統，特色在於透過「下沉而上浮」的方式，將抗菌胜肽快速地拉入仿細菌的生物膜內，並且相較於自然插入大幅縮短所需的平衡時間達10倍左右。從模擬軌跡可計算一個新 設計出的分配自由能，△Gp。此分配自由能△Gp可作為一個更好的物理指標來預測某一胜肽的抗菌活性。
有鑑於此，本發明提供一種評估抗菌胜肽之抗菌力之系統，其包括：(a)一第一輸入單元，該第一輸入單元係用以建構一胜肽；(b)一第二輸入單元，該第二輸入單元係用以建構一磷酸雙脂層；(c)一第一處理單元，其係與該第一輸入單元以及該第二輸入單元連接，該第一處理單元係將該第一輸入單元建構之該胜肽與第二輸入單元建構之該磷酸雙脂層於水溶液環境中進行一分子動力學模擬；(d)一第二處理單元，該第二處理單元與該第一處理單元相連接，計算該胜肽在每格模擬快照(snapshot)中與膜內脂鏈尾有碰觸之重原子數Ni及與膜內脂鏈尾未碰觸之重原子數NO。對模擬平衡後四奈秒中所收集的快照做平均，得到<Ni>與<NO>，進而計算分配自由能△Gp。其中所述重原子係指氫原子之外的所有原子；(e)一輸出單元，該輸出單元係與該第二處理單元連接，並將一預測資訊輸出；其中，該第一輸入單元、該第二輸入單元、該第一處理單元、該第二處理單元及該輸出單元係透過一電腦操作。
本發明又提供一種利用本發明系統，來評估/預測抗菌胜肽之抗菌力之方法，其包含以下步驟：I.透過一第一輸入單元建構一胜肽，將該胜肽置於一水溶液環境中 一第一時間，進行模擬平衡；II.透過一第二輸入單元建構一磷酸雙脂層，將該磷酸雙脂層置於一水溶液環境中一第二時間，進行模擬平衡；III.透過一第一處理單元，將前述第一輸入單元所建構之該胜肽與第二輸入單元建構之該磷酸雙脂層於水溶液環境中進行一分子動力學模擬；IV.透過一第二處理單元，計算該胜肽在每格模擬快照(snapshot)中與膜內脂鏈尾有碰觸之重原子數Ni及與膜內脂鏈尾未碰觸之重原子數NO。對模擬平衡後四奈秒中所收集的快照做平均，得到<Ni>與<NO>，進而計算分配自由能△Gp。其中所述重原子係指氫原子之外的所有原子；V.透過一輸出單元，該輸出單元係與該第二處理單元連接，並將一預測資訊輸出；其中，該第一輸入單元、該第二輸入單元、該第一處理單元、該第二處理單元及該輸出單元係透過一電腦操作。
較佳地，該胜肽構型為α-螺旋。
較佳地，該第一輸入單元可包含軟體(如PyMol或Discovery Studio Visualizer)創造之模擬胜肽，或由實驗結果(如從X-ray crystallography或NMR)得知之胜肽。模擬平衡之胜肽包含利用模擬軟體(如NAMD2.9版、VMD1.9.2版、AMBER14、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到胜肽在類生理環境下的平衡狀態。
較佳地，該第二輸入單元係包含以「CHARMM-GUI」伺服 器及相似軟體來建膜(磷酸雙脂層)。模擬平衡之磷酸雙脂層包含利用模擬軟體(如NAMD2.9版、VMD1.9.2版、AMBER14、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到磷酸雙脂層在類生理環境下的平衡狀態。
較佳地，該第一處理單元係包含利用模擬軟體(如NAMD2.9版、VMD1.9.2版、AMBER14、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到胜肽穩定插入磷酸雙脂層的平衡狀態。
較佳地，該第二處理單元之輸入元素(胜肽與膜內脂鏈尾有碰觸及碰觸之重原子數)係依據第一處理單元所輸出之模擬軌跡而得。
較佳地，該磷酸雙脂層係由十六醯油醯磷脂醯膽鹼(palmitoyloleoyl Phosphatidylcholine，簡稱POPC)及/或十六醯油醯磷脂醯甘油醯甘油(palmitoyloleoyl-phosphatidyl glycerol，簡稱POPG)所構成。
較佳地，該第一時間為100皮秒(ps)。
其中，該預測資訊為該胜肽之抗菌效果。
其中，該分子動力學模擬為，使該胜肽疏水面朝向預先平衡好的磷酸雙脂層而親水面(即帶正電端)朝向另一端，然後使兩者的質心當投影到與膜垂直的軸上時相距為35Å，然後再展開一「下沉而上浮表面」模擬。
其中該「下沉而上浮表面」模擬為該螺旋構型的胜肽被微弱的拉力拖至膜內磷酸雙脂上層磷原子之平均座標6Å下方的位置並維持數奈秒。接著去除對螺旋構型胜肽的限制力，再進行25~35奈秒的模擬，使其 上浮至膜表面並且平衡。
較佳地，前述計算分配自由能△Gp=-kBTln(<Ni>/<No>)或 =-kBT(<lnNi>/<lnNo>)(當Ni及No均不為零時)，其中kB為波茲曼常數、T為溫度、Ni與No分別為每格模擬快照(snapshot)中與膜內脂鏈尾有碰觸(視為已插入)和未碰觸(視為未插入)的胜肽內重原子之數量。<>表示4ns的移動平均。
較佳地，在本發明抗菌胜肽中，經計算該△Gp與其對應之抗 菌效果(MIC)彼此間的相關係數(R)大於0.84(“1”代表完美的相關)。在此系列中，MIC=13.49*△Gp-5.79。
第1圖為分子模擬系統之簡單示意圖。
第2圖為分子模擬系統之流程圖。
第3圖為分子模擬結果之示意圖。
第4圖為胜肽之溶血性
利用本發明系統所設計出之具低溶血性之抗菌胜肽，該抗菌胜肽如下列式I所示：xAP1yBP2zCn(P3vD)；其中x、y、z、v以及n均為正整數；且x=0~6、y=0或4、z=0~6、v=0~4以及n=0或1； 其中P1、P2以及P3係指-Trp-Leu-Lys-；其中A、B以及C係選自由Trp、Leu以及Lys所組成之群組；其中D係指Lys。
於較佳實施例中，抗菌胜肽於分子動力模擬系統之結果於表一所示：
於較佳實施例中，抗菌胜肽之抗菌效果如表二所示。
最低抑菌濃度測試
抗菌活性的最低抑菌濃度值被定義為能抑制90%的細菌生長的最低蛋白濃度，而大腸桿菌(ATCC 25922)被選作為此次WLK異構胜肽系列(SEQ ID NO：1~13)的最低抑菌濃度測試的代表菌株。蛋白濃度由紫外光/可見光光譜儀(Ultrospec 1100 pro from Amersham Biosciences)在波長280nm的吸光值搭配消光係數計算(Gill S.C.& Von Hippel P.H.,Analytical biochemistry1989,182(2),319-326)而得，然後被配置為以下七個初始濃度：5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078mg/ml。將對數生長中期、濃度為每毫升5×105菌落形成單位(CFU)的細菌培養液與上述濃度的蛋白溶液於96孔盤中均勻混和(每孔中含有1微升的蛋白溶液與99微升的菌液)。在37℃環境下震盪培養16小時後，由微量孔盤儀(Thermo Max,Molecular Devices)在波長600nm環境下的吸光值來偵測該細菌生長抑制情形。最後，最低抑菌濃度值將透過三重覆上述的實驗後來決定。
溶血活性測試
溶血活性是由受測胜肽之於人類紅血球的溶血性所測定。新鮮的紅血球和PBS緩衝溶液(pH 7.4)均勻混和後在相對離心力(RCF)800g環境下離心10分鐘得以清洗，然後再由PBS緩衝溶液依體積百分比濃度(v/v)稀釋至10%。各個受測胜肽預先配置好不同濃度(800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56μg/ml)，分別與PBS緩衝溶液依1：1的體積比例混合(100μL：100μL)。而紅血球溶液依體積比例1：1，分別與 包含或不包含2%聚乙二醇辛基苯基醚X-100(Triton X-100)(v/v)的PBS緩衝液混合，以作為正、負控制組樣本。然後所有受測樣品在37℃環境下靜置1小時。接著將樣品在RCF 800g環境下再離心10分鐘，取其上清液並測其波長450nm下的吸光值。如此溶血活性將依照以下公式而測定： % hemolysis=[A sample -A PBS ]/[A TritonX100-A PBS ]
針對原先為螺旋構型的SEQ ID NO：1，經「序列逐步位移置 換」過程中所新設計之12段異構胜肽(SEQ ID NO：2~13)，其之抗菌效果、溶血性及其鹽類耐受性如表二所示，進一步運用上述「下沉而上浮」模擬策略與△Gp計算方式來衡量其抗菌活性，並且分析該13段胜肽(含原始序列)其分配自由能(△Gp)與實驗抗菌性(MIC)之間的相關性，而該相關係數大於0.8(MIC=13.50*△Gp-5.79,R=0.84)，表二結果更說明該13段胜肽於高鹽濃度中仍然具有抑制效果。且在這12段本發明異構胜肽中有3段的抗菌活性比原先序列更佳，而其中SEQ ID NO：12同時表現出對人類紅血球更低的溶血性。當前的發明明顯地提供了一個新的平台，運用已知的抗菌胜肽來合理地設計更有效的抗菌胜肽，並且利過電腦運算來預測新抗菌胜肽的活性。
<110> 國立清華大學
<120> 評估抗菌胜肽之抗菌力之系統及其使用方法
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (19)

  1. 一種評估抗菌胜肽之抗菌力之系統，其包括：(a)一第一輸入單元，該第一輸入單元係用以建構一胜肽；(b)一第二輸入單元，該第二輸入單元係用以建構一磷酸雙脂層；(c)一第一處理單元，其係與該第一輸入單元以及該第二輸入單元連接，該第一處理單元係將該第一輸入單元之該胜肽與第二輸入單元建構之磷酸雙脂層於水溶液環境中進行一分子動力學模擬；(d)一第二處理單元，該第二處理單元與該第一處理單元相連接，並計算該胜肽在每格模擬快照(snapshot)中與膜內脂鏈尾有碰觸之重原子數Ni及與膜內脂鏈尾未碰觸之重原子數NO。對模擬平衡後四奈秒中所收集的快照做平均，得到<Ni>與<NO>，進而計算分配自由能△Gp。其中所述重原子係指氫原子之外的所有原子；(e)一輸出單元，該輸出單元係與該第二處理單元連接，並將一預測資訊-分配自由能△Gp輸出；其中，該第一輸入單元、該第二輸入單元、該第一處理單元、該第二處理單元及該輸出單元係透過一電腦操作。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之系統，其中該第一輸入單元係包含由軟體(如PyMol或Discovery Studio Visualizer)創造之模擬胜肽，或由實驗結果(如從X-ray crystallography或NMR)得知之胜肽。模擬平衡之胜肽包含利用模擬軟體(如NAMD2.9版、VMD1.9.2版、AMBER14、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到胜肽在類生理環境下的平衡狀態。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之系統，其中該第二輸入單元係包含以「CHARMM-GUI」伺服器及相似軟體來建膜(磷酸雙脂層)。模擬平衡之磷酸雙脂層包含利用模擬軟體(如NAMD2.9版、VMD1.9.2版、AMBER14、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到磷酸雙脂層在類生理環境下的平衡狀態。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之系統，其中該第一處理單元係包含利用模擬軟體(如NAMD2.9版、VMD1.9.2版、AMBER14、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到胜肽穩定插入磷酸雙脂層的平衡狀態。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之系統，其中前述磷酸雙脂層係由十六醯油醯磷脂醯膽鹼(palmitoyloleoyl Phosphatidyl choline，簡稱POPC)及/或十六醯油醯磷脂醯甘油醯甘油(palmitoyloleoyl-phosphatidylglycerol，簡稱POPG)所構成。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之系統，其中該分子動力學模擬係為將該胜肽調整方向，使其疏水面朝向預先平衡好的磷酸雙脂層而親水面(即帶正電端)朝向另一端，然後使兩者的質心當投影到與膜垂直的軸上時相距為35Å，然後再展開一下沉而上浮表面模擬。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之系統，其中該下沉而上浮表面模擬該螺旋構型的胜肽被微弱的拉力拖至膜內磷酸雙脂上層磷原子之平均座標6Å下方的位置並維持數奈秒。接著去除對螺旋構型胜肽的限制力，進行25~35奈秒的模擬，使其上浮至膜表面並且平衡。
  8. 一種透過申請專利範圍第1項之評估抗菌胜肽之抗菌力之系統，以預測抗菌胜肽之抗菌力之方法，其包含以下步驟：(a)透過一第一輸入單元建構一胜肽，將該胜肽置於一水溶液環境中一第一時間，進行一平衡反應；(b)透過一第二輸入單元建構一磷酸雙脂層，將該磷酸雙脂層置於一水溶液環境中一第二時間，進行平衡反應；(c)透過一第一處理單元，將前述第一輸入單元之該胜肽與第二輸入單元建構之磷酸雙脂層於水溶液環境中進行一分子動力學模擬；(d)透過一第二處理單元，計算該胜肽在每格模擬快照(snapshot)中與膜內脂鏈尾有碰觸之重原子數Ni及與膜內脂鏈尾未碰觸之重原子數NO。對模擬平衡後四奈秒中所收集的快照做平均，得到<Ni>與<NO>，進而計算分配自由能△Gp；(e)透過一輸出單元，該輸出單元係與該第二處理單元連接，並將分配自由能或預測之胜肽活性資訊輸出。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之預測抗菌胜肽之抗菌力之方法，其中該平衡反應係為將胜肽置於模擬水環境中100皮秒(ps)。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之方法，其中該第一輸入單元係包含由軟體(如PyMol或Discovery Studio Visualizer)創造之模擬胜肽，或由實驗結果(如從X-ray crystallography或NMR)得知之胜肽。模擬平衡之胜肽包含利用模擬軟體(如NAMD2.9版、VMD1.9.2版、AMBER14、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到胜肽在類生理環境下的平衡狀態。
  11. 如申請專利範圍第8項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之方法，其中該第二輸入單元係包含以「CHARMM-GUI」伺服器及相似軟體來建膜(磷酸雙脂層)。模擬平衡之磷酸雙脂層包含利用模擬軟體(如NAMD2.9版、VMD1.9.2版、AMBER14、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到磷酸雙脂層在類生理環境下的平衡狀態。
  12. 如申請專利範圍第8項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之方法，其中該第一處理單元係包含利用模擬軟體(如NAMD2.9版、VMD1.9.2版、AMBER14、GROMACS)以及常用力場(如CHARMM、AMBER、GROMOS、OPLS)來達到胜肽穩定插入磷酸雙脂層的平衡狀態。
  13. 如申請專利範圍第8項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之方法，其中該磷酸雙脂層係由十六醯油醯磷脂醯膽鹼(palmitoyloleoyl Phosphatidylcholine，簡稱POPC)及/或十六醯油醯磷脂醯甘油醯甘油(palmitoyloleoyl-phosphatidylglycerol，簡稱POPG)所構成。
  14. 如申請專利範圍第8項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之方法，其中該預測資訊係指該胜肽之抗菌性。
  15. 如申請專利範圍第8項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之方法，其中前述分子動力學模擬係為針對上述具螺旋構型的胜肽調整方向，使其疏水面朝向預先平衡好的磷酸雙脂層而親水面(即帶正電端)朝向另一端，然後使兩者的質心當投影到與膜垂直的軸上時相距為35Å，然後再展開「下沉而上浮表面」的模擬。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之方法，其中該下沉而上浮表面模擬該螺旋構型的胜肽被微弱的拉力拖至膜內磷酸雙脂上層磷原子之平均座標6Å下方的位置並維持數奈秒。接著去除對螺旋構型胜肽的限制力，使其上浮至膜表面，再進行25~35奈秒的模擬。
  17. 如申請專利範圍第8項所述之評估抗菌胜肽之抗菌力之方法，其中前述分配自由能係為△Gp=-kBTln(<Ni>/<No>)或=-kBT(<lnNi>/<lnNo>)，其中kB為波茲曼常數、T為溫度、Ni與No分別為每格模擬快照(snapshot)中與膜內脂鏈尾有碰觸和未碰觸的胜肽內重原子之數量，<>表示4ns的移動平均。
  18. 一種具低溶血性之抗菌胜肽，該抗菌胜肽如下列式I所示：xAP1yBP2zCn(P3vD)式I；其中x、y、z、v以及n均為正整數；且x=0~6、y=0或4、z=0~6、v=0~4以及n=0或1；其中P1、P2以及P3係指-Trp-Leu-Lys-；其中A、B以及C係選自由Trp、Leu以及Lys所組成之群組；其中D係指Lys。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之抗菌胜肽，其中該抗菌胜肽係選自由SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：13所組成之群組。
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